A sepse é descrita como uma disfunção orgânica ameaçadora à vida secundária à resposta desregulada do organismo a uma infecção, e é responsável por uma alta e crescente taxa de internação hospitalar no Brasil e no mundo. Apesar da diminuição da mortalidade ao longo do tempo, efeitos da doença a longo prazo como infecções secundárias e mortes tardias têm sido observadas. A sepse caracteriza-se pela liberação de mediadores inflamatórios e posterior imunossupressão compensatória, e o distúrbio na homeostase pode causar danos às células e órgãos levando a um estado mais grave da doença. Os linfócitos T reguladores (Tregs) são células responsáveis pela tolerância periférica e modulação de processos inflamatórios e são essenciais na imunossupressão observada na sepse. Este trabalho teve por objetivo estudar a relação entre a atividade imunológica (quantificação de Tregs, monócitos e citocinas inflamatórias) e a susceptibilidade a novas infecções e mortalidade em pacientes sépticos admitidos na Unidade de Emergência do HC-FMRP-USP. Foram incluídos 33 pacientes sépticos e 34 controles saudáveis, entre outubro de 2014 e novembro de 2015. Os pacientes foram acompanhados durante a internação na admissão (D0), D2, D7, D14, D21 e D28, e 12 pacientes retornaram para avaliação pelo menos três meses após a alta. Os pacientes tiveram porcentagens de Treg em linfócitos CD4+ elevados em relação aos controles nos momentos D2 e retorno (p = 0,0004), sendo que no D2 pacientes que desenvolveram complicação infecciosa tiveram porcentagens significativamente menores que os que não desenvolveram complicação (p = 0,0015). Além disso, porcentagens altas de Treg na admissão (D0) correlacionaram-se inversamente com o tempo de internação dos pacientes sobreviventes (p = 0,0271). Valores absolutos de Treg nos pacientes estiveram significativamente elevados no retorno em relação à admissão (p = 0,0074). Pacientes no retorno tiveram maior porcentagem de monócitos CD163+ em relação aos controles (p = 0,036). Pacientes na admissão tiveram menor porcentagem demonócitos HLA-DR+ em relação aos controles e aos pacientes no retorno (p = 0,0057). Pacientes tiveram valores de IL-6, IL-8, IL-10 e ST2 superiores em relação aos controles em diversos momentos da internação e retorno (p < 0,0001, p < 0,0001, p = 0,0030 e p < 0,0001, respectivamente). Valores de ST2 na admissão correlacionaram-se com o escore SOFA (p = 0,0252), tempo de internação (p = 0,0105), presença de complicação infecciosa (p = 0,0356) e mortalidade (p = 0,0114) dos pacientes. Valores de IL-8 na admissão também se correlacionaram com a presença de complicação infecciosa (p = 0,0387). Podemos inferir, portanto, que apesar de uma inflamação exacerbada já na admissão dos pacientes, evidenciada por altos valores de citocinas inflamatórias, há um aumento posterior de células Treg, imunorreguladoras, no D2, e o mesmo foi benéfico em relação à recuperação mais rápida dos pacientes e instalação de uma nova infecção. Porém, a imunossupressão continua sendo exibida mesmo após a alta dos pacientes, como podemos observar com a alta porcentagem de Tregs e monócitos CD163+ e valores de IL-10 nos pacientes em retorno em relação aos controles. Além disso, muitos dos pacientes sobreviventes à primeira internação foram internados novamente, e alguns deles foram a óbito no ano seguinte. / Sepsis is defined by a life-threatening organ dysfunction caused by a dysregulated host response to infection, and it is responsible for a high and increasing rate of hospital admission in Brazil and worldwide. Despite the decrease in mortality over time, long-term disease effects such as secondary infections and late deaths have been observed. Sepsis is characterized by the release of inflammatory mediators and subsequent compensatory immunosuppression, and the homeostasis disorder can cause damage to cells and organs leading to a more severe disease state. Regulatory T lymphocytes (Tregs) are cells responsible for peripheral toleran ce and modulation of inflammatory processes and are essential in the immunosuppression observed in sepsis. This study aimed to investigate the relationship between immunological activity (quantification of Tregs, monocytes and inflammatory cytokines) and susceptibility to new infections and mortality in septic patients admitted to the HC-FMRP-USP Emergency Unit. Thirty-three septic patients and 34 healthy controls were included between October 2014 and November 2015. Patients were followed up at admission (D0) and during hospitalization at D2, D7, D14, D21 and D28, and 12 patients returned for evaluation at least three months after discharge. Patients had higher Treg percentages on CD4 + lymphocytes than had controls at D2 and on return (p = 0.0004), whereas in D2 patients who developed infectious complications had significantly lower percentages than those who did not develop complications (p = 0.0015). In addition, high percentages of Treg at admission (D0) correlated inversely with the length of hospital stay of surviving patients (p = 0.0271). Absolute values of Treg in patients were significantly elevated in the return relative to admission (p = 0.0074). Patients on return had a higher percentage of CD163 + monocytes than controls (p = 0.036). Patients on admission had a lower percentage of HLA-DR+ monocytes than controls and patients on return (p = 0.0057). Patients had higher IL-6, IL-8, IL-10 and ST2 levels than controls at various times ofhospitalization and return (p < 0.0001, p < 0.0001, p = 0.0030 and p < 0.0001, respectively). ST2 values at admission were correlated with SOFA score (p = 0.0252), length of hospital stay (p = 0.0105), presence of infectious complication (p = 0.0356) and mortality (p = 0.0114). IL-8 values at admission also correlated with the presence of infectious complication (p = 0.0387). We can infer, therefore, that despite exacerbated inflammation as soon as at the admission of the patients, demonstrated by high levels of inflammatory cytokines, there is a posterior increase of immunoregulatory Treg cells at D2, and that was beneficial in relation to the faster recovery of the patients and setting up of new infection. However, immunosuppression continues to appear even after discharge of patients, as can be observed with the high percentage of CD163 + monocytes, Tregs and L-10 levels in patients on return compared to controls. In addition, many of the patients surviving the first hospitalization were hospitalized again, and some of them died the following year.

