O veneno da subespécie de cascavel Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus) altera a coagulação, tem ação neurotóxica, miotóxica e efeito imunossupressivo. O veneno de C.d.terrificus e a sua fração majoritária, crotoxina (CTX), inibem a resposta celular e humoral, sendo esse efeito independente da indução de morte celular. O objetivo foi investigar os mecanismos envolvidos na imunossupressão exercida pela CTX. A CTX induz a produção de IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 e prostaglandina E2 (PGE2) pelas células dos camundongos que a receberam. Menor secreção de IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 e IL-12 foi observada nas culturas de células de camundongos imunizados e que receberam CTX. A CTX aumenta a expressão da enzima indoleamina 2,3 dioxigenase e a geração de células T reguladoras em camundongos imunizados com OVA e que receberam CTX. A CTX foi capaz de inibir a expressão de CD40, CD80, CD86 e de MHC de classe II em células de camundongos imunizados e nas células dendríticas (DCs) purificadas destes animais. Em culturas de DCs, a CTX induz alta secreção de IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 e PGE2 e menor de IL-12. / The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus) changes the coagulation system and presents neurotoxic, myotoxic and immunosuppressive effect. The venom and its main fraction, crotoxin (CTX) inhibited both the cellular and humoral response. This effect is not due to induction of cell death. The objective was to investigate the immunosuppressive mechanisms of CTX. CTX induces production of IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 and prostaglandin E2 (PGE2) by cells of mice that received it. Lower secretion of IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 and IL-12 was observed in the cultured cells from mice immunized that received CTX. CTX promotes increased expression of the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase and generation of regulatory T cells in mice immunized with OVA and receiving the toxin. CTX was able to inhibit the expression of CD40, CD80, CD86 and MHC II in mice immunized and in dendritic cells (DCs) purified from these animals. In cultures of DCs, CTX increased secretion of IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 and PGE 2 and lower IL-12.

Utilizando modelo de coinflamação tuberculose e alergia (TB/OVA), nosso grupo mostrou que camundongos BALB/c coinflamados apresentaram diminuição significativa no número de bacilos, associada com diminuição no infiltrado granulomatoso no pulmão, aumento na produção de leucotrieno B4 e no número de células CD8+, quando comparados ao grupo infectado com Mycobacterium tuberculosis (TB). No presente estudo, nosso objetivo foi avaliar os mecanismos envolvidos na restrição ao crescimento dos bacilos nos animais do grupo TB/OVA. Quatro estratégias foram usadas: I) Para avaliar o papel dos linfócitos CD8+ no modelo TB/OVA, foram utilizados camundongos deficientes para a molécula CD8 (CD8KO). Foi observado que não houve diferenças significativas no crescimento do bacilo no pulmão dos animais CD8KO-TB/OVA e WT-TB/OVA. No entanto, nos pulmões dos animais WT-TB/OVA houve maior crescimento de bacilos em relação aos animais WT-TB, diferente do previamente observado com os animais TB/OVA da linhagem BALB/c. Para avaliar o papel dos leucotrienos foram usadas as seguintes estratégias: II). Camundongos da linhagem 129Sv tratados com MK886, inibidor da enzima 5-lipoxigenase (5LO), envolvida na síntese de mediadores lipídicos; III) animais 129Sv, deficientes para a expressão da 5LO (5LOKO). Foi observado que o tratamento com MK886 não afetou o número de bacilos no pulmão do grupo coinflamado TB/OVA quando comparado ao grupo TB/OVA. Além disso, diferente do que foi previamente observado em animais BALB/c, os animais 129Sv coinflamados foram mais susceptíveis que os animais 129Sv infectados. Do contrário, animais 5LOKO-TB/OVA foram mais resistentes que os camundongos WT-TB/OVA. Para avaliar se alterações no infiltrado granulomatoso estavam relacionadas com o infiltrado de macrófagos no pulmão, usamos a quarta estratégia: IV) quantificação das populações de macrófagos M1 e M2. Foi observado que os animais TB/OVA apresentaram aumento da população de macrófagos M2 no pulmão, enquanto a população de macrófagos M1 manteve-se inalterada comparado-se ao grupo apenas infectado. A diminuição no crescimento de bacilos nos animais TB/OVA foi dependente dos macrófagos M2, pois animais deficientes para a expressão do receptor de IL-33 submetidos ao protocolo de coinflamação tiveram diminuição da população de macrófagos M2, e foram susceptíveis à infecção. Esses resultados mostram que a diminuição no crescimento de bacilos nos animais coinflamados TB/OVA é dependente do aumento da população de macrófagos M2. / Using model of coinfection allergy and tuberculosis (TB / OVA), our group showed that coinfected BALB/c showed a significant decrease in the number of bacilli, associated with a decrease in granulomatous infiltrate the lung, increased production of leukotriene B4 and the number of cells CD8+, compared to the group infected with Mycobacterium tuberculosis (TB). To evaluate the mechanisms involved in reducing the growth of bacilli in group TB/OVA, were used four strategies: I) To assess the role of CD8+ lymphocytes in model TB/OVA, we used mice deficient for the molecule CD8 (CD8KO).We was observed that the number of bacilli in the lungs of animals in the group CD8KO-TB/OVA and WT-TB/OVA was similar. However, the lungs of animals WT-TB/OVA growth of bacillus was higher compared to WT animals, TB, unlike what was previously observed with background genetic BALB/c. To evaluate the role of leukotrienes, we use the following strategies: II) strain 129Sv mice treated with MK886, an inhibitor of the enzyme 5-lipoxygenase (5LO), involved in the synthesis of lipid mediators, III) 129Sv animals deficient for the expression of 5LO (5LOKO). We observed that treatment with MK886 did not affect the number of bacilli in the lung of the coinfected group TB/OVA. Moreover, unlike what was previously observed in animals BALB/c mice, coinfected 129Sv were more susceptible than the animals infected 129Sv. On the contrary, 5LOKO-TB/OVA animals were more resistant than mice WT-TB/OVA. To assess whether changes in granulomatous infiltrates were related to macrophages, we use the fourth strategy: IV) quantification of macrophage populations M1 and M2. We observed that M2 population in animals TB/OVA showed increased lung. The decrease in bacilli growth of animals TB/OVA was dependent on macrophage M2, since animals deficient for the expression of IL-33 protocol submitted to coinfected protocol had decreased macrophage population M2, and were susceptible to infection. These results show that the reduction in growth of bacilli in coinfected animals TB/OVA is dependent increase in macrophage population M2.

