O chá verde (CV) é um fitoterápico produzido a partir da planta Camellia sinensis e apresenta propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, anticancerígenas e antiobesidade. Foi realizado um estudo para investigar se o CV seria capaz de modular alguns parâmetros funcionais de linfócitos de animais induzidos à obesidade por dieta hipercalórica. Os grupos suplementados receberam 500 mg/kg de CV durante 22 dias seguida da dieta hipercalórica por mais 44 dias acompanhada também do tratamento com o CV. O tratamento com o CV reduziu a proliferação celular, a atividade das enzimas metabólicas hexoquinase e glicose-6-fosfato desidrogenase, aumentou a atividade de enzimas antioxidantes, diminuiu a produção de espécies reativas de oxigênio, a produção de citocinas pró- inflamatórias (IL-6, IL-1β, TNF-α) e restaurou os índices de IL-10 que se encontrava diminuído no grupo obeso. Os efeitos observados pelo CV podem proporcionar um ambiente mais adequado para o bom funcionamento celular, diminuindo a produção de mediadores inflamatórios que estão presente na obesidade. / Green tea (GT) is a phytochemical produced from Camellia sinensis and it has anti-inflammatory, anti-cancer, anti-obesity and antioxidant properties. This study was conducted to investigate whether the GT was able to modulate some lymphocyte functional parameters of obesity - induced animals by hypercaloric diet. Supplemented groups received 500 mg/kg GT for 22 days followed by hypercaloric diet for additional 44 days, together with the GT treatment. Treatment with GT reduced the cell proliferation capacity, the activity of metabolic enzymes hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, increased the activity of antioxidant enzymes, decreased the production of reactive oxygen species, production of proinflammatory cytokines (IL-6, IL-1β, TNF-α) and restored the levels of IL-10 which was reduced by obesity. The GT effects can provide a more suitable environment for proper lymphocyte function, also reducing production of inflammatory mediators in obesity.

Introdução: A modulação da resposta imune em muitas situações clínicas persiste como um dos problemas mais desafiadores em imunologia. Citocinas são fundamentais para esta regulação e são amplamente estudadas. Após a ligação com receptores específicos na superfície das células alvo, uma das principais vias de sinalização é o sistema JAKs/STATs. No entanto, em contraste com as citocinas, não existem estudos detalhados sobre a cinética expressão intracelulares de STAT in vitro. Objetivo: Determinar por citometria de fluxo, a cinética expressão de proteínas STAT 1, 3, 4, 5 e 6 fosforiladas, a produção de citocinas associadas e expressão de seus receptores em PBMC humanas estimuladas in vitro com fito-hemaglutinina (PHA) e antígeno de citomegalovírus (CMV). Metodologia: Foram avaliados CMNs de 23 doadores saudáveis em relação à cinética de expressão STATs (12 doadores estimulados com PHA e 11 estimulados com CMV), secreção de citocinas e expressão de seus receptores. Resultados: Em células estimulada com PHA e CMV, pSTAT1 e 6 tiveram sua expressão aumentada precocemente (4h e três dias, respectivamente). pSTAT3 teve sua expressão aumentada em momentos posteriores (respectivamente 36h e 6 dias). A indução de expressão de pSTAT4 e 5 foi observada nos tempos mais tardios da cinética em células estimuladas com PHA (24-36h), enquanto observamos constante baixo nível de expressão em todos os tempos analisados em células estimuladas com CMV. No que diz respeito á secreção de citocinas em células estimuladas com PHA, níveis maiores de IL-6, IL-10 e IL-4 foram detectados a partir de 12h, enquanto aumento da secreção de IFN-y e IL-2 ocorreu a partir de 24h. Com CMV, apenas IL-6 mostrou um aumento da secreção nos dias 4 e 6. Os receptores de citocinas CD119 (IFN-g), CD126 (IL-6), CD210 (IL-10), CD212 (IL-12), CD25 (IL -2) e CD124 (IL-4) tiveram um aumento da expressão após 24-36h de estimulação com PHA. Com estímulo de CMV, CD126, CD212, CD25, também aumentaram a expressão em tempos tardios (5-6 dias), enquanto os outros receptores mantiveram níveis baixos de expressão em todos os momentos estudados. Discussão: Houve uma correlação entre a cinética de expressão de pSTAT3 e 5, e a cinética das citocinas associadas e de seus receptores (IL-6 / CD126, IL-10 / CD210 e IL-2 / CD25). A cinética de expressão de pSTAT4 se correlacionou com a expressão de CD212. (IL-12p70 não foi detectada no presente estudo). Entretanto a expressão de pSTAT1 e 6 precedeu à de IFN-y / CD119 e IL-4 / CD124. Conclusão: A determinação da cinética de expressão pSTAT in vitro pode contribuir para a compreensão da regulação da resposta imune a patógenos distintos e, potencialmente, ajudar no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos bem como de novas estratégias destinadas a modular as vias de sinalização em diversas condições clínicas associadas à desregulação imunológica / Introduction: Modulation of immune responses in many clinical situations persists as one of the most challenging issues in immunology. Cytokines are fundamental to this regulation and have already been extensively studied. After binding with its specific receptors on the surface of the target cells, the main signaling pathway is the JAKs/STATs system. However, in contrast to cytokines, there are no detailed studies on the in vitro intracellular expression kinetics of STATs. Objective: To determine by flow cytometry the kinetics of phosphorylated STAT1, 3, 4, 5 and 6 proteins expression in human PBMCs in vitro stimulated with phytohemagglutinin (PHA) and cytomegalovirus antigen (CMV), and the associated cytokine production and cytokine receptors expression. Methodology: We evaluated PBMCs from 23 healthy donors regarding the kinetics of STATs expression (12 donors stimulated with PHA and 11 stimulated with CMV), cytokine secretion and respective receptors expression. Results: In PHA and CMV stimulated cells, pSTAT 1 and 6 expression increased early, 4h and 3days respectively). pSTAT3 expression augmented at later times (respectively 36h and 6 days). pSTAT4 and 5 expression were observed late in PHA stimulated cells (24-36h), while there was a constantly low level of expression in all times analyzed. Regarding cytokine release In PHA stimulated cells, IL-6, IL10 and IL-4 secretion started to increase at 12h while IFN-y and IL-2 increased at 24h. With CMV, only IL-6 showed increased expression at days 4 and 6. The cytokines receptors CD119 (IFN-g), CD126 (IL-6), CD210 (IL-10), CD212 (IL-12), CD25 (IL-2) and CD124 (IL-4) had increased expression at 24-36h with PHA stimulation. With CMV stimulation, CD126, CD212, CD25 also had increased expression at late times (5-6 days) while the other receptors maintained low expression levels at all times. Discussion: There was a correlation in between the pSTAT3 and 5 expression kinetics and the associated cytokines and cytokine receptors kinetics (IL-6/CD126, IL-10/CD210 and IL-2/CD25. pSTAT4 expression kinetics correlated with that of CD212 expression (IL-12p70 was not detected in the present study). The higher pSTAT1 and 6 expressions preceded that of IFN-y/CD119 and IL-4/CD124, respectively. Conclusion: Determination of pSTAT expression kinetics in vitro can contribute to the understanding of the regulation of immune responses to distinct pathogens and potentially help in the design of new therapeutic targets as well as new strategies aimed at modulating signaling pathways