Com o objetivo de avaliar a evolução clínica, a persistência da infecção e a resposta imune humoral e celular, sete cães adultos desprovidos de anticorpos anti-Ehrlichia canis foram inoculados com E. canis e acompanhados durante vinte semanas. Três cães permaneceram como controle. Exame físico diário e avaliação laboratorial (hemograma, bioquímica sanguínea, fragilidade osmótica eritrocitária, teste de Coombs, teste de redução de tetrazólio nitroazul), reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisa de anticorpos anti-E. canis (IFI) e quantificação dos linfócitos T CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo foram realizados, em diferentes momentos, durante o período de observação. A infecção foi comprovada pela presença de mórulas em linfócitos/monócitos no sangue circulante, soroconversão, com títulos de anticorpos entre 1.280 a 20.480 e a reação positiva ao PCR. Febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, trombocitopenia, anemia não regenerativa, aumento das atividades séricas de ALT, AST e FA, foram as principais alterações clínicas e de patologia clínica observadas, com pico máximo entre 21 e 28 dias. Também nesses momentos foram observados o aumento de linfócitos T CD8+ e a diminuição dos linfócitos T CD4+. O aumento do metabolismo oxidativo dos neutrófilos, quando estimulados, entre o 28&ordm; e 35&ordm; dia p.i., o aumento de reticulócitos na circulação sanguínea nessa ocasião, a redução dos linfócitos T CD4+ e o aumento de linfócitos T CD8+ indicaram a resposta do hospedeiro, na tentativa de eliminar a infecção. No auge da infecção entre o 21&ordm; e 49&ordm; dia p.i., houve a inversão da relação CD4:CD8, principalmente o aumento dos linfócitos T CD8+. A fragilidade osmótica eritrocitária manteve-se inalterada, bem como o teste de Coombs, comprovando não ter ocorrido a hemólise imunomediada. Nos cães infectados não foram detectados a presença de anticorpos IgM anti-E. canis em nenhum momento de observação. O aumento de reticulócitos na circulação sanguínea a partir do 28&ordm; dia p.i. sugere ser temporária a supressão da atividade eritropoética. O baixo número de linfócitos T CD4+, coincidindo com a esplenomegalia e a PCR positiva até a vigésima semana p.i., sugere a relação entre a persistência da infecção, com a localização esplênica de E. canis e ativação de um mecanismo de escape pelo microrganismo, representado pelo baixo limiar de ativação de linfócitos T CD4+. Por outro lado, o aumento de linfócitos T CD8+ no auge da infecção coincidindo com a melhora clínica, sugere o envolvimento do mecanimo de citotoxicidade na patogenia da erliquiose canina. O bloqueio parcial da atividade dos linfócitos T CD4+, constitui-se provavelmente em um dos mecanismos de escape da E. canis, enquanto a contínua liberação de TNF-&alpha; pelas células citotóxicas, como parte do mecanismo do hospedeiro para a eliminação do parasita pode resultar na pancitopenia terminal observado freqüentemente nos cães cronicamente infectados por E. canis. / The clinical evolution, the persistence of infection and humoral and cellular immune response were evaluated on seven adult naïve dogs experimentally inoculated with an E. canis strain and followed during 20 weeks. Three dogs were remained as control. Daily clinical evaluation and laboratorial exams (hematological, biochemistry, erythrocyte osmotic fragility, Coombs´ test, neutrophils oxidative metabolism by nitroblue tetrazolium reduction test), polymerase chain reaction assay (PCR), anti-E. canis antibodies detection by indirect immunofluorescence assay (IFA) and quantification of CD4+ and CD8+ T lymphocytes by flow cytometry technique were evaluated, at different moments during all the experimental period. The presence of E. canis morulae, seroconversion with high antibodies titers (1,280 to 20,480) and positive PCR had confirmed the infection in all the inoculated animals. Fever, splenomegaly, lymphadenomegaly, thrombocytopenia, non-regenerative anemia and increase on liver´s enzymes serum activity (ALT, AST and ALP) were the main clinical and laboratorial changes observed, with the highest point between days 21 and 28 post-infection (p.i.). Also at these moments were observed increase of CD8+ T lymphocytes and reduction of the CD4+ T lymphocytes. The increase in the stimulated neutrophils oxidative metabolism between days 28 and 35 p.i., and the increase of reticulocytes in the same period, allied to the reduction of the CD4+ T lymphocytes and the increase of CD8+ T lymphocytes, indicated the host´s immune response in the attempt to eliminate the infection. On the peak of the infection, from the 21st to the 49th post-infection day, there was an inversion in the CD4:CD8 ratio of blood lymphocytes, mainly caused by increase of the CD8+ T lymphocytes. There was no variation on erythrocyte osmotic fragility and Coombs? test results, which suggested the absence of immune-mediated hemolysis. It wasn´t detected any anti-E. canis IgM antibodies in the infected group of dogs. The increase of reticulocytes only from the 28th post-infection day suggests a temporary erythropoietic suppression. The low number of CD4+ T lymphocytes, coinciding with the splenomegaly and the positive PCR until the twentieth week p.i., suggest that there is a relation between the persistent infection, the splenic localization of E. canis and an evasion mechanism, represented for the low threshold of activation of CD4+ T lymphocytes. On the other hand, the increase of CD8+ T lymphocytes in the peak of infection, coinciding with clinical improvement, suggests the involvement of the cytotoxicity mechanism on canine ehrlichiosis pathogenesis. The partial blockage of CD4+ T lymphocytes activity could probably be one of the E. canis escape mechanisms, while the continue TNF-&alpha; release by host´s cytotoxic cells, as a mechanism to eliminate the parasite, could result in terminal pancytopenia commonly observed in dogs chronically infected with E. canis.

