A hepatite C é uma doença que leva à inflamação do fígado, sendo causada pelo vírus da hepatite C (VHC). Estima-se que existam 130 a 170 milhões de casos de infecção crônica pelo VHC por todo o mundo. Apesar do VHC ser principalmente hepatotrópico, foi evidenciada a detecção de RNA viral em células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Evidências clínicas e experimentais têm demonstrado um importante tropismo do VHC por células do sistema imune, em especial por PBMCs. Apesar deste interessante achado, a importância da infecção do sistema imune na história natural da doença não é totalmente conhecida. É possível observar em alguns estudos que, em pacientes que desenvolvem infecção aguda, observa-se uma vigorosa resposta mediada por células T, específica ao VHC, mediada, por células T CD4+ e T CD8. Esta resposta é detectada na fase inicial da doença, e prolonga-se durante vários anos após a resolução do vírus. Pelo contrário, os pacientes que desenvolvem infecção crônica, apresentam, normalmente, respostas T fracas e / ou de curta duração, bem como defeitos nas funções efetoras de células T específicas. As respostas mediadas por células T com este perfil resultam, normalmente, em um baixo controlo da viremia e na sua persistência. Outra importante questão que permanece incerta até o presente momento é como a infecção das células imunes pelo VHC altera a sua função, principalmente no que concerne às PBMCs. Informações referentes às PBMCs e o VHC são pouco estudadas e referidas na literatura internacional, embora sejam de fundamental importância para a compreensão do seu peso na história natural da infecção. OBJETIVO: Baseado nessas incertezas o presente estudo tentará contribuir para a elucidação da influência do parasitismo por VHC na função de células TCD4+ e TCD8+ em pacientes naïve com indicação de tratamento com IFNpeg+RBV e comparar os dados obtidos antes, durante e pós-tratamento com os valores encontrados dos controles negativos, avaliando a influência do tratamento sobre a função dessas células. Verificar a presença do RNA-VHC nas PBMCs por RT-PCR em Tempo Real. Verificar a influência de fatores do vírus e do hospedeiro, tais como genótipo, carga viral, idade, gênero, raça, polimorfismo IL28B e biópsia hepática sobre as células parasitadas pelo VHC e sua produção de citocinas; Determinar a contagem e a função de linfócitos T CD4+ e CD8+ no sangue periférico desses pacientes; Determinar a influência do parasitismo de linfócitos pelo VHC sobre a função dos linfócitos TCD4+ e TCD8+. METODOLOGIA: Foram estudados 52 pacientes com hepatite C crônica; destes, 17 pacientes foram tratados com IFNalfa+RBV; 10 controles sadios, atendidos no Ambulatório de Hepatites da Divisão de Clínica de Doenças Infecciosas e Parasitárias do HC FMUSP. A contagem de células da subpopulação de linfócitos T CD4+ e CD8+ periféricas foram realizadas por citometria de fluxo FACSCanto II (BD) por meio do software MultiSet(BD). Foi analisada a presença/ausência do RNA-VHC em PBMC por PCR em tempo real no sistema TaqMan, no termociclador Applied Biosystems StepOne(TM). A função dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ foram avaliadas através da técnica ELISPOT utilizanso o Kit Human IFN-gamma/IL-4 Dual-Color FluoroSpot. A contagem dos spots foi realizada em um leitor automatizado CTL-ImmunoSpot® S6 FluoroSpot Line. As PBMCs foram fracionadas e depletadas, utilizando-se o Kit Dynabeads FlowComp Human CD4 (Invitrogen Life Technologies) segundo as instruções do fabricante. RESULTADOS: Foram estudados 52 pacientes com hepatite C crônica; destes, 17 pacientes foram tratados com IFNalfa+RBV; 10 controles sadios. O genótipo 1 foi o mais prevalente 61,5%. O RNA do VHC foi detectado nas PBMCS em 88,4% dos pacientes. XVII Nossos resultados mostraram um aumento de células CD4 e CD8 parasitadas pelo VHC antes do tratamento, com valores estatisticamente significantes quando comparadas aos controles normais apenas no caso das CD4. Ocorreu, porém, um nítido prejuízo na produção de interleucinas por estas células parasitadas, particularmente a produção de IFN- y, com valores altamente significantes (0,009). Na semana 12, podemos ver o aumento de células CD4 no pré-tratamento, porém com diminuição na semana 12 e no follow up; entretanto a produção de IL-4 pelas células CD4 aumenta na semana 12 e cai novamente no seguimento; com as células CD8 ocorre leve queda na semana 12 porém uma tentativa de recuperação no follow up; sua produção de IFN-y cai na semana 12 e no follow up para números estatisticamente significantes. É a chamada \"exaustão\" de função destas células já descrita in vitro por alguns autores. Estes dados poderão ser muito úteis nas futuras observações desses pacientes que serão tratados com esquemas de DAAs sem interferon alfa. CONCLUSÃO: Em conclusão, os resultados desta pesquisa confirmam a importante influência do parasitismo das células CD4 e CD8 em suas funções / Hepatitis C is a disease that causes inflammation of the liver, caused by hepatitis C virus (HCV). It is estimated that there are 130 million to 170 million cases of chronic HCV infection worldwide. Although HCV is primarily hepatotropic was evidenced by detection of viral RNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Clinical and experimental evidence have demonstrated an important tropism of HCV by immune system cells, in particular by PBMC. Despite this interesting finding, the importance of infection of the immune system in the natural history of the disease is not fully known. It can be observed in some studies in patients who develop acute infection a vigorous response is observed mediated by T cells specific to HCV mediated by CD4 + and CD8. This response is detected at the initial stage of the disease, and extends for years after the resolution of the virus. Conversely, patients who develop chronic infection, are typically in the low T responses and / or short-term as well as defects in the effector functions of specific T cells. The responses mediated by T cells with the profile usually result in a low control of viremia and its persistence. Another important issue that remains unclear to date is how the infection of immune cells by HCV alters its function, especially with regard to the PBMCs. Information relating to the PBMCs and HCV are little studied and reported in the international literature, although they are of fundamental importance for the understanding of its weight in the natural history of infection. OBJECTIVE: Based on these uncertainties the present study attempts to contribute to the elucidation of the influence of parasitism by HCV on CD4 T cell function + and CD8 + in naïve patients with treatment indication with IFNpeg + RBV and compare the data obtained before, during and after treatment with the values found negative controls, assessing the