Introdução: A disfunção neurogênica do trato urinário inferior (DNTUI) é comum, tendo como causa diversas doenças neurológicas e se apresentando de maneira diversa e heterogênea. O tratamento da DNTUI pode incluir medicamentos, utilização de toxina botulínica intravesical e tratamento cirúrgico. A cirurgia de ampliação vesical é uma alternativa consagrada, usada principalmente no caso de bexigas fibrosadas ou em pacientes refratários ao tratamento conservador ou minimamente invasivo. Os mecanismos que levam à progressão da fibrose vesical e à refratariedade aos tratamentos conservadores nessa população de pacientes não são bem conhecidos. Objetivos: Avaliar a expressão gênica dos fatores relacionados à hipóxia e fibrose nos pacientes com DNTUI e correlacionar o padrão de expressão gênica com as características urodinâmicas dos pacientes estudados. Métodos: Foram avaliados prospectivamente 17 pacientes com DNTUI que foram submetidos à cirurgia de ampliação vesical pelo Departamento de Urologia do HCFMUSP. Os pacientes foram avaliados de acordo com os sintomas clínicos, exames laboratoriais e avaliação urodinâmica completa. Durante a cirurgia foi obtido um fragmento vesical interessando todas as camadas da bexiga para análise de expressão gênica com utilização de qRT-PCR de MMP-1, TIMP-1, HIF1alfa, HIF2alfa, HIF3alfa, iNOS, eNOS, VEGF e CTGF. Amostras vesicais de 9 doadores cadavéricos foram utilizados como controles. Resultados: A média dos pacientes estudados foi de 37,5 anos, com complacência vesical variando entre 3,8 e 50 ml/cmH20, com média de 11,16ml/cmH20. Os pacientes apresentaram superexpressão estatisticamente significativa de TIMP-1 e HIF3alfa e subexpressão estatisticamente significativa de MMP-1. A expressão gênica de HIF1alfa e HIF2alfa também apresentou uma tendência à superexpressão, apesar de não ser estatisticamente significativa (p = 0,14 e p = 0,11). Os outros genes avaliados foram expressos de forma heterogênea. Conclusão: Em pacientes com DNTUI associados a fibrose vesical e/ou refratariedade ao tratamento conservador, que foram submetidos à cirurgia de ampliação vesical, os fatores relacionados ao aumento da deposição da matriz extracelular e à hipóxia parecem ser relevantes na progressão da disfunção vesical. Esse achados são compatíveis com estudos em modelos animais de obstrução infravesical e hipóxia e reforçam a necessidade de estudos complementares para o melhor entendimento da fisiopatologia da progressão da disfunção vesical na DNTUI / Introduction: The neurogenic lower urinary tract dysfunction (NLUTD) is a common complication of a variety of neurological diseases and can present itself in a diverse and heterogeneous way. NLUTD can be treated with anticholinergic or alfa3 agonists drugs, intravesical botulinum toxin and/or surgical treatment. The bladder augmentation surgery is a classic alternative, used mainly in cases of fibrotic bladders or in patients with refractory symptoms with conservative treatment. The mechanisms that lead to the progression of bladder fibrosis and to conservative treatments failure are not well known. Objectives: To evaluate the expression of fibrosis and hypoxia related genes in patients with NLTUD and correlate the pattern of gene expression with urodynamic data of the population studied. Methods: We analyzed bladder specimens of 17 patients with NLUTD undergoing bladder augmentation surgery due to bladder fibrosis or conservative treatment failure. Urodynamic tests were performed in all patients. A bladder fragment was obtained during surgery for relative gene epression with quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) of MMP-1, TIMP-1, HIF1alfa, HIF2alfa, HIF3alfa, iNOS, eNOS, VEGF e CTGF. 9 cadaveric organ donors composed the control group. Results: The mean age of the patients was 37.5 years. Bladder compliance ranged form 3,8 to 50 ml/cmH20, with a mean of 11,16 ml/cmH20. Patients undergoing bladder augmentation surgery presented a statistically significant overexpression of TIMP-1 and HIF3alfa. MMP-1 was statistically significant underexpressed. The gene expression of HIF1alfa and HIF2alfa also showed a tendency to overexpression, although it was not statistically significant (p = 0,14 and p = 0,11). The other genes were expressed heterogenously. Discussion: In patients with NLUTD associated with bladder fibrosis and/or failure to conservative treatment, the gene expression of factors related to increased extracellular matrix deposition and hypoxia appears to be relevant in the progression of bladder dysfunction. These findings are comparable with studies in animal models of bladder oulet obstrucion and hypoxia and reinforces the need for complentary studies to better understand the pathophysiology of the progression of bladder dysfunction in the NLTUD