Um mecanismo de tolerância periférica estudado é mediado por células T reguladoras (Tregs) que expressa o marcador CD25 e o fator de transcrição FoxP3. Estudamos o papel das Tregs nos fenômenos de imunossupressão na resistência e susceptibilidade genética dos hospedeiros contra o fungo. Animais A/J e B10.A foram depletados de células CD25 e outro grupo recebeu Ig de rato. Na 2ª semana de infecção, a depleção de células CD25 resultou em doença menos grave em ambas as linhagens com intenso afluxo de linfócitos T e macrófagos somente nos animais A/J. Na 10ª semana, a depleção de células CD25 também resultou em doença menos grave com aumento dos níveis de citocinas em ambas as linhagens. Neste período, entre os grupos controle, somente os animais A/J apresentaram aumento de linfócitos T e macrófagos. Em conclusão, os animais A/J apresentaram aumento da ativação da resposta imune enquanto que animais B10.A não desenvolveram eficiente ativação da resposta adaptativa mas que podem ter apresentado uma imunidade inata mais eficiente no controle do crescimento fúngico. / A mechanism for studying peripheral tolerance is mediated by regulatory T cells (Tregs) expressing the marker CD25 and the transcription factor FoxP3. We studied the role of Tregs in the mechanism of immunosuppression in genetic susceptibility and resistance of host against the fungus. A/J and B10.A mice were depleted of CD25 and control group received rat Ig. In the second week post infection, the depletion of CD25 cells resulted in low severity of disease in both mouse strains, with an intense influx of T lymphocytes and macrophages only in A/J. At 10 weeks, the depletion of CD25 also resulted in low severity disease with increased levels of cytokines in both mouse strains. Moreover, between the control group, only A/J mice showed an increase of T lymphocytes and macrophages. In conclusion, A/J mice showed increased activation of the immune response, whereas B10.A mice that had not developed efficient activation of the adaptive immune response, but that probably had an innate immunity that was more effective in controlling fungal growth.

O presente estudo discute o papel dos miRNAs na fisiopatologia molecular de Esclerose Múltipla Recorrente Remitente (EMRR). O estudo demonstrou que em linfócitos T CD4+ de pacientes com EMRR em surto ocorre a diminuição da expressão do miR-15a e do miR16-1 em contraposição ao aumento de seu gene alvo BCL-2, um importante gene regulador da apoptose. Esses achados sugerem a participação desses miRNAs no controle da apoptose na EM. Para explorar essa associação, foi analisado a expressão global de miRNAs nas subpopulações de linfócitos T de pacientes com EMRR no estágio de remissão. O resultado dessa análise determinou de forma inédita o aumento significativo da expressão de 9 miRNAs (miRNAs-16, miRNAs-20a, miRNAs-21, miRNAs-24, miRNAs-155, miRNAs-221, miRNAs-222, miRNAs-720 e miRNAs-1281) nos linfócitos T CD8+ de memória central. A análise in silico dos alvos desses miRNAs indicou que três vias canônicas, relacionadas à ativação da apoptose, eram enriquecidas com alvos preditos e validados experimentalmente desses miRNAs. Desse modo sugerimos a forte relação desses miRNAs no controle da apoptose nos linfócitos T dos pacientes com EMRR. A fim de aprofundar nossos estudos, selecionamos os miRNAs miR-21 e miR-24, para a realização de experimentos funcionais in vivo. Foi verificada a indução da expressão miR-21 somente nos linfócitos T CD4+ de modelo experimental da EM. Adicionalmente, experimentos in vitro demonstraram que a expressão do miR-21 e restrita as populações de células Th2 e Th17. Nesse caso, miR-21 parece ser regulado pelo fator de transcrição STAT3, sugerindo assim que o aumento da expressão do miR-21 verificada no modelo animal possa estar relacionada com a presença de linfócitos T CD4+ de perfil Th17 nesse tecido. Em resumo, o conjunto desses resultados demonstra a relevância dos miRNAs na fisiopatologia da EMRR, principalmente no controle da apoptose. / This study discusses the role of miRNA in the Molecular Pathophysiology of Relapse Remitting Multiple Sclerosis (RRMS). The study has shown that CD4+ lymphocytes from relapsed RRMS patients had lower expression of miR15a and miR-16-1 in contraposition of higher expression of the target gene BCL-2, a key regulator of apoptosis. These findings suggest the role of those on the control of apoptosis in MS. In order to explore this association, the global expression of miRNAs was analysed in T lymphocyte subpopulations from remission RRMS patients. The result of this analysis has demonstrated for the first time a significant higher expression of 9 miRNAs (miRNAs-16, miRNAs-20a, miRNAs-21, miRNAs-24, miRNAs-155, miRNAs-221, miRNAs-222, miRNAs-720 e miRNAs-1281) in central memory T CD8+ lymphocytes. In silico analysis of the miRNAs targets indicates that three canonical pathways related to the activation of apoptosis were enriched with predicted and experimental validated gene targets for those miRNAs. In this way, we suggest the strong relation of these miRNAs in the control of apoptosis in the lymphocytes from RRMS patients. In order to intensify our studies we selected miR-21 and miR-24 to perform in vivo functional experiments. It was verified miR-21 induction only in T CD4+ lymphocytes from MS animal model. Additionally, in vitro experiments have demonstrated that miR-21 expression was restricted to Th2 and Th17 cell populations. In this way, miR-21 seems to be regulated by the STAT3 transcription factor, thereby suggesting that the increase of miR-21 expression observed in vivo could be related with Th17 CD4+ present in this tissue. In summary, this set of results showed the relevance of miRNAs in the RRMS pathophysiology, mainly in the control of apoptosis.

O presente trabalho refere-se ao estudo do papel dos microRNAs no controle pós-transcricional das células T de camundongos Non Obese Diabetic (NOD) modelo que reproduz o diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). Durante o desenvolvimento do trabalho, procurou-se esclarecer a hipótese de que os microRNAs controlam os níveis de determinados RNAs mensageiros (mRNAs) das células T durante a indução ou perda de tolerância imunológica. Portanto, a expressão alterada dos microRNAs estaria contribuindo com o processo da autoimunidade. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar os perfis de expressão e as redes de interação entre um conjunto de microRNAs e seus respectivos mRNAs alvos nos timócitos e nos linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) em camundongos NOD. Para avaliar a expressão de genes codificadores de mRNAs, sendo estes possíveis alvos de microRNAs, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Acreditase que fenômenos complexos como a regulação pós-transcricional de células T e seu envolvimento no processo de tolerância imunológica, bem como o surgimento de doenças autoimunes, podem ser melhor compreendidos por meio da genômica funcional. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). As diferenças nos perfis transcricionais encontradas envolvem expressão de genes (mRNAs) relacionados diretamente ao sistema imune, a diferenciação e ativação de linfócitos T e a apoptose, bem como a outros processos relacionados a resposta imune. Além disso, as redes de interação microRNA-mRNA encontradas no presente trabalho evidenciam interações já conhecidas e apresentam novas interações, mostrando a participação de um grupo de microRNAs que estão atuando no controle pós-transcricional do diabetes do tipo 1 em camundongos NOD, contribuindo com a melhor compreensão do controle genético-molecular das doenças autoimunes, principalmente do diabetes do tipo 1. / This study refers to the role played by microRNAs in the post-transcriptional control of T cells from non obese diabetic (NOD) mice model which reproduces the type 1 diabetes (T1D). During the study, it was tried to clarify the hypothesis that microRNAs control certain messenger RNAs (mRNAs) levels of the T cells during the induction or loss of immunological tolerance. Therefore, the altered expression of microRNAs might be contributing to the process of autoimmunity. Thus, the study aim was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1diabetes (T1D) in NOD mice. The microarray technology was used to evaluate the expression of mRNAs as possible targets of microRNAs involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. It was realized that complex phenomena as post-transcriptional regulation in T cells and their involvement in the immune tolerance process, as well as the emergence of autoimmune diseases can be better understood only by means of functional genomics. The results show differential expression of mRNAs and microRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1 diabetes (T1D). The differences found in the transcriptional profiles involve mRNAs related to the immune system, differentiation and activation of T lymphocytes and apoptosis as well as other processes related to immune response. In addition, the microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study evidence the predicted interactions as well as new ones, showing the participation of a group of microRNAs that may be acting in post-transcriptional control of type 1 diabetes in NOD mice contributing to a better understanding of the molecular genetic control of autoimmune diseases in specially type 1 diabetes.