A esclerose múltipla (EM) é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC), sendo considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. Além das alterações imunes, neurológicas e vasculares que são encontradas na EM, tem sido postulado que o estresse oxidativo pode estar envolvido na patogênese desta doença. Os nucleotídeos ATP, ADP e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas capazes de modular vários processos biológicos incluindo tromboregulação, inflamação e neurotransmissão. O controle dos níveis extracelulares destas moléculas e a conseqüente sinalização purinérgica por elas induzida é realizada por uma variedade de enzimas como as NTPDases (Nucleotídeo Trifosfato Difosfoidrolase), E-NPPs (Ecto-Nucleotídeo Pirofosfatase/Fosfodiesterases), 5'- nucleotidase e a adenosina deaminase (ADA). Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade destas ectoenzimas em linfócitos e plaquetas de pacientes com a forma surto remissão da EM (SREM) e o papel da NTPDase e 5'-nucleotidase em sinaptossomas e plaquetas bem como a avaliação de parâmetros de estresse oxidativo em ratos submetidos à desmielinização experimental pelo brometo de etídio (BE) e tratados com vitamina E. Os resultados obtidos demonstraram alterações na atividade das ectoenzimas em linfócitos e plaquetas de pacientes com SREM. Em linfócitos foi observado um aumento na atividade e expressão da NTPDase e uma diminuição na atividade da ADA em pacientes com SREM quando comparados com o grupo controle. Uma diminuição na atividade e expressão da NTPDase, bem como uma diminuição na atividade das enzimas E-NPP, 5'-nucleotidase e ADA foi observada em plaquetas de pacientes com SREM quando comparadas com indivíduos saudáveis. Em relação ao modelo experimental os resultados demonstraram que em ratos submetidos à desmielinização por BE ocorreu um aumento na atividade da NTPDase e 5'-nucleotidase tanto em sinaptossomas quanto em plaquetas. Quando ratos desmielinizados foram tratados com vitamina E este composto foi capaz de reverter o aumento da NTPDase, entretanto a atividade da 5'-nucleotidase permaneceu aumentada em sinaptossomas e plaquetas quando comparado com o grupo controle. Além disso, foi observado também que parâmetros de estresse oxidativo como o conteúdo de TBARS e tióis não protéicos foram encontrados aumentados e a atividade da catalase estava diminuída em ratos desmielinizados pelo BE, sendo que o tratamento com vitamina E foi capaz de reverter estas alterações ao nível do grupo controle. Os resultados descritos aqui sugerem que as ectoenzimas estão envolvidas na modulação de respostas imunes, vasculares e neurológicas possuindo assim um papel relevante tanto na EM quanto em modelos experimentais de desmielinização. Além disso, a vitamina E pode interferir com a hidrólise dos nucleotídeos de adenina bem como o estresse oxidativo durante um evento desmielinizante sugerindo assim, que este composto pode ser importante no tratamento de patologias desmielinizantes com a EM. / Multiple sclerosis (MS) is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. Immune, neurological and vascular alterations are found in MS and it has been postulated that oxidative stress may be involved in the pathogenesis of this disease. The nucleotides ATP, ADP and nucleoside adenosine are important molecules that modulate several biological processes including thromboregulation, inflammation and neurotransmission. The control of extracellular levels of these molecules and consequent purinergic signaling induced by them is controlled by a variety of enzymes such as NTPDases (Nucleotide Triphosphates Diphosphohydrolase), E-NPPs (Ecto-Nucleotide Pyrophosphatase Phosphodiesterases), 5'-nucleotidase and adenosine deaminase (ADA). Therefore, the objective of this study was to evaluate the activity of these ectoenzymes in lymphocytes and platelets of patients with the relapsing - remitting form of MS (RRMS) as well as the role of NTPDase and 5'- nucleotidase in synaptosomes and platelets and oxidative stress parameters in rats subjected to experimental demyelination with ethidium bromide (EB) and treated with vitamin E. The results showed changes in ectoenzyme activities in lymphocytes and platelets of RRMS patients. In lymphocytes, an increase in NTPDase activity and expression along with a decrease in ADA activity was observed in patients with RRMS when compared with the control group. A decrease in NTPDase activity and expression and a decrease in E-NPP, 5'- nucleotidase and ADA activities was observed in platelets of RRMS patients when compared with healthy subjects. As for the experimental model, the results showed that rats subjected to demyelination by EB demonstrated increased NTPDase and 5'-nucleotidase activities in both synaptosomes and platelets. When demyelinated rats were treated with vitamin E this increase in NTPDase was reversed, however 5'-nucleotidase activity remained increased in synaptosomes and platelets when compared with the control group. Furthermore, we observed that oxidative stress parameters such as TBARS content and non-protein thiols were increased and catalase activity was decreased in demyelinated rats and that treatment with vitamin E reversed these changes in the control group. The results reported here suggest that ectoenzymes are involved in the modulation of immune, vascular and neurological responses, thus having an important role both in MS and in experimental models of demyelination. Moreover, vitamin E may interfere with the hydrolysis of adenine nucleotides and oxidative stress during a demyelinating event which suggests that this compound could be important in the treatment of demyelinating diseases such as MS.