Orientadores: Maria Edwirges Hoffmann, Marta Helena Krieger / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T20:12:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soraggi_ClaudiadeLourdes_D.pdf: 1381104 bytes, checksum: c9a1645ee2ea31e5e43d843d4db6a1fd (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O óxido nítrico é uma molécula multifuncional, a qual está envolvida numa extensa variedade de funções fisiológicas, estendendo-se da neurotransmissão, citotoxicidade de macrófagos e modulação das funções fisiológicas do sistema cardiovascular. Devido às ações benéficas do NO nas diversas disfunções vasculares, há um grande interesse no desenvolvimento em dispositivos que possam liberar NO de maneira controlada no sistema cardiovascular e tecido-específica. Por exemplo, 'stents¿ intracoronarianos recobertos por materiais com liberação de NO, podem reduzir a incidência da reestenose e inibir a formação da neoíntima após angioplastia percutânea coronariana. O objetivo deste estudo foi o de estabelecer protocolos para avaliação da citotoxicidade e do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico de formulações eluidoras de NO para aplicações em dispositivos intravasculares. As formulações eluidoras de NO foram avaliadas por meio de: A) citotoxicidade através dos ensaios da redução do MTT e da captação do vermelho neutro (NR) com as linhagens celulares: 3T3 e RASM, B) potencial anti-reestenótico utilizando-se o ensaio de inibição da proliferação celular com células de musculatura lisa de coelho (RASM) e C) potencial anti-trombogênico, utilizando-se plaquetas humanas em ensaios de agregação e adesão plaquetária. Foram testadas S-nitrosoglutationa (GSNO), solução polimérica contendo poli (vinil álcool) PVA e poli (vinil pirrolidona) (PVP), e formulação contendo PVA, PVP, GSNO. O ensaio da captação do vermelho neutro mostrou que a GSNO e GSNO/PVA/PVP não apresentaram citotoxicidade em concentrações até 30 mg/mL de GSNO, em ambas as linhagens celulares. Enquanto que o ensaio de redução do MTT mostrou que apenas a solução contendo GSNO apresentou citotoxicidade com EC50=2,75±0,05 mg/mL em células 3T3. A sensibilidade da linhagem 3T3 foi maior do que =2,3±0,4 µg/mL), e GSNO (EC= 2,5±0,3 µg/mL). O ensaio da adesão plaquetária mostrou que a inibição superior a 50% causada pela GSNO só foi obtida em concentração acima 6,72 mg/mL, mas nesta concentração não foram encontradas plaquetas viáveis. Os resultados mostraram que a metodologia adotada foi apropriada para a avaliação do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico e também para estabelecer a margem de segurança de novas formulações envolvendo S-nitrosoglutationa e soluções poliméricas. para células RASM, enquanto que células RASM foram mais sensíveis à alteração de permeabilidade de membrana. A GSNO per se promoveu inibição da proliferação celular no ensaio da proliferação celular e este efeito foi potencializado em presença dos polímeros PVA/PVP em concentrações superiores a 22,7 mg/mL. Foi verificada inibição da agregação plaquetária para ambas as soluções, GSNO/PVA/PVP (EC5050 =2,3±0,4 µg/mL), e GSNO (EC= 2,5±0,3 µg/mL). O ensaio da adesão plaquetária mostrou que a inibição superior a 50% causada pela GSNO só foi obtida em concentração acima 6,72 mg/mL, mas nesta concentração não foram encontradas plaquetas viáveis. Os resultados mostraram que a metodologia adotada foi apropriada para a avaliação do potencial anti-reestenótico e anti-trombogênico e também para estabelecer a margem de segurança de novas formulações envolvendo S-nitrosoglutationa e soluções poliméricas / Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifunctional molecule which is involved in a wide variety of physiological functions, ranging ftom neurotransmission, macrophage cytotoxicity, and modulation of physiological functions of the cardiovascular system. Due to NO beneficial action in various vascular pathological conditions, there is a great interest on development in devices that can release NO by a controlled manner and tissue-specific. For example, intracoronary stents coated with NO releasing materials, may reduce the incidence of restenosis and inhibit neo-intima formation after following percutaneous angioplasty. The aim of this study was to establish protocols for evaluation of NO eluting formulations cytotoxicity and antirestenotic and antithrombotic activities which have potential for application in intravascular devices. NO releasing formulations were evaluated regarding to following aspects: A) cytotoxicity measured by MTT reduction and Neutral Red uptake assays with 3T3 and RASM celllines, B) antirestenotic potential by using cell proliferation assay, with rabbit smooth muscle cells ~M), and C) antithrombogenic potential, by using a human platelet aggregation and adhesion assays. S-nitrosoglutathione (GSNO), polymer solutions containing poly(vinyl alcohol) (pV A) and poly(vinyl pyrrolidone) (pVP), and formulation containing GSNO, PV A and PVP were tested. Neutra! Red uptake assays showed that .GSNO and GSNOIPV A/P)'P-solutions presented no cytotoxicity up to 30 mg /mL GSNO, in both celllines. While, MTT reduction assays showed that only the solution of GSNO alone presented cytotoxicity with ECso=2.75± 0,05 mg/rnL, in 3T3 cell line. The sensitivity of3T3 cells to cytotoxicity was higher than that ofRASM cells, while RASM cells were more sensitivity to membrane permeation alterations. GSNO per se presented inhibition in a cell proliferation assay and this effect was potentialized with PV AIPVP in concentrations up 'to 22.7 mglmL. Concentration-dependent inhibition of platelet aggregation was verified for both GSNO/PV AIPVP (ECso of 2.3±0.4 JlglmL), and GSNO alone (ECso of 2.5±0.3 JlglrnL) solutions. Platelet adhesion assay showed that the inhibition above 50% caused by GSNO only in concentration up to 6.72 mglmL was found, but in this concentration range, decrease of viable platelets was presented. The results showed that the methodology adopted was suitable to evaluate antirestenotic and antithrombotic potential, and to establish security margins for the development of new formulations involving GSNO and polymers in solution / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.