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T10:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Longhi_LarissaNaraAlegrini_D.pdf: 4091504 bytes, checksum: 149e4a062c177377d07fb66598d14e85 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Pesquisas recentes têm demonstrado a importância da resposta imune inata no controle da resposta adaptativa. Em estudo anterior pudemos demonstrar que as células Natural Killer (NK) participam da resposta imunológica ao Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM). Atualmente sabe-se que células dendríticas (DCs) são capazes de interagir com células NK, aumentando a sua atividade. O objetivo deste trabalho foi avaliar o mecanismo utilizado pelas células NK no reconhecimento de células leveduriformes de P. brasiliensis e, se DCs estimuladas pelo fungo são capazes de interagir com células NK e por conseguinte influenciar a diferenciação de linfócitos T. Foram utilizadas DCs derivadas de monócitos e células CD56+ (NK) isoladas do sangue periférico de indivíduos saudáveis. A análise do papel dos receptores do tipo toll (TLR-2 e TLR-4) e do receptor de complemento 3 (CR3 - CD11b) no reconhecimento do P. brasiliensis pelas células NK demonstrou que este último receptor é provavelmente mais importante, uma vez que o seu bloqueio diminuiu a ativação e a atividade citotóxica direta das células NK contra o fungo. Enquanto que o TLR2, em conjunto com o CR3 leva à produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Além disso, nossos resultados demonstraram que DCs estimuladas com o fungo são ativadas e produzem citocinas importantes para a ativação de células NK (IL-12, IL-18, IL-23 e IL-15). Células NK estimuladas com essas citocinas ou cocultivadas com DCs (previamente estimuladas com leveduras do fungo) apresentam maior capacidade de proliferação, aumento na expressão de marcadores de ativação (CD25 e CD69), aumento na capacidade fungicida e aumento da produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Esses efeitos foram parcialmente dependentes de contato, provavelmente envolvendo a participação de IL-15 associada à membrana das DCs, e também à produção de citocinas solúveis (IL-12, IL-23 e IL-18) pelas DCs. Por outro lado, a interação entre células NK e DCs leva estas últimas a aumentarem a expressão de moléculas coestimulatórias (CD80 e CD86) e de moléculas de MHC de classe II, importantes para a apresentação de antígenos aos linfócitos T. Também pudemos observar que a interação entre DCs estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis e células NK levam a diferenciação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IFN-gama, ao mesmo tempo inibindo a diferenciação de linfócitos T produtores de IL-4. Em conjunto nossos resultados demonstraram que a interação entre DCs e células NK estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis leva a um aumento tanto da ativação das DCs quanto das células NK, e que essa interação pode ser importante para modular a resposta imunológica adquirida subsequente / Abstract: Several studies have shown that the innate immune response presents a fundamental role in controlling the adaptive immune response. In a previous study we demonstrated that natural killer cells (NK) participate in the immune response to Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). Currently it is known that dendritic cells (DCs) are able to interact with NK cells, increasing its activity. The objective of this study was to evaluate the mechanism used by NK cells in the recognition of P. brasiliensis yeast cells and, whether DCs stimulated by the fungus are able to interact with NK cells and therefore influence the differentiation of T lymphocytes. We used DCs derived from monocytes and CD56 + (NK) cells isolated from peripheral blood of healthy individuals. We analyzed the role of some toll-like receptors (TLR-2 and TLR-4) and the complement receptor 3 (CR3 - CD11b) in the recognition of P. brasiliensis NK cells. Our results showed that the CR3 is probably more important, since that its blockage decreased the activation and the direct cytotoxic activity of NK cells against the fungus. Furthermore, activation via TLR2, together with CR3, leads to the production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. Moreover, our results demonstrated that DCs stimulated with the fungus are activated and produce cytokines important for the activation of NK cells (IL-12, IL-18, IL-23 and IL-15). NK cells stimulated with these cytokines or co-cultured with DCs (previously stimulated with yeast cells) presented greater capacity for proliferation, increased expression of activation markers (CD25 and CD69), increased fungicide capacity and increased production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. These effects were partially dependent on contact, probably involving the participation of membrane associated IL-15, and also the production of soluble cytokines (IL-12, IL-23 and IL-18) by DCs. In addition, the interaction between NK cells and DCs leads to an increased expression of molecules important for the antigen presentation to T cells, such as costimulatory molecules (CD80 and CD86) and class II MHC on DCs. We also observed that the interaction between DCs (stimulated with the fungus) and NK cells increased the differentiation of T CD4+ and T CD8+ cells into IFN-gamma producing lymphocytes, while inhibited the differentiation of IL-4 producing T lymphocytes. Altogether our results demonstrate that the crosstalk between DCs and NK cells stimulated with P. brasiliensis yeast cells leads to an increased activation of both DCs and NK cells, and that this interaction can be important for modulating the subsequent acquired immune response against the fungus / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-19T15:00:56Z No. of bitstreams: 1 Ana Paula de Souza Mernick.pdf: 747300 bytes, checksum: 7cec9bdaa4c2bd9e6dfcc62d9bfdbd12 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T15:00:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Paula de Souza Mernick.pdf: 747300 bytes, checksum: 7cec9bdaa4c2bd9e6dfcc62d9bfdbd12 (MD5) Previous issue date: 2014-12-16 / Periodontitis is an infectious disease characterized by the destruction of the supporting tissues