Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-21Bitstream added on 2014-06-13T20:05:11Z : No. of bitstreams: 1 fabro_at_dr_botfm.pdf: 9225853 bytes, checksum: cd0dd6d4aee86763e86640feaa8792e7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A fibrose pulmonar é a base patológica de uma variedade de doenças crônicas incuráveis. A IL-17A, uma glicoproteína secretada de células Th17, é uma citocina pró-fibrótica relacionada recentemente à síntese de colágeno V e fibrose pulmonar. O remodelamento parenquimatoso pulmonar da matriz extracelular pelo colágeno I e V, apoptose e resposta Th17 foi estudado em camundongos Balb/c, C57/B6J selvagens e com knockout para o receptor A da IL-17; para determinar as vias fisiopatológicas que prolongam a fase tardia do processo fibrótico induzido por bleomicina e paraquat. Microscopia eletrônica, imunofluorescência, imunohistoquímica, detecção in situ da apoptose, morfometria, reconstrução tridimensional e reação em cadeia da polimerase em tempo real foram usados para avaliar a quantidade, estrutura e cadeias moleculares dos tipos de colágenos, apoptose e células imunes. Verificamos um aumento da síntese e secreção do colágeno V que promove a perpetuação da fibrose pulmonar de maneira IL-17A dependente. Além disso, observou-se que marcadores críticos da resposta Th17 como IL17, STAT3, TGF-β, IL-6, IL- 21, IL-23 e células T CD4+ foram significantemente aumentados em cepas susceptíveis a fibrose pulmonar e intensificadas na ausência do receptor A da IL-17. O aumento de marcadores Th17 resulta em um aumento de células T CD4+ através de uma resposta imune que efetivamente bloqueia a degradação do colágeno V, o qual contribui para o bloqueio da apoptose. Nosso estudo indica que o colágeno V participa da perpetuação da fibrose pulmonar por mecanismos IL-17 dependente e independentes, indicando o potencial alvo terapêutico do colágeno V e das vias de sinalização da resposta IL-17 no tratamento das doenças fibroproliferativas pulmonares / Pulmonary fibrosis is the pathologic basis for a variety of incurable human chronic lung diseases. IL-17A, a glycoprotein secreted from IL-17– producing cells, has recently been shown to be a profibrotic cytokine involved in type V collagen synthesis and pulmonary fibrosis. Remodeling of the extracellular matrix by collagen I and V, cell death and Th-17 immune response were evaluated in Balb/c, wild and IL-17 receptor A knockout C57/B6J mice, to determine the pathways that prolong the late phase of the fibrotic process induced by bleomycin and paraquat. Electron microscopy, immunofluorescence, immunohistochemistry, in situ detection of apoptosis, morphometry, tridimensional reconstruction and a real-time PCR were used to evaluate the amount, structure and molecular chains of collagen types, apoptosis and immune cells. We verified increased synthesis and secretion of type V collagen that promoted the maintenance of pulmonary fibrosis in a IL-17A dependent manner. However, we observed that the critical Th17 markers, IL-17, STAT3, TGF-β, IL-6, IL-21, IL-23 and CD4+ T cells, were significantly increased in the fibrosis-susceptible strain and intensified in the absence of IL-17 receptor A. Increased Th17 markers resulted in an increase in CD4+ T cells in fibrotic lung tissue toward an immune response that effectively blocked degradation of collagen V, which contributes to block apoptosis. Our studies indicate that collagen V participates in the maintenance of pulmonary fibrosis in both Th-17 – dependent and -independent manners and that collagen V and the components of the Th-17 signaling pathway are potential therapeutic targets for the treatment of fibroproliferative lung diseases

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