INTRODUÇÃO: Os pacientes com asma crônica podem compartilhar similaridades clínicas e fisiológicas com pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica, tal como reversibilidade parcial ao broncodilatador ou pouca obstrução persistente do fluxo expiratório. Entretanto, não existem estudos comparando a patologia destas duas doenças em pacientes com idade similares e mesma gravidade da doença. MÉTODOS: Nós comparamos as dimensões das grandes e pequenas vias aéreas de 12 pacientes adultos (média±erro padrão, 32±3 anos) e 15 pacientes idosos e pré-idosos idosos (65±1 ano) não tabagista que foram a óbito por asma fatal com 14 pacientes tabagistas crônicos que foram a óbito por DPOC grave (71± 1 ano) e 19 pacientes-controle (56±1 ano). Usando a coloração de Movat e H&E, e a técnica de análise de imagens, nós quantificamos a espessura da membrana basal (MB) (valores expressos em ?m) a área de glândula submucosa nas grandes vias aéreas. Nas grandes e pequenas vias aéreas quantificamos a área de camada interna, a área de músculo liso e a área de camada externa. As áreas foram normalizadas pelo perímetro da MB (?m/?m2). RESULTADOS: os pacientes asmáticos adultos apresentaram a MB, área de músculo liso e a área da camada externa nas grandes e pequenas vias aéreas mais espessas, quando comparadas com os controles com idade similar com DPOC grave. Nos pacientes idosos e pré-idosos com asma, houve uma sobreposição na espessura da MB e na área da glândula submucosa, enquanto que nas pequenas e grandes vias aéreas a área de músculo liso foi mais espessa quando comparados com os controles com idade similar com pacientes com DPOC grave. Os pacientes com DPOC apresentaram nas pequenas e grandes vias aéreas as áreas de músculo liso menor quando comparada aos controles com idade similar. Os asmáticos adultos apresentaram a área de músculo liso maior quando comparada aos asmáticos idosos. CONCLUSÃO: Nossos dados fornecem novas informações sobre as mudanças patológicas que podem nos ajudar a entender melhor as similaridades e diferenças patológicas no pacientes adultos e idosos com asma comparados ao DPOC / Background: In some patients with chronic asthma, clinical and physiological similarities with chronic obstructive pulmonary disease may co-exist, such as partial reversibility to bronchodilators despite persistent expiratory airflow obstruction. However, pathologic analyses comparing both diseases in patients of similar age and disease severity are scarce. Methods: We compared the large and small airway dimensions in 12 younger (mean±SD, age 32 yr±3 yr) and 15 older (65 yr±1 yr) non-smoking fatal asthmatics with 14 chronic smokers with severe, fatal COPD (71 yr±1 yr) and 19 control patients (56 yr±1 yr). Using H&E, Movat\'s pentachrome staining and image analysis, we quantified large airway basement membrane (BM) thickness (?m); submucosal gland area; and large and small airway inner wall, smooth muscle and outer wall areas. Areas were normalized by BM perimeter (?m2/?m). Results: Younger adult fatal asthmatics had thicker BM, smooth muscle, and outer wall areas in both small and large airways when compared to agematched controls and fatal COPD patients. In older asthmatics, there was an overlap in BM thickness and submucosal gland area, whereas both large and small airway smooth muscle areas were thicker compared to age-matched controls and fatal COPD patients. COPD patients had thinner large and small airway smooth muscle areas compared to age-matched controls. Younger asthmatics had thicker small airway smooth muscle area compared to older asthmatics. Conclusion: Our data provide novel pathological substrate changes that may help us better understand physiological similarities and differences in younger and older patients with asthma compared to COPD.

As coronárias derivam do proepicárdio, uma estrutura formada por precursores dos constituintes de vasos coronários, células endoteliais e musculares lisas (CoSMC). In vivo observa-se um marcante atraso entre a diferenciação endotelial e a integração de CoSMC à parede do vaso. O objetivo deste trabalho foi identificar os mecanismos que inibem a diferenciação a CoSMC in vivo. Baseados na perda progressiva da expressão de raldh2, a principal enzima de síntese de ácido retinóico (AR), nós exploramos a sinalização por AR como um possível inibidor da diferenciação a CoSMC. Através de um vetor adenoviral de expressão de raldh2 e da inibição in vivo da síntese de AR nós demonstramos que a sinalização por AR bloqueia a diferenciação a CoSMC dos precursores coronários. Nós também identificamos o VEGF como um fator chave no controle da diferenciação a CoSMC. Em conjunto, nossos dados suportam o modelo que a síntese de AR e VEGF durante o desenvolvimento cardíaco foi co-optada para o bloqueio da diferenciação a CoSMC até o estabelecimento de uma vasta malha vascular. / Coronary vessels derive from the proepicardium (PE), a structure formed by precursor of coronary vessels cells, endothelial and smooth muscle cells (CoSMC). In vivo there is a clear gap between the endothelial differentiation and the integration of CoSMC into the vascular tubes. The aim of this work was to understand the mechanisms controlling the delayed in vivo CoSMC differentiation. Based on the progressive loss of expression of raldh2, the main retinoic acid (RA) synthesizing enzyme, we explored the RA signaling as a possible candidate inhibitor of CoSMC differentiation. Using a adenoviral raldh2 expression system and in vivo inhibition of RA synthesis we showed that RA signaling act as a brake to slow CoSMC differentiation in PE-derived cells. We also identified VEGF as key factor acting on the control of CoSMC differentiation. Together our results support a model that AR and VEGF synthesis during cardiac development was co-opted to block the CoSMC differentiation of coronary precursors before an extensive endothelial network of tubes is established.