of the teeth and therefore the dental loss. Neutrophils are the first cells to arrive in periodontal inflammation and have as function phagocytosis and cytokine release. After a few days, the neutrophils are replaced by lymphocytes, which give the chronic nature of periodontitis. The established treatment for periodontitis is oral hygiene care, scaling and root planing, and in more advanced cases, there may be the need for systemic antibiotics. In order to reduce the prescription of antibiotics, it has been researched the use of photodynamic therapy (PDT) as antimicrobial intervention, with great results. The objective of this work is to verify if the PDT interferes with the chemotaxis of neutrophils and T lymphocytes into the periodontal tissue. For such, 05 patients who had undergone prior treatment with periodontal good oral hygiene and periodontal pockets with residual surgical indication were allocated. PDT was applied under the following parameters: methylene blue (50 µg/ml) was applied to the bottom of the periodontal pocket and after 5 minutes, via transmucosal, was irradiated with diode laser 660 nm, P = 100 mW, t = 90 s per point 9 J/point, energy density: 22 J/cm2, power density: 250 mW/cm2. One week after PDT, the surgical removal of the periodontal pockets was performed and the samples sent for routine histology and immunohistochemistry for detection of neutrophil and lymphocyte. The samples were photographed and positive cells counted with the aid of ImageJ software. The data were evaluated statistically and no significant difference between groups (Mann-Whitney p = 0.5). It was concluded that PDT did not interfere with the chemotaxis of neutrophils and T lymphocytes in the periodontal tissue after 7 days. / A periodontite é uma doença infecciosa caracterizada pela destruição dos tecidos de suporte dos dentes e consequentemente à perda do elemento dental. Os neutrófilos são as primeiras células a chegar ao processo inflamatório periodontal e têm como função fagocitose e liberação de citocinas. Após alguns dias os neutrófilos vão sendo gradualmente substituídos por linfócitos, que dão o caráter crônico da periodontite. O tratamento estabelecido para a periodontite é a orientação de higiene oral, raspagem e alisamento radicular e em casos mais avançados, pode haver a necessidade de antibioticoterapia sistêmica. No sentido de reduzir a prescrição de antibióticos, tem-se pesquisando o uso da terapia fotodinâmica (PDT) como intervenção antimicrobiana, com ótimos resultados. Assim, o objetivo deste trabalho é verificar se a PDT interfere na quimiotaxia de neutrófilos e linfócitos T no tecido periodontal. Para tal, foram alocados 05 pacientes que passaram por tratamento periodontal prévio com boa higiene oral e presença de bolsas periodontais residuais com indicação cirúrgica. A PDT foi aplicada nos seguintes parâmetros: azul de metileno (50 µg/mL) aplicado no fundo da bolsa periodontal e após 5 minutos foi irradiado via transmucosa com laser de diodo, 660 nm, P= 100 mW, t= 90 s por ponto, 9 J/ponto, densidade de energia: 22 J/cm2, densidade de potência: 250 mW/cm2. Uma semana após a PDT foi realizada remoção cirúrgica das bolsas e as amostras encaminhadas para processamento histológico de rotina e imunohistoquímica para detecção de neutrófilos e linfócitos T. As amostras foram fotografadas e as células positivas contadas com auxílio do software ImageJ. Os dados foram avaliados estatisticamente e não houve diferença significativa entre os grupos (Mann-Whitney p= 0,5). Conclui-se que a PDT não interfere na quimiotaxia de neutrófilos e linfócitos T no tecido periodontal após 7 dias.

INTRODUÇÃO: A atuação do sistema nervoso parassimpático em células imunes é conhecida como \"Via Anti-inflamatória Colinérgica\". Trabalhos prévios demonstraram que a estimulação vagal reduz a inflamação e melhora a sobrevida em modelos experimentais com sepse. Neste estudo avaliamos se o uso do anticolinesterásico piridostigmina: altera o número de linfócitos T (CD4+ e CD8+) convencionais (CD25+Foxp3-) e reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico, no baço e no miocárdio; modifica a concentração de citocinas (interleucina 1, interleucina 6, TNFalfa) no miocárdio; e influencia a função ventricular após infarto agudo do miocárdio experimental (IAM) em ratos. MÉTODOS: Utilizamos ratos machos adultos da linhagem Wistar, com peso variando entre 200 e 250 g, divididos em 3 grupos de 20 animais cada: grupo controle (GC), grupo infartado sem tratamento (IC) e grupo infartado tratado com piridostigmina (IP). O infarto agudo do miocárdio (IAM) foi obtido com a técnica da ligadura da artéria coronária esquerda, e o grupo IP recebeu piridostigmina na dose de 40mg/kg/dia na água de beber, iniciada 4 dias antes do IAM. Todos os animais foram submetidos à canulação da artéria femoral no dia seguinte ao IAM para registro das curvas de pressão arterial, e posterior análise dos componentes da variabilidade da freqüência cardíaca (VFC), domínio do tempo (SDNN e RMSSD) e da freqüência (componentes LF e HF); o estudo ecocardiográfico foi realizado no segundo dia pós IAM. No terceiro dia pós IAM, os ratos foram divididos em subgrupos de 10 animais, e sacrificados de forma específica para coleta de materiais: 500 ul de sangue periférico e baço fresco para realização da técnica de citometria de fluxo; ventrículo esquerdo para dosagem de citocinas pela técnica de ELISA; e ventrículo esquerdo para realização de imunohistoquímica. Foram usadas as técnicas padronizadas e de uso corrente nos laboratórios. Os resultados foram avaliados por análise de variância (ANOVA) multifatorial, usando o programa GraphPad Prism com teste post hoc de Tukey. RESULTADOS: O grupo IC comparado ao grupo controle apresentou queda significativa da pressão arterial e aumento da freqüência cardíaca. O grupo IP, comparado ao grupo IC, apresentou maior atividade vagal, caracterizada pela significante redução da FC e aumento da VFC (SDNN, 9,2±1,5 vs 5,2±0,5 p < 0,05). Os parâmetros ecocardiográficos avaliados evidenciaram presença de área hipo/acinética e redução da fração de ejeção do ventrículo esquerdo nos grupos infartados, de igual magnitude. Com relação ao número de linfócitos T, verificamos que o grupo IC, comparado