Orientadora : Profª. Drª. Lia Sumie Nakao / Orientadora : Profª. Drª. Marcia Helena Appel / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2013 / Inclui referências / Área de concentração :Biologia / Resumo: Quiescina/sulfidril oxidase isoforma 1b (QSOX1b) é uma enzima secretada, e catalisadora da oxidação de proteínas nascentes e mal dobradas. Esta oxidação induz a formação de pontes dissulfeto, que são cruciais para a conformação e estabilidade de diversas proteínas. A literatura propõe que a oxidação de proteínas intra e extracelular, ou aquelas de superfície celular, acarreta em mudanças no estado redox destes microambientes, e também em alterações conformacionais das micro e macroestruturas proteicas. Baseado nisso, tivemos como objetivo analisar o papel de QSOX1b recombinante de camundongo (mQSOX1b) como possível oxidase da fibronectina (FN), uma glicoproteína dimérica de matriz extracelular (MEC). Através das determinações de peróxido de hidrogênio e de tióis em ensaios cinéticos com mQSOX1b e FN reduzida (redFN), in vitro, constatamos que redFN é oxidada pela enzima. A constante de Michaelis menten medida foi de aproximadamente 456 nM (com uréia) e 290 nM (sem uréia). redFN, per se, auto fibrila, produzindo multímeros solubilizados por deoxicolato (DOC), contudo, verificamos que mQSOX1b acelera a formação destes multímeros. Estas estruturas fibrilares possuem massa molecular maior que 800 kDa, e são desfeitas por agentes redutores, mas não são desfeitas por DOC (2%), indicando que são mantidas por pontes dissulfeto. Os multímeros não afetam a interação de redFN com gelatina, como indicado por imunoensaio. Coatings com multímeros de FN (nativa e reduzida) não alteraram a capacidade adesiva de Rasm (células musculares lisas de aorta de rato), HeLa (células de câncer cervical, Henrietta Lacks) ou 3t3 (Fibroblasto de camundongo), contudo, a proliferação foi aumentada quando Rasm e HeLa foram incubados sobre natFN junto a mQSOX1b. Ao analisar a superexpressão da mQSOX1b sobre o estado redox da MEC e superfície celular nas linhagens Hek293t (células de rim de embrião humano para transfecção) e HeLa, pudemos constatar a promoção do estado mais oxidado para estes ambientes. Sendo assim, propomos para QSOX1b funções biológicas sobre a formação e remodelamento de componentes da MEC, aqui demonstrado especificamente sobre FN. Sendo assim, a presença de QSOX1 pode estar associada com o controle do crescimento e sobrevivência celular, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas. Palavras chaves: Quiescina/Sulfidril Oxidase 1b (QSOX1b); Matriz extracelular (MEC); Fibronectina (FN); oxidação; estado redox. / Abstract: Quiescin/Sulfhydryl Oxidase isoform 1b (QSOX1b) is a secreted enzyme, and catalyzes the oxidation of nascent and misfolded proteins. This oxidation leads to the formation of disulfide bonds which are critical to the conformation and stability of various proteins. The literature suggests that oxidation of intra-and extracellular proteins or those at cell surface leads to changes in the redox state of these microenvironments, as well as conformational changes in the protein micro and macrostructure. Based on that, we aimed to analyze the role of mouse recombinant QSOX1b (mQSOX1b) as a possible oxidase for fibronectin (FN), a dimeric glycoprotein of the extracellular matrix (ECM). In vitro, through enzyme kinetics assays and measurement of thiols in the presence of mQSOX1b and reduced FN (redFN), we found that redFN is oxidized by the enzyme. The KM values found were approximately 456 nM (urea) and 290 nM (without urea). FN multimers are also generated by auto fibrillation and can be solubilized by deoxycholate (DOC), however, we found that the QSOX1b accelerates the formation of these multimers. These fibrillar structures have molecular mass greater than 800 kDa, and are lost in the presence of reducing agents but not DOC (2%), indicating that multimers are maintained by disulfide bonds. The multimers forms no affect the gelatin-redFN interaction, indicated by ELISA. Coatings with multimers of FN (native and reduced FN) did not alter the adhesive capacity of Rasm, HeLa or 3T3, however, the proliferation was increased when Rasm and HeLa were incubated on natFN along mQSOX1b. Analyzing mQSOX1b overexpression influence on the ECM redox state and cell surface protein thiols at HEK293T and HeLa cells, we found more oxidized state for these environments. Therefore, we propose as biological functions to QSOX1b the formation and remodeling ECM components, here specifically FN. Thus, the presence of QSOX1 may be associated with cellular growth and survival control, probably in physiological and pathological conditions. Keywords: Quiescin/sulfhydryl oxidase 1b (QSOX1b), extracellular matrix (ECM), fibronectin (FN); oxidation; redox state.