Dissulfeto isomerase protéica (PDIA1 ou PDI) é uma chaperona e ditiol-dissulfeto oxido-redutase residente do reticulo endoplasmático (RE). PDI é essencial à regulação da proteostase por ter função no enovelamento oxidativo de proteínas e na via de degradação associada ao RE (ERAD). Além disso, PDI interage fisicamente e regula a atividade de NADPH oxidases, e fora da célula é um regulador redox essencial à atividade de proteínas extracelulares. Este pool epi/pericelular da PDI (pecPDI) regula função de proteínas de membrana/secretadas, como integrinas, glicoproteínas gp120 do virus HIV e outras, com múltiplas funções que incluem: trombose, ativação plaquetária, adesão celular, infecção viral e remodelamento vascular. A rota de externalização da PDI permanece obscura, e seu conhecimento pode indicar mecanismos dos efeitos (fisio)patológicos da PDI. A secreção da PDI pela rota RE-Golgi foi sugerida em células endoteliais infectadas pelo vírus da dengue, células pancreáticas e tireoideanas. No entanto, uma varredura sistemática das possíveis rotas de externalização da PDI não foi previamente realizada. Neste estudo, mostramos que células endoteliais (EC) externalizam constitutivamente, por rotas distintas, dois pools de PDI, de superfície celular e solúvel, enquanto na EC não estimulada PDI não foi detectada significativamente em micropartículas. PDI externalizada corresponde a ca.1,4% do pool total de PDI celular. Tanto a PDI de superfície celular como a solúvel foram majoritariamente secretadas pela via de secreção não-convencional do tipo IV independente de GRASP. Contudo, a via de secreção clássica também contribui para externalização basal da PDI de superfície celular, mas não da solúvel basal ou estimulada por PMA, ATP e trombina indicando que todas envolvem escape do Golgi. Além disso, a externalização constitutiva da PDI de superfície em célula muscular lisa vascular também ocorre por via independente de Golgi. Externalização da PDI não foi detectavelmente mediada pela secreção não-convencional do tipo I, II, III, lisossomos secretórios, endossoma de reciclagem e transporte ativo (dependente de ATP) em EC. Considerando que chaperonas são vias essenciais de resposta a estresses, investigamos o efeito de estresse do RE e choque térmico na pecPDI. Estresse do RE não altera a PDI de superfície celular, mas aumenta PDI solúvel. Ambos os pools de PDI não foram alterados por choque térmico, embora a recuperação desse estresse diminua a secreção de PDI. Estes dados sugerem que a liberação de PDI é um processo regulado, dependente da natureza do estresse. Bloqueio da síntese de proteínas com cicloheximida não altera pecPDI, indicando que PDI recém-sintetizada não é preferencialmente externalizada e que o tráfego da PDI independe de outras proteínas recém-sintetizadas. Um aspecto importante do estudo foi indicar uma resiliência da pecPDI à modulação individual de distintas vias secretoras, consistente com uma estrita auto-regulação e possibilidade de vias sinérgicas e complementares. Estes resultados indicam que a externalização da PDI de superfície e PDI secretada possam ser externalizadas por mecanismos independentes. Estes processos compõem um processo regulado estritamente, consistente com papel homeostático da pecPDI / Protein disulfide isomerase (PDIA1 or PDI) is dithiol-disulfide oxireductase chaperone resident in the endoplasmic reticulum (ER). PDI is essential for proteostasis, due to its support of oxidative protein folding and ER-associated protein degradation (ERAD). In addition, PDI associates with NADPH oxidase(s) and regulate its activity, while outside of the cell, PDI redox-dependently modulates extracellular proteins. This epi/pericellular PDI (pecPDI) pool is known to regulate membrane/secreted proteins such as integrins, HIV glycoprotein gp120 and others, with functions that involve thrombosis, platelet function, cell adhesion, viral infection and vascular remodeling. PDI externalization route remains enigmatic and its elucidation can help understand some (patho)physiological PDI effects. An ER-Golgi route for PDI secretion has been as described on dengue virus-infected endothelial cells pancreatic and thyroid) cells. However, none of these papers addressed PDI secretion routes in a systematic fashion. Here, we show that endothelial cells (EC) constitutively externalize, through different routes, two PDI pools, a cell-surface and a secreted one, while in nonstimulated ECs PDI was not significantly detected in microparticles. Externalized PDI corresponds to < 2% of total cellular PDI pool. Both cell-surface and soluble PDI were predominantly externalized through unconventional type IV GRASP-independent pathway(s). However, the classical secretory pathway also contributes to basal cell-surface, but not soluble, PDI externalization, as PMA, ATP or thrombin-stimulated secretion also involve Golgi bypass. Furthermore, constitutive cell-surface PDI externalization in vascular smooth muscle cells also occurs in a Golgi-independent way. PDI externalization was not detectably mediated by non-conventional type I, II and III secretion routes, secretory lysosomes, recycling endosomes and ATP dependent active transport in EC. Since chaperones are essential for cellular stress response, we assessed the effects of ER stress and heat-shock on pecPDI. ER stress did not affect cell-surface PDI but increased the soluble pool. Both PDI pools were unaltered by heat shock, while stress recovery decreased PDI secretion. These data suggest that PDI release is finely tuned and dependent on the type of stress. Blockade of protein synthesis with cycloheximide did not change pecPDI levels, suggesting that newly-synthesized PDI is not preferentially externalized and that PDI traffic does not require newly-synthesized proteins. An important aspect of the study was the evidence for pecPDI resilience to individual modulation of distinct secretion routes, consistent with strict auto-regulation and possible synergic or complementary pathways. Overall, our data suggest that cell-surface and secreted PDI pool externalization are regulated through independent mechanisms, which in both cases involve Type IV non-conventional routes, with some minor contribution of Golgi-dependent secretory pathway. These patterns compose a strictly regulated process, consistent with an important homeostatic role for pecPDI