ao grupo controle, apresentou número significativamente menor de linfócitos reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico (CD4+: 63,5 ±1,4 vs 70,6 ±3,2%, e CD8+: 68,3 ±1,9 vs 76,1 ± 2,8%). O grupo IP, comparado ao grupo IC, apresentou significativa redução do número de linfócitos T convencionais no sangue periférico (respectivamente, CD4+: 1,5 ±0,2 vs 2,2 ± 0,2 %; CD8+: 1,1 ± 0,1 vs 1,8 ± 0,9%), e no baço houve redução somente do tipo CD4+ (respectivamente, 1,4 ± 0,2 vs 2,2 ± 0,2%), com aumento do tipo CD8+ (respectivamente, 1,2 ± 0,1 vs 0,7 ± 0,1 %). O grupo IP também apresentou significativo aumento de linfócitos reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico (respectivamente, CD4+: 76,5 ± 2,9 vs 63,5 ± 1,4 %; CD8+: 75,1 ± 1,0 vs 68,3 ± 1,9 %), e não apresentou diferenças significativas no número dessas células no baço. O grupo IC comparado ao grupo controle apresentou significativa marcação de anticorpos para CD4 e CD8 nas áreas infartada e peri-infarto por meio da análise de imunohistoquímica. O grupo IP comparado ao grupo IC, apresentou significativo aumento de CD4+ (respectivamente, 20,9 ± 6,5 vs 12,2 ± 2,5, p < 0,05) e de CD8+ (respectivamente, 17,9 ± 2,8 vs 5,8 ± 1,1%, p < 0,05) na área infartada; observamos redução significativa na marcação de CD4+ (respectivamente, 6,0 ±1,2 vs 12,5 ±4,8) na área peri-infarto, sem alterações significativas na marcação de CD8+. CONCLUSÃO: O tratamento com piridostigmina em ratos com IAM está associado a aumento da atividade vagal, aumento do número de linfócitos reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico e maior mobilização de células inflamatórias (CD4+ e CD8+) para a área infartada no miocárdio, com redução de CD4+ na área peri-infarto, no entanto sem mudança de CD8+ nesta região. A mudança do perfil inflamatório decorrente do aumento da atividade vagal na fase aguda do IAM, pode ser um possível mecanismo para explicar os benefícios detectados no remodelamento cardíaco após o IAM, em especial, na redução da área de lesão e na melhora da função ventricular, com uso de anticolinesterásicos / INTRODUTION: The role of the parasympathetic nervous system in immune cells is known as \"Cholinergic anti-inflammatory pathway\". In previous work has demonstrated that vagal stimulation reduces inflammation and improves survival in experimental sepsis models. The aim of the present study evalued the use of anticholinesterase pyridostigmine: change the number of T lymphocytes (CD4+ and CD8+) conventional (CD25+Foxp3-) and regulatory (CD25+Foxp3+) in peripheral blood, spleen, and myocardium: modifies the concentration of cytokines (interleukin-1, interleukin-6, TNFalfa) in the myocardium, and influences ventricular function after experimental myocardial infarction (MI) in rats. METHODS: Adult male rats of Wistar strain, weighing between 200 and 250 g were divided into 3 groups of 20 animals each: control group (GC); untreated group without treatment (IC) and infarcted group treated with pyridostigmine (IP). Acute myocardial infarction (AMI) was obtained with the technique of ligation of the left coronary artery, and the IP group received pyridostigmine dose of 40 mg/Kg/day in drinking water starting 4 days before the AMI. All animals underwent cannulation of the femoral artery on the day following AMI to record the blood pressure curves, and subsequent analysis of the components of heart rate variability (HRV), the time domain (SDNN and RMSSD) and frequency (components LF and HF), the echocardiografic study was performed on the second day after AMI. On the third day post-MI, mice were divided into subgroups of 10 animals, and were sacrificed in order to collet specific materials: 500 ul of fresh peripheral blood and spleen technique for performing flow cytometry left ventricle for measurement of cytokine ELISA, and the left ventricle to perform immunohistochemistry. Techniques used were standardized and commonly used in laboraties. The results were evaluated by analysis of variance (ANOVA) multifactorial, using the GraphPad Prism with Tukey post hoc test RESULTS: The HF group compared to the control group showed a significant drop in blood pressure and increased heart rate. The IP group compared to the IC group showed higher vagal activity, characterized by a significant reduction in HR and increase HVR (SDNN, 9.2 ± 1.5 vs 5.2 ± 0.5, p < 0.05). The echocardiography parameters evaluated showed presence of area hypo/acinetic and reduced ejection fraction of the left ventricle in infracted groups of equal magnitude. Regarding the number of T lymphocytes, we found that the IC group compared with the control group showed significantly fewer lymphocytes regulators (CD25+Foxp3+) in peripheral blood (CD4+:63.5 ± 1.4 vs 70.6 ± 3.2% and CD8+ cells: 68.3 ± 1.9 vs 76.1 ± 2.8%). The IP group compared to the IC group showed a significant reduction in the number of conventional T lymphocytes in peripheral blood (CD4+:1.5 ± 0.2 vs 2.2 ± 0.2%; CD8+: 1.1 ± 0.1 vs 1.8 ± 0.9%) and was reduced only in the spleen of the type CD4+(1.4 ± 0.2 vs 2.2 ± 0,2%) with increased CD8+(1.2 ± 0.1 vs 0.7 ± 0.1%). The IP group also showed a significant increase of lymphocytes regulators (CD25+Foxp3+) in peripheral blood (CD4+: 76.5 ± 2.9 vs 63.5 ± 1.4%; CD8+:75.1 ± 1.0 vs 68.3 ± 1.9%), and no significant differences in the number of these cells in the spleen. The IC group compared to the control group showed significant labeling antibodies to CD4 and CD8 areas infarcted and peri-infarction by immunohistochemical analysis. The IP group compared to the IC group showed a significant increase in CD4 (20.9 ± 6.5 vs 12.2 ± 2.5, p < 0.05) and CD8 (17.9 ± 2.8 vs 5.8 ± 1.1%, p < 0.05) in the infarcted area, and we observed a significant reduction in the labeling of CD4 (6.0 ± 1.2 vs 12.5± 4.8) in the peri-infraction without significant changes in the marking of CD8. CONCLUSION: The treatment with pyridostigmine in rats with acute myocardial infarction is associated with increased vagal activity, increased number of regulatory lymphocytes (CD25+Foxp3+) in peripheral blood and increased mobilization of inflammatory cells (CD4 and CD8) to the infarcted myocardium, with reduction of these cells in the peri-infarction. The change of the inflammatory profile due to increased vagal activity may be a possible mechanism to explain the benefits in the evolution of myocardial infarction, especially in the improvement of cardiac remodeling and maintenance of ventricular function with anticholinesterase drugs