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCKM.pdf: 1278719 bytes, checksum: e6f475e245c9c48760e1aefa654ef6c0 (MD5) Previous issue date: 2006-06-08 / Universidade Federal de Minas Gerais / ACLF is a fibrinolytic non-hemorrhagic metallopeptidase from the venom of the snake Agkistrodon contortrix laticinctus. rACLF is synthesized as a zymogen (pro- ACLF) with 412 aminoacids, while the active form of enzyme has 222 aminoacids. The ORF (open reading frame) that codes for the peptidase was isolated (from a cDNA venom gland library of A. contortrix. lacticinctus ) and characterized. This work shows the effects of rACLF on endothelial cells (HUVECs), tumor cells (HeLa, MDA-MB-231 and MCF-7) and non-tumor cell (fibroblast) as well its proteolytic activity on extracellular matrix proteins. Our results showed that rACLF inhibited the apoptosis induced by serum deprivation in HUVECs, but had no effect on cell proliferation. rACLF had direct effect on HUVECs, since it was observed an increased amount of IL-8 in the cell supernatants, in addition to the expression induction of molecules related to adhesion and inflammation processes. rACLF and rACLH were not cytotoxic to human fibroblasts. On the other hand, both proteins caused decrease of cell viability, changes in morphology, and detachment of HeLa cells. On human fibroblasts, rACLF modulated the expression of chemokines CXC, IL-8 and GRO, and chemokine CC, MCP1. The supernatant of human fibroblasts and HeLa cells were analyzed for MMP-2 (gelatinase-A) secretion. No difference was observed after 48 h incubation with rACLF and controls. rACLF presented hydrolytic activity on extracellular matrix proteins, such as laminin, fibronectin, collagen IV, and thrombospondin. Furthermore, hydrolytic activity on insulin β chain peptide was tested and compared to rACLH activity. rACLF was shown to be more efficient than rACLH on this substrate. In conclusion, the results of this study increased the knowledge on the protein effects on different cell lines and open up perspectives for new studies concerning signaling and regulation mechanisms affected by this protein activity. / A ACLF é uma metalopeptidase da peçonha da serpente Agkistrondon contortrix laticinctus. A ACLF é sintetizada na forma de zimogênio (pró-ACLF) com 412 aminoácidos, enquanto a sua forma ativa possui 222 aminoácidos. A fase aberta de leitura que codifica para a peptidase foi isolada (de uma biblioteca de cDNA feita a partir da glândula venenífera da serpente) e caracterizada. Este trabalho apresenta os efeitos da rACLF em células endoteliais (HUVECs), tumorais (HeLa, MDA-MB-231 e MCF-7) e não-tumorais (fibroblastos), bem como a atividade proteolítica da enzima sobre proteínas da matriz extracelular, como colágeno, fibronectina, laminina e trombospondina. Nossos resultados demonstraram que a rACLF inibiu a apoptose induzida por privação de soro fetal bovino em HUVECs, mas não foi capaz de induzir a proliferação celular. A rACLF apresentou efeito direto sobre as células endoteliais, aumentando a liberação de IL-8, além de induzir a expressão de moléculas envolvidas na adesão celular e reposta inflamatória. A rACLF e a rACLH não foram citotóxicas para fibroblastos humanos. Por outro lado as duas enzimas estudadas causaram redução na viabilidade alteração na morfologia e desgrudamento em células HeLa. Em fibroblastos, a rACLF modulou a expressão das quimoquinas CXC, IL-8 e GRO e CC, MCP1. Nos sobrenadantes de fibroblastos e HeLa incubados com rACLF por 48 h não foi observada diferença na secreção de MMP-2 (gelatinase-A). A rACLF apresentou atividade sobre proteínas da matriz extracelular, como laminina, fibronectina, colágeno IV e trombospondina. A rACLF também hidrolisou alguns substratos fluorogênicos e foi mais eficiente na hidrólise do substrato correspondente ao peptídeo central da cadeia β da insulina, quando comparada com a rACLH .Os resultados deste trabalho contribuíram para melhor entendimento dos efeitos da proteína estudada sobre diferentes linhagens celulares e abrem perspectivas para novos estudos voltados à elucidação dos mecanismos de regulação e sinalização afetados pela atividade da proteína.