A via Unfolded Protein Response (UPR) é uma via de sinalização ativada pelo estresse do Retículo endoplasmático (ER). Anteriormente descrevemos um Paciente com Imunodeficiência Comum Variável (CVID) que apresenta um atraso na ativação da via UPR associado com o acumulo de imunoglobulinas dentro do ER e uma taxa de proliferação diminuída. Nossos resultados demonstram que a ativação crônica da UPR interrompe o ciclo celular de EBV-B através da quebra da natureza cíclica da ciclina A1. Essa parada é depende da linhagem EBV-B estudada e da droga utilizada. Além disso, a ativação crônica da UPR aumenta a apoptose através da ativação do braço da PERK da via UPR. Células ex-vivo e EBV-B do Paciente P apresentaram uma taxa metabólica muito baixa e numero aumentado de células em apoptose. A deficiência da resposta do paciente P frente a ativação da via UPR parece ser somente no reconhecimento de proteínas não dobradas. Nossos resultados sugerem que a proliferação deficiente observada em diversos paciente com CVID pode ser resultado de uma ativação deficiente da via UPR. / The unfolded protein response (UPR) is a signaling pathway activated by endoplasmic reticulum (ER) stress. Previously we described a patient (Patient P) with Common Variable Immunodeficiency (CVID) whose delayed activation of the UPR associates with accumulation of immunoglobulins and slower rate of proliferation. Our results showed that chronic UPR stress interrupted cell cycling of EBV-B cells through dysruption of the cyclic nature of cyclin A1. This interrption is depend of the cell type and drug. Furthermore, chronic ER stress triggered early apoptosis through activation of the PERK branch of the UPR. EBV-B and ex vivo cells from patient presented low metabolic rate and a high apoptosis rate even in the absence of ER stressors.. We noted that the deficiency of UPR pathway activation by Patient P apears to be on the recognition of unfolded proteins. Our results support the hypothesis that deficient proliferation observed in some CVID patients might be the result of deficient UPR activation.

Introdução. Apesar das evidências dos efeitos imunomodulatórios da morfina, não há na literatura estudos que tenham comparado a interação entre citocinas, imunidade celular (linfócitos T, B e NK) e a administração prolongada de morfina administrada pelas vias oral ou intratecal em doentes com dor crônica neuropática não relacionada ao câncer. Foram avaliados de forma transversal e comparativa 50 doentes com diagnóstico de dor lombar crônica e com presença de radiculopatia (dor neuropática) previamente operados para tratar hérnia discal lombar (Síndrome Dolorosa Pós- Laminectomia), sendo 18 doentes tratados prolongadamente com infusão de morfina pela via intratecal com uso de sistema implantável no compartimento subaracnóideo (grupo intratecal); 17 doentes tratados prolongadamente com morfina pela via oral (n=17) e 15 doentes tratados com fármacos mas sem opióides (grupo sem opioide). Foram analisadas as concentração das citocinas IL-2, IL-4, IL-8, TNFalfa, IFNy, IL-5, GM-CSF, IL-6, IL-10 e IL-1beta no plasma e no líquido cefalorraquidiano; imunofenotipagem de linfócitos T, B e células NK e avaliados os Índice de Escalonamento de Opióide (em percentagem de opióide utilizada e em mg), dose cumulativa de morfina (mg), duração do tratamento em meses, dose final de morfina utilizada (em mg), e equivalente de morfina por via oral (em mg). Resultados. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o número de linfócitos T, B e NK nos doentes com morfina administrada pelas vias IT, VO e os não usuários de morfina. Houve correlação positiva entre as concentrações de linfócitos T CD4 e o Índice de Escalonamento de Opióide (em % e mg) nos doentes tratados com morfina por via intratecal. Houve correlação negativa entre as concentrações de células NK (CD56+) e o Índice de Escalonamento de Opióide (em % e mg) nos doentes tratados com morfina por via intratecal. Houve correlação positiva entre o número de células NK (CD56+) e a dose cumulativa de morfina (em mg) administrada pelas vias intratecal e oral. Houve correlação positiva entre as concentrações de linfócitos T CD8 e a duração do tratamento em meses nos doentes tratados com morfina pela via oral. As concentrações de IL-8 e IL-1beta foram maiores no LCR do que no plasma em todos os doentes da amostra analisada. As concentrações de IFNy no LCR foram maiores nos doentes que utilizavam morfina pela via oral e nos não usuários de morfina do que nos que a utilizavam pela via intratecal. As concentrações de plasmáticas de IL-5 foram maiores nos doentes utilizavam morfina pela via oral ou intratecal do que nos que não a utilizavam. A concentração de IL-5 no LCR correlacionou-se negativamente com a magnitude da dor de acordo com a EVA nos doentes tratados com morfina pelas via oral ou intratecal. Nos doentes tratados com morfina pelas via oral ou intratecal, a concentração de IL-2 no LCR correlacionou-se positivamente com a magnitude da dor de acordo com a EVA e negativamente com o Índice de Escalonamento de Opióide (em % e mg) e a dose cumulativa de morfina (em mg). As concentrações plasmáticas de GMCSF foram