O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células Tγ&#948 para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células Tγ&#948, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células Tγ&#948 foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células Tγ&#948 para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina. / The maternal immune system plays an important role on the establishment and maintenance of pregnancy until the onset of parturition in mammals. Our hypothesis is that there is a recruitment of γ&#948T-cell to the endometrium during pregnancy. These cells express a particular cytokine profile that is important to the establishment and maintenance of maternal toleranceto fetal antigens in cattle. Experiment I - To study the population dynamics of immune cells in the peripheral blood of NLNP, 1st and 3rd trimester of pregnancy, PBMCs were separated by Ficoll density gradient and the abundance of CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ and WC1+ was analyzed by single-color flow cytometry. There was no statistical difference of the abundance of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ among groups of cows. Experiment II To analyze the gene expression profile of 1st trimester, LNP and NLNP. PBMCs were isolated by Ficoll density gradient and γ&#948T-cells (WC1+) were enriched by magnetic cell sorting. Both PBMC and WC1+ cells gene expression was analyzed for IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 and TNFA by qRT-PCR. Gene expression analysis showed increased expression of the IL1B, IL6 and TGFB2 in PBMC in NLNP compared with 1st trimester of pregnancy and LNP cows, while other genes analyzed showed no significant difference. Experiment III fragments of endometrium were collected from cows at the early (33 to 35 days of pregnancy), mid (143 to 182 days of pregnancy) and late pregnancy (228 to 247 days of pregnancy). Endometrial immune cells were quantified (CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+, and WC1+) by single-color immunofluorescence. There was an increase CD25+ and CD62L+ cells in the endometrium in early pregnancy. In the mid of pregnancy, there was an increase of WC1+ and CD14+ cells. At the end of pregnancy, there was an increase of CD14+, CD25+, CD18+ and CD62L+. In conclusion, our data suggest that the maternal immune system is modulated according to the stage of pregnancy in the cow. In early pregnancy, there is an increased number of endometrial CD25+ cells that may reflect the activation of local immune response and recruitment of putative T-reg cells to the endometrium for an active establishment of maternal tolerance to fetal antigens. While, in mid pregnancy there is a massive recruitment of γ&#948T-cells and CD14+ to the pregnant endometrium perhaps to maintain an tolerogenic microenvironment and to promote tissue remodeling for proper fetal development and growth. Finally, in late pregnancy, there is a recruitment of effector immune cells such as CD62L+, CD18 and CD14+ cells associated with an increased expression of proinflammatory cytokines (i.e. IFNG, IL-6) to play a role on induction of parturition and uterine involution in the cow

O ácido retinoico (RA), metabolito ativo da vitamina A, exerce ampla atividade biológica sobretudo na modulação da resposta imunológica. A interação do RA com os seus receptores nucleares induz a transcrição de genes que atuam na homeostase de sítios imunológicos, principalmente no tecido linfóide associado à mucosa intestinal (GALT). O RA promove a diferenciação de células T reguladoras CD4&#43CD25&#43Foxp3&#43, a migração de células efetoras para a mucosa intestinal induzindo a expressão de CCR9 e 4&#9467, além de inibir a diferenciação de linfócitos T helper (Th) 17 no intestino, garantindo a homeostase intestinal. Entretanto, eventos mediados pelo RA durante o desenvolvimento do sistema imunológico neonatal ainda não são totalmente conhecidos, principalmente no contexto materno-fetal. Desta forma, o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da suplementação materna com RA, durante a amamentação, no sitema imunológico da prole. Para tanto, camundongos fêmeas C57BL6 Foxp3-GFP receberam 6 doses de RA (1mg/gavagem), durante o período de amamentação, e o grupo controle recebeu apenas óleo vegetal. Os resultados mostram que a suplementação materna com RA foi capaz modular o sistema imunológico da prole aumentando o percentual de linfócitos T reguladores (Treg) esplênicos nas proles com 6 semanas de idade. Além disso, houve aumento percentual de linfócitos Treg, TCD4&#43 e TCD8&#43 que expressam CCR9, tanto no baço quanto nos linfonodos mesentéricos da mães e de suas prole, o que pode proporcionar a migração de células para o intestino. Este efeito foi duradouro nas proles até 6 semanas de idade. A suplementação materna com RA elevou o percentual de linfócitos Treg e linfócitos B IgA&#43 no intestino das proles, e a concentração de imunoglobulina (Ig) A fecal, mas não alterou a composição da microbiota intestinal. Nas mães suplementadas houve redução das concentrações séricas de IgA e IgG. Em contraste com o efeito tolerogênico do RA na lâmina própria do intestino, observamos o aumento sérico de interferon (IFN)- nas proles de mães suplementadas e aumento na secreção de IFN- por esplenócitos induzida por CL097 (agonista de Toll-like receptor 7/8), sugerindo que o RA pode ter um impacto importante na deficiente resposta de perfil Th1 nos neonatos. Para averiguar o efeito modulatório in vivo da suplementação materna de RA, foi avaliada a indução de colite por sulfato de sódio dextrano (DSS) nas proles. Não houve perda de peso acentuado nas proles de mães suplementadas com RA quando comprado às proles de mães controles, além de apresentarem a permeabilidade intestinal conservada e aumento do fator de transformação do crescimento (TGF)- &#946 no homogenato intestinal, indicando menor dano no tecido epitelial do intestino. Apesar disto, o RA não foi capaz de inibir totalmente o processo inflamatório na colite. No conjunto, os achados evidenciam que a suplementação materna com RA foi importante no desenvolvimento da imunidade de mucosa e na manutenção da homeostase intestinal, sendo um importante metabólito para atenuar respostas inflamatórias. A indução sérica de IFN- e após estímulo com CL097 pode indicar o uso de RA como estratégia para potencializar respostas Th1, crucial contra infecções virais e bacterianas no período neonatal. / Retinoic acid (RA), the active metabolite of vitamin A, exerts extensive biological activity mainly in the modulation of the immune response. The interaction of RA with its nuclear receptors induces the transcription of genes that acts on the homeostasis of immunological