Orientador: Célia Regina Nogueira / Coorientador: Patricia Pinto Saraiva / Banca: Sandro José Conde / Banca: Durvanei Augusto Maria / Resumo: Introdução: As Células Tronco Mesenquimais (CTMs) são capazes de diferenciar em várias linhagens de células. As CTMs, quando em cultura, e na presença de citocinas ativadoras de osso, sofrem osteoindução e diferenciam em osteoblastos. Entretanto, pouco se conhece sobre a função e a proliferação dos progenitores osteoblásticos, que pode ser essencial para a integridade do tecido ósseo. Objetivo: Implantar a técnica para diferenciação osteoblástica a partir de células tronco mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo. Metodologia: O tecido adiposo foi obtido de três pacientes do sexo feminino submetidas à abdominoplastia. As CTMs foram mantidas em meio D-MEM completo contendo 10% de SFB, mantidas a 37° C em uma atmosfera umidificada com 95% O2/5% CO2. Após a confluência alíquotas de células foram separadas para o processo de caracterização celular. Após esse período, foi realizada osteoindução utilizando meio DMEN completo com acréscimo de dexametasona, ácido ascórbico e βglicerofosfato. As células foram mantidas nesse meio por até 16 dias. Como controle negativo da indução, culturas de células foram mantidas em meio convencional pelo mesmo período de tempo. Ao término de 16 dias as células foram separadas para a caracterização celular e o RNA foi coletado para análise da expressão de RANKL. Resultados: As células após seis dias de cultura apresentaram aderidas com 40% de confluência e após dezessete dias com 75% de confluência. As CTMs expressaram anticorpo CD 44 e 90. Foi encontrado médio nível (20%- 40%) de dano de DNA em 40% das CTMs analisadas. A imunofluorescência confirmou a homogeneidade e positividade para expressão de anti-vimentina. A diferenciação química foi conseguida pela adição de dexametasona, ácido ascórbio e βglicerofosfato ao meio DMEN completo. Houve a expressão de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal Stem Cells (MSCs) are able to differentiate into multiple cell lineages. The MSCs, when cultured, in the presence of activating cytokines bone suffer osteoinduction and differentiate into osteoblasts. However, little is known about the function and proliferation of osteoblastic progenitors, which can be essential for the integrity of bone tissue. Objective: Deploy the technique for osteoblast differentiation from human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue. Methods: Adipose tissue was obtained from three female patients undergoing abdominoplasty. MSCs were maintained in complete D-MEM containing 10% FBS, maintained at 37 ° C in a humidified atmosphere with 95% O2 / 5% CO2. After confluence aliquots of cells were separated into the cellular characterization process. After this period, was performed using osteoinduction medium DMEN complete with addition of dexamethasone, ascorbic acid and βglicerofosfato. Cells were maintained in this medium for up to 16 days. As a negative control induction, cell cultures were maintained in standard medium for the same period of time. At the end of 16 days the cells were separated for the characterization and cellular RNA was collected for analysis of expression of RANKL. Results: The cells after six days of culture had adhered with 40% confluency and after seventeen days with 75% confluency. The MSCs expressed antibody CD 44 and 90. Found average level (20% - 40%) of DNA damage in 40% of MSCs analyzed. Immunofluorescence confirmed the homogeneity and positivity for anti-vimentin expression. The chemical differentiation was achieved by addition of dexamethasone, ascórbio acid and βglicerofosfato DMEN in half full. There expression