maiores nos doentes utilizavam morfina pela via oral ou intratecal do que nos não a utilizavam. A concentração de TNFalfa no LCR nos doentes tratados com morfina pela via intratecal correlacionou-se negativamente com o Índice de Escalonamento de Opióide (em % e mg), a dose cumulativa de morfina (em mg) e dose equivalente por via oral (em mg) de morfina. A concentração plasmática das citocinas IL-6 e IL-10 correlacionou-se negativamente com a duração do tratamento (em meses) nos doentes tratados com morfina administrada pela via oral. O Índice de Escalonamento de Opióide (em mg e %) correlacionou-se negativamente com as concentrações no LCR de IL-2 e TNFalfa nos doentes tratados com morfina administrada pela via intratecal. O Índice de Escalonamento de Opióide (em mg e %) correlacionou-se negativamente com as concentrações no LCR de IL-2 e IL-5 nos doentes tratados com morfina administrada pela via oral. Houve correlação negativa entre a intensidade da dor de acordo com a EVA e as concentrações de IL-5 e IL-2 no LCR nos doentes tratados com morfina administrada pelas vias oral e intratecal. Houve correlação negativa entre a intensidade da dor de acordo com a EVA e as concentrações plasmáticas de IL-4 nos doentes tratados com morfina administrada pela via intratecal. Houve correlação negativa entre a intensidade da dor de acordo com a EVA e as concentrações plasmáticas de IL-1beta nos doentes tratados com morfina administrada pela via intratecal. Conclusões: Os resultados sugerem associações entre citocinas e imunidade celular (células T , B e NK) e o tratamento prolongado com morfina administrada pela via oral ou intratecal. Estes resultados podem contribuir para a compreensão da imunomodulação da morfina administrada por diferentes vias em doentes com dor neuropática crônica não oncológica . São necessários mais estudos sobre os efeitos da morfina sobre o sistema imunológico / Objective: To analyze plasma and cerebrospinal fluid (CSF) cytokine levels and cell-mediated immunity (T, B and NK cells) of chronic neuropathic pain patients under long-term morphine treatment administered through the oral or spinal routes. Design: Cross- sectional clinical and laboratory analysis. Subjects:Fifty ambulatory patients with diagnosis of chronic low back pain and presence of radiculopathy (neuropathic pain) previously operated to treat lumbar disc hernia (failed back surgery syndrome) receiving long term morphine treatment (minimum 180 days); 18 patients receiving long term morphine into the intrathecal space through a implanted pump (\"spinal group\"); 17 patients treated with long-term oral morphine (\"oral group\") and 15 patients treated with non-opioid analgesics (\"without opioid group\"). Methods: Were analyzed plasma and cerebrospinal fluid concentrations of 10 cytokines using a multiplex system (Luminex®) for the following cytokines: IL- 2, IL-4, IL-8, TNFalfa, IFNy, IL-5, GM-CSF, IL-6, IL-10 and IL-1beta; immunophenotyping of lymphocytes T, B and NK cells. Results: There were no significant group demographic differences. No significant T, B and NK cells differences were observed between the 3 groups. CD4 levels and Opioid Escalation Index (OEI) were positively correlated in spninal group. NK cells levels and OEI were negatively correlated in spinal group. NK cells levels and cumulative morphine dose were positively correlated in spninal and oral groups. CSF concentrations of IL-8 and IL-1beta were higher than plasma concentrations in all groups. CSF concentration of FNg were higher in oral and without opioid group. Plasma IL-5 concentrations were higher in the oral and spinal groups compared to without opioid group. CSF concentration of IL-5 was negatively correlated with pain intensity in the oral and spinal groups. CSF concentrations of IL-2 was positively correlated with pain intensity and negatively correlated with OEI and cumulative morphine dose in the oral and spinal groups. GM-CSF plasma concentrations were higher in oral and spinal group compared to without opioid group. TNFa CSF concentrations was negatively correlated with OEI, cumulative morphine dose and equivalent oral morphine dose in the spinal group. IL-6 and IL-10 plasma concentrations were negatively correlated with treatment duration in the oral group. OEI The significant inverse correlations observed between pain intensity and the plasma IL-6 and IL-10 concentrations in patients receiving longterm i.t. opioids for chronic pain management, suggests that these cytokines are worthy of further investigation as possible biomarkers of persistent pain. CSF concentrations of IL-2 and TNFa were negatively correlated with OEI in spinal group. CSF concentrations of IL-2 and IL-5 were negatively correlated with OEI in oral group and with pain intensity in the oral and spinal group. Plasma concentrations of IL-4 was negatively correlated with pain intensity in spinal group. Plasma concentrations of IL-1beta were negatively correlated with pain intensity in spinal group. Conclusions: The results suggest associations between long term morphine treatment administered by oral or spinal routes and cytokines concentrations and cellmediated immunity (T, B and NK cells). These results can contribute to the understanding of immunomodulation by morphine administered through diferent routes in patients with chronic neuropathic non-cancer pain. Further studies on the effects of morphine on the immune system are needed