sites, especially in gut associated lymphoid tissue (GALT). RA promotes the differentiation of CD4&#43CD25&#43Foxp3&#43 regulatory T cells, migration of effector cells to the intestinal mucosa through gut-homing receptors CCR9 and 4&#9467, besides inhibiting the differentiation of T helper (Th) 17 cells in the gut, guaranteeing intestinal homeostasis. However, events mediated by RA during the development of the neonatal immune system are not totally known, especially in the maternal-fetal context. Thus, the aim of the study was to evaluate the effect of maternal RA supplementation during breastfeeding on the immune system of offspring. For this, C57BL/6 Foxp3-GFP female mice with 8-10 weeks-old received 6 doses of RA (1mg / gavage) during the breastfeeding period, and the control group received only vegetable oil. The results show that maternal RA supplementation was able to modulate the offspring immune system by increasing the percentage of splenic regulatory T (Treg) cells in offspring at 6 weeks of age. In addition, there was an enhancement in the CCR9 expression on regulatory T cells and CD4&#43 and CD8&#43 T cells, in the spleen and in the mesenteric lymph nodes of mothers and their offspring, which can provide migration of cells into the gut. This effect was long-term in offspring up to 6 weeks of age. Maternal RA supplementation also increasing the percentage of regulatory T cells and B IgA&#43 cells in the offspring´s gut, beside increasing the fecal immunoglobulin (Ig) A concentration, but did not alter the composition of the intestinal microbiota. In the supplemented mothers, serum concentrations of IgA and IgG were reduced. In contrast to the tolerogenic effect of RA on intestinal lamina propria, we observed a serum increase of interferon (IFN)- in offspring and increasing in CL097(Toll-like receptor 7/8 agonist)-induced IFN- secretion by splenocytes, suggesting that RA may have a significant impact on the deficient Th1 profile response in neonates. To investigate the modulatory effect in of RA maternal supplementation, was evaluated the induction of colitis by dextran sodium sulfate (DSS) in the offspring. There was no significant weight loss in the offspring from mothers supplemented with RA in comparison with the offspring from control mothers, as well as having preserved intestinal permeability and increased transforming growth factor (TGF)- &#946 in the intestinal homogenate, indicating less damage to intestinal epithelial tissue. Despite this, RA was not able to totally inhibit the inflammatory process in colitis. Taken together, the findings show that maternal RA supplementation was important in the development of mucosal immunity and maintenance of intestinal homeostasis, being an important metabolite to attenuate inflammatory responses. Induction of serum IFN- after TLR7/8 (CL097) stimulation may indicate the use of RA as a strategy to potentiate Th1 responses, crucial against viral and bacterial infections in the neonatal period.

As células dendríticas (DCs) são as mais eficazes células apresentadoras de antígenos. Mesmo com a possibilidade da geração de DCs in vitro, que permitiu a criação de protocolos de vacinação antitumoral, mecanismos de tolerância periférica, mediados por células T reguladoras, impedem uma resposta imune antitumoral eficaz. O presente estudo visou avaliar, in vitro, a geração de linfócitos T reguladores por células dendríticas derivadas de pacientes portadoras de câncer de mama. Para tanto, DCs foram diferenciadas a partir de monócitos do sangue periférico de pacientes com câncer, por sete dias, na presença de GM-CSF e IL-4 (DCs imaturas - iDCs), e ativadas, por adição de TNF-<font face=\"Symbol\">a no dia cinco de cultura (DCs maduras - mDCs). As DCs foram caracterizadas, por citometria de fluxo, quanto à: expressão de CD1a, CD11c, CD14, CD80, CD86, CD83, CD123, PD-L1, HLA-ABC e HLA-DR; produção de IL-10 e TGF-beta1, por ELISA; e ainda em ensaio funcional, que se deu pela co-cultura das DCs com linfócitos T (CD3+, CD3+CD25neg ou CD4+CD25neg), isolados por microsferas imunomagnéticas. Após co-cultura, a expressão de CD25, a proliferação (diluição de CFSE), a produção de citocinas (IFN-<font face=\"Symbol\">g, IL-10, TGF-beta1) e a geração de células Tregs foram analisadas. As células foram caracterizadas como Tregs por seu fenótipo (CD4+CD25+CD127lowCTLA-4+Foxp3+) e sua capacidade supressora sobre linfócitos alogeneicos. iDCs de pacientes apresentaram aumento da expressão de CD86 (com duas subpopulações: CD86High e CD86Low) e CD123 além de produção elevada de IL-10 e TGF-beta1 bioativo. Co-culturas com DCs de pacientes apresentaram níveis altos de TGF-beta1 bioativo (298,08 pg/ml x ctrl: 57,63 pg/ml) e induziram um alta freqüência de Tregs (iDCs: 57% ± 4,1; mDCs: 48% ± 5,0 x ctrl: 2,5% ± 0,7) a partir de precursores CD25negFoxp3neg, que foram capazes de suprimir a proliferação de linfócitos alogeneicos. O bloqueio de TGF-beta nas co-culturas reduziu parcialmente a freqüência de Treg geradas por DCs de pacientes. Esses achados são condizentes com a alta freqüência de Tregs no sangue periférico dessas mesmas pacientes (19,5% ± 2,3 x 8% ± 2,3) e com a presença de células com fenótipo de DCs no sangue, apresentando marcação semelhante a iDCs geradas in vitro. Por outro lado, iDCs provenientes de doadoras saudáveis induziram estimulação linfocitária mais intensa (35,7% ± 7,9 x 11,8 ± 5,9% CD25+), intensa proliferação de linfócitos CD4+ (82,7% x 29,4%) e CD8+ (73,8% x 21%) e alta produção de IFN-<font face=\"Symbol\">g (109,85 pg/ml x 7,86 pg/ml) nas co-culturas. Estes dados indicam que DCs derivadas de monócitos de pacientes com câncer de mama apresentam um viés imunossupressor que não é estritamente dependente do seu status de maturação ou de TGF-beta. Esses achados além de contribuir para a compreensão das interações entre o sistema imune e as neoplasias, devem ser considerados no delineamento de protocolos imunoterapêuticos baseados em DCs. / Dendritic cells (DCs) are the most effective professional antigen-presenting cells. Even considering the possibility of generating DCs in vitro, which allowed the design of antitumor vaccination protocols, mechanisms of peripheral tolerance mediated by regulatory T cells prevent an effective antitumor immune response. The aim of our study was evaluate, in vitro, the induction of regulatory T cells by dendritic cells derived from breast cancer patients.DCs were differentiated from breast cancer patients blood monocytes, for seven days, in the presence of GM-CSF and IL-4 (immature DCs- iDCs) and activated by TNF-<font face=\"Symbol\">a on day five of culture (mature DCs- mDCs). DCs were characterized by flow cytometry to CD1a, CD11c, CD14, CD80, CD86, CD83, CD123, PD-L1, HLA-ABC