Introdução: O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune multissistêmica de etiologia complexa que envolve fatores ambientais, genéticos e hormonais. É caracterizada pela produção de autoanticorpos e mediadores inflamatórios, ativação e proliferação de células T autorreativas e perda da autotolerância imunológica. Em pacientes com LES, a expressão do receptor primário de ativação CD69 é aumentada e a de células T supressoras/reguladoras (Treg) CD4+CD25+FoxP3+ é reduzida. O CD69 é essencial para ativação de células T CD4 autorreativas enquanto que as células Treg são importantes na manutenção da autotolerância. Desta forma, células T tem um papel central na patogênese do LES, mas os mecanismos implicados na falência da autotolerância ainda não são elucidados, destacando a importância de estudos em modelos experimentais da doença, como o de LES-induzido por pristane. Objetivo: Quantificar células T CD4+CD69+ ativadas e Treg CD4+CD25+FoxP3+ no sangue, baço e LP de camundongos Balb/c LESinduzido por pristane no sentido de avaliar a falência de autotolerância neste modelo. Métodos: Analisamos 84 camundongos Balb/c fêmeas: 52 receberam por via intraperitoneal uma dose única de 0,5 ml de pristane e 32 a mesma dose de salina. Amostras de sangue, baço e LP dos camundongos eutanasiados foram coletadas 90, 120, 180 e 300 (T90, T120, T180 e T300) dias após a inoculação de pristane ou salina. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP), do LP (CMLP) e esplenócitos foram obtidos por lise das hemácias seguida de lavagens com RPMI medium 1640 e centrifugação, e posteriormente criopreservadas até a avaliação por citometria de fluxo usando o aparelho Guava EasyCyteTM HT (Millipore). Para esta etapa, as células foram descongeladas, lavadas com RPMI medium 1640 e incubadas com anticorpos monoclonais dirigidos contra CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 e Ly6C (BD PharmingenTM). Os resultados foram expressos como média ± DP e teste de Mann-Whitney foi utilizado para análises estatísticas, sendo p<0,05 considerado significante. Resultados: Comparados aos animais controles, animais com LES-induzido por pristane apresentaram aumento de células T CD4+CD69+ no sangue nos T90, T120 e T180 (p < 0,022, p=0,008 e p=0,010, respectivamente) e no baço no T120 (p=0,049), enquanto que, no LP, houve redução destas células nos T120, T180 e T300 (p=0,001, p=0,001 e p < 0,001, respectivamente). A porcentagem de células Treg CD4+CD25+FoxP3+ foi menor no sangue nos T90, T120 e T180 (p=0,018, p=0,012, p < 0,046, respectivamente), no baço, nos T120 e T180 (p=0,018 e p=0,013), e no LP nos T90 e T300 (p=0,008 e p=0,005). Conclusão: Aumento da expressão de células T CD4+CD69+ e redução da expressão de Treg CD4+CD25+FoxP3+ sugerem células T CD4 ativadas e perda da autotolerância periférica em camundongos com LES-induzido por pristane. Estas alterações são semelhantes às observadas no lúpus humano, de modo que demonstramos que este modelo também pode ser útil na avaliação de mecanismos de ativação celular, tolerância periférica desequilíbrio imune homeostático envolvidos no LES / Introduction: Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is multisystemic autoimmune disease with complex etiology that involves environmental, genetic and hormonal factors. Is characterized by auto-antibodies and inflammatory mediators production, autoreactive T cells activation and proliferation and loss of immunogenic autotolerance. In patients with SLE, expression of CD69 activation primary receptor is increased and the CD4+CD25+FoxP3+ suppressor/regulatory T cell (Treg) is reduced. CD69 is essential for activation of autoreactive CD4 T cells while Treg cells are important in autotolerance maintenance. In this way, T cells have a central role in the pathogenesis of SLE however, the mechanisms implied in the autotolerance failure are still not elucidated, highlighting the importance of studies in this disease\'s experimental models, such as pristane-induced SLE. Objective: Quantify activated CD4+CD69+ T cells and CD4+CD25+FoxP3+ Treg in blood, spleen and peritoneal lavage (PL) of Balb/c mice with pristane-induced SLE in order to evaluate autotolerance failure in this model. Methods: 84 female Balb/c mice were analyzed: 52 received a single intraperitoneal 0,5 ml dose of pristane and 32 the same dose of saline. Euthanized mice samples of blood, spleen and peritoneal lavage were collected 90, 120, 180 and 300 (T90, T120, T180 and T300) days after inoculation of pristane or saline. Mononuclear cells from peripheral blood (PBMC), PL (PLMC) and splenocytes were obtained by lysis of erythrocytes followed by washings with RPMI medium 1640 and centrifugation, subsequently criopreserved until evaluation by flow cytometry using the appliance GuavaEasyCyteTM HT (Millipore). For this step, cells were unfrozen, washed with RPMI medium 1640 and incubated with monoclonal antibodies against CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 and Ly6C (BD PharmingenTM). The results were expressed as mean ± SD and Mann-Whitney 11 test was used for statistical analysis, being considered significant p < 0,05. Results: Compared to control animals, SLE pristane-induced animals presented increase of CD4+CD69+ T cells in blood on T90, T120 and T180 (p=0.022, p=0.008 and p=0.010, respectively) and in spleen on T120 (p=0.049), while, in PL, there was reduction of these cells on T120, T180 and T300 (p=0.001, p=0.001 and p < 0.001, respectively). The porcentage of Treg CD4+CD25+FoxP3+ was smaller in blood on T90, T120 and T180 (p=0.018, p=0.012 and p < 0.046, respectively), in spleen on T120 and T180 (p=0.018 and p=0.013), and in PL on T90 and T300 (p=0.008 and p=0.005). Conclusion: Increase of CD4+CD69+ T cell and reduction of CD4+CD25+FoxP3+ Treg expression suggests activated T CD4 cells and loss of peripheral autotolerance in pristane-induced SLE mice. These alterations are similar to observed in human lupus, in order we showed that this model can also be useful in evaluating the mechanisms of cellular activation, peripheral tolerance and homeostatic immune imbalance involved in the LES