INTRODUÇÃO: O papel da linfangiogênese no transplante renal em humanos é desconhecido até o momento. As poucas publicações disponíveis acerca do assunto revelam resultados controversos. O presente estudo visa a avaliar a influência dos vasos linfáticos sobre aspectos clínicos e patológicos no transplante renal. MÉTODOS: Biópsias de indicação clínica de pacientes submetidos a transplante renal com enxertos oriundos de doadores falecidos na Unidade de Transplante Renal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo de janeiro de 2007 a dezembro de 2009 foram selecionadas e os dados clínicos destes pacientes foram coletados do banco de dados. Estas biópsias foram classificadas de acordo com a Classificação de Banff. Reação imuno-histoquímica foi empregada para identificar vasos linfáticos, linfócitos T, linfócitos B e macrófagos. Análise histomorfométrica foi empregada para quantificar estes quatros elementos e a fibrose intersticial cortical. RESULTADOS: A presença de vasos linfáticos foi significativamente mais intensa em biópsias com rejeição aguda mediada por linfócitos T e com distúrbios infecciosos (nefropatia do poliomavírus e pielonefrite), quando comparadas à expressão de linfáticos com biópsias sem rejeição e com biópsias com fibrose intersticial e atrofia tubular de etiologia indeterminada. Biópsias com expressão de vasos linfáticos apresentaram escores semiquantitativos da Classificação de Banff mais altos. Os linfócitos B túbulo-intersticiais apresentaram maior concentração em amostra com presença de vasos linfáticos. A linfangiogênese não demonstrou influência sobre desfechos clínicos relevantes, como função renal e sobrevida do enxerto. CONCLUSÃO: O presente estudo associa a linfangiogênese com distúrbios inflamatórios túbulo-intersticiais do enxerto (rejeição aguda mediada por linfócitos T e infecções) e com infiltrado de linfócitos B. No entanto, a expressão de linfáticos não foi associada à influência sobre a função e a sobrevida do enxerto / INTRODUCTION: The role of lymphangiogenesis in human kidney allograft is currently unknown. Controversial results have arisen from few publications available. This study intends to evaluate the influence of lymphatics on relevant clinical and pathological aspects of renal transplantation. METHODS: Clinically indicated biopsies from patients who underwent renal transplantation with allografts from deceased donors at the Renal Transplantation Unit of the Clinics Hospital of the University of São Paulo Medical School from January of 2007 to December of 2009 were selected and clinical data of these patients were retrieved from the database. These biopsies were classified according to the Banff Classification. Immunohistochemistry was used to identify lymphatic vessels, T lymphocytes, B lymphocytes, and macrophages. Morphometric analysis was employed to quantify their expression and cortical interstitial fibrosis. RESULTS: Lymphatic vessel formation was significantly higher in biopsies with acute T-cell mediated rejection and infectious disorders (polyomavirus-associated nephropathy and pyelonephritis) compared with no rejection and interstitial fibrosis and tubular atrophy without evidence of any specific etiology. Biopsies with expression of lymphatics presented higher levels of semiquantitative scores of the Banff Classification. B lymphocytes infiltrate was more intense in biopsies with lymphatics compared with those without the vessels. Lymphangiogenesis had no effect on important clinical parameters examined (graft function and graft survival two years post transplant). CONCLUSION: The present results associate lymphangiogenesis with kidney allograft tubulointerstitial inflammation (ATCMR and infectious disorders) and with B lymphocytes infiltrate. However, the presence of lymphatic vessels was not associated with any influence on graft function and survival

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-09-20T19:05:22Z No. of bitstreams: 1 alessasinsingerbrugiolo.pdf: 7024795 bytes, checksum: 9af11871ea610d9074a4267774a8aea9 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-09-26T20:25:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alessasinsingerbrugiolo.pdf: 7024795 bytes, checksum: 9af11871ea610d9074a4267774a8aea9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T20:25:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alessasinsingerbrugiolo.pdf: 7024795 bytes, checksum: 9af11871ea610d9074a4267774a8aea9 (MD5) Previous issue date: 2010-03-11 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A asma é uma doença caracterizada por obstrução intermitente das vias aéreas e inflamação crônica e afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo. É considerada um grave problema de saúde, trazendo consigo um grande encargo econômico. A resposta imunológica na asma é predominantemente de linfócitos Th2, com altos níveis de IgE total e alérgeno-específica e