and HLA-DR expression; the cytokine secretion to IL-10 and bioactive TGF-beta1, by ELISA; and in functional assay by co-culturing DCs with T lymphocytes (CD3+, CD3+CD25neg or CD4+CD25neg) isolated by microbeads. Cell activation (CD25 expression), proliferation (CFSE dilution), cytokine production (IFN-gamma, IL-10 and TGF-beta1) and de novo regulatory T cells (Tregs) generation, were analyzed in these co-cultures after 5 or 6 days. Tregs were characterized by their phenotype (CD4+CD25+CD127LowCTLA-4+Foxp3+) and suppressive capability on allogeneic T cell proliferation. Patients iDCs showed a higher expression of CD86 (two subpopulation: CD86High and CD86Low) and CD123 beyond the elevated production of IL-10 and bioactive TGF-beta1. Co-cultures using patients DCs presented high levels of bioactive TGF-beta1 (298.08 pg/ml x ctrl: 57.63 pg/ml) and induced elevated frequency of Tregs (iDCs: 57% ± 4.1; mDCs: 48% ± 5.0 x ctrl: 2.5% ± 0.7) from CD25neg Foxp3neg precursors, which were able to suppress the allogeneic lymphocyte proliferation. The TGF-beta blocking partially reduced the frequency of induced Tregs by patients DCs. These findings are consistent with the higher frequency of Tregs on peripheral blood of those patients (19.5% ± 2.3 x ctrl 8% ± 2.3) and the presence of DCs also on the blood, showing similar markings with iDCs generated in vitro. Contrastingly, iDCs from healthy donors were better stimulator cells, leading to a higher CD25+ cell frequency (ctrl 35.7% ± 7.9 x 11.8 ± 5.9% CD25+), more intense proliferation of CD4+ (82.7% x 29.4%) and CD8+ (73.8% x 21%) cells and higher production of IFN-gamma (109.85 pg/ml x 7.86 pg/ml) on co-cultures. These data indicate that DCs derived from breast cancer patients show an immunosuppressive bias that is not strictly dependent on DCs maturation status or TGF-beta. Finally, these observations call to caution in the use of patients monocytes for the generation of DC-based vaccines and also contribute to the comprehension of the interactions between the immune system and cancer.

Com o objetivo de verificar se as proteínas do sistema GH-IGF-IGFBP e o receptor do fator de crescimento insulina símile tipo I (IGF-IR) estão envolvidos na etiopatogenia do Diabetes Melito tipo 1 (DM1) , foram estudados 23 pacientes prépúberes portadores de DM1 em diferentes fases do diagnóstico (Grupo A: tempo de diagnóstico <= 6 meses; Grupo B: tempo de diagnóstico > 6 meses) e 10 indivíduos pré-púberes sadios como grupo controle (Grupo C). A expressão do mRNA do IGFIR realizada através do ensaio molecular de RT-PCR nos linfócitos periféricos T e B não demonstrou diferenças estatisticamente significantes nos linfócitos T quando comparados indivíduos diabéticos e controles, sugerindo que a ativação imunológica destas células seja independente da ação do IGF-IR. Observou-se uma maior expressão do mRNA do IGF-IR dos linfócitos B de pacientes diabéticos em relação ao grupo controle (p < 0,05). A avaliação das proteínas do sistema GH-IGF-IGFBP não demonstrou diferença estatística significante entre os grupos. Estes achados, associados à presença de auto-anticorpos para o DM1 (ICA, anti-GAD e anti-IA2) sugerem fortemente o papel do IGF-IR na ativação dos linfócitos B envolvidos na etiopatogenia do DM1 / Aiming to verify if GH-IGF-IGFBP proteins system and insulin-like growth factor type I receptor (IGF-IR) are implicated on pathofisiology of type 1 Diabetes Mellitus (DM1), we studied 23 prepubertal patients with DM1 on different stages of diagnosis (Group A: time of diagnosis <= 6 months; Group B: time of diagnosis > 6 months) and 10 prepubertal healthy subjects as control group (Group C). The RT-PCR molecular assay for IGF-IR mRNA on peripheral T and B lymphocytes didn\'t show statistical differences between the groups when T cells were analyzed. We found an increase of IGF-IR mRNA expression on B cells from diabetic patients when compared to healthy subjects (p< 0,05). There were no differences in the GH-IGF-IGFBP proteins system levels between the groups. Our study suggest that IGF-IR in association with diabetes-related autoantibodies (ICA, anti-GAD and anti-IA2) presence could activate B cells involved on pathofisiology of DM1

INTRODUÇÃO: A deficiência de IgA (DIgA) é a imunodeficiência primária mais comum e caracteriza-se pela presença de concentrações de IgA sérica abaixo de 7 mg/dL e níveis normais de IgM e IgG. A maioria dos indivíduos acometidos não apresenta doença aparente embora alguns possam apresentar infecções recorrentes ou crônicas de mucosas, atopia e/ou doenças autoimunes (DAIs). Presumivelmente, a doença resulta de um defeito na troca de isótipo para IgA ou de falha na maturação de linfócitos produtores de IgA. A imunodeficiência comum variável (ICV) constitui uma deficiência primária de anticorpos caracterizada por níveis séricos baixos de IgG, IgA e/ou IgM, ao lado de valores normais ou diminuídos de linfócitos B e/ou T, levando a infecções crônicas ou recorrentes principalmente dos tratos respiratório e gastrintestinal. Embora a fisiopatologia da ICV ainda não esteja esclarecida, em muitos pacientes ela pode ser decorrente de algum defeito intrínseco de linfócitos B. De modo especial, as células B de memória (CD27+) têm sido correlacionadas com alguns aspectos clínicos da doença. Números elevados de células B de memória com persistência de IgM (CD27+IgM+) parecem estar correlacionados com a presença de infecções, enquanto valores diminuídos de células B de memória clássicas ou class-switched (CD27+IgG-IgM-) parecem estar associados a baixos níveis de IgG e presença de autoimunidade. A progressão de DIgA para ICV tem sido descrita em alguns pacientes embora não constitua regra geral. Uma hipótese é a de que uma base genética comum e a associação com DAIs possam constituir fatores de risco para a progressão de DIgA para ICV. Há relato anterior de que a persistência de células B imaturas IgM+ IgD+ em alguns pacientes com DIgA estava associada à progressão para ICV. Adicionalmente, há evidências de que a diminuição de células B de memória em uma proporção de pacientes com ICV esteja associada à presença de autoimunidade. OBJETIVOS: comparar em pacientes com DIgA e ICV várias subpopulações de células B e analisar a relação entre estas populações celulares e a presença de DAIs em ambos grupos. MÉTODO: Este estudo incluiu 56 pacientes adultos de ambos sexos com DIgA e ICV, distribuídos em grupos de acordo com a associação com DAI: grupo DIgA sem DAI (14 pacientes), grupo DIgA com DAI (14 pacientes), grupo ICV sem DAI (14 pacientes) e grupo ICV com DAI (14 pacientes). As seguintes subpopulações de células B foram determinadas por citometria de fluxo de quatro-cores: células B naive (CD19+IgM+), células B de memória clássicas ou class-switched (CD27+IgM-IgD-) e células B de memória imaturas (CD27+IgM+ or CD27+IgD+). Na análise estatística foi aplicado o teste de ANOVA; valores significativos foram determinados pela correção de Bonferoni. RESULTADOS: os grupos analisados foram homogêneos quanto à idade e distribuição de gêneros. Os valores de linfócitos totais e de células B naive foram similares nos quatro grupos estudados. Os pacientes com deficiência de IgA e ICV com DAIs associadas apresentaram valores igualmente aumentados de células B de memória imaturas CD27+IgM+ e CD27+IgD+ quando comparados a pacientes sem doenças autoimunes. CONCLUSÕES: estes resultados sugerem que a persistência de células B de memória imaturas possa estar relacionada à presença de autoimunidade em pacientes com DIgA e ICV. Especula-se se a persistência destas células em pacientes com DIgA e DAI associada possa constituir fator preditivo da progressão de DIgA para ICV. / INTRODUCTION: IgA deficiency (IgAD) is the most common primary immunodeficiency disorder and is characterized by serum IgA concentration below 7 mg/dL and normal serum IgM and IgG levels. Most of the affected individuals have no apparent disease, whereas selected patients suffer from recurrent or chronic mucosal infections, atopy and/or autoimmune diseases (AIDs). This defect is presumed to result from impaired class-switching to IgA or from maturational failure of IgA-producing lymphocytes. Common variable immunodeficiency (CVID) is a primary antibody deficiency disease characterized by low serum levels of IgG, IgA and/or IgM, and normal or decreased B and/or T cell numbers, leading to chronic or recurrent infections, noted mostly in the respiratory and gastrointestinal tract. While the pathophysiology of CVID remains elusive, in many patients it may be due to an intrinsic B cell defect. Memory B cells (CD27+) in particular, have been noted to correlate with certain clinical aspects of the disease. High numbers of IgM+ memory B cells (CD27+IgM+) appear to correlate with the presence of infections, whereas decreased numbers of classic (class-switched) memory B cells (CD27+IgG-IgM- ) correlate with lower serum IgG levels and increased rates of autoimmune features. Progression from IgAD to common variable immunodeficiency (CVID) has been reported in some patients, but is not a general rule. It is postulated that a common genetic base and association with AIDs could be risk factors for progression from IgAD to CVID. OBJECTIVES: The aim of this study was to compare B cell subpopulations of patients with IgAD and with CVID, and to assess the relationship between these populations and the presence of autoimmune diseases in both group of patients: . METHOD: The study included 56 adult patients of both genders with IgAD or CVID. Patients were grouped, according to the association with autoimmune disease,as follows: group IgAD with AID (14 patients), group IgAD without AID (14 patients), group CVID with AID (14 patients) and group CVID without AID (14 patients). We determined by immunophenotyping of lymphocytes by four-colour cytometry the following subpopulations of B cells: naïve B cells (CD19+IgM+), class-switched memory B cells (CD27+IgM-IgD-) and immature B memory cells (CD27+IgM+ or CD27+IgD+). Statistical analysis was performed by the ANOVA test; significant P-values were determined by means of Bonferonis correction. RESULTS: there is no statistically significant difference between the average ages and the gender of patients between the groups. the distribution of the sample values seem to indicating that, there is no statistically significant difference in the CD19 levels between the groups. patients with AID represent greater values of CD27 IgM+ and CD27+ IgD+ than patients without AID, independent of the group studied. CONCLUSIONS: These results suggest that the persistence of immature memory B cells in patients with IgAD and CVID can be related to autoimmune diseases. We speculate if the persistence of immature B cells can constitute risk factor to progression of IgAD for CVID.

INTRODUÇÃO: As infecções causadas por bactérias ou vírus são frequentes em pacientes com imunodeficiência comum variável (ICV) devido à deficiência de anticorpos e associação com alteração da função das células T. OBJETIVOS: Avaliar o efeito da ativação de receptores Toll-like (TLR) utilizando ligantes de TLRs em células T monofuncionais ou polifuncionais em pacientes com ICV. MÉTODOS: Foram selecionados 16 pacientes com ICV do Ambulatório de Manifestações Dermatológicas das Imunodeficiências Primárias ADEE3003 HC-FMUSP e 16 controles saudáveis. Os métodos utilizados de citometria de fluxo foram: a) análise em sangue periférico de linfócitos B, linfócitos T quanto ao perfil de ativação/maturação, linfócitos T foliculares (Tfh) e células T reguladoras (Treg); b) dosagem de citocinas e quimiocinas em amostras de soro e em sobrenadante de culturas de células mononucleares do sangue periférico (CMNs) estimuladas com agonistas de TLRs; c) avaliação das células TCD4+ mono e polifuncionais secretoras de IL-17a, IL-22, TNF, IFN- e IL-10, e expressão de marcador de ativação crônica de CD38 estimuladas por agonistas de TLR2, TLR3 e TLR7/8 e estímulos policlonais como enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) e acetato miristato de forbol e ionomicina (PMA/IONO); d) células Th22 e Tc22 estimuladas com TLR e SEB. RESULTADOS: Na ICV, os linfócitos B do sangue periférico mostram diminuída frequência, sendo em maior frequência de linfócitos B naïve (CD19+IgD+CD27-), e ausência de células B de memória. Além disto, um aumento na expressão do marcador de exaustão PD-1 foi observado nas células TCD4+ de memória efetora (CD45RA-CCR7-) e na expressão de CD38, em células TCD8+ terminalmente diferenciadas (CD45RA + CCR7-). Em contraste, houve diminuição na frequência de células T reguladoras naïve nos pacientes com ICV. Nos indivíduos com ICV foi observado aumento na frequência de células TCD4+ TNF+ sob estímulo TLR2 e TLR7/8 comparado ao grupo controle, enquanto que sob estímulo com PMA/IONO houve menor frequência de células TCD4+ e TCD8+ secretoras de IFN-y IL-17a, IL-22 ou TNF. Já em células TCD8+ houve importante redução na ativação via TLR3 na resposta de IL-22, IFN-y e IL-17a. Contudo, os estímulos com TLR7/8 e SEB foram capazes de aumentar a frequência de células Th22 e Tc22 nos pacientes com ICV. Em geral, as células TCD4+, que secretam simultaneamente 4 a 5 citocinas induzidas por TLR foram preservadas em ICV. Embora as células TCD4+ polifuncionais secretoras de 3 citocinas, foram capazes de responder a estímulos via TLR2 e TLR7/8, as células TCD8+ não responderam para qualquer estímulo via TLRs. Além