Introdução: O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune multissistêmica de etiologia complexa que envolve fatores ambientais, genéticos e hormonais. É caracterizada pela produção de autoanticorpos e mediadores inflamatórios, ativação e proliferação de células T autorreativas e perda da autotolerância imunológica. Em pacientes com LES, a expressão do receptor primário de ativação CD69 é aumentada e a de células T supressoras/reguladoras (Treg) CD4+CD25+FoxP3+ é reduzida. O CD69 é essencial para ativação de células T CD4 autorreativas enquanto que as células Treg são importantes na manutenção da autotolerância. Desta forma, células T tem um papel central na patogênese do LES, mas os mecanismos implicados na falência da autotolerância ainda não são elucidados, destacando a importância de estudos em modelos experimentais da doença, como o de LES-induzido por pristane. Objetivo: Quantificar células T CD4+CD69+ ativadas e Treg CD4+CD25+FoxP3+ no sangue, baço e LP de camundongos Balb/c LESinduzido por pristane no sentido de avaliar a falência de autotolerância neste modelo. Métodos: Analisamos 84 camundongos Balb/c fêmeas: 52 receberam por via intraperitoneal uma dose única de 0,5 ml de pristane e 32 a mesma dose de salina. Amostras de sangue, baço e LP dos camundongos eutanasiados foram coletadas 90, 120, 180 e 300 (T90, T120, T180 e T300) dias após a inoculação de pristane ou salina. Células mononucleares do sangue periférico (CMSP), do LP (CMLP) e esplenócitos foram obtidos por lise das hemácias seguida de lavagens com RPMI medium 1640 e centrifugação, e posteriormente criopreservadas até a avaliação por citometria de fluxo usando o aparelho Guava EasyCyteTM HT (Millipore). Para esta etapa, as células foram descongeladas, lavadas com RPMI medium 1640 e incubadas com anticorpos monoclonais dirigidos contra CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 e Ly6C (BD PharmingenTM). Os resultados foram expressos como média ± DP e teste de Mann-Whitney foi utilizado para análises estatísticas, sendo p<0,05 considerado significante. Resultados: Comparados aos animais controles, animais com LES-induzido por pristane apresentaram aumento de células T CD4+CD69+ no sangue nos T90, T120 e T180 (p < 0,022, p=0,008 e p=0,010, respectivamente) e no baço no T120 (p=0,049), enquanto que, no LP, houve redução destas células nos T120, T180 e T300 (p=0,001, p=0,001 e p < 0,001, respectivamente). A porcentagem de células Treg CD4+CD25+FoxP3+ foi menor no sangue nos T90, T120 e T180 (p=0,018, p=0,012, p < 0,046, respectivamente), no baço, nos T120 e T180 (p=0,018 e p=0,013), e no LP nos T90 e T300 (p=0,008 e p=0,005). Conclusão: Aumento da expressão de células T CD4+CD69+ e redução da expressão de Treg CD4+CD25+FoxP3+ sugerem células T CD4 ativadas e perda da autotolerância periférica em camundongos com LES-induzido por pristane. Estas alterações são semelhantes às observadas no lúpus humano, de modo que demonstramos que este modelo também pode ser útil na avaliação de mecanismos de ativação celular, tolerância periférica desequilíbrio imune homeostático envolvidos no LES / Introduction: Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is multisystemic autoimmune disease with complex etiology that involves environmental, genetic and hormonal factors. Is characterized by auto-antibodies and inflammatory mediators production, autoreactive T cells activation and proliferation and loss of immunogenic autotolerance. In patients with SLE, expression of CD69 activation primary receptor is increased and the CD4+CD25+FoxP3+ suppressor/regulatory T cell (Treg) is reduced. CD69 is essential for activation of autoreactive CD4 T cells while Treg cells are important in autotolerance maintenance. In this way, T cells have a central role in the pathogenesis of SLE however, the mechanisms implied in the autotolerance failure are still not elucidated, highlighting the importance of studies in this disease\'s experimental models, such as pristane-induced SLE. Objective: Quantify activated CD4+CD69+ T cells and CD4+CD25+FoxP3+ Treg in blood, spleen and peritoneal lavage (PL) of Balb/c mice with pristane-induced SLE in order to evaluate autotolerance failure in this model. Methods: 84 female Balb/c mice were analyzed: 52 received a single intraperitoneal 0,5 ml dose of pristane and 32 the same dose of saline. Euthanized mice samples of blood, spleen and peritoneal lavage were collected 90, 120, 180 and 300 (T90, T120, T180 and T300) days after inoculation of pristane or saline. Mononuclear cells from peripheral blood (PBMC), PL (PLMC) and splenocytes were obtained by lysis of erythrocytes followed by washings with RPMI medium 1640 and centrifugation, subsequently criopreserved until evaluation by flow cytometry using the appliance GuavaEasyCyteTM HT (Millipore). For this step, cells were unfrozen, washed with RPMI medium 1640 and incubated with monoclonal antibodies against CD3, CD4, CD25, CD28, CD69, CTLA-4, FoxP3, CD14 and Ly6C (BD PharmingenTM). The results were expressed as mean ± SD and Mann-Whitney 11 test was used for statistical analysis, being considered significant p < 0,05. Results: Compared to control animals, SLE pristane-induced animals presented increase of CD4+CD69+ T cells in blood on T90, T120 and T180 (p=0.022, p=0.008 and p=0.010, respectively) and in spleen on T120 (p=0.049), while, in PL, there was reduction of these cells on T120, T180 and T300 (p=0.001, p=0.001 and p < 0.001, respectively). The porcentage of Treg CD4+CD25+FoxP3+ was smaller in blood on T90, T120 and T180 (p=0.018, p=0.012 and p < 0.046, respectively), in spleen on T120 and T180 (p=0.018 and p=0.013), and in PL on T90 and T300 (p=0.008 and p=0.005). Conclusion: Increase of CD4+CD69+ T cell and reduction of CD4+CD25+FoxP3+ Treg expression suggests activated T CD4 cells and loss of peripheral autotolerance in pristane-induced SLE mice. These alterations are similar to observed in human lupus, in order we showed that this model can also be useful in evaluating the mechanisms of cellular activation, peripheral tolerance and homeostatic immune imbalance involved in the LES