influence of treatment on the function of these cells. Verify the presence of HCV-RNA in PBMC by RT-PCR in real time. Check the influence of virus and host factors such as genotype, viral load, age, gender, race, IL28B polymorphism and liver biopsy on the parasitized cells with HCV and their cytokine production; Determine count and function of lymphocytes T CD4 + and CD8 + peripheral blood of patients; To determine the influence of parasitism lymphocytes HCV on the function of CD4 + and CD8 + T lymphocytes. METHODS: We studied 52 patients with chronic hepatitis C; of these, 17 patients were treated with IFNalpha + RBV; 10 healthy controls, treated at the Hepatitis Clinic of the Division of Clinical Infectious and Parasitic Diseases of the FMUSP. The lymphocyte subpopulation of T-cell count CD4 + and CD8 + peripheral been made by FACSCanto II flow cytometer (BD) through the multiset software (BD). the presence / absence of HCV-RNA in PBMC by real-time PCR was analyzed in the TaqMan system, Applied Biosystems thermal cycler StepOne (TM). The role of CD4 + T lymphocytes and CD8 + were assessed by ELISPOT technique utilizanso the Human Kit IFN-gamma / IL-4 Dual-Color FluoroSpot. The counting of the spots was carried out in an automated reader CTL-ImmunoSpot® S6 FluoroSpot Line. And fractionated PBMCs were depleted using Dynabeads kit is the Human CD4 FlowComp (Invitrogen Life Technologies) according to manufacturer\'s instructions. RESULTS: We studied 52 patients with chronic hepatitis C; of these, 17 patients were treated with IFNalpha + RBV; 10 healthy controls. Genotype 1 was the most prevalent 61.5%. The HCV RNA was detected in PBMC in 88.4% of patients. Our results showed an increase of CD4 and CD8 cells parasitized with HCV prior to treatment, with statistically significant amounts compared to controls only if CD4. There was however, a marked impairment in production of interleukins for these parasitized cells, particularly the production of IFN- y, with highly significant values (0.009). At week 12, we can see the increase in CD4 cells before treatment, but with decreased at week 12 and at follow up; However IL-4 production by CD4 cells increased at week 12 and again falls in the following; with the CD8 cells is slightly lower at week 12 but a recovery attempt at follow up; their IFN-y production drops at week 12 and follow up to statistically significant numbers. It is called \"exhaust\" function of these cells in vitro been described by some authors. This data is very useful in future observations of these patients are treated with AADs regimens without interferon alfa. CONCLUSION: In conclusion, the results confirm the important influence of the parasitism of CD4 and CD8 cells in their functions

A asma afeta aproximadamente 300 milhões de pessoas no mundo e é a maior causa de internação hospitalar em crianças nos países desenvolvidos. Essa doença é incurável e por vezes refratária ao tratamento em um número significativo de pacientes. As taxas de prevalência de tabagismo entre pacientes asmáticos são semelhantes aos da população em geral e o impacto da fumaça de cigarro nestes pacientes ainda é clinicamente controverso. O objetivo deste trabalho foi traçar o perfil inflamatório e analisar o papel das células dendríticas sobre a imunomodulação provocada pela exposição à fumaça do cigarro na inflamação alérgica pulmonar induzida previamente por ovalbumina (OVA) em um modelo murino. Primeiramente avaliamos in vivo a ação da fumaça de cigarro na inflamação pulmonar alérgica crônica avaliando a responsividade brônquica, o remodelamento pulmonar, a produção de anticorpos antígeno-específicos, o perfil de células inflamatórias pulmonares e sistêmicas e a produção de citocinas inflamatórias e moduladoras. Em seguida, realizamos estudo in vitro do perfil de maturação, migração e inflamatório de células dendríticas expostas a OVA e/ou a extrato de fumaça de cigarro. Nosso estudo mostrou que a sensibilização e desafios inalatórios com OVA levaram à inflamação pulmonar de característica Th2 com aumento de responsividade brônquica, remodelamento, altos níveis de IgE e de citocinas pró-inflamatórias como IL-4, IL-5 e IL-13. A exposição à fumaça de cigarro, surpreendentemente, levou a uma redução dos níveis de IL-4, IL-5 e IL-13, e simultaneamente reduziu os níveis de citocinas anti-inflamatórias como IL- 10 e TGF-beta em animais sensibilizados e desafiados com antígeno. Foi observada nestes animais, uma redução no número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e aumento no número de neutrófilos no pulmão. A combinação da inflamação alérgica com exposição à fumaça de cigarro levou a um aumento do recrutamento e ativação de células dendríticas linfoides nos linfonodos mediastinais, que mostrou relação direta com aumento do influxo de células T CD8+ e ativação das mesmas no pulmão. A inflamação alérgica juntamente com a exposição à fumaça de cigarro, levou a uma redução no recrutamento de células dendríticas plasmocitoides além de reduzir o recrutamento de células T regulatórias. In vitro, mostramos que o extrato de fumaça de cigarro combinado ao antígeno aumenta a capacidade migratória e fagocítica do antígeno pelas BMDCs. No entanto, houve redução da expressão gênica para IL-13 neste mesmo grupo. Concluímos que neste modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica combinada com a exposição à fumaça de cigarro leva a uma descaracterização do perfil inflamatório característico da resposta Th2 com a redução do recrutamento de eosinófilos, redução dos níveis de IL-4, IL-5 e IL-13 aliados a um aumento do número de neutrófilos, o que pode estar relacionado ao aumento do recrutamento e ativação de células dendríticas linfoides bem como de células T CD8+ e redução local de células dendríticas plasmocitoides. Mostramos ainda que a fumaça de cigarro juntamente com o antígeno leva as células dendríticas a aumentarem sua capacidade fagocítica porém, reduzir sua capacidade pró-inflamatória pela expressão gênica reduzida de IL-13 / Asthma affects approximately 300 million people worldwide and it is the major cause of hospitalization among children in developed countries. This disease is often refractory to treatment in a high number of patients. The prevalence rates of smoking among asthmatic patients are similar to the general population and the impact of cigarette smoke is also clinically controversial. The main goal of this study is to outline, in a murine model, the inflammatory profile and to analyze the role of dendritic cells on the immunomodulation caused by exposure to cigarette smoke in ovalbumin (OVA)-induced pulmonary allergic inflammation. First, we evaluated in vivo the action of cigarette smoke on chronic allergic pulmonary inflammation, evaluating the bronchial responsiveness, pulmonary remodeling, the production of