disso, as células T que expressam CD38 mostraram menor polifuncionalidade aos estímulos via TLRs e PMA/IONO. O perfil inflamatório nos pacientes com ICV foi observado pela elevação sérica de IL-6, CCL-2, CCL-5, CXCL8, CXCL-9, CXCL-10. Alteração na resposta aos agonistas de TLRs em ICV pode ser observada com a ativação dos agonistas de TLRs em CMNs, que mostrou maior produção de TNF e diminuição de CCL2 e CXCL8 após ativação via TLR4. Em contraste, o agonista de TLR7/8, teve ação oposta induzindo CXCL10 e reduzindo os níveis de CXCL9. Chama atenção no ICV, à reduzida secreção de IFN-alfa induzida por TLR7/8, que não foi observada com a ativação via TLR9. CONCLUSÕES: Até o momento, os achados em ICV mostram alterações nas células T, seja quanto à baixa frequência de células T reguladoras naïve e a reduzida resposta efetora, em especial das células TCD8+. Contudo, enfatiza o potencial de adjuvante dos agonistas de TLR7/8 na ativação das células T / INTRODUCTION: Infections caused by bacteria or viruses are common in patients with Common Variable Immunodeficiency (CVID), due to antibody deficiency and association with altered function of T cells. OBJECTIVES: To evaluate the effect of Toll-like receptors (TLR) activation using TLR agonists on the monofunctional or polyfunctional T cells in patients with CVID. METHODS: We selected 16 patients with ICV from the Dermatologic Manifestations of Primary Immunodeficiencies Clinic ADEE3003 HC-FMUSP and 16 healthy controls. The methods used for flow cytometry were: a) analysis of peripheral blood B lymphocytes, T lymphocytes were assessed by the activation/maturation profile, follicular T cells (Tfh) and regulatory T cells (Treg); b)evaluation of cytokines and chemokines serum levels and in supernatants of mononuclear cell cultures from peripheral blood (PBMC) stimulated with TLR agonists; c) evaluation of mono and polyfunctional CD4+ T cells secreting IL-17a, IL-22, TNF, IFN-y and IL-10, and expression chronic activation marker of CD38 stimulated by agonists of TLR2, TLR3 and TLR7/8 and polyclonal stimuli such as Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) and phorbol myristate acetate and ionomycin (PMA / IONO); d) analysis of Tc22 and Th22 cells stimulated with TLR and SEB. RESULTS: In the CVID, the peripheral blood B cells show decreased frequency, being higher frequency of naïve B cells (IgD+ CD19+ CD27-) and lack of memory B cells. Moreover, an increased expression of PD-1, an exhaustion marker, was detected in the CD4+ T cell effector memory (CD45RA- CCR7-) and expression of CD38 on CD8+ T terminally differentiated cells (CD45RA+ CCR7-). In contrast, a decreased frequency of naïve regulatory T cells was detected in the patients with CVID. In CVID patients it was observed increased frequency of T CD4+ TNF+ cells upon TLR2 and TLR7/8 agonists compared to the control group, while under stimulation with PMA /IONO there was a lower frequency of CD4+ and CD8+T cells secreting IFN-y, IL-17a, IL-22 or TNF. The CD8+T cells showed a significant reduction of in the IL-22 response, IFN-? and IL-17a induced by TLR3 activation. However, stimulation with TLR7/8 and SEB were able to increase the frequency of Th22 and TC22 cells in the patients with CVID. In CVID patients it was observed increased frequency of T CD4+ TNF+ cells upon TLR2 and TLR7/8 agonists compared to the control group, while under stimulation with PMA /IONO there was a lower frequency of CD4+ and CD8+ T cells secreting IFN-y, IL-17a, IL-22 or TNF. The CD8+ T cells showed a significant reduction of in the IL-22 response, IFN-y and IL-17a induced by TLR3 activation. However, stimulation with TLR7/8 and SEB were able to increase the frequency of Th22 and TC22 cells in the patients with CVID. In general, CD4+ T cells that secrete simultaneously 4 to 5 cytokines induced by TLR were preserved in CVID. Although polyfunctional CD4+ T cells secreting 3 cytokines were able to respond to TLR2 and TLR7/8 agonists, the CD8+ T cells did not respond to any stimuli. In addition, T cells expressing CD38, showed lower polyfunctionality to the stimuli via TLRs and PMA/IONO. Furthermore, the inflammatory status in the patients with CVID was observed by the increased serum levels of IL-6, CCL-2, CCL-5, CXCL8, CXCL-9, CXCL-10. In contrast, the agonist of TLR7/8 had opposite action inducing CXCL10 and reducing the CXCL9 levels. Noteworthy in CVID, that the reduced secretion of IFN-alfa induced by TLR7/8 was not observed with TLR9 activation. CONCLUSIONS: To date, the CVID findings shows alterations in the T cells, as the low frequency of naïve regulatory T cells and reduced effector response, mainly of CD8+ T cells. However, it emphasizes the adjuvant potential of the TLR7/8 agonist in the T cells activation

Durante a ativação policlonal induzida pelo P. chabaudi a maior fonte de IL-2 são as células CD4+ ativadas, além disso, acorre a expansão de células Treg. No dia 7 após a infecção, a ausência de células Treg leva a uma exacerbação da ativação de células CD4+, além de altos níveis de anticorpos anti-P.chabaudi e auto-anticorpos. A neutralização da IL-2, com Mab anti-IL-2 JES6-1, na fase aguda da infecção leva a uma redução no número de células Treg. No dia 20 de infecção, a freqüência de células CD4+ ativadas esteve elevada e as células Treg voltaram aos níveis basais. Experimentos in vitro mostraram que a neutralização da IL-2 não altera a proliferação antígeno-específica de células CD4+ da fase aguda da infecção, porém, em tempos tardios da infecção houve um drástico aumento na freqüência de células CD4+ que proliferam em resposta a eritrócitos parasitados. Podemos concluir que a IL-2 e as células Treg são capazes de limitar a ativação policlonal induzida pelo P. chabaudi ainda que com cinéticas distintas. / Polyclonal activation during P. chabaudi infection results on a huge IL-2 production by activated CD4+ T cells, besides a considerable expansion of Treg cells. At day 7 after infection in the absence of Treg cells there is an enhanced response of activated CD4+ T cells, an increase of Abs anti-P.chabaudi and autoantibody production. Neutralization of IL-2 with Mab anti-IL2 JES6-1 during acute infection reveals a markedly reduction in Treg-cells number. At day 20 of infection we can observe an increase on activated CD4+ T cells frequency. Moreover, Treg cells return to values similar to controls. IL-2 in vitro assays during acute infection results on Ag-specific CD4+ T cells proliferation, on the other hand, at the late infection, we observed a huge increase of CD4+ T cells frequency that strongly response to PRBC. Our findings suggest that IL-2 and Treg cells are capable of restricting PLA during P.chabaudi infection, although with different kinetics.