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T06:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sousa_RobertaReginaRuelade_M.pdf: 3257089 bytes, checksum: 29f24a432f8c0bfd7dd71af48cc7608a (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: As proteínas tirosina fosfatases (PTP) (EC 3.1.3.48) são enzimas regulatórias chaves que participam na transdução de sinal e são essenciais na regulação do crescimento, diferenciação, ciclos celulares, na transcrição gênica, resposta imune e outros processos. Esta classe de enzimas, que contém cisteína no sítio ativo, pode ser inativada por agentes oxidantes. Neste trabalho, estudamos os efeitos de peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido, compostos que induzem estresse oxidativo, na atividade de uma PTP purificada de membranas de linfócitos humanos, indicativamente a CD45. A PTP foi purificada de membranas de linfócitos humanos através de cromatografias de troca iônica (DEAE Sepharose) e exclusão molecular (Sephacryl S-200). A purificação enzimática foi acompanhada por SDS-PAGE e eletroforese bidimensional. A atividade enzimática foi determinada através de incubação a 37°C por 30 min em pH 5,0 em presença de 5 mM de p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato. A enzima obtida da cromatografia de exclusão molecular apresentou uma massa molecular relativa de aproximadamente 200 kDa, reconheceu mais eficientemente tirosina fosfato (cerca de 3,2 vezes) como substrato quando comparado ao pNPP, e foi inibida por inibidores específicos de PTP, tais como vanadato (40%), pervanadato (100%), p-cloromercuribenzoato (20%) and Cu2+ (95%). Ácido okadáico, um inibidor específico de serina e treonina proteína fosfatases, não afetou a atividade da PTP de membranas de linfócitos. Estes resultados de caracterização sugerem fortemente que a PTP purificada de membranas de linfócitos humanos é a CD45. Peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido inibiram a atividade dessa proteína com valores de IC50 (concentração do composto que produz 50% de inibição enzimática) de 50 µM e 16 mM, respectivamente. Glutationa reduzida (GSH) protegeu parcialmente a enzima contra estes oxidantes, porém proteções totais foram obtidas quando se adicionava 250 mM de desferoxamina ao meio de ensaio. Nossos resultados sugerem que essa proteína pode ser regulada por alteração do estado de oxidação dos grupos funcionais do sítio ativo e que esta regulação poderia fornecer um mecanismo de controle celular através de espécies reativas de oxigênio / Abstract: Protein phosphatases, that dephosphorylate proteins in residues of threonine, serine and tyrosine, are a class of enzymes that can be stressed by compounds present in oxidant or reductant environments. In particular, the protein tyrosine phosphatases (PTP) (EC 3.1.3.48) are key regulatory enzymes that participate in signal transduction and are essential for regulating cellular growth, differentiation, cell cycle, gene transcription, immune response and other processes. This class of enzymes, which contain cysteine in the active site, can be inactivated by oxidant reagents. In this work we have studied the effect of hydrogen peroxide and t-butyl hydroperoxide, compounds that induce oxidative stress, on a purified PTP (CD45) from membrane human lymphocytes. PTP was purified from human lymphocyte membranes through ion exchange (DEAE Sepharose) and molecular exclusion (Sephacryl S-200) chromatographies. The enzyme purification was followed by SDS-PAGE and 2D electrophoresis. The enzyme activity was determined by incubation at 37oC for 30 minutes at pH 5.0 in presence of 5 mM p-nitrophenylphosphate (pNPP) as substrate. The enzyme obtained from molecular exclusion chromatography had a relative molecular mass of approximately 200 kDa, recognized more efficiently tyrosine phosphate (about 3.2-fold) as substrate when compared with p-NPP, and was inhibited by specific PTP inhibitors, such as, vanadate (40%), pervanadate (100%), p-chloromercuribenzoate (20%) and Cu2+ (95%). Okadaic acid, a specific serine and threonine protein phosphatases inhibitor, did not significantly affect the lymphocyte membrane PTP activity. These characterization results strongly suggest that the membrane PTP purified from human lymphocytes was the CD45. Hydrogen peroxide and t-butyl hydroperoxide inhibited the CD45 activities with IC50 (concentration of compound that produces 50% enzyme inhibition) values of 50 µM and 16 mM, respectively. Reduced glutathione (GSH) partially protected the enzyme against these oxidations, but full protections were observed when 250 mM deferoxamine were added to the assay medium. Our results suggest that CD45 can be regulated by altering the oxidation state of active site functional groups, and that this regulation could provide a mechanism of cell control by reactive oxygen species / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sonia Jancar / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Landgraf_RichardtGama_D.pdf: 1629843 bytes, checksum: d732dae7c868194b49b83ed52b21a953 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve, simultaneamente, a participação de diversos tipos celulares, citocinas e mediadores inflamatórios. Apesar do grande número de estudos sobre o papel da bradicinina e do óxido nítrico (NO) na asma, vários aspectos não foram abordados e outros são controversos. Os objetivos deste trabalho foram, em modelo murino de asma: 1) caracterizar alguns parâmetros da inflamação pulmonar como infiltrado de eosinófilos e linfócitos (CD4 +, CD8 +, B, T?d e NK1.1) no espaço aéreo, reatividade das vias aéreas à metacolina e produção de muco e avaliar o efeito de antagonistas de receptor induzível (B1) e constitutivo (B2) da bradicinina nestes parâmetros; 2) comparar o efeito da supressão aguda da síntese de NO (por tratamento com inibidores da síntese) com a ausência constitucional da iNOS (utilizando animais deficientes para este gene) nestes parâmetros; 3) avaliar a cinética da expressão da iNOS no pulmão e o tipo celular responsável pela produção de NO na fase inicial da inflamação alérgica pulmonar. Camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de ovalbumina utilizando hidróxido de alumínio como adjuvante. Uma dose de reforço foi administrada após 7 dias e o desafio antigênico realizado no 14º e 21º dia por aerosol. Os antagonistas de receptores da bradicinina e os inibidores de NO foram administrados por via intraperitoneal 30 minutos antes de cada desafio antigênico. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com o antagonista do receptor induzível B1 da bradicinina (R-954) reduziu significativamente o número de eosinófilos no BAL, a hiperreatividade das vias aéreas e a secreção de muco, entretanto não alterou o número de linfócitos no BAL. Por outro lado, o tratamento com o antagonista do receptor constitutivo B2 da bradicinina (HOE-140) aumentou o número de eosinófilos e linfócitos no BAL, porém, não alterou a hiperreatividade das vias aéreas nem a secreção de muco. Estes efeitos dos antagonistas foram semelhantes nas linhagens C57Bl/6 e BALB/c. Estes resultados sugerem que, neste modelo de inflamação alérgica pulmonar, a ativação dos receptores constitutivos da bradicinina regula negativamente a inflamação enquanto que a ativação dos receptores induzíveis regula positivamente. O tratamento com os inibidores de NO, L-NAME ou aminoguanidina, diminuiu o número de eosinófilos e linfócitos no BAL, a hiperreatividade das vias aéreas e a secreção de muco. Surpreendentemente, camundongos deficientes para o gene da iNOS apresentaram inflamação das vias aéreas semelhantes aos camundongos não deficientes, e o tratamento destes camundongos com os inibidores de NO não afetou nenhum dos parâmetros avaliados. Estes dados mostram que a inibição aguda da iNOS tem efeito anti-inflamatório neste modelo de asma, enquanto que a ausência constitutiva desta enzima não tem efeito. Observamos ainda que no BAL obtido 12 horas após o desafio antigênico, as células que expressam marcador fluorescente de NO são células com núcleo polimórfico. Isto coincidiu com o pico de infiltração de neutrófilos para o BAL e com o pico de expressão da iNOS no pulmão. Estes resultados sugerem que neutrófilos do BAL produzem NO na fase inicial da asma murina. Assim, nossos estudos contribuíram para uma melhor compreensão do papel dos receptores constitutivos e induzidos da bradicinina, na asma e sugeriram que a utilização de antagonistas do receptor B1 poderia ter um efeito protetor. Além disso, a demonstração da produção de NO por neutrófilos que migraram para o BAL na fase inicial da inflamação alérgica sugere que inibidores da síntese de NO possam ter efeito protetor quando utilizados em fase precoce da estimulação antigênica / Absract: Asthma is a chronic inflammatory disease that involves simultaneously several cell types, cytokines and inflammatory mediators. Despite the large number of publications dealing with the role of nitric oxide (NO) and bradykinin in asthma, several aspects of the disease were not addressed and some are controvertial. In the present study, using a murine model of asthma, we: 1) characterized some parameters of pulmonary inflammation such as airways infiltration of eosinophil and lymphocytes (CD4 +, CD8 +, B, T?d e NK1.1), airways reactivity to methacholine and mucus secretion and evaluated the effect of antagonists of the inducible (B1) and constitutive (B2) bradikinin receptors in these parameters; 2) compared the effect of acute suppression of NO synthesis (by treatment with NO inhibitors) with the absence of iNOS (using mice deficient for this gene) on these parameters; 3) evaluated the temporal profile of iNOS expression in the lungs and the cell type responsible for lung NO production in the initial phase of lung inflammation. Mice were sensitized by ip injection of ovalbumin using alum as adjuvant. One booster was administered after 7 days and antigen challenge performed on day 14 and 21 by aerosol. The bradykinin receptor antagonists and the NO inhibitors were given ip, 30 min before each challenge. The results obtained show that treatment with the B1 receptor antagonist, R-954 significantly reduced the number of eosinophils in the BAL, airways hyperreactivity and mucus secretion but did not alter the number of BAL lymphocytes. Treatment with the constitutive (B2) bradykinin receptor,HOE-140), however, increased eosinophils and BAL lymphocytes number, but had no effect on airways hyperreactivity nor in mucus secretion. These effects of the antagonists were observed in both, C57Bl/6 e BALB/c mice. These results suggest that, in this model of lung inflammation, activation of constitutive bradykinin receptors would down-regulate the inflammation whereas activation of the inducible receptor would have a pro-inflammatory effect. Treatment with NO inhibitors, L-NAME or aminoguanidine, reduced eosinophils and lymphocytes in BAL, airways hyperreactivity and mucus secretion. Surprisingly, in mice deficient of iNOS gene the airways inflammation was similar to that observed in iNOS sufficient mice and treatment of the deficient mice with the NO inhibitors did not affect the parameters analyzed. These results show that acute inhibition of iNOS has anti-inflammatory effect in this model of asthma whereas the absence of this enzyme has no effect. It was also observed that in the BAL collected 12h after antigen challenge, the cells that expressed a fluorescent NO marker were cells with polymorphic nucleous. This was coincident with the peak of neutrophils infiltration to the BAL and with the peak expression of lung iNOS. These results suggest that BAL neutrophils produce NO in the initial phase of murine asthma. Thus, our studies contributed for a better understanding of the role of the constitutive and inducible bradykinin in asthma and suggest that antagonists of B1 receptor could have a beneficial effect on asthma. Moreover, the demonstration of NO production by neutrófilos that had migrated to the BAL suggests that NO synthesis inhibitors would have a beneficial effect when administered early after antigenic stimulation / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Introduction: Sickle cell anemia (SCA) is one of the most common genetic disorders in the world. However, until recently, only the direct consequences of the deoxyHbS polymerization was used to explain the pathophysiology of the disease. Currently, it is known that the clinical repercussions of FA involve complex interactions between the erythrocyte, endothelium and leukocytes: cytokines secreted by inflammatory cells are involved in SCA crisis and in the maintenance of a systemic inflammatory status, suggesting that T cells (Helpers and Cytotoxics) and NK have a fundalmental role in the clinical phenomena of SCA. This study aims to evaluate the profile of T and NK lymphocytes in patients with AF and compare them with the profile of individuals with sickle cell trait and individuals without hemoglobinopathies. Materials and methods: Peripheral blood was collected from 13 individuals; 7 with SS hemoglobinopathy (SS group), 5 with sickle cell trait (AS group) and 5 normal (AA group). The lymphocytes isolation for analysis was performed using Ficoll-Hypaque solution. Immunophenotyping for the determination of lymphocyte subtypes was performed by flow cytometry, using eight-color cytometer and eight BD Biosciences antibodies. Data were analyzed using Flowjo software and tabulated in SPSS IBM 22.0. The results referring to the numerical variables were expressed through measures of central tendency. Results: A lower frequency of T lymphocytes and a greater frequency of NK cells were observed in sickle cell patients.The variation of TCD4 + found between the SCA and the AA group was significant (p = 0.04). Lower frequency tendency in patients of the SS group remained for B lymphocytes. A higher frequency of NK cells was observed in patients with sickle cell anemia (mean: group AA = 15.63%, group AS = 14.82% and group SS = 23.34%) with statistically significant variation. Conclusion: SCA patients present a lower frequency of CD4 + CD8 + T cells and TNK cells when compared with HbAS individuals and individuals without hemoglobinopathies. An increasing and progressive frequency of NK cells is observed between groups AA, AS and SS. We believe that further studies are needed to understand the role of these cells in the genesis of systemic inflammation of SCA. This understanding may contribute to the development of new therapeutic strategies. / INTRODUÇÃO: A anemia falciforme (AF) é uma das desordens genéticas mais comuns do mundo. Entretanto, até pouco tempo atrás, apenas as consequências diretas da polimerização da desoxiHbS explicava a fisiopatogenia da doença. Atualmente, sabe-se que as repercussões clíncas da AF envolvem interações complexas entre o eritrócito, endotélio e leucócitos: citocinas secretadas por células inflamatórias estão envolvidas nas crises e na manutenção de um status inflamatório sistêmico, o que sugere que as células T (auxiliares e citotóxicas) e NK têm papel fundalmental nos fenômenos clínicos da AF. Este estudo visa avaliar o perfil de linfócitos T e NK em portadores de AF e comparar com o perfil de indivíduos com traço falciforme e indivíduos sem hemoglobinopatias. MATERIAIS E MÉTODOS: Foi coletado sangue periférico de 17 indivíduos; 7 com hemoglobinopatia SS (grupo SS), 5 com traço falciforme (grupo AS) e 5 normais (grupo AA). Todos confirmados por eletroforese de hemoglobina. Amostras de pacientes hemotransfundidos 30 dias antes ou em uso de antiinflamatórios 2 dias antes da coleta foram excluídas. O isolamento dos linfócitos para análise foi realizado utilizando solução de Ficoll-Hypaque. A imunofenotipagem para determinação dos subtipos linfocitários foi realizada por citometria de fluxo, utilizando citômetro de oito cores e oito anticorpos da BD Biosciences. Os dados foram analisados com auxílio do software Flowjo e tabulados no SPSS IBM 22.0. Os resultados referentes às variáveis numéricas foram expressos através de medidas de tendência central: média e valores mínimos e máximos. RESULTADOS: Globalmente foi observada menor frequência de linfócitos T e maior frequência de células NK nos pacientes falcêmicos, com média de 31,2% de TCD4+ contra 43,47% do grupo AS e 45,37% do grupo AA. Para os linfócitos TCD8+, o grupo SS obteve média de 12,64% contra 17,1% do AS e 16,42% do AA. A variação de TCD4+ encontrada entre os pacientes AF e o grupo AA foi significativa (p=0,04). Tendência de menor frequência em pacientes do grupo SS se manteve para os linfócitos B. Foi observada maior frequência de células NK em pacientes portadores de anemia falciforme (média do grupo AA=8,83%; AS=11,2% e grupo SS=19,6%), respectivamente, com diferença significativa entre o grupo AA e o grupo SS (p=0,040). CONCLUSÃO: Portadores de AF apresentam tendência de menor frequência de linfócitos T, com diferença significativamente menor comparado ao portador de traço e o paciente portador de AF, para linfócitos T CD4+ verificou-se redução significativa deste subtipo celular entre grupo SS e AA. Neste estudo também foi evidenciado uma frequência crescente e progressiva de células NK entre os grupos AA, AS e SS. Acreditamos que mais estudos são necessários visando compreender o papel destas células na gênese da inflamação sistêmica da AF. Este entendimento possivelmente contribuirá para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. / Aracaju, SE

A dengue é uma doença infecciosa aguda causada pelo vírus DEN do gênero Flavivirus e é transmitida pela picada de um mosquito vetor, principalmente o Aedes aegypti. Existem quatro sorotipos do vírus da dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4) e sua incidência tem aumentado dramaticamente nos últimos 50 anos, inclusive no Brasil. O objetivo deste trabalho é caracterizar subpopulações de linfócitos T, principalmente linfócitos T CD8+, provenientes de pacientes infectados quanto a sua capacidade proliferativa, seu estado de ativação e memória celular. Os pacientes foram recrutados no Hospital Ana Costa de Santos, SP, no ano de 2010, após assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. O diagnóstico de dengue foi realizado utilizando o teste rápido Dengue Duo e os parâmetros imunológicos foram analisados no citômetro de fluxo. Foi coletado sangue periférico para criopreservação de células mononucleares e separação de soro para detecção da carga viral. Pacientes com dengue apresentaram maior proliferação de linfócitos T CD8+ quando comparados com indivíduos saudáveis. Foi ainda observado que tal proliferação celular foi evidente nos dias cinco e seis de sintomas. Quando marcadores de ativação celular foram analisados por citometria de fluxo, observou-se um aumento de linfócitos T CD8+ expressando CD38 e HLA-DR nos pacientes, quando comparados com indivíduos saudáveis. Da mesma forma, a ativação celular também aumentou com o passar dos dias de sintomas com destaque para o quinto e sexto dia. Este aumento na ativação das células juntamente com os dias de sintomas, foi igualmente observado em várias subpopulações de células T de memória Além disso, foi observada uma correlação negativa entre o número absoluto de linfócitos T CD8+ e a carga viral. Juntos, os resultados desse estudo sugerem que a infecção por DEN leva a um aumento da ativação de células T CD8+ / Dengue is an acute disease caused by DEN, a Flavivirus transmitted by a mosquito vector, primarily Aedes aegypti. There are four serotypes of dengue viruses (DEN-1, DEN-2, DEN-3 and DEN-4) and their incidences have increased dramatically over the past 50 years, including in Brazil. The goal of this study is to characterize subpopulations of T lymphocytes, mainly CD8+ T cells, from infected patients. Status of cell activation, and memory cell profiles were assessed. Patients were recruited at Hospital Ana Costa, Santos-SP, Brazil, in 2010, after having signed an informed consent form. The serologic diagnosis of dengue was carryied out using a rapid test and immunological parameters were analyzed in flow cytometer. Peripheral blood was collected for cryopreservation of mononuclear cells and separation of serum for viral load testing. Dengue patients showed higher proliferation of CD8+ T cells compared to healthy subjects. Cell proliferation was more evident in the fifth and sixth days of symptoms. We observed increased frequency of CD8+ T cells expressing activation markers CD38 and HLA-DR in patients, when compared to healthy subjects. Similarly, T cell activation also increased along with the passing days of symptoms hitting on the fifth and the sixth days. Such augment in cellular activation along with the days of symptoms was equally observed in the several memory T cell compartments. Furthermore, we observed a negative correlation between the absolute number of CD8+ T lymphocytes and viral load. Together, the results of this study suggest that dengue virus infection leads to an increased activation of CD8+ T cells

A persistência de células T de memória funcionais é importante para garantir uma imunidade protetora na infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). As células T de memória têm sido subdivididas em memória central (TCM), memória efetora (TEM) e memória efetora altamente diferenciada (TEMRA) com base na expressão de moléculas de superfície como CCR7 e CD45RA, e na capacidade de produzir citocinas e proliferar. Recentemente, identificamos 18 peptídeos derivados de seqüências do consenso B do HIV-1, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR e amplamente reconhecidos por linfócitos T de sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV. Diante disso e considerando a importância das células T de memória na manutenção da resposta imune específica, nosso objetivo foi caracterizar fenotípica e funcionalmente as subpopulações de células T de memória de indivíduos infectados pelo HIV envolvidas no reconhecimento in vitro desses epitopos. Foram incluídos 14 indivíduos controles sadios e 61 pacientes HIV+ com contagem de linfócitos T CD4+ maior que 250 células/mm3. Os pacientes HIV+ foram divididos em seis diferentes grupos clínicos de acordo com o estágio da infecção, carga viral (CV) plasmática e uso de terapia anti-retroviral (ART): não progressores por longo tempo (LTNP), avirêmicos em uso de ART (AV-ART), virêmicos em uso de ART (VI-ART), virêmicos sem uso de ART (VI sem ART), virêmicos recéminfectados sem uso de ART (VI-RI) e controladores. Células mononucleares do sangue periférico dos indivíduos do estudo foram estimuladas com o conjunto de peptídeos do HIV-1 e com um conjunto de peptídeos do Citomegalovírus (CMV). A freqüência de células de memória produtoras de IFN- e IL-2 e a proliferação celular antígeno-específica foram detectadas por citometria de fluxo de multiparâmetros. Nossos resultados mostraram que o conjunto de peptídeos do HIV-1 foi capaz de ativar subpopulações funcionais de memória TCM, TEM e TEMRA secretoras de IFN- e IL-2 em 100% dos pacientes HIV+ dos diferentes grupos clínicos. O conjunto de peptídeos do HIV-1 também induziu proliferação das subpopulações de linfócitos T de memória. As freqüências de TEMRA CD4+IFN-+, TEMRA CD4+IFN-+ total, TCM CD8+IFN-+, TCM CD8+IFN-+ total, TEM CD8+IFN-+, TEM CD8+IFN-+ total e TEMRA CD8+IFN-+ correlacionaram-se negativamente com a carga viral do HIV em pacientes virêmicos. Esses dados sugerem que essas subpopulações de memória funcionais são importantes no controle da viremia. Comparando as respostas HIV e CMVespecíficas observamos freqüências mais elevadas de células T de memória produtoras de IL-2, IFN-/IL-2 e IFN- em respostas ao pool de peptídeos do HIV. Esses dados sugerem que esse conjunto de peptídeos derivados de seqüências do HIV-1 ativa respostas polifuncionais de subpopulações de linfócitos T de memória. Nossos resultados mostraram que o conjunto de peptídeos do HIV-1 foi capaz de estimular diferentes subpopulações distintas de linfócitos T de memória produtores de IFN-, IFN-,/IL-2 e IL-2 de indivíduos em diferentes estágios da infecção pelo HIV e sugerem o envolvimento de subpopulações de memória funcionais no controle da viremia. Estes achados fortalecem a possibilidade de uso desses peptídeos em uma formulação vacinal bem-sucedida em