antigen-specific antibodies, pulmonary and systemic inflammatory cell profile and the production of inflammatory and modulating cytokines. Next, we performed an in vitro study of the maturation, migration and inflammatory profile of dendritic cells exposed to OVA and/or cigarette smoke extract. Our study showed that sensitization and challenge with OVA led to Th2-type lung inflammation with increased bronchial responsiveness, remodeling, high levels of IgE and proinflammatory cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-13. Exposure to cigarette smoke has surprisingly led to a reduction in levels of IL-4, IL-5 and IL-13, and simultaneously reduced levels of anti-inflammatory cytokines such as IL-10 and TGF-beta in animals sensitized and challenged with the antigen. We also observed a reduction in the number of eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid and an increase in the number of neutrophils in the lung of these animals. The combination of allergic inflammation with exposure to cigarette smoke led to increased recruitment and activation of lymphoid dendritic cells in the mediastinal lymph nodes, which showed to be direct related with increased activation and influx of CD8+ T cells in lung. Allergic inflammation combined with cigarette smoke led to a decrease of plasmacytoid dendritic cells a well as regulatory T cells. In vitro, we showed that cigarette smoke extract combined with antigen increased migratory and phagocytic capacity of BMDCs. However, there was a reduction of IL-13 gene expression in this same group. We conclude that in this model of chronic pulmonary allergic inflammation combined with exposure to cigarette smoke leads to a mischaracterization of the characteristic inflammatory profile of the Th2 response with the reduction of eosinophil recruitment, reduction of levels of IL-4, IL-5 and IL-13 allied to increased number of neutrophils, which is related to increased recruitment and activation of lymphoid dendritic cells as well as CD8+ T cells and local decrement of plasmacytoid dendritic cells. We further show that cigarette smoke combined with antigen increases dendritic cell phagocytic capacity however, reduces its pro-inflammatory capacity by the reduced gene expression of IL-13

LLC-B é uma neoplasia hematológica derivada de uma população de linfócitos B maduros CD5+ localizados na zona do manto dos folículos linfóides e é a mais comum das doenças linfoproliferativas. É uma doença clinicamente heterogênea na qual certos pacientes apresentam quadros indolentes que durante muitos anos podem ser controlados com pouco ou nenhum tratamento. Relatos da literatura sugerem que os linfócitos T na LLC-B podem ser incapazes de iniciar, manter e concluir uma resposta imune para a célula B maligna e outros antígenos, e podem estar diretamente envolvidos na manutenção do tumor. Os linfócitos são ativados, proliferam e polarizam sua resposta para padrões pro-inflamatórios ou antiinflamatórios, aumentando sua população e tornando-se capazes para realizar suas funções efetoras. Embora o processo de ativação dos linfócitos Th seja indispensável para a defesa do hospedeiro, é necessário que haja um equilíbrio homeostático, onde as células auto-reativas ou recorrentemente ativadas sejam eliminadas. A esse último mecanismo de manutenção do equilíbrio imunológico, dá-se o nome de Tolerância Periférica, sendo que o processo de morte celular induzida por ativação (AICD) constitui um dos principais mecanismos para sua manutenção. Assim, neste estudo também foram analisados membros do grupo de receptores de membrana da superfamília dos receptores de fatores de necrose tumoral (tumor necrosis factor receptor, TNFR). Esta família TNFR inclui diversos receptores, entre eles o FAS (CD95) e seu ligante FASL. O objetivo central deste trabalho é investigar alterações no compartimentos de linfócitos T como, Th1, Th2, Th17 e Treg, bem como membros da via extrínseca de morte, FAS e FASL nos linfócitos T CD4+. Os resultados mostraram que o número absoluto dos linfócitos T CD4+, CD8+ e Th1 é heterogêneo, sendo que alguns pacientes apresentaram aumento e outros diminuição destas células quando comparados com o grupo controle do estudo. Em relação a expressão de FAS e FASL os resultados também apresentaram heterogeneidade. Sendo assim foi analisado cada paciente e comparados com os fatores de prognósticos e dados clínicos em cada caso. Ainda há muito para ser investigado, mas este trabalho tem como perspectivas buscar melhor entendimento da participação dos linfócitos T CD4+ nas LLC-B, expandindo as possibilidade de tratamento e busca de novos alvos terapêuticos. / B-CLL is a hematologic malignancy derived from a mature population of CD5+ Blymphocytes located in the mantle zone of the lymphoid follicles and is the most common lymphoproliferative disorders. It is a clinically heterogeneous disorder in which patients have certain frames idle for many years that can be controlled with little or no treatment. Literature reports suggest that T lymphocytes in B-CLL may be unable to initiate, sustain and complete an immune response to the malignant B cell and other antigens, and may be directly involved in tumor maintenance. The lymphocytes are activated, proliferate and polarize their response patterns to pro-inflammatory or anti-inflammatory, increasing its population and becoming able to perform their effector functions. Although the process of Th lymphocyte activation is essential for host defense, there must be a homeostatic balance, where autoreactive cells are eliminated or recurrently activated. The latter mechanism of maintenance of immune balance, gives the name of Peripheral Tolerance, and the process of activation-induced cell death (AICD) is a major mechanism for its maintenance. In this study group members of the superfamily of membrane receptors of tumor necrosis factor (tumor necrosis factor receptor, TNFR) receptors were also analyzed. The TNFR family includes many receptors, including FAS (CD95) and its ligand FasL. The central objective of this study is to investigate changes in T lymphocyte compartments as Th1, Th2, Th17 and Treg as well as members of the extrinsic death pathway, FAS and FASL in CD4+ lymphocytes. The results showed that the absolute number of CD4+, CD8+ and Th1 lymphocytes is heterogeneous, with some patients showed an increase and others decrease of these cells when compared with the control group of the study. Regarding the expression of FAS and FASL results also showed heterogeneity. Thus each patient was analyzed and compared to the prognostic factors and to clinical data in each case. Much remains to be investigated, but this work has the prospects look better understanding of the role of the B-CLL CD4+ T lymphocytes, expanding the possibilities of treatment and the search for new therapeutic targets.