O dimorfismo sexual relacionado à hipertensão arterial surge na adolescência e persiste por toda vida adulta. Homens apresentam maior incidência de doenças cardiovasculares quando comparados a mulheres de mesma faixa etária. O mesmo perfil é observado em modelos animais de hipertensão, nos quais machos apresentam maiores níveis pressóricos quando comparados a fêmeas. Dessa forma, a testosterona é frequentemente relacionada à hipertensão arterial. Entretanto, os mecanismos pelos quais a testosterona exerce efeitos vasculares ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da testosterona sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), importantes mediadores do processo hipertensivo, em células da musculatura lisa vascular (CMLV) de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Os receptores para andrógenos, as fontes de EROs (papel da NADPH oxidase), bem como os efeitos funcionais celulares (migração celular) relacionados aos efeitos da testosterona também foram analisados. Para tanto, CMLV do leito mesentérico de ratos Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) e SHR foram isoladas, cultivadas e estimuladas com testosterona 10-7mol/L em diferentes tempos, de acordo com cada protocolo. Sempre que necessário, as células foram pré-incubadas por 30 minutos com inibidores específicos para o estudo dos mecanismos envolvidos, tais como: flutamida (inibidor do receptor clássico para andrógenos), apocinina (inibidor da NADPH oxidase), PP2 (inibidor da c-Src), actinomicina D (inibidor da transcrição gênica) e cicloheximida (inibidor da síntese protéica). Nossos resultados indicam que a testosterona induz a geração de EROs por mecanismos dependentes do tempo e da linhagem de ratos, de modo que células isoladas de animais SHR são mais sensíveis a testosterona. Esta geração ocorre por dois mecanismos principais: um mediado pelo receptor clássico para andrógenos (AR) e outro mediado pelo receptor de membrana para andrógenos (ARm), resultando em efeitos genômicos e não-genômicos, respectivamente. Enquanto os efeitos genômicos são comuns, isto é, são observados em células de animais normotensos e hipertensos, os efeitos não-genômicos são específicos, e ocorrem exclusivamente em células de animais hipertensos. A geração genômica de EROs, mediada pelo AR, depende da modulação da expressão de subunidades da NADPH oxidase. Por outro lado, a geração não-genômica, é mediada pelo ARm, independe de síntese protéica, e ocorre devido à ativação de vias de sinalização específicas, reguladoras do complexo enzimático NADPH oxidase. As EROs formadas a partir do estímulo com a testosterona tanto por mecanismos genômicos ou não-genômicos levam a migração celular por mecanismos mediados pelo RA. Nossos resultados sugerem que a testosterona tem papel importante na função de células da musculatura lisa vascular, o que pode contribuir para algumas alterações vasculares características do processo hipertensivo. Portanto, nosso trabalho é o primeiro a demonstrar que a testosterona regula vias de sinalização redox em CMLV levando a efeitos funcionais importantes, relacionados ao remodelamento vascular, os quais podem contribuir para o desenvolvimento e manutenção da hipertensão arterial. / Sexual dimorphism related to hypertension begins at childhood and persists through adulthood. The incidence of cardiovascular diseases is higher in men when compared to age-matched women. Although testosterone has been associated to the sexual dimorphism in hypertension, the mechanisms whereby testosterone acts in the vasculature remain unclear. The main objective of this study was to determine whether testosterone induces reactive oxygen species (ROS) generation, key players on hypertension, in vascular smooth muscle cells (VSMC) isolated from normotensive and hypertensive rats. The signaling pathways and the androgen receptors activated by testosterone, the role of NADPH oxidase in ROS generation and the cellular outcomes (cell migration) were also determined. Accordingly, VSMC isolated from the mesenteric bed of Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive (SHR) rats were stimulated with testosterone 10-7mol/L for different periods of time, according to each protocol. Whenever appropriate, cells were pre-incubated with specific inhibitors, such as flutamide 10-5mol/L (nuclear androgen receptor antagonist), apocynin 3x10-5mol/L (NADPH oxidase inhibitor), PP2 10-5mol/L (c-Src inhibitor), actinomycin D 10-5mol/L (inhibitor of gene transcription), and cycloheximide 10-5mol/L (protein synthesis inhibitor). Our findings demonstrate that testosterone induces ROS formation in a time and strain-dependent manner. Augmentation of ROS formation is higher in SHR-VSCMC, indicating an increased sensitivity of SHR-VSMC to testosterone stimuli. Testosterone-induced ROS production occurs by two main mechanisms: the first mediated through the classical androgen receptor (AR) and the second mediated through membrane-associated androgen receptor (ARm), leading to genomic and non-genomic effects, respectively. Whereas the genomic effects occur in VSMC from both strains, non-genomic effects are only observed in SHR-VSMC. The genomic ROS production is mediated through AR and depends on modulation of NADPH oxidase subunits. On the other hand, non-genomic ROS formation is mediated through RAm, does not rely on protein synthesis and occurs via specific signaling pathways that regulate NADPH oxidase. Genomic and non-genomic ROS production by testosterone leads to a common final effect: VSMC migration, indicating that testosterone plays a key role in VSMC function. These results indicate that testosterone signals through redox-sensitive pathways, important in c-Src-mediated migration of VSMCs in SHR. Such processes may contribute to vascular remodeling in hypertension.