humanos / The persistence of functional memory T cell is important to ensure a protective immunity to Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection. Memory T cells have been subdivided into central memory (TCM), effector memory (TEM) and highly differentiated effector memory (TEMRA) based on the expression of surface molecules such as CCR7 and CD45RA, and the ability to produce cytokines and proliferate. Recently, we identified 18 peptides derived from B consensus sequences of HIV-1 that bind to multiple HLA-DR molecules and are widely recognized by peripheral blood T lymphocytes from HIV-infected patients. Given this and considering the importance of memory T cells in the maintenance of specific immune response, our objective was to characterize phenotypic and functionally memory T cell subsets from HIV-infected individuals involved in the recognition of these epitopes in vitro. The study included 14 healthy control subjects and 61 HIV+ patients with CD4+ lymphocytes counts higher than 250 cells/mm3. The HIV+ patients were divided into six different clinical groups according to the stage of infection, plasma viral load (VL) and antiretroviral therapy use (ART): long-term non-progressors (LTNP), aviremic under ART (AV-ART), viremic under ART (VI-ART), viremic without using ART (VI without ART), recently infected viremic without using ART (VI-RI) and controllers. Peripheral blood mononuclear cells from study subjects were stimulated with HIV-1 peptide pool and with a cytomegalovirus (CMV) peptide pool. The frequencies of IFN- and IL-2 producing memory cells and antigenspecific cell proliferation were detected by multiparametric flow cytometry. Our results showed that the HIV-1 set of peptides was able to activate TCM, TEM and TEMRA functional memory subsets that secrete IFN- and IL-2 in 100% of the HIV patients from the different clinical groups. The HIV-1 set of peptides also induced memory T lymphocyte subsets proliferation. TEMRA CD4+IFN-+, total TEMRA CD4+IFN-+, TCM CD8+IFN-+, total TCM CD8+IFN-+, total TEM CD8+IFN-+, TEM CD8+IFN-+ and TEMRA CD8+IFN- + frequencies negatively correlated with HIV viral load in viremic patients. These data suggest that these functional memory subsets are important to control the viremia. When comparing the HIV and CMV-specific responses we observed higher frequencies of IL-2, IFN-/IL-2 and IFN- producing memory T cells in response to HIV peptide pool. These data suggest that this set of HIV sequence derived peptides activates polyfunctional response of memory T lymphocyte subsets. Our results showed that the HIV-1 peptide set was able to stimulate different IFN-, IFN-/IL-2 e IL-2 producing memory T lymphocytes from individuals in different stages of HIV infection and suggest the involvement of functional memory subsets in the control of viremia. These findings strengthen the possibility of using these peptides in a successful vaccine formulation in humans

Para investigar o papel dos linfócitos T no modelo de Paracoccidioidomicose pulmonar, depletamos in vivo os linfócitos TCD4+ e TCD8+ de camundongos resistentes (A/J) e susceptíveis (B10.A) infectados intratraquealmerite com um milhão de leveduras de isolado virulento do Paracoccidioides brasiliensis. Quando comparados ao grupo não depletado de linfócitos TCD4+, após 4 semanas de infecção, camundongos A/J apresentaram aumento da disseminação de leveduras ao fígado; na 8ª semana, contudo, houve redução na carga fúngica pulmonar destes animais. Ao contrário, a depleção de células TCD4+ não alterou a gravidade da doença de animais B10.A em ambos os períodos de infecção. O tratamento com o AcM anti-CD4, em ambos os tempos de infecção, diminuiu as reações de HTT dos animais A/J, mas não alterou a anergia cutânea dos camundongos B10.A. Em adição, ambas as linhagens depletadas tiveram a produção específica de anticorpos diminuída na 4ª e 8ª semanas. Quanto às citocinas pulmonares, após 4 semanas de infecção, os animais A/J depletados apresentaram redução nos níveis de IL-12 pulmonar e na 8ª semana da infecção, esta linhagem apresentou redução nos níveis de IL-10, IL-4, IL-5,IL-2 e GM-CSF pulmonar, e os animais B10.A mostraram aumento nos níveis de IL-12. Por outro lado, verificamos que ambas as linhagens depletadas com o AcM anti-CD8, apresentaram aumento da gravidade da doença após a semanas de infecção, pois camundongos A/J tratados apresentaram aumento da carga fúngica pulmonar, e animais B10.A apresentaram aumento do crescimento fúngico no pulmão e fígado. Animais B10.A depletados de células TCD8+ apresentaram ainda um incremento nas suas reações de HTT específicas. Esses dados sugerem que na linhagem susceptível há a presença de duas subpopulações celulares de TCD8+, uma subpopulação protetora que controla o crescimento fúngico e outra inibidora de reações de HTT. A depleção dos linfócitos TCD8+ não levou a grandes alterações na produção de anticorpos específicos em ambas as linhagens; no entanto, levou a alterações significativas nos níveis das citocinas pulmonares; os animais A/J apresentaram aumento de IL-4, IL-12, IL-3 e GM-CSF, e diminuição de IL-2. Por outro lado, os animais B10.A apresentaram aumento nos níveis de IL-10, IL-12, IL-3 e IFN-γ. Estes resultados demonstraram que nos animais B10.A as células TCD4+ têm pouca ou nenhuma participação no controle da infecção. No entanto, nos animais A/J há duas subpopulações, uma protetora (4ª semana) e outra exacerbadora (8ª semana) dependendo do estágio da doença. Contudo, em ambas as linhagens a subpopulação TCD8+ apresentou-se importante no controle da doença. Além disso, na PCM experimental, tanto as respostas de HTT como a produção de anticorpos específicos, são mecanismos que dependem de células TCD4+ e na linhagem B10.A há uma subpopulação TCD8+ que regula negativamente as reações de HTT. / To investigate the role of T lymphocytes in the pulmonary model of Paracoccidioidomycosis (PCM), resistant and susceptible mice were in vivo depleted of T CD4+ and T CD8+ cells by intraperitoneal injection of specific monoclonal (mAb) antibodies and infected intratracheally with one million yeast cells of a virulent isolate of Paracoccidioides brasiliensis. When compared with the non-depleted group, at week 4 after infection A/J mice presented increased dissemination of yeasts to liver; however, at week 8 A/J-depleted mice showed decreased fungal loads in the lungs. In contrast, depletion of TCD4+ cells of B10.A mice did not alter the severity of disease at any periods of infection assayed. Treatment with anti-CD4 mAb diminished the delayed-type hypersensitivity reactions (DTH) of resistant mice but the cutaneous anergy of B10.A mice was not modified. In addition, CD4-depleted A/Sn and B10.A mice presented decreased titers of P.brasiliensis specific antibodies at both the 4th and 8th week postinfection. Regarding pulmonary cytokines, at week 4 of infection A/J-depleted mice presented diminished levels of IL-12 but at week 8 IL-10, IL-4, IL-S, IL-2 and GM-CSF appeared in lower levels. Only IL-12 was detected in lower levels in the lungs of B10.A-depleted mice at week 8 after infection. Depletion of CD8+ cells led to a more severe disease in both mouse strains. A/J-treated mice presented increased fungal burdens in the lungs whereas in the B10.A strain increased number of yeast cells was detected in the lungs and liver. Importantly, neutralization of CD8+ cells reverted the DTH anergy of susceptible mice. These data suggest the existence of two T CD8+ subpopulations in B10.A mice, a protective that controls fungal growth and another one that suppresses DTH reactions. The production of P.brasiliensis specific antibodies by resistant and susceptible mice depleted of CD8+ T cells was similar to that of mice given control antibody. Neutralization of CD8+ cells, however, induced significant alterations in the concentrations of pulmonary cytokines. In A/J-treated mice, higher levels of IL-4, IL-12, IL-3 and GM-CSF were concomitant with reduced amounts of IL-2. B10.A mice depleted of CD8+ cells presented higher levels of pulmonary IL-10, IL-12, IL-3 and IFN-γ than their controls. As a whole, our results demonstrate that CD4+ T cells have no influence on the control of disease severity of B10.A mice. Depending on the period of the infection, A/J mice develop two subpopulations of CD4+ T cells: one protective subset which appeared early in the infection, followed by a subpopulation that lead to disease exacerbation. Moreover, in both mouse strains CD8+ T cells are protective and able to control fungal growth. It was also verified that DTH reactions and antibody production in murine PCM are CD4+ T cells mediated. Finally, only in B10.A mice a regulatory CD8+ T cell subpopulation was characterized by its ability to suppress DTH reactions

Introdução: A endometriose, condição inflamatória prevalente, associa-se a alterações da reposta imune na cavidade peritoneal e no útero. Evidências sugerem participação de mediadores inflamatórios, como as células Natural Killer e T-reguladoras na patogênese desta doença. A resposta destas células pode ser controlada pela atividade de algumas quimiocinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica das quimiocinas reguladoras das células Natural Killer e T-reguladoras em endométrio tópico em lesões endometrióticas de pacientes com endometriose. Pacientes e Métodos: A expressão gênica das quimiocinas reguladoras da atividade das células Natural Killer (CXCL9, 10, 11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1) e T reguladoras (CCL17 e CCL21) foi avaliada por meio de RTPCR no endométrio tópico e lesão endometriótica de 22 pacientes com endometriose de retossigmóide; 10 pacientes com endometriose retrocervical e no endométrio tópico de 32 mulheres sem endometriose comprovada por laparoscopia para laqueadura tubária. Resultados: Dentre as quimiocinas relacionadas às células Natural Killer, encontramos diferença estatística significativa na CX3CL1 e CXCL12, as quais foram mais expressas no foco de endometriose intestinal e retrocervical, quando comparadas ao endométrio tópico das pacientes e controles (p < 0,05). Das relacionadas às células T-reguladoras, a CCL17 foi mais expressa no endométrio tópico de pacientes com lesão em retossigmóide quando comparada aos demais grupos (p < 0,05). Conclusões: As quimiocinas CX3CL1 e CXCL12 foram mais expressas nos focos de endometriose intestinal e a CCL17 foi mais expressa no endométrio tópico de pacientes com lesão de retossigmóide. Estes resultados sugerem que as quimiocinas CX3CL1, CXCL12 e CXCL17 participam da resposta inflamatória que ocorre na endometriose pélvica / Objective: Endometriosis is a highly prevalent inflammatory condition associated with an altered immune response in the peritoneal cavity and uterus. Evidence suggests a participation of inflammatory mediators such as natural killer (NK) and T-regulatory (T-reg) cells in the pathogenesis of this disease while the response of these cells may be controlled by the activity of some chemokines. Patients and Methods: Gene expressions of the chemokines that regulate the activity of NK (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 and CX3CL1) and T-reg cells (CCL17 and CCL21) were evaluated using real time polymerase chain reaction (PCR) in the eutopic and ectopic endometrium of 22 patients with bowel endometriosis, 10 patients with retrocervical endometriosis and 32 controls. Results: Of the chemokines associated with NK cells, the expression of CX3CL1 and CXCL12 was significantly greater in the foci of endometriosis (p < 0.05). Of those associated with T-reg cells, significant differences between groups were found in CCL17. In addition, CCL17 was expressed to a higher degree in the eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid lesions when compared to the other groups (p < 0.05). Conclusions: Chemokines CX3CL1 and CXCL12 were more expressed in intestinal endometriosis and CCL17 expression was higher in eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid lesions. These results suggest that those chemokines participate in the inflammatory response that occurs in pelvic endometriosis