O carcinoma espinocelular de lábio (CEC) é uma patologia relativamente freqüente e acomete preferencialmente indivíduos de pele clara e com antecedentes de exposição solar. A localização labial do CEC está associada ao comportamento clínico mais agressivo. Algumas características clínicas e histológicas, como tamanho do tumor, grau de diferenciação, espessura, invasão perineural e perivascular, atuam como fatores prognósticos do CEC de lábio. A presença do infiltrado inflamatório vem sendo associada ao comportamento de diversos tumores, dentre eles o CEC. Esse infiltrado é composto por linfócitos T, B, células natural killer, macrófagos e eosinófilos. O papel do infiltrado eosinofílico no CEC é bastante controverso, mostrando associação tanto com melhor como com pior prognóstico. Neste trabalho, tentamos relacionar os infiltrado eosinofílico e linfocítico entre si e estabelecer uma possível associação com o prognóstico do tumor. Foram avaliados 29 casos de CEC de lábio atendidos no ambulatório de cirurgia dermatológica do HC-FMUSP, no período de 1980 a 1989. Foram colhidos dados clínicos provenientes dos prontuários (sexo, idade, tabagismo, duração da lesão, presença de recidiva e metástase) e dados histológicos (grau de diferenciação, espessura, invasão perineural e perivascular, comprometimento da camada muscular, contagem de eosinófilos peritumoral e intratumoral, contagem de linfócitos) em lâminas coradas pela hematoxilia-eosina. A comparação entre a quantificação dos eosinófilos na área intra e peritumoral mostrou-se semelhante. Não foi encontrada significância estatística entre a contagem de eosinófilos tumorais e fatores que funcionam como prognósticos do CEC de lábio (espessura, duração da lesão, infiltrado perivascular e perineural, comprometimento da camada muscular, grau de diferenciação, presença de recidiva e metástase). O infiltrado linfocítico desempenha fator prognóstico nos casos de melanoma, porém, no CEC, ainda é controverso. Foi realizada a classificação semiquantitativa do infiltrado linfocítico e comparada às mesmas variáveis estudadas com os eosinófilos. Foi encontrada relação estatisticamente significativa entre maior infiltrado linfocítico e menor grau de diferenciação das células tumorais, sugerindo um papel importante dos antígenos de superfície presentes no desencadeamento da resposta imune linfocitária anti-tumoral. As outras comparações não se mostraram significativas. Tentamos relacionar ainda a quantidade de eosinófilos e linfócitos no infiltrado, e observamos que as duas populações de células se comportam de maneira independente. Concluímos então que os infiltrados eosinofílicos peritumoral e intratumoral apresentam quantidades semelhantes de eosinófilos; o infiltrado eosinofílico não tem relação com prognóstico do CEC de lábio; o número de linfócitos no infiltrado tumoral é maior em tumores mais indiferenciados; o infiltrado linfocítico não influencia no restante dos fatores que funcionam como prognóstico do CEC de lábio; a quantidade de eosinófilos e linfócitos no CEC de lábio comportam-se de maneira independentes / The squamous-cell carcinoma (SCC) is a pathology quite frequent in people in general, mostly in white persons with history of excessive exposition to the sun rays. The fact of the SCC is located on the lips is associated with the most aggressive clinical behavior. Some clinical and histological characteristics, as the size of the tumor, degree of differentiation, density, perineural and perivascular invasion, act as prognostic factors of SCC of the lip. The presence of the tumor-infiltrating has being associated with the behavior of several tumors, including SCC. This infiltrating is composed by lymphocytes T, B, natural killer cells, macrophages and eosinophils. The role of the eosinophilict infiltrating in SCC is controversial enough because it shows association with both best and worst prognosis. In this study, we tried to stablish relations between the eosinophilic and the lymphocytic infiltratings, to stablish a possibility of association with the tumor prognosis. In order to achieve our objective, we have analized 29 cases of SCC os lip observed in the ambulatory of dermatologic surgery of HC-FMUSP from 1980 to 1989. We have also collected clinical data from the patient\'s promptuaries (sex, age, tobaccoism, time of lesion, presence of recurrence and metastasis) and histological data (degree of differentiation, depth, perineural and perivascular invasion, infiltration of the muscle layer, counting of peritumoral and intratumoral eosinophils, counting of lymphocytes) in microscopic features stained with hematoxylin and eosin. When comparing quantities of eosinophils in the intra and peritumoral areas we found them similar. We have not found any significant differences between the counting of tumoral eosinophils and factors that work as SCC of lips prognosis (depth, time of lesion, perivascular and perineural invasion, infiltration of the muscle layer, degree of differentiation, presence of recurrence and metastasis). The lymphocytic infiltrating acts as prognostic factor in the cases involving melanoma, however, in CEC it is still controversial. We have proceeded a classification of the lymphocytic infiltrating and compared with the same fluctuations studied with the eosinophils. We have found a significant relationship between the higher lymphocytic infiltrating and a minor degree of differentiation of tumoral cells, which suggests that the surface antigens in the lymphocytic anti-tumor immune response have an important role. Other comparisons were not significant. We tried to list the quantity of eosinophils and lyphocytes in the infiltrating and we noted that two groups of cells had differents behaviors. We conclude, therefore, that: the peritumoral and intratumoral eosinophilic infiltrating present similar quantities of eosinophils; the eosinophilic infiltrating is not related to the SCC of lips prognosis; the number of lyphocytes in the tumoral infiltrating is higher in less differentiated tumors; the lymphcytic infiltrating has no influence in the other factors that work as lips\' CEC prognosis; and the quantity of eosinophils and lymphocites in the SCC of lips have independent behaviors

A tolerância operacional (TO) é um raro fenômeno que ocorre em indivíduos transplantados, que permanecem com função estável do aloenxerto, sem rejeição, após a suspensão de drogas imunossupressoras, por pelo menos um ano. A compreensão de mecanismos envolvidos na tolerância operacional poderá contribuir para a elaboração de novas terapias imunorreguladoras, na clínica do transplante. Investigamos se, no estado de tolerância operacional, há um perfil funcional diferencial de resposta imune celular antígeno-específica, dirigida a três grupos de antígenos relevantes no alotransplante: aloantígenos do doador (peptídeos HLA-DR), antígenos de patógenos (peptídeos do CMV - citomegalovírus) e autoantígenos (peptídeos da Hsp60 - Proteína de choque térmico 60, com funções imunológicas, imunorreguladora (REGULA) e pró-inflamatória (INFLAMA). Analisamos a produção de citocinas (por Luminex) e a proliferação de diferentes subpopulações de células T CD4+ (por FACS), com funções, predominantemente, REGULA ou INFLAMA, frente aos três tipos de antígenos, comparativamente entre TO (n=6) e Rejeição Crônica (RC: n=8), indivíduos com função estável do enxerto, usando imunossupressores (EST: n=8) e indivíduos saudáveis (SAU: n=7). Em concordância com nossa hipótese, a resposta celular é modulada, de forma diferencial, na tolerância operacional, ocorrendo um desvio funcional da resposta a peptídeos HLA-DR do doador para um perfil REGULA, enquanto é preservado o perfil INFLAMA na resposta a peptídeos do patógeno (CMV). Apesar das diferenças nas respostas aos peptídeos do CMV entre TO e RC (p=0,02 e p=0,02 para citocinas e subpopulações regula e p=0,008 e p=0,003 para citocinas e subpopulações inflama), houve preservação do perfil INFLAMA na TO, em relação ao estado fisiológico, com indução/aumento das citocinas inflamatórias IL-1B, IL-17, IFNy, MCP-1 e MIP-1B, com algum grau de inibição de citocinas imunorreguladoras, e inibição da proliferação de células Tregs, sugerindo serem importantes mecanismos na preservação da imunocompetência, na tolerância operacional. Na resposta celular a autoantígenos, destacamos o peptídeo N6 que induziu um perfil significativamente diferente na TO (mais REGULA), em relação à RC (mais INFLAMA) (p=0,001 para citocinas regula; p=0,04 para citocinas inflama), principalmente pelo aumento/indução da produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, na TO, sugerindo que o peptídeo N6 possa ter uma contribuição nos mecanismos na TO, favorecendo a produção dessas citocinas com atividade imunorreguladora. Considerando a diferença significativa do perfil funcional de resposta aos aloantígenos do doador entre TO (REGULA) e RC (INFLAMA) (p=0,0007 para citocinas regula e p < 0,0001 para citocinas inflama), principalmente pela inibição das citocinas próinflamatórias, como IL-1B, IL-8, IL-12, IL-17, G-CSF, IFN-y e MCP-1, na TO, concluímos que o desvio REGULA da via indireta de alorreconhecimento dirigida a peptídeos HLA-DR do doador, com inibição dessas citocinas, tenha um papel importante nos mecanismos envolvidos na tolerância operacional. Em conclusão os mecanismos em curso na tolerância operacional, modulam a resposta celular antígeno-específica dirigida a desafios antigênicos no transplante, envolvendo o desvio REGULA da resposta a peptídeos HLA-DR do doador, a participação da autoimunidade imunorreguladora à Hsp60, ao mesmo tempo em que há preservação da resposta inflamatória a patógenos / Operational tolerance (OT) is a rare phenomenon, taking place in transplanted individual who do not reject, following the complete withdrawal of immunosuppressive drugs for at least one year. Understanding the mechanisms involved in operational tolerance will contribute to opening new pathways for the development of novel immunoregulatory therapies, in transplantation. We investigated whether the state of operational tolerance displays a functionally differential profile of the antigen-specific cellular response, directed to three groups of antigens, relevant in the context of allotransplantation: donor alloantigens (HLA-DR peptides), pathogen-derived antigens (cytomegalovirus peptides - CMV) and autoantigens (peptides derived from the Hsp60 - selfantigen displaying immunoregularory (REG) and proinflammatory (INFLAMMA) properties). We determined cytokine production (by Luminex) and the proliferative response of different CD4+ T cell subsets (by FACS), displaying predominantly REG or INFLAMMA activities, in response to the three types of antigens, comparing OT (n=6) with Chronic Rejection (CR: n=8), individual with stable graft function, taking conventional immunosuppression (Sta: n=8), and healthy individuals (HI: n=7). In concordance with our hypothesis, the cellular immune response is differentially modulated in operational tolerance, giving rise to an immunoregulatory deviation in the response to HLA-DR donor peptides, preserving the proinflammatory response to pathogen peptides (CMV). Despite significant differences in the responses to CMV peptides, between OT and CR (p=0.02 and p=0.02 for REG cytokines and CD4+ subsets; p=0.008 and p=0.003 for INFLAMMA cytokines and CD4+ subsets), OT is able to preserve the INFLAMMA response in relation to the physiologic state (HI). This INFLAMMA profile of the response to CMV peptides is maintained by the induction/increase of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-17, IFN-y, MCP-1 and MIP-1B, some inhibition of REG cytokines and inhibition of Treg proliferation, suggesting that these are important mechanisms in the preservation of immunocompetence to deal with pathogens, in OT. In the cellular response to autoantigens, we highlight the N6 peptide that induced a differential profile in OT (REG profile) compared to CR (INFLAMMA profile) (p=0.001 for REG cytokines; p=0.04 for INFLAMMA cytokines), due to the induction/increase of IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, in OT, suggesting that N6 may contribute to the underlying mechanisms in OT, favoring the production of these immunoregulatory cytokines. Taken the marked differences in the response to donor alloantigens, between OT (predominantly REG) and CR (predominantly INFLAMMA) (p=0.0007 for REG cytokines and p < 0.0001 for INFLAMMA cytokines), due to the inhibition of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-8, IL- 12, IL-17, G-CSF, IFN-y and MCP-1, in OT, we conclude that the immunoregulatory deviation in the indirect pathway of allorecognition, directed to donor HLA-DR peptides, leading to the inhibition of these cytokines, has an important role in the mechanisms of tolerance. In conclusion, the ongoing immunoregulatory mechanisms in operational tolerance, modulate the antigenspecific cellular response to relevant antigenic challenges in allotransplantation, involving a REG deviation in the response to donor HLA-DR peptides, together with the participation of immunoregulatory autoimmunity to Hsp60, while preserving the proinflmammatory response to pathogens

A rejeição ao aloenxerto mediada por mecanismos celulares ou humorais representa uma importante complicação no pós-transplante renal. Estudos anteriores demonstraram que o depósito de C4d peritubular é um marcador de rejeição mediada por anticorpos. A técnica padrão ouro para a pesquisa de C4d é a imunofluorescência em criostato. No entanto, o manuseio do material congelado implica em algumas limitações custo-operacionais, particularmente em nosso meio. Nos casos de rejeição mediada por anticorpos é de relevância patogenética a análise da participação de linfócitos B e plasmócitos, pois são as células responsáveis pela produção de anticorpos. Considerando que até o momento o envolvimento de linfócitos B e plasmócitos no processo de rejeição foi pouco investigado, no presente estudo também será analisada a expressão de CD20 e CD138 em biópsias renais, para caracterização destes componentes celulares. Portanto, o objetivo do presente estudo foi analisar a detecção do fragmento C4d por meio de 4 diferentes técnicas, além de analisar o infiltrado de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados com o C4d peritubular. Foram analisadas 107 biópsias de 82 pacientes submetidos a transplante renal. A pesquisa do C4d foi realizada utilizando-se as técnicas de imunofluorescência [IF] (em cortes de criostato e de parafina) e imuno-histoquímica [IH] (em cortes de criostato e de parafina), enquanto que as pesquisas dos linfócitos B e plasmócitos foram realizadas pela técnica de IH em cortes de parafina utilizando-se os anticorpos anti-CD20 e anti-CD138, específicos para linfócitos B e plasmócitos, respectivamente. Com relação à detecção de C4d, as técnicas com maior índice de concordância com a IF-criostato, considerada padrão-ouro, foram IH-criostato (75,6% dos casos apresentaram resultados coincidentes, r=0,72; p<0,0001) e IF-parafina (73%, r=0,59; p=0,0001), enquanto a taxa de concordância na técnica de IH-parafina foi de apenas 51,4% (r=0,35; p=0,03). Analisando a evolução clínica, a sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia foi menor no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d negativo (67% vs 96%, respectivamente, p=0,01). A prevalência de linfócitos B (CD20+) foi de 54% das biópsias de enxerto renal. A análise histológica do infiltrado de linfócitos B revelou 2 padrões distintos de infiltrado: padrão de células isoladas (74%) e padrão nodular (26%). O padrão nodular esteve associado a uma menor sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia (61% vs 89% no grupo CD20 negativo; p=0,03; e 61% vs 87% no grupo padrão de células isoladas; p=0,03). A prevalência de plasmócitos (CD138+) em biópsias de enxerto renal foi de 59%. O infiltrado plasmocitário não esteve associado a uma pior evolução clínica do transplante. A análise da correlação entre C4d peritubular, linfócitos B e plasmócitos demonstrou que o número de células CD20+ e CD138+ foi significativamente maior nos casos C4d positivos comparados aos casos C4d negativos (CD20+: 155±53 vs 26±7 cels/mm2, respectivamente; p=0,001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cels/mm2, respectivamente; p=0,002). O presente estudo concluiu que o depósito peritubular de C4d e o infiltrado de linfócitos B, em especial o padrão nodular, estão associados a uma evolução clínica desfavorável do transplante renal. Outra conclusão importante é que há uma associação positiva entre os infiltrados de linfócitos B e de plasmócitos com o C4d peritubular, sugerindo um possível papel destas células responsáveis pela produção de anticorpos na ativação do sistema complemento in situ. Finalmente, as técnicas de IH-criostato e IF-parafina podem ser consideradas técnicas alternativas à técnica de IF-criostato para a detecção do C4d / Allograft rejection mediated by cellular or humoral mechanisms represents an important complication after kidney transplantation. Capillary C4d deposition was recognized as a specific and independent prognostic marker of antibody mediated rejection. The gold standard technique for C4d detection is the immunofluorescence in cryostat sections. However, this technique involves some operating and costs limitations, particularly in Brazil. In antibody mediated rejection, the analysis of B lymphocytes and plasma cells is of pathogenetic relevance since these cells are responsible for antibody production. Considering that the involvement of B lymphocytes and plasma cells in the rejection process is not clear, in this study the CD20 and CD138 expression in kidney biopsies will be also analyzed. Therefore, the aim of the present study was to analyze the C4d detection by 4 different techniques and the infiltration of B lymphocytes and plasma cells in renal allograft biopsies, correlating these findings with the capillary C4d deposition. One hundred and seven biopsies of 82 renal transplant patients were analyzed. C4d was evaluated by immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC) techniques in frozen and paraffin sections (obtained from the same patients), whereas B-lymphocytes and plasma cells were evaluated by immunohistochemistry in paraffin sections using specific antibodies anti-B Lymphocytes (CD20) and anti-plasma cells (CD138). Regarding the C4d detection, the techniques with higher concordance rate with frozen-IF, considered the gold standard, were the frozen-IHC technique (85.4% of cases showed coincident results, r=0.72; p<0.0001) and the paraffin-IF technique (73%, r=0.59; p=0.0001), whereas the concordance rate in the paraffin-IHC technique was only 51.4% (r=0.35; p=0.03). The clinical follow up analysis demonstrate that C4d positive group was associated with a poor graft survival at 3 years post-diagnosis (67% vs 96% in C4d negative group; p=0.01). The histological analysis of mature B cells (CD20+) infiltrate showed 2 distinct patterns: scattered cells and clusters. The cluster pattern was associated with poor graft survival at 3 years (61% vs 89% in the CD20 negative group; p=0.03; and 61% vs 87% in the CD20+ scattered pattern group; p=0.03). The plasma cells infiltrate was not associated with a worse clinical transplant outcome. The analysis of the capillary C4d and B lymphocytes correlation demonstrate that the number of CD20+ and CD138+ cells was significantly higher in C4d positive cases (CD20+: 155±53 vs 26±7 cells/mm2, respectively; p=0.001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cells/mm2, respectively; p=0.002). This study concluded that C4d capillary and mature B cells (clusters pattern) are associated with worse graft survival. Another important conclusion is a positive association between B lymphocytes (mature B cells and plasma cells) and capillary C4d, suggesting a possible role of these cells, responsible for antibodies production, in the in situ complement system activation. Finally, the frozen-IHC and paraffin-IF techniques may be considered alternative to frozen-IF technique for C4d detection