Células de músculo liso vascular são capazes de perceber estímulos mecânicos do sistema cardiovascular, coordenando pressão sanguínea e perfusão tecidual por meio da modulação do tônus e do diâmetro vascular via resposta contrátil. O gatilho inicial à contração é um aumento na concentração intracelular de cálcio e diversas vias de sinalização têm sido descritas na sustentação deste sinal inicial. Evidências atuais indicam que adesões focais desempenham papel crucial na contração através da organização do citoesqueleto de actina e engajamento com o aparato contrátil. Nosso grupo demonstrou que a proteína rica em cisteína e glicina 3 (CRP3) interage com a quinase de adesão focal (FAK) em resposta a um aumento do estiramento mecânico e existem evidências de que CRP3 modula a dinâmica do citoesqueleto de actina. Neste trabalho testamos a hipótese de que a proteína CRP3 atua como uma proteína de adesão focal que regula a contração de células musculares lisas aórticas. Por meio de ensaios de imunoprecipitação e colocalização, verificou-se a presença de CRP3 nas adesões focais de células selvagens. Evidenciou-se que a ausência de CRP3 está associada a aumento no tamanho médio de adesões focais em células musculares lisas aórticas de forma independente do substrato. Entretanto, em resposta à angiotensina II, células nocaute para CRP3 apresentam incapacidade de maturação das adesões focais, um evento que está associado ao reduzido conteúdo proteico de FAK, paxilina e MLC2 (plataformas moleculares envolvidas na maturação de adesões focais) observada em células nocaute. Consistente com o maior tamanho médio das adesões focais, células nocaute são mais rígidas e, portanto, menos elásticas que células selvagens, sendo que a rigidez avaliada por citometria magnético-óptica de oscilação se reflete na reduzida capacidade contrátil, seja em condições basais, em resposta à angiotensina II ou ao inibidor de ROCK, como evidenciado no ensaio de contração em gel de colágeno. Em síntese, os dados deste trabalho mostram que CRP3 está presente nas adesões focais, regulando tamanho e sinalização, com reflexos na rigidez (viscoelasticidade) e capacidade contrátil, variáveis fundamentais ao correto funcionamento de células musculares lisas aórticas. Em conjunto, as evidências deste trabalho suportam a hipótese de que CRP3 é um modulador de contratilidade e mecanotransdução em células musculares lisas aórticas / Smooth muscle cells act also as mecanosensors of the cardiovascular system, coordinating blood pressure and tissue perfusion by means of vascular tone and diameter modulation via the contractile response. The trigger for contraction is a rise in the intracellular calcium concentration and several signaling pathways have been described to sustain the initial calcium signal. Recent evidences highlight the crucial role of focal adhesions to the contractile response, given its role in actin cytoskeleton assembly and engagement with the actomyosin contractile apparatus. We have demonstrated that the cysteine and glycine-rich protein-3 (CRP3) interacts with focal adhesion kinase (FAK) in response to increased hemodynamic stress. Additionally, it has also been shown that CRP3 modulates actin cytoskeleton dynamics. Here, we tested the hypothesis that CRP3 acts as a focal adhesion protein that regulates the contraction of aortic smooth muscle cells. Through colocalization and immunoprecipitation studies we found that CRP3 is a focal adhesion protein in aortic smooth muscle cells. Focal adhesion mean size evaluation showed that in the baseline, CRP3 KO smooth muscle cells display greater focal adhesion size. However, upon angiotensin II (a contraction-triggering molecule) stimulation, CRP3 KO cells fail to maturate focal adhesions, an event that might be related to the reduced protein levels of FAK, paxillin, and MLC2 (key signaling molecules involved in focal adhesion maturation) observed in KO cells. Consistent with the greater mean focal adhesion size, CRP3 KO cells exhibited increased stiffness and therefore, reduced viscoelasticity when compared to wild type cells. The reduced viscoelasticity of KO cells seems to influence cell contractility, as CRP3 KO cells also displayed reduced contractile response in the baseline and in response to angiotensin II. In summary, these data showed that CRP3 is present at focal adhesions, regulating their size and signaling. Thus, CRP3 at focal adhesions influences cell stiffness and contractile capacity, which are key features of smooth muscle cell physiology. Altogether, our findings support the idea that CRP3 is a key modifier of contractility and mechanotransduction in aortic smooth muscle cells

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1945153 bytes, checksum: 2c1abc7e6111c3fc75af32ff4400e496 (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / From Xylopia langsdorfiana A. St-Hil. & Tul. stem bark was isolated the diterpene of trachylobane class, ent-7α-hydroxytrachyloban-18-oic acid (trachylobane-318) that in previous studies showed to be able to relax guinea-pig trachea pre-contracted by carbachol (CCh). Thus, we aimed to investigate the action mechanism underlying in this trachylobane-318 relaxant activity. Trachea rings were suspended in organ baths, containing Kreb s solution, at 37 ºC and aired with carbogenic mixture. Isometric contractions were registered using a digital acquisition system. In order to evaluate a direct effect of the diterpene in Ca2+-calmodulin complex was used chlorpromazine (CPZ) (10-6 M), a calmodulin inhibitor, and we observed that trachylobane-318 relaxation effect (pD2 = 4.38 ± 0.07, n = 5) was not significantly altered in presence of this inhibitor (pD2 = 4.25 ± 0.07, n = 5). Then, was performed a protocol using different potassium (K+) extracellular concentrations which indicated that trachylobane-318 would be acting as a possible potassium channels activator since its relaxation was more potent when guinea-pig trachea was pre-contracted by KCl 18 mM (pD2 = 4.90 ± 0.25, n = 5) than by KCl 60 mM (pD2 = 3.88 ± 0.01, n = 5). To confirm the potassium channels participation was used a non-selective potassium channels blocker, tetraethylammonium (TEA+) 10 mM, that was pre-incubated before CCh addition, that resulted in an attenuation of diterpene relaxation (pD2 = 4.01 ± 