eosinofilia brônquica. O tratamento da asma visa ao controle da doença e os medicamentos utilizados atualmente apresentam efeitos colaterais sistêmicos e, em geral, não são eficazes nos casos de asma de difícil controle. Neste trabalho, foi investigado o efeito do extrato aquoso de Echinodorus grandiflorus, planta utilizada pela população por suas propriedades diurética e anti-inflamatória, no modelo de alergia pulmonar no qual camundongos BALB/c foram sensibilizados e desafiados com OVA. O tratamento com o extrato por via oral reduziu marcadamente o número de neutrófilos, linfócitos, macrófagos e eosinófilos no lavado bronco-alveolar (LBA), a atividade da peroxidase eosinofílica (EPO) no tecido pulmonar, os níveis de IgE específica para OVA no soro, os níveis de CCL11 e a expressão gênica de IL-4 e IL-13 no tecido pulmonar e a expressão de CD25 em células do LBA. Entretanto, o tratamento não alterou o infiltrado inflamatório e o número de eosinófilos no tecido pulmonar, os níveis das quimiocinas CCL2 e CCL5, das citocinas IL-4, IL-13, IL-10 e IL-17A e a expressão gênica de Foxp3 no tecido pulmonar e a expressão de CD28 e CD152 nas células do LBA. Esses resultados sugerem que o extrato aquoso de E. grandiflorus é capaz de modular alguns aspectos da inflamação pulmonar alérgica e pode ser útil no tratamento da asma. / Asthma is a disease characterized by intermittent obstruction of the airways and chronic inflammation and affects about 300 million people around the world. It is considered a serious health problem, bringing a large economic burden. The immune response in asthma is predominantly Th2 lymphocytes, with high levels of total and allergen-specific IgE and bronchial eosinophilia. Asthma treatment is aimed at controlling the disease and the drugs used currently have systemic side effects and generally are not effective in cases of asthma are difficult to control. In this study we investigated the effect of aqueous extract of Echinodorus grandiflorus, plant used in folk medicine for its diuretic and anti-inflammatory properties, in the model of lung allergy in which BALB/c mice were sensitized and challenged with OVA. Oral treatment with the extract markedly reduced the number of neutrophils, lymphocytes, macrophages and eosinophils in bronchoalveolar lavage (BAL), the activity of eosinophil peroxidase (EPO) in lung tissue, levels of OVA-specific IgE in serum, levels of CCL11 in lung tissue, the gene expression of IL-4 and IL-13 in lung tissue and the expression of CD25 on BAL cells. However, the treatment did not alter the inflammatory infiltrate and the number of eosinophils in lung tissue, levels of chemokines CCL2 and CCL5, levels of cytokines IL-4, IL-13, IL-10 and IL-17A and gene expression of Foxp3 in the lung tissue and the expression of CD28 and CD152 on BAL cells. These results suggest that the aqueous extract of E. grandiflorus is able to modulate some aspects of allergic pulmonary inflammation and may be useful in the treatment of asthma.

Orientadores: José Andrés Yunes, Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T20:56:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zenatti_PriscilaPini_D.pdf: 14781518 bytes, checksum: 2324b48b89768b42bcd5bf002d30a510 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A IL-7 é uma citocina essencial para o desenvolvimento, sobrevivência, e proliferação dos timócitos prematuros normais no timo e linfócitos T maduros nos órgãos linfoides periféricos. O receptor da IL-7 é um heterodímero constituído pela IL-7Ra (codificado pelo gene IL7R) e IL-2Ry. A IL-2Ry participa também dos receptores da IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 e IL-21, sendo por isso conhecida como cadeia comum gama ou yc. A sinalização via IL-7 é imprescindível para o processo de rearranjo V(D)J dos receptores de células T (TCR), pois leva à modificação da cromatina que permite o acesso da recombinase aos loci TCR no DNA Camundongos defeituosos para a cadeia alfa do receptor da IL-7 (IL-7Ra) desenvolvem imunodeficiências devido à falta de células T. A via IL-7/IL-7Ra é também importante para proliferação e sobrevivência da leucemia linfóide aguda de células T (LLA-T). Suspeitando da existência de mutações em IL7R resultando em ganho de função e hiperativação da via IL-7/IL-7Ra, procurou-se por mutações no gene do IL-7Ra em mais de 50 casos de LLA-T pediátrica. Procurou-se também mutações no domínio de autoinibição das JAK1 e JAK3, moléculas associadas ao IL-7Ra e IL-2Ry, respectivamente. Aproximadamente 9% das LLA-T pediátricas apresentaram mutações no IL-7Ra, resritas a uma região estreita do éxon 6, que resultaram, na maioria dos casos, em inserções de uma cisteína no domínio transmembrana/justamembrana da proteína. A presença dessa cisteína leva à homodimerização das cadeias IL-7Ra mediante a formação de pontes de dissulfeto e à ativação constitutiva do IL-7Ra independente de seu ligante, conforme verificado pela fosforilação de JAK1, STAT5, AKT e BAD e análise de mutantes artificiais do IL-7Ra com subtração ou adição de resíduo de cisteína. Verificou-se também que o local de inserção da cisteína é crítico para que a homodimerização das cadeias IL-7Ra mutantes resulte em ativação da via JAK/STAT. Receptores imitados tiveram um efeito transformante nas linhagens celulares Dl e Ba/F3, que sobreviveram na ausência dos fator de crescimento IL-7 e IL-3, respectivamente. Além disso, células Dl transduzidas com IL7R mutante, quando injetadas em camundongos knockout (KO) para IL7, causaram esplenomegalia, metástase e tumor no local da injeção. Resultados semelhantes foram obtidos com a expressão ectópica do IL7R mutante em células progenitoras hematopoiéticas de camundongos knockout para IL7R, JAK3 e/ou IL2RG, demonstrando que o homodímero IL-7Ra mutante atua independentemente dessas moléculas. Em conclusão, mutações no IL7R contribuem para a leucemogenese em 9% das crianças com LLA-T. Espera-se que a melhor caracterização do mecanismo responsável pela ativação constitutiva do IL-7Ra mutante abra caminho para o desenho de novas drogas e anticorpos monoclonais, o que permitirá avaliar o valor terapêutico do bloqueio/inibição do IL-7Ra mutante nas LLA-T / .Abstract: The IL-7, a product of stromal cells, is normally required for T cells development and for survival of mature peripheral T cells. The IL-7R consists of two components, the IL-7Ra (encoded by IL7R) and the common gamma chain (yc), or IL-2Ry, that is shared by receptors for IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 and IL-21. The IL-7 signaling has a role in V(D)J recombination in developing T and B cells by controlling access of the V(D)J recombinase to the locus. IL-7Ra deficiency mice showed a diminished T cell number and impaired lymphocyte development. Further, the IL-7/IL-7Ra pathway is important for T-acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) proliferation and survival. Hypothesizing that IL7R gain-of-function mutation could be occurring in T-ALL, 50 T-ALL samples were analyzed for mutations. The kinases JAK1 and JAK3, mat are associated with IL-7Ra and yc, respectively, were also studied for mutations. About 9% of childhood T-ALL presented mutations at the transmembrane domain encoded by éxon 6, and all of mem were in-frame insertions and deletions. In all but three cases there was an insertion of cysteine mat is essential for disulfide bond formation and constitutive activation of the receptor independent of IL-7. The constitutive signaling was confirmed by phosphorylation of JAK1, STAT5, AKT and BAD, and analysis of IL-7Ra artificial mutants with or without cysteine. The position of cysteine insertion is very important to disulfide bond formation, to activate the JAK/STAT pathway and to support the proliferation of Ba/F3 and Dl cell lines in the absence of cytokine. Moreover, IL7R mutant transduced Dl cells injected into ILT1' mice caused splenomegaly, metastasis and tumor at the injection site. Similar results were obtained with the ectopic expression of the IL7R mutant in hematopoietic progenitor cells of IL7K1', JAK3'1' and/or IL2RG'1' mice, demonstrating that the mutant homodimer IL-7Ra operates independently of these molecules. In conclusion, mutations in ÚÍQIL7R contribute to leukemo genes is in 9% of children with ALL-T. We hope mat a better comprehension of the mechanism responsible for the constitutive activation of IL-7Ra mutant opens new perspectives into the design of new drugs and monoclonal antibodies, which may turn into valuable therapeutic treatment / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:43:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ruberti_Maristela_D.pdf: 10774061 bytes, checksum: 7afe7ee8aa8c7f97c1f80e66f0cd8bfa (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que camundongos transgênicos DO11.10, cuja maioria dos linfócitos T expressam TCR específico para ovalbumina (OVA) no contexto de...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Previous work from our laboratory showed that DO11.10 transgenic mice, in which the most of T lymphocytes express TCR specific for ovalbumin (OVA) in the context of...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, multisystem inflammatory disease characterized by symmetric and erosive synovitis. The purinergic signaling system plays an important role in the modulation of inflammatory and immune responses through extracellular biomolecules as nucleotides adenine and its adenosine nucleoside derivative, whose extracellular concentrations are controlled by ectoenzymes action as ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA) present on the surface of various cells. The deficiency of vitamin D, a hormone known to play an important role in calcium homeostasis, has been related the several autoimmune diseases, including RA. This fact is due to its immunomodulatory role, where it inhibits the proliferation of T lymphocytes, especially Th1 lymphocytes as well as in the production and action of cytokines. Due to high doses of vitamin D can lead to hypercalcemia and intoxication it was tested the use of a nanoencapsulation system able to release in a controlled and sustainable manner, a reduced dose on site of action. Based on these principles, the effect of vitamin D3 free and nanoencapsulated was evaluated in the score for arthritis, thermal hyperalgesia and paw edema