INTRODUÇÃO: Células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton (GW-CTM) exibem a capacidade de modular a resposta das células T e geralmente esses efeitos imunomoduladores são anti-inflamatórios. Devido ao seu potencial imunossupressor, as CTM emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para terapia celular. No entanto, essas células têm uma vida útil limitada in vitro, com redução progressiva da sua capacidade de autorrenovação e parada irreversível do ciclo celular. O resultado deste processo é a perda da funcionalidade das CTM, o que limita a sua utilização para fins terapêuticos. Pouco se sabe sobre a variabilidade individual das amostras de GW-CTM e como isso poderia afetar sua expansão in vitro, seu potencial imunomodulador e o processo de envelhecimento. Neste estudo, avaliamos o perfil de citocinas imunomoduladoras e a capacidade das GW-CTM inibir a proliferação de células T durante o processo de senescência replicativa para determinar se a resposta esperada é afetada. MÉTODOS: GW-CTM foram cultivadas até a senescência replicativa ser atingida; as amostras foram coletadas numa fase inicial (passagem 5), numa etapa intermediária (passagem 15) e na senescência replicativa (passagem geralmente entre 20 e 25) para análise do perfil basal de moléculas imunomoduladoras. GW-CTM foram cocultivadas com amostras de duas células mononucleares de sangue periférico (PBMC), obtidas de doadores de plaquetas saudáveis. PBMC foi estimulado com fitohemaglutinina (PHA) durante 72 horas e cocultivado com três amostras de GW-CTM diferentes para medir a supressão da proliferação das células T. Os experimentos foram realizados utilizando as passagens P5 e P10. As análises foram feitas por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo. RESULTADOS: Nossos resultados mostram que a expressão gênica e a secreção de moléculas imunomoduladoras variam entre amostras de GW-CTM, sem padrão específico. Em cocultura, todas as GW-CTM foram capazes de inibir a proliferação de células T CD3+ ativadas por mitogéno, embora em diferentes graus. E cada PBMC respondeu à cocultura com um nível diferente de inibição. Além disso, o perfil imunomodulador de todas as GW-CTM foi essencialmente mantido, mesmo após várias passagens. CONCLUSÃO: Nossos dados indicam que cada GW-CTM exibe um comportamento único, diferindo nos padrões de expressão e secreção de citocinas e capacidade imunomoduladora. Essa variabilidade intrínseca entre amostras pode influenciar a eficácia de GW-CTM quando utilizadas em terapia celular / INTRODUCTION: Wharton\'s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) exhibit the ability to modulate T cell responses and these immunomodulatory effects are usually anti-inflammatory. Due to their immunosuppressive potential, MSC have recently emerged as a promising tool for cell therapy. However, MSC have a limited lifespan in vitro, with a progressive reduction in their capacity for selfrenewal leading to irreversible arrest of cell division. The result of this process is the loss of stem cell functionality, which limits its use for therapeutic purposes. Information on the variability of individual cell samples impacting upon in vitro expansion, immunomodulatory potential, and aging processes is still lacking. In this study, we evaluated the immunomodulatory cytokine profile and capacity to inhibit T cell proliferation of WJ-MSC progressing to replicative senescence to determine if the expected response is affected. METHODS: WJ-MSC were cultured until replicative senescence was reached and the samples were collected at an early stage (passage 5), at an intermediate stage (passage 15), and in replicative senescence (passage generally between 20 and 25) to analyze the basal profile of immunomodulatory molecules. WJ-MSC were co-cultured with samples from the same two peripheral blood mononuclear cells (PBMC), obtained from healthy platelet donors. PBMC were stimulated with phytohemagglutinin (PHA) for 72 hours and tested against 3 different WJ-MSC to measure suppression of T cell proliferation. The experiments were performed using passages P5 and P10. Analyses were done by real-time PCR, western blot, and flow cytometry. RESULTS: Our results show that gene expression and secretion of immunomodulatory molecules varied among WJ-MSC samples with no specific pattern discernible. In co-culture all WJ-MSC were capable of inhibiting mitogen-activated CD3+ T cell proliferation, although to different extents and each PBMC responded with its unique level of inhibition. In addition, the immunomodulatory profile of each WJ-MSC sample was essentially maintained even after several passages. CONCLUSION: Our results indicate that each WJMSC displays a unique behavior, differing in patterns of cytokine mRNA expression and immunomodulatory capacity. The intrinsic variability between samples may influence the effectiveness of WJ-MSC when employed therapeutically

A eliminação de células-alvo por linfócitos T citotóxicos (CTLs) exerce um papel importante na imunidade protetora contra patógenos e células tumorais, o que pode ser desencadeada pela ação de perforina e granzima, ou pelas interações Fas-FasL. A interação Fas-FasL promove a apoptose pela formação de DISC, que é composto pela cauda citoplasmática de Fas, a proteína adaptadora FADD e a pro-caspase-8. Nesse complexo, a caspase-8 é ativada e induz a clivagem das caspases efetoras -3, -6 e -7, e/ou BID - membro da família Bcl-2, desencadeando o sinal apoptótico. Devido à sua relevância na sinalização apoptótica, a caspase-8 é alvo de inúmeros estudos. Uma correlação entre mutações no gene CASP8 de células tumorais e alta atividade citolítica foi demonstrada, sugerindo que a deficiência em caspase-8 pode representar um mecanismo de evasão imune. Nesse projeto, nosso objetivo foi avaliar o efeito da deficiência em caspase-8 na eliminação de células-alvo por linfócitos T CD8&#43. Para isso, nós estabelecemos uma técnica de citotoxicidade in vitro utilizando blastos de camundongos OTI como células efetoras e células RMA como alvo. Nesse ensaio, as células-alvo foram marcadas e pulsadas com diferentes concentrações de peptídeo OVA e colocadas em co-cultura a diferentes razões efetora: alvo (E:A) com linfócitos OTI, estimulados por 7 dias com ConA e rIL-2. A eliminação específica foi avaliada após 16 horas de co-cultura. Como controle para avaliar a especificidade ao MHC de classe I, utilizamos as células RMA-S, uma vez que expressam níveis reduzidos desta molécula na superfície. Os resultados demonstraram que o ensaio estabelecido é eficiente e antígeno-específico. Foi também observado que a eliminação das células RMA-S é menor em comparação com as células RMA, sendo essa diferença melhor discriminada em condições com números limitados de células efetoras. Para avaliar o efeito da caspase-8, células RMA caspase-8-suficientes e -deficientes, obtidas pela técnica CRISPR-Cas9, foram utilizadas como alvo nesse ensaio. Os resultados demonstram que, em condições com menor número de células efetoras, as células caspase-8-deficientes são significativamente mais resistentes à eliminação por linfócitos T CD8&#43, em comparação com as células caspase-8-suficientes. Portanto, nossos dados corroboram com a ideia de que a deficiência em caspase-8 poderia representar um mecanismo de evasão imune, principalmente na eliminação por linfócitos T CD8&#43. / The killing of target cells by cytotoxic T lymphocytes (CTLs) plays a major role in protective immunity to pathogens and tumor cells, which can be triggered by either the action of perforin and granzymes or FAS-FASL interactions. The Fas-FasL interaction leads to apoptosis through the formation of DISC, which is composed by the cytoplasmic tail of Fas, the adaptor protein FADD and the pro-caspase-8. At the complex, caspase-8 become activated and transduce the apoptotic signal by cleaving the effector caspases-3, -6 and -7 and/or the Bcl-2 family member Bid. Due to its role on apoptotic signaling, caspase-8 is the target of several studies. Recently, it has been demonstrated a correlation between mutations in CASP8 in tumors from patients with high cytolytic activity, suggesting that deficiency in caspase-8 may represent an immune evasion mechanism. Our project aimed to evaluate the effect of caspase-8 deficiency on the elimination of target cells by CD8&#43 T lymphocytes. In order to assess this elimination, we have established an in vitro cytotoxic assay using as effector, blasts from OTI mice, and as target, RMA cells. In this assay, the target cells were labeled, pulsed with OVA peptide at different concentrations and then co-cultured with OTI lymphocytes, which were stimulated with ConA and rIL-2, at different effector: target (E: T) ratios. The specific elimination was evaluated after 16 hours of co-culture. As a control to assess the specificity to MHCI of our assay, RMA-S cells were used because they have reduced levels of MHCI at surface. The results have shown that OTI blasts have effector capacity and that our established assay is antigen-specific. In addition, we observed that RMA-S elimination is reduced in comparison to RMA cells. The difference between RMA and RMA-S is better detected in conditions with limited number of effector cells. In order to assess the effect of caspase-8 in the resistance to elimination by CD8&#43 T cells, caspase-8-sufficient and deficient RMA cells (obtained by CRISPR-Cas9 technique) were used as targets in this assay. Our results demonstrate that caspase-8-deficient cells are more resistant to elimination than wild-type counterparts. This difference is better detected at conditions with reduced number of effector cells. Thus, our data suggests the deficiency in caspase-8 results in lower elimination by CD8&#43 T lymphocytes, suggesting this might represent an immune evasion mechanism.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T14:08:18Z No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Perfil de ativação... 2014 .pdf: 1722380 bytes, checksum: 909bc68a97d8e0a06206d205cd3557f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T14:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Perfil de ativação... 2014 .pdf: 1722380 bytes, checksum: 909bc68a97d8e0a06206d205cd3557f7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / O vírus linfotrópico das células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da mielopatia associada ao HTLV / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP ), que ocorre em menos de 5 % dos indivíduos infectados. A resposta imune controla parcialmente a infecção, porém pode estar ligada a patogênese da doença. O objetivo deste estudo foi caracterizar fenotipicamente as subpopulações de linfócitos T, em pacientes assintomáticos e com diagnóstico de HAM/TSP. Foram avaliados 103 pacientes acompanhados no Centro de HTLV da Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública (EBMSP) e 19 controles não infectados. Os pacientes foram categorizados de acordo com o grau de certeza do diagnóstico de HAM/TSP: possível (Ps), provável (Pb) e definido (D), além de pacientes assintomáticos (ASS). O perfil fenotípico (CD25, CD45RA, CD45RO, HLA-DR, CD25, CCR-7, CD62L) das subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e a expressão da proteína Tax de FoxP3 na subpopulação T CD4+ foram avaliados por citometria de fluxo. A carga proviral do HTLV foi quantificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. As proporções dos linfócitos TCD4+HLA-DR+ e TCD8+HLA-DR foram significativamente maiores nos pacientes com HAM/TSP Ps, Pb e D comparados aos controles não infectados (p=0,003). Comparando-se o grupo de infectados, as proporções de linfócitos TCD4+ e TCD8+ expressando HLA-DR foram significantemente maiores em pacientes com HAM/TSP-Ps e D comparados a pacientes assintomáticos (p<0,0001). Além disso, houve uma correlação positiva entre porcentagem de linfócitos T CD4+ HLA-DR+ e a carga proviral (r=0,5, p=0,0003). As proporções de linfócitos T CD4+CD25+ foram maiores nos pacientes com HAM/TSP D comparados aos controles não infectados. Observou-se um aumento na proporção de células reguladoras (T CD4+FOXP3+) nos indivíduos assintomáticos e nos pacientes com HAM/TSP-D comparados a indivíduos não infectados (p=0,04). A carga proviral HTLV-1 foi maior no grupo de pacientes HAM/TSP-D do que em pacientes assintomáticos (p=0,0001). Observa-se uma diferença estatística entre a proporção de células CD4+TAX+ dos indivíduos assintomáticos (0,26%) e os pacientes HAM/TSP-Ps (5,26%) (p=0,04). Em conclusão, os pacientes com HAM/TSP Ps, Pb e D apresentam um perfil fenotípico de ativação celular, comparados aos controles não infectados. Além disso, os pacientes com HAM/TSP Pb e D apresentam maior expressão de HLA-DR nas subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+, comparados aos assintomáticos, indicando um perfil imunológico semelhante nestes dois subgrupos de pacientes. / The human T-cell lymphotropic vírus type 1(HTLV-1) is the etiological agent of HTLV- associated myelopathy/ Tropical spastic paraparesis(HAM/TSP), wich occurs in less then 5% of the infected individuals. The immune response partially controls the infection, but may be linked to the pathogenesis of disease. The aim of this study was to characterize phenotipically T lymphocyte subpopulations in asymptomatic and in patients diagnosed with HAM/TSP. We evaluated 103 patients treated at the center for HTLV of Bahia School of Medicine and Public Health (EBMSP) and 19 uninfected controls. Patients were categorized as asymptomatic and according to the degree of certainty of the diagnosis of HAM/TSP: Possible(Ps), Probable(Pb) and Definite(D). The phenotypic profile (CD25, CD45RA, CD45RO, HLA-DR, CCR-7, CD62L) subpopulation of CD4+ and CD8+ T Cells and expression of the protein Tax and Foxp3 in the subpopulation CD4+ T cells were evaluated by flow cytometry. The HTLV proviral load was quantified by polymerase chain reaction (PCR) in real time. The proportions of CD4+ and CD8+ expressing HLA-DR+ were significantly higher in patients (p<0.0001). In addition there were a correlation between CD4+ HLA-DR+ or CD8+ HLA-DR+ and the proviral load(R=0,5;p<0,0001). The proportions of CD4+CD25+ were higher in patients with HAM/TSP D compared to infected controls. There was an increased proportion of regulatory cells (CD4+Foxp3+) of asymptomatic individuals and patients HAM/TSP D, compared to the uninfected individuals (p=0.04). . There is a statistical difference between the proportion of CD4+TAX+ asymptomatic individuals (0.26%) patients and HAM/TSP-Ps (5.26%) (p = 0.04 ) . In conclusion, patients with HAM/TSP Ps, Pb and D exhibit a phenotypic profile of cell activation, compared to uninfected controls. In addition, patients with HAM/TSP Pb and D show higher expression of HLA -DR in subpopulations of T lymphocytes CD4+ and CD8+ T cells, compared to asymptomatic, indicating an immunological profile similar in both groups of patients

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Uma das principais causas de falência terapêutica é o surgimento de cepas resistentes aos inibidores da transcriptase reversa (IRT) e da protease (IP). O processo de replicação do vírus HIV – 1 promove alta taxa de mutação devido aos erros inerentes à atividade da transcriptase reversa. Portanto, é comum em indivíduos sob tratamento e com carga viral detectável, o surgimento e seleção de cepas resistentes. O Estado de São Paulo é considerado como um dos epicentros da epidemia de Aids no Brasil, sendo que o município de Santos possui um dos maiores portos da América Latina e devido às rotas de comércio internacional atua como introdutor e difusor do HIV – 1 no sudeste brasileiro, com uma alta incidência de infecção, alta prevalência da resistência antirretroviral primária e de alta prevalência de vírus recombinante B/F. Tem sido também reconhecido que a falência virológica ao tratamento antirretroviral é alta nesta cidade, entretanto, não existem dados recentes e abrangentes a respeito da caracterização genotípica, da freqüência dos subtipos e resistência primária do HIV – 1. O objetivo do estudo foi avaliar os perfis virológico e imunológico e a resistência primária em pacientes virgens de tratamento aos medicamentos antirretrovirais e os fatores relacionados à falência virológica após 48 semanas de HAART nesta população. Foram analisados os prontuários dos pacientes recém diagnosticados e cadastrados no ano de 2000 e 2001, num total de 594 pacientes. Destes pacientes estudados no período citado, apenas 315 realizaram os exames de quantificação da carga viral e a contagem da subpopulações dos linfócitos TCD4+/TCD8+ no momento do seu diagnóstico. Posteriormente dos 315 pacientes foram selecionados 80 virgens de tratamento aos antirretrovirais, para a realização do exame de genotipagem, no qual foram comparados os perfis demográficos do HIV – 1 entre os indivíduos com sucesso virológico versus falência virológica após 48 semanas de iniciação aos antirretrovirais. Os pacientes que realizaram a genotipagem (N=80), foram divididos em dois grupos: Grupo 1 (N=43) são os pacientes que após a introdução do tratamento aos antirretrovirais não conseguiram atingir os níveis de quantificação de carga viral abaixo de 50 cópias/mL, isto é a carga viral se manteve detectável após seis meses de tratamento. Grupo 2 (N=37) são os pacientes que conseguiram se manter com os níveis de quantificação da carga viral, indetectáveis após seis meses de tratamento. Todos os indivíduos estudados iniciaram HAART, sendo que foram considerados aderentes aos antirretrovirais, de acordo com a frequência que obtiveram as suas medicações prescritas pelo médico e a partir de uma farmácia centralizada. O HIV - 1 foi seqüenciado na região pol a partir do plasma em amostras armazenadas a – 80° C, coletadas imediatamente antes do início do tratamento. Ao avaliar os pacientes (N=315) a contagem média das células TCD4+ foi de 320 células/µL. Destes pacientes 98 (31%) tinham TCD4+ menor que 200 células/µL, 69 (22%) TCD4+ entre 200 e 350 células/µL; 57 (18%) TCD4+ entre 350 e 500 células/µL e 91 (29%) com TCD4+ acima de 500 células/µL, mostrando a importância do diagnóstico. Em relação a carga viral a média foi de 180.000 cópias/ml e o “log” médio foi de 4,28. Ainda referente a quantificação da carga viral avaliou-se que 40,2% estavam, acima de 30.000 cópias/mL e 22% maior que 100.000 cópias/mL, indicando uma imunossupressão e mostrando a importância do diagnóstico precoce do vírus HIV-1. A determinação da contagem das subpopulações dos linfócitos TCD4+ e a quantificação da Carga viral do HIV – 1, ambos exames representam a pedra angular no acompanhamento, estadiamento e a avaliação da resposta terapêutica dos antirretrovirais. Deve-se considerar também que a determinação da contagem das subpopulações dos linfócitos TCD4+ é um indicador do estágio evolutivo da doença, bem como o determinante fundamental na terapêutica. Avaliar as condições imunológicas dos pacientes recém diagnosticados, que chegam ao serviço de referência em Aids de Santos, é de grande valia, no momento que inicia o tratamento médico, sendo justificado pelos resultados apresentados, no qual destacamos que 53% dos pacientes tinham contagem de TCD4+ menor que 350 células/µL do total estudado (N=315), indicando uma imunossupressão, mostrando nitidamente a importância do diagnóstico precoce pelo HIV-1, sabendo que, segundo os critérios do Consenso Nacional Brasileiro de tratamento para a infecção pelo vírus HIV -1, os mesmos já deveriam estar fazendo uso de medicações antirretrovirais. Quando analisamos a resistência primária dos pacientes do Grupo 1 (N=43) 21 (48,8%) comparada com o Grupo 2 (N=37) 6 (16,2%), ao longo de 48 semanas concluímos que os pacientes do grupo 1 por apresentarem maior prevalência de mutações relacionadas à resistência aos fármacos antirretrovirais prescritos (p<0,005), eles não conseguiram atingir os níveis de quantificação de carga viral abaixo de 50 cópias/mL, isto é, a carga viral se manteve detectável após seis meses de tratamento até final do estudo. Em relação às classes dos medicamentos antirretrovirais, os pacientes do grupo 1 e 2 apresentaram resistência de 16.2% aos IRTNN; 20% aos IRTN e 2,5% aos IP. Quanto a resistência de pelo menos duas classes de ARVs (IRTNN e IRTN) foram 5% e não foi observado nenhum paciente resistente as três classes de ARVs. Na determinação da prevalência dos subtipos do HIV – 1 baseada nas seqüências do gene pol, a classificação filogenética das seqüências puras foi de 80% do subtipo B e 7,5% F. Quanto as seqüências recombinantes B/F foi de 12,5% mostrando uma preocupação epidemiológica na cadeia de transmissão porque essas cepas recombinantes estão infectando novos indivíduos e predominando nos pacientes recém diagnosticados. Não foram encontradas diferenças significativas basais observadas na carga viral e níveis de TCD4+ com relação aos antirretrovirais utilizados ou a demografia entre os 2 grupos, pacientes portadores de vírus resistentes e tipo selvagem. A prevalência de 33,7% de resistência primária aos antirretrovirais entre os pacientes foi considerada extremamente elevada nesta região, portanto, em regiões atípicas como a cidade de Santos, seria de grande valia apoiar o conceito de realizar exames de genotipagem antes de iniciar o tratamento antirretroviral, fato fundamental, efetivo e econômico para o serviço público, embora alguns indivíduos com resistência primária têm conseguido uma supressão viral empírica sob HAART, a estreita associação entre a resistência primária e falência virológica pode sugerir que essa resistência dificulte gradativamente a atividade dos antirretrovirais. / One of the main causes of therapeutic failure is the appearance of strains resistant to reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) and protease (PI). The process of replication of HIV - 1 promotes high rate of mutation due to errors inherent in the activity of reverse transcriptase. Therefore, it is common in individuals under treatment and with detectable viral load, the appearance and selection of resistant strains. The State of São Paulo is considered one of the epicenters of the AIDS epidemic in Brazil, and the city of Santos has one of the biggest ports of Latin America and because the routes of international trade acts as a diffuser and introducer of HIV -1 in the Southeast Brazil, with a high incidence of infection, high prevalence of primary antiretroviral resistance and high prevalence of recombinant viruses B/F. It has also been recognized that virological failure to antiretroviral treatment is high in this city, however, there are no recent and comprehensive data on the genetic characterization of the frequency of subtypes and primary resistance of HIV–1. The objective of the study was to evaluate the virological and immunological profiles and primary resistance in patients naïve to antiretroviral drugs treatment and the factors related to virological failure after 48 weeks of HAART in this population. We analyzed the charts of newly diagnosed patients registered in 2000 and 2001, as a total of 594 patients. From these patients studied during the period cited, only 315 were tested for quantification of viral load and counts of lymphocyte subpopulations of CD4+T cells/+ TCD8 at the time of diagnosis. Later among the 315 patients were selected 80 naïve to antiretroviral treatment, for the test for genotyping, in which were compared the demographic profiles of HIV-1 among individuals with virological success versus virological failure after 48 weeks of initiation of antiretroviral. Patients in which we performed genotyping (n = 80) were divided into two groups: Group 1 (N=43) are the patients that after the introduction of antiretroviral treatment failed to achieve the quantification levels of viral load below 50 copies/mL, in other words, the viral load remained detectable after six months of treatment. Group 2 (N=37) patients who were able to remain with the quantification of viral load on undetectable levels after six months of treatment. All studied subjects started HAART, which were considered adherent to antiretroviral according to how often they obtained their medications prescribed by a doctor and from a centralized drugstore. The HIV-1 was sequenced in the pol region from plasma samples stored at – 176ºC, collected immediately before starting treatment. When evaluating the patients (N=315) the average cell count CD4+T cells was 320 cells/µL. 98 (31%) of these patients had CD4+T cells below 200 cells/µL, 69 (22%) CD4+T cells between 200 and 350 cells/µL, 57 (18%) CD4+T cells between 350 and 500 cells/µL and 91 (29%) with CD4+T cells above 500 cells/µL, showing the importance of diagnosis. In relation to the average viral load was 180,000 copies/mL and the "log" average was 4.28. Still concerning the quantification of viral load assessed that 40.2% were above 30,000 copies/mL and 22% higher than 100,000 copies/mL, indicating an immunosuppression and showing the importance of early diagnosis of HIV-1. The determination of the counts of lymphocyte subpopulations of CD4+T cells and quantification of viral load of HIV-1, both tests represent a cornerstone in monitoring, staging and assessment of antiretroviral therapeutic response. One should also consider that the determination of the counts of lymphocyte subpopulations of CD4+T cells is an indicator of the stage of the disease, and the decisive role in therapy. To evaluate the immunological conditions of patients newly diagnosed who come to the referral service on AIDS of Santos, is of great value in the moment you start the treatment, being justified by the results presented, in which is highlighted that 53% of patients had counting CD4+T cells below 350 cells/ul from the total studied (N=315), indicating a immunosuppression, showing clearly the importance of early diagnosis of HIV-1, knowing that according to the criteria of the Brazilian Consensus for the treatment of HIV-1 infection, they should already be using antiretroviral medications. When we analyze the primary resistance of the patients in Group 1 (N = 43) 21 (48.8%) compared with Group 2 (N = 37) 6 (16.2%) during over 48 weeks we conclude that group 1 patients, due to higher prevalence of mutations associated with resistance to antiretroviral drugs prescribed (p<0.005), failed to achieve the quantification of viral load below 50 copies/mL, in other words, viral load remained detectable after six months of treatment by the end of the study. Concerning the classes of antiretroviral drugs, patients in group 1 and 2 showed resistance of 16.2% to IRTNN; 20% to IRTN and 2.5% to PI. Regarding the resistance of at least two classes of ARVs (IRTNN and IRTN) were 5% and there was no studied patient resistant to at least two of the three classes of ARVs. In determining the prevalence of subtypes of HIV -1 based on the pol gene sequences, the phylogenetic classification of pure sequences was 80% of subtype B and 7.5% F. As the sequences recombinant B/F it was 12.5% showing a concern in the epidemiological chain of transmission because these recombinant strains are infecting new individuals and are predominant in newly diagnosed patients. No significant baseline differences were observed in viral load and levels of CD4 + T cells regarding the antiretroviral used or the demographics between the 2 groups, patients with resistant virus and patients with the wild type. The 33.7% prevalence of primary resistance to antiretroviral among patients was considered extremely high in this region, so as atypical regions in the city of Santos, would be of great value to support the concept of conducting examinations of genotyping before starting treatment antiretroviral, indeed essential, effective and economical for the public service, although some individuals with primary resistance have achieved an empirical viral suppression under HAART, the close association between primary resistance and virological failure may suggest that this resistance make the activity of antiretroviral gradually difficult. / FAPESP: 2004/15856-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29 / O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença inflamatória crônica pertencente ao grupo das doenças reumáticas autoimunes sistêmicas, caracterizando- se por apresentar as mais variadas manifestações clínicas e laboratoriais. Seu mecanismo exato de etiopatogenia ainda permanece obscuro. Observações prévias avaliando o papel das células TREG CD4+ CD25+ nas doenças autoimunes, em que se tem detectado tanto alterações de freqüência como alterações funcionas e fenotípicas em modelos murinos e humanos, sugerem o papel significante dessa população celular na etiopatogenia da autoimunidade. No LES podemos observar a existência de uma complexa rede de interações que caracterizam a doença, em que muitos alvos para intervenção terapêutica podem ser considerados. Atualmente tem-se voltado bastante a atenção para o estudo das células TREG CD4+CD25+, a fim de que possam ser usadas como alvos potenciais para terapia imunomoduladora. Os dados sobre a freqüência e fenótipo das células TREG publicados ate o momento são controversos devido à heterogeneidade de marcadores fenotípicos e estratégias de análises utilizadas. Um alto nível de células efetoras ativadas contaminam as amostras de células selecionadas de acordo com as estratégias clássicas de identificação de células TREG no LES e este fenômeno é ainda mais acentuado quanto maior o grau de atividade da doença. Assim, o presente projeto pretendeu inicialmente validar uma estratégia de análise capaz de identificar e quantificar células TREG utilizando a combinação dos marcadores CD25 e CD127 associados à expressão de Foxp3 em pacientes com LES em atividade ou fora de atividade. Concluiu-se pelo painel CD4+CD25+/highCD127Æ/low como melhor marcador de células TREG em virtude de sua alta associação com Foxp3 tanto em sadios como em pacientes com LES. Num segundo momento avaliamos a freqüência de células TREG e células Tconvonde observamos níveis normais de células TREG e níveis elevados de células Tconv ativadas em pacientes com doença em atividade. Foi nosso objetivo, também, avaliar a expressão de marcadores fenotípicos importantes para biologia das células TREG. Foi avaliada a expressão dos marcadores: CTLA-4, GITR, PD-1, OX40, HLA-DR, CD95, CD45Ra, CD28, CD40L nas células CD4+CD25+/hiCD127Æ/low, em pacientes com LES em fase ativa e inativa. Avaliamos também a relação entre o balanço de células TREG versus células Tconv expressando estes marcadores mediante o calculo da razão de equilíbrio fenotípico TREG/Tconv. Em pacientes com doença ativa observamos níveis diminuídos de células TREG positivas para as moléculas CTLA-4 e CD28 e níveis elevados de células TREG CD40L+. Quando avaliada a razão TREG/Tconv observamos uma alteração no balanço TREG/Tconv positivas para GITR, HLA-DR, OX40, CD40L e CD45RO. Houve queda na razão TREG/Tconv para os marcadores GITR, HLADR, OX40 e CD45RO e ganho para o marcador CD40L em pacientes com LES quando comparado a controles sadios. Além da caracterização fenotípica ampla, o presente estudo tem um ponto original extra, que consiste na definição da população de células TREG a partir do fenótipo CD4+CD127lowCD25+, que tem se mostrado mais específico que o tradicional fenótipo CD4+CD25high altamente contaminado por células Teff. Estas informações, no futuro, poderiam levar a pistas importantes na busca de alternativas mais eficazes de imunoterapia, capazes de restabelecer os mecanismos normais de tolerância imunológica, evitando ou minimizando assim os danos causados pela resposta autoimune. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic inflammatory disease that is part of the group of rheumatic autoimmune inflammatory diseases, being characterized by heterogeneous clinical and laboratory manifestations. The exact etiopathogenic mechanism underlying SLE still remains obscure. Previousr observations evaluating CD4+ CD25+ TREG cell function in auto-immune diseases detected alterations on frequency and on phenotypic and functional features in murine and human models that support the significant activity of this cell population on autoimmune pathophysiology. In SLE we can observe the existence of a complex interaction network that characterizes the disease, in which many targets for therapeutic intervention may be considered. The present study has focused on TREG cells, since they may represent putative targets for immunomodulatory therapy in this disease. Published data on frequency and phenotype of TREG cells is controversial due to heterogeneity of phenotypic markers and analytic strategies used. The present project aimed to validate an appropriate strategy to identify and quantify TREG in SLE. The CD4+CD25highCD127 low/- panel was validated as an appropriate strategy for identification of Foxp3+ TREG cells in healthy and in SLE patients. The frequency of TREG cells presented normal frequency in active and inactive SLE. In contrast, the frequency of conventional non-regulatory T cells was increased in patients with active disease. We also evaluated the expression of important phenotypic markers for TREG cells biology, including CTLA-4, GITR, PD-1, OX40, HLA-DR, CD95, CD45RO, CD28 and CD40L in patients with active and inactive disease. In addition we evaluated the relationship between the balance of TREG cells versus conventional non-regulatory T cells expressing these markers by means of deriving the TREG/Tconv rate for each surface marker. In patients with active disease we observe reduced levels of TREG cells expressing CTLA-4 and CD28 molecules, and elevated levels of CD40L+ TREG cells. There was an imbalance in TREG/Tconv for GITR, HLA-DR, OX40, CD40L and CD45RO: samples from active SLE patients depicted a decreased TREG/Tconv ratio for GITR, HLA-DR, OX40 and CD45RO and an increased ratto for CD40L when compared with healthy controls. The knowledge on the role of TREG cells in SLE may bring important contribution in devising therapeutic alternatives for this disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:30:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 diana_silva_ioc_mest_2015.pdf: 1327366 bytes, checksum: 52c95c7cbdb04fca5bc7a3e03c0b5ffb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 3 diana_silva_ioc_mest_2015.pdf.txt: 202731 bytes, checksum: 9b39c6a38525112f2bb08a22733cb783 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) diana_silva_ioc_mest_2015.pdf: 1327366 bytes, checksum: 52c95c7cbdb04fca5bc7a3e03c0b5ffb (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Teresina, PI, Brasil / Introdução. Com a utilização em larga escala da terapia antirretroviral combinada em pacientes com HIV/AIDS, tem se observado um aumento da frequência de doenças crônicas e degenerativas, como a insuficiência renal crônica, nesta população. Algumas drogas utilizadas, como o tenofovir, assim como lesões atribuídas à própria infecção são potencialmente nefrotóxicas. Objetivos. O presente estudo tem como objetivo avaliar a prevalência e os fatores associados às alterações renais em pacientes portadores de HIV/AIDS atendidos em um serviço de referência em Teresina, Piauí. Materiais e Métodos. Foi realizado um estudo do tipo transversal, em pacientes com diagnóstico de HIV/AIDS atendidos no ambulatório do Instituto de Doenças Tropicais Natan Portella. Calculou-se uma amostra aleatória de 109 indivíduos, considerando-se uma frequência esperada de alterações renais de 5%, erro de 4% e nível de confiança de 95%. A coleta de dados se deu de março a julho de 2015. Além de exames de rotina, foram realizados exames mais específicos e sensíveis para avaliar a função renal: microalbuminúria na urina isolada, \03B22-microglobulina na urina e fósforo sérico Resultados. Observou-se que 9,2% dos pacientes apresentaram disfunção renal com TFGe < 60 mL/min/1,73m2 e 28,4% dos pacientes tinham alterações renais, definidas por TFGe < 90 mL/min/1,73m2. A frequência de pacientes com níveis alterados de microalbuminúria na urina isolada foi de 21,1% (23/109). A presença de níveis alterados de fósforo sérico foi observada em 40,4% (44/109) e níveis anormais de \03B22-microglobulina foram observados em 24,8% dos pacientes (27/109). Alteração na concentração de \03B22-microglobulina na urina foi associada ao sexo masculino (31,8%), à idade > 60 anos (58,3%) e ao uso do tenofovir (39,4%). Os pacientes com TFGe < 60 mL/min/1,73m2 e os pacientes hipertensos e diabéticos tinham uma média de tempo maior de uso de TARV. Não observamos correlação entre a contagem de linfócitos TCD4 e a taxa de filtração glomerular. Conclusões. Marcadores como a microalbuminúria na urina isolada e a \03B22-microglobulina na urina tem relevância na identificação precoce de pacientes com disfunção renal incipiente / Abstract: Introduction. With the large-scale use of antiretroviral combination therapy in patients with HIV / AIDS, we have observed an increased frequency of chronic and degenerative diseases such as chronic renal failure in this population. Some drugs used, such as tenofovir, as well as lesions attributed to infection itself, are potentially nephrotoxic. Goals. This study aims to evaluate the prevalence and factors associated with kidney abnormalities in patients with HIV / AIDS treated at a reference service in Teresina, Piauí. Materials and methods. One cross-sectional study was conducted in patients with HIV / AIDS treated at the outpatient clinic of the Institute of Tropical Diseases Natan Portella. We calculated a random sample of 109 subjects, considering an expected frequency of kidney abnormalities of 5%, 4% error and reliability level of 95% .The data collection took place from March to July 2015. In addition to routine tests, more specific and sensitive tests were performed in order to assess the renal function: isolated microalbuminuria in urine, \03B22 microglobulin in urine and serum phosphorus Results. We observed that 9.2% of patients had renal dysfunction with eGFR < 60mL/min/1.73m² and 28.4% of patients had mild, mild to moderate or severe kidney abnormalities defined by eGFR < 90ml/min/1.73m². The frequency of patients with altered levels of microalbuminuria isolated in urine was 21.1% (23/109). The presence of altered levels of serum phosphorus was observed in 40.4% (44/109) and abnormal levels of \03B22-microglobulin were observed in 24.8% of patients (27/109). Changes in the concentration of \03B22-microglobulin in urine was associated with male (31.8%), age> 60 years (58.3%) and the use of tenofovir (39.4%). Patients with eGFR <60 ml/min/1.73m² and hypertensive and diabetic patients had a longer usage of ART. There was no correlation between CD4 lymphocyte count and glomerular filtration rate. Conclusions. Markers as microalbuminuria isolated in urine and \03B22-microglobulin in urine are relevance to the early identification of patients with incipient renal dysfunction. Early diagnosis of renal disease in patients with HIV and identification of risk factors is critical to prevent the progression of kidney damage and to the institution of the appropriate treatment

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-26Bitstream added on 2014-06-13T19:15:56Z : No. of bitstreams: 1 frasnelli_sct_me_arafo.pdf: 758242 bytes, checksum: fc10d5e79dcb4b386aacc5d2776f572c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... / Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below)