0.06, n = 5). To determinate which potassium channels subtypes would be involved in the trachylobane-318 action, the diterpene relaxation curve was assessed in the presence of several potassium channels selective blockers. The fact of the trachylobane-318 relaxation curve was shifted to the right in a significant manner in the presence of 4-AP, a selective blocker of voltage activated K+ channels (Kv) (pD2 = 4.00 ± 0.06, n = 5); glibenclamide, a selective blocker of ATP-sensitive K+ channel (KATP) (pD2 = 3.91 ± 0.003, n = 5); apamin, a selective blocker of small conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) (3.45 ± 0.14, n = 5) and big conductance calcium-activated K+ channels (BKCa) (3,80 ± 0,05, n = 5) is suggestive that the diterpene is modulating positively these channels to exert its relaxant effect. On the other hand, the inwardly rectifying K+ channels (Kir) was discarded since the relaxation curve was not altered (pD2 = 4.15 ± 0.10, n = 5) in the presence of BaCl2, selective blocker of these channels. Cyclic nucleotides participation was discarded since the relaxation curve obtained with aminophylline on guinea-pig contracted by CCh (pD2 = 4.27 ± 0.09, n = 5), a phosphodiesterases (PDEs) non-selective inhibitor, was not altered in trachylobane-318 presence (pD2 = 4.46 ± 0.08, n = 5). Thus, trachylobane-318 relaxant effect seems to involve the positive modulation of potassium channels subtypes Kv, KATP, SKCa and BKCa on guinea pig trachea. / A partir das cascas do caule de Xylopia langsdorfiana A. St-Hil. & Tul. foi isolado o diterpeno da classe dos traquilobanos, ent-7α-hidroxitraquiloban-18-oico (traquilobano-318) que em estudos anteriores mostrou-se capaz de relaxar a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol (CCh). Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação envolvido nesta atividade relaxante do traquilobano-318. Os anéis de traqueia foram suspensos em cubas para órgão isolado, contendo solução de Krebs, a 37º C e aerados com carbogênio. As contrações isométricas foram registradas com o auxílio de um sistema de aquisição digital. Para avaliar uma possível ação direta do diterpeno sobre o complexo Ca2+-calmodulina foi utilizado a clorpromazina (CPZ) (10-6 M), um inibidor da calmodulina, e observou-se que o efeito relaxante do traquilobano-318 (pD2 = 4,38 ± 0,07, n = 5) não foi significantemente alterado na presença deste inibidor (pD2 = 4,25 ± 0,07, n = 5). Em seguida foi realizado um protocolo usando diferentes concentrações extracelulares de potássio (K+) que indicaram que o traquilobano-318 estaria agindo como um possível ativador dos canais de K+, uma vez que seu efeito relaxante mostrou-se mais potente quando a traqueia era pré-contraída por 18 mM de KCl (pD2 = 4,90 ± 0,25, n = 5) do que quando pré-contraída por 60 mM de KCl (pD2 = 3,88 ± 0,01, n = 5). Para confirmar a participação dos canais de K+ utilizou-se um bloqueador não seletivo destes canais, tetraetilamônio (TEA+) (10 mM) que foi pré-incubado antes da adição de CCh, o que resultou na atenuação do relaxamento promovido pelo diterpeno (pD2 = 4,01 ± 0,06, n = 5). Com o objetivo de se determinar quais subtipos de canais de potássio estariam envolvidos na ação relaxante do traquilobano-318, a curva de relaxamento do diterpeno foi avaliada na presença de vários bloqueadores seletivos destes canais. O fato da curva de relaxamento do traquilobano-318 (pD2 = 4,38 ± 0,07) ter sido desviada para direita, de maneira significante, na presença de 4-AP, bloqueador dos canais de K+ sensíveis a voltagem (Kv) (pD2 = 3,91 ± 0,003); glibenclamida, bloqueador dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP) (pD2 = 4,00 ± 0,06); apamina, bloqueador dos canais de K+ ativados pelo cálcio de pequena condutância (SKCa) (pD2 = 3,45 ± 0,14) e na presença de iberiotoxina, bloqueador dos canais de K+ ativados pelo cálcio de grande condutância (BKCa) (pD2 = 3,80 ± 0,05) sugere que o diterpeno está modulando positivamente estes canais para exercer seu efeito relaxante. Por outro lado a participação dos canais de potássio retificadores de entrada (Kir) foi descartada pois a curva de relaxamento do traquilobano-318 não foi alterada (pD2 = 4,15 ± 0,10, n = 5) na presença do BaCl2, bloqueador seletivos destes canais. A participação dos nucleotídios cíclicos foi descartada, uma vez que a curva de relaxamento em traqueia pré-contraída por CCh obtida com aminofilina (pD2 = 4,27 ± 0,09, n = 5), um inibidor não seletivo das fosfodiesterases (PDEs), não foi alterada na presença do traquilobano-318 (pD2 = 4,46 ± 0,08, n = 5). Assim, o efeito relaxante do traquilobano-318 parece envolver a modulação positiva dos subtipos de canais de potássio KATP, Kv, SKCa e BKCa em traqueia isolada de cobaia.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-30 / Justificativa: Devido aos poucos estudos que enfatizam o tratamento agudo in vivo com anfetamina e etanol e sua conseqüência na transmissão noradrenérgica da musculatura lisa de animais jovens, decidimos estudar os efeitos do tratamento simultâneo destes dois fármacos, estudando-os também isoladamente e em diferentes dosagens, tendo como modelo o ducto deferente (DD) de ratos periadolescentes, faixa etária que é pouco considerada nos estudos farmacológicos e que apresenta na maioria das vezes respostas diferentes daquelas esperadas para animais adultos e que podem determinar o desenvolvimento do animal. Materiais e métodos: Os animais periadolescentes foram divididos em seis grupos experimentais. A anfetamina (AMPH) foi administrada nas dosagens de 3 mg/Kg e 7 mg/Kg, enquanto o etanol (EtOH) foi administrado nas dosagens de 4 mL/Kg e 8 mL/Kg. A anfetamina e o etanol foram administrados tanto isoladamente quanto simultaneamente (AMPH 3 mg/Kg + EtOH 4 mL/Kg e AMPH 7 mg/Kg + EtOH 8 mL/Kg) para verificar possíveis interações. Para os experimentos funcionais, o DD foi montado sob tensão de 1 grama num banho de órgão isolado. As mudanças de tensão foram registradas em fisiógrafo. Curvas concentração-efeito cumulativas foram realizadas para agonistas adrenérgicos (noradrenalina, dopamina, fenilefrina) e bário e os parâmetros farmacológicos Emax, pD2 e ρ medidos e analisados. Curvas tempo-resposta também foram realizadas para a tiramina, para checar a liberação de noradrenalina endógena. Para avaliar a contração