as well as histological analyzes and in the activity of the E-NTPDase and E-ADA enzyme lymphocytes from animals with arthritis induced by complete Freud‟s adjuvant (CFA). Hematological and biochemical parameters, including serum concentrations of vitamin D, were determined. Adult Wistar rats were divided into ten groups: I: control (CN); II: adjuvant-induced arthritis (AR); III: control vehicle (CV); IV: AR+V; V: vitamin D3 free at a dose of 120 IU/day (VD3); VI: AR+VD3 (120 IU/day); VII: control of white formulation (CF); VIII: AR+F; IX: vitamin D3 lipid-core nanocapsules formulation at a dose of 15.84 IU/day (LNC-D3) and X: AR+LNC-D3 (15.84 IU/day). The initiation of treatment was 15 days after the induction of arthritis in a period of 15 days. The results of this study demonstrated that VD3 was able to reduce arthritis score, thermal hyperalgesia and paw edema in rats with AR. At the same time, treatment with LNC-D3 only reduced thermal hyperalgesia and paw edema. The histological analyzes showed that both formulations were able to reduce inflammatory changes induced by CFA. The levels AST showed an increased in the CN group compared to the others. In the group treated with VD3 it was observed an increase in the levels of 25 (OH)D. The activity of the E-NTPDase in lymphocytes from rats that developed AR was higher in comparison with the control group, whereas the activity of E-ADA was lower. This effect was reversed after 15 days of treatment with VD3 and LNC-D3. In addition, both vitamin D3 formulations did not alter the activity of E-NTPDase and E-ADA enzymes in healthy animals. Data from this study indicate that vitamin D3, either in free or nanoencapsulated forms, seems to contribute mitigating the inflammatory process induced by CFA, possibly by modulating the activities of ectonucleotidases, can be used, after further studies, as a complementary therapeutic agent for the treatment of rheumatoid arthritis. / A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica, multissistêmica, caracterizada por sinovite simétrica e erosiva. O sistema de sinalização purinérgica desempenha um papel importante na modulação das respostas inflamatórias e imunes, através de biomoléculas extracelulares, como os nucleotídeos de adenina e seu derivado nucleosídeo adenosina, cujas concentrações extracelulares são controladas por ação de ectoenzimas, como ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase) e ecto-adenosina desaminase (E-ADA) presentes na superfície de diversas células. A deficiência da vitamina D, um hormônio conhecido por desempenhar importante papel na homeostase do cálcio, vem sendo relacionada a diversas doenças autoimunes, entre elas a AR. Este fato deve-se a seu papel imunomodulador, onde atua na inibição da proliferação de linfócitos T, especialmente linfócitos Th1, bem como na produção e na ação de citocinas. Como altas doses podem levar à hipercalcemia e à intoxicação, foi testada a utilização de um sistema de nanoencapsulação capaz de liberar, de forma controlada e sustentada, uma dose reduzida no local de ação. Com base nestes princípios, foi avaliado o efeito da vitamina D3 livre e nanoencapsulada no escore de artrite, na hiperalgesia termal e no edema de pata, bem como em análises histológicas e na atividade das enzimas E-NTPDases e E-ADA de linfócitos de animais com artrite induzida por adjuvante Completo de Freund (CFA). Parâmetros hematológicos e bioquímicos, entre eles a concentração sérica de vitamina D, foram determinados. Ratas adultas Wistar foram divididas em dez grupos: I: controle (CN); II: artrite (AR); III: controle veículo (CV); IV: AR+V; V: vitamina D3 livre na dose de 120 UI/dia (VD3); VI: AR+VD3 (120 UI/dia); VII: controle da formulação branca (CF); VIII: AR+F; IX: vitamina D3 nanoencapsulada na dose de 15,84 UI/dia (LNC-D3) e X: AR+LNC-D3 (15,84 UI/dia). O início do tratamento foi após 15 dias da indução da artrite, em um período de 15 dias. Os resultados do presente estudo demonstraram que VD3 foi capaz de reduzir escore de artrite, hiperalgesia térmica e edema da pata em ratos com AR. Ao mesmo tempo, o tratamento com LNC-D3 reduziu apenas a hiperalgesia térmica e o edema da pata. As análises histológicas mostraram que ambas as formulações foram capazes de reduzir as alterações inflamatórias induzidas por CFA. Os níveis de AST apresentaram um aumento no grupo AR em comparação com os demais. No grupo tratado com a VD3 observou-se um aumento nos níveis de 25(OH)D. A atividade da E-NTPDase em linfócitos de ratos que desenvolveram AR foi maior em comparação ao grupo controle, ao passo que a atividade da E-ADA foi menor. Este efeito foi revertido após 15 dias de tratamento com VD3 e LNC-D3. Além disso, ambas as formulações de vitamina D3 não alteraram a atividade das enzimas E-NTPDase e E-ADA em animais saudáveis. Os dados do presente estudo apontam que a vitamina D3, tanto na forma livre quanto nanoencapsulada, parece contribuir amenizando o processo inflamatório induzido pelo CFA, possivelmente por modular as atividades das ectonucleotidases, podendo após estudos adicionais ser utilizada como um agente terapêutico complementar para o tratamento da artrite reumatoide.

Orientadores: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro. Patrícia Ucelli Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:08:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thome_Rodolfo_M.pdf: 2705250 bytes, checksum: 05d8c21f84c00f9da679ff148b082292 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O camundongo BALB/c, linhagem geneticamente resistente à artrite induzida por colágeno (CIA), pode desenvolver um quadro similar ao de camundongos susceptíveis quando uma proteína não relacionada ao próprio, como a ovalbumina (OVA), é associada a colágeno tipo II (CII). Utilizando esse modelo, avaliamos se a tolerância oral a OVA poderia interferir nas respostas imunes contra CII, bem como o efeito da transferência adotiva de células dendríticas (DCs) tolerogênicas para camundongos artríticos. Para avaliação dos efeitos da tolerância oral sobre o desenvolvimento de artrite em BALB/c, os camundongos foram alimentados com OVA misturada à água de beber na concentração de 4mg/mL, por sete dias consecutivos, antes ou depois do desafio com CII+OVA (100?g/mL de cada antígeno). Para avaliar a participação de células dendríticas (DCs) tolerogênicas na modulação da artrite em BALB/c, células CD11c+ foram isoladas de baços de animais tolerantes à OVA e transferidas adotivamente para camundongos naïve, que foram subsequentemente imunizados com CII+OVA (100?g de cada antígeno). Para acompanhamento da evolução dos quadros de artrite, foram avaliados: o edema de patas, tomando-se regularmente as medidas de espessura de patas; realizadas análises histológicas dos tecidos articulares de joelhos e; conduzidas avaliações ex-vivo dos níveis séricos de anticorpos anti-CII e de respostas proliferativas e produção de citocinas de linfócitos T esplênicos. O tratamento com OVA antes da indução de CIA preveniu o desenvolvimento da artrite em todos os parâmetros analisados, enquanto que o tratamento com OVA após o estabelecimento da doença reduziu significativamente a inflamação e a produção de anticorpos anti-CII. Observamos ainda que a transferência de DCs tolerogênicas preveniu o aparecimento dos sinais clínicos da doença e o aumento dos níveis de anticorpos específicos no soro e reduziu significativamente a proliferação de linfócitos T CII-específicos. Enquanto a frequência de células CD4+CD25+Foxp3+ foi maior nas culturas de células de animais recipientes de DCs tolerogênicas, houve redução significativa na frequência de células produtoras de IFN? e IL-17. Os níveis de TGF-?, IL-4 e IL-10 foram significativamente mais elevados nas culturas de células esplênicas de animais recipientes de DCs tolerogênicas, enquanto que os de IFN-?, IL-6 e TNF-? foram mais reduzidos. Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que a tolerância oral a um antígeno não relacionado ao próprio modifica o curso da artrite experimental em resposta ao colágeno, e que células dendríticas com perfil tolerogênico estão envolvidas nos fenômenos observados / Abstract: BALB/c mice, genetically resistant to collagen-induced arthritis (CIA), can develop a inflammatory condition resembling what is observed in susceptible strains when a non-related protein, such as ovalbumin (OVA), is associated with type II collagen (CII). Using this model, we evaluated whether oral tolerance to OVA could interfere in the immune response against CII, as well as the effect of adoptive transfer of tolerogenic dendritic cells (DCs) to arthritic mice. In order to evaluate the effect of oral tolerance over arthritis development in BALB/c mice, animals were fed with OVA in the drinking water at a 4mg/mL concentration, for seven consecutive days, before or after challenge with CII+OVA (100?g of each antigen). In order to evaluate the participation of tolerogenic DCs in the modulation of arthritis, splenic CD11c+ cells were isolated from OVA tolerant mice and adoptively transferred to naïve mice, which were subsequently immunized with CII+OVA. In order to monitor the evolution of the severity of arthritis, we evaluated paw edema, taking paw thickness regularly measured; performed histological analyses of articular knee tissues and, conducted ex-vivo evaluation of serum specific antibody levels and proliferation and cytokine secretion of splenic T lymphocytes. The treatment with OVA before CIA induction prevented the development of arthritis in all analyzed parameters, while the treatment after disease onset significantly reduced inflammation and CII-specific antibody production. We also observed that tolerogenic DC transfer prevented the appearance of clinical signs of arthritis, the increase of serum specific antibody levels and significantly reduced CII-specific T lymphocytes proliferation. While the frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells were higher in cell culture from tolerogenic DC recipient mice, frequency of IFN?- and IL-17- producing cells were significantly reduced. We observed that levels of TGF-?, IL-4 and IL-10 were significantly higher in cultures of splenic cells from mice recipient of tolerogenic DC, while levels of IFN-?, IL-6 and TNF-? were reduced. Taken together, our results indicate that oral tolerance to a non-related antigen modifies the course of experimental arthritis in response to collagen, and that dendritic cells with a tolerogenic profile are involved in the observed phenomena / Mestrado / Mestre em Genética e Biologia Molecular