neurogênica ao estímulo Elétrico Transmural (EET) o DD foi montado em banho de órgão isolado entre dois eletrodos. Estímulos de 60 V, 1 ms de duração com freqüências de 0,1 a 20 Hz foram empregados. Para avaliar a participação do íon cálcio, o DD foi despolarizado por 5 minutos com 80mM de KCl na ausência de Ca+2 e na presença de EGTA (10μM) seguido pela adição de uma dose única de CaCl2 (10mM por 10 minutos). Para a dosagem de noradrenalina utilizou-se o detector eletroquímico para a detecção das catecolaminas e o HPLC, Shimadzu, coluna Chromolith RP-18e (Merck) para a separação das mesmas. As concentrações de corticosterona plasmáticas foram quantificadas por radioimunoensaio específico para ratos. Resultados: O grupo tratado com AMPH 3 mg/Kg apresentou uma potencialização da resposta contrátil do DD à noradrenalina, ao bário e ao cálcio, sem alterar a contração neurogênica. Observou-se, ainda, que o conteúdo de catecolaminas foi reduzido. Com o aumento da dosagem do tratamento (AMPH 7 mg/Kg) observou-se apenas uma redução da contração fásica ao EET e do conteúdo de noradrenalina determinado pelo HPLC. O grupo tratado com EtOH 4 mL/Kg apresentou uma diminuição da contratilidade do DD à noradrenalina, fenilefrina e bário, e ao EET, assim como um menor conteúdo de catecolaminas. A resposta ao cálcio não foi alterada. Com o aumento da dosagem (EtOH 8 mL/Kg) a resposta do DD a agonistas adrenérgicos, bário e ao EET não foi alterada. Em contrapartida, tal tratamento deprimiu a resposta tônica das curvas tempo-efeito para o cálcio mostrou uma tendência de aumento do conteúdo neuronal de noradrenalina. O grupo tratado com AMPH 3 mg/Kg + EtOH 4 mL/Kg não apresentou quaisquer alterações nos protocolos experimentais utilizados. Estes dados sugerem que a anfetamina e o etanol poderiam estar atuando de forma antagônica. Utilizando dosagens maiores para este tratamento simultâneo (AMPH 7 mg/Kg + EtOH 8 mL/Kg) observamos nenhuma alteração significativa nos protocolos experimentais testados. No entanto, este tratamento anulou os efeitos individuais do pré-tratamento com cada fármaco no EET e nas curvas tempo-efeito para o cálcio. Os tratamentos com anfetamina (7 mg/Kg) ou etanol (4 mL/Kg e/ou 8 mL/Kg), assim como os tratamentos simultâneos mostraram uma tendência de aumento da concentração plasmática de corticosterona. Conclusões: Desta forma, observamos um efeito antagônico entre a anfetamina e o etanol quando administrados simultaneamente, possivelmente por agir em sítios intracelulares próprios ou competir por estes, quanto aos efeitos na neurotransmissão simpática de animais periadolescentes. / Justification: Because of the few studies that emphasize the in vivo acute treatment with amphetamine and ethanol, and their consequence onnoradrenergic transmission in the smooth muscles of young animals, we decided to study the effect of these drugs on peripheral sympathetic neurotransmission. We use d he vas deferens (VD) of periadolescent rats as a model for the study of sympathetic neurotransmission. Materials and methods: The periadolescent animals were divided into six groups. Amphetamine (AMPH) was administered at doses of 3 mg/kg 7 mg/kg, while ethanol (EtOH) was administered at doses of 4 mL /kg or 8 mL/kg. Amphetamine and ethanol were administered either alone or simultaneously (AMPH 3 mg/kg + EtOH, 4 mL/kg por AMPH 7 mg/kg + EtOH 8 mL/kg) to investigate possible interactions. For functional experiments, the VD was mounted under 1 g tension in isolated organ bath. The contraction was recorded in physiograph. Cumulative concentration-effect curves were made for adrenergic agonists (noradrenaline, dopamine, phenylephrine) and barium. Pharmacological +parameters E max, ripD and ρ were analyzed. Time - response curves were also performed for tyramine, to check the release of endogenous nor adrenaline. To evaluate the neurogenic contraction to electrical field stimulation (EFS) the VD was mounted on the isolated organ bath between two electrodes. Stimuli of 60 V, 1 ms duration at frequencies of 0.1 to 20 Hz were employed To evaluate the role of calciu m the V D was depolarized for 5 minutes with 80 mM KCl in the absence of Ca +2 in the presence of EGTA (10μM) followed by the addition of a single dose of CaCl 2 (10 mM for 10 minutes). For the dosage of noradrenaline we used an electrochemical detector for t he detection of catecholamine in HPLC, Shimadzu, column RP - 18e Chromolith (Merck). Plasma corticosterone concentrations were measured by radioimmunoassay. Results: T he group treated with AMPH 3 mg /kg showed a potentiating of the VD contractile response of noradrenaline, barium and calcium, without chang e of neurogenic contraction . It was noted also that the content of noradrenaline was reduced. With increasing dosage (AMPH 7 mg/ kg) we found only a reduction of phasic contraction to the E FS and the content o f noradrenaline determined by HP LC. The group treated with EtOH 4 mL/ k g showed a decrease in VD contractility to noradrena line , p henylephrine and barium, and EFS , as well as a lower content of catecholamine. The response to calcium was unchanged. Wi th incr easing dosage (EtOH 8 mL /kg) t he response of the agonists and barium, and the EFS was not changed. In contrast, such treatment depressed the tonic response for time - effect curves for calcium showed a tendency for increasing, though not significant ly , the c ontent of noradrenaline. T he group treated with AMPH 3 mg /kg + EtOH, 4 mL/kg did not show any changes in experimental protocols used. These data suggest that amphetamine and ethanol could be acting antagonistically. Using higher doses for this si multaneous treatment (AMPH 7 mg / kg + EtOH 8 mL / kg) we found no alteration in the experimental protocols tested. However, this treatment nullified the effects of each individual drug in the E FS and the time - effect curves for calcium. The treatments with amphetamine ( 7 mg / kg) or ethanol (4 mL / kg and / or 8 mL / kg) XXIV and simul t aneous treatments, did not significantly increase plasma concentrations of corticosterone . Conclusion: We observed a possible antagonism between amphetamine and ethanol when adm inistered simultaneously on peripheral sympathetic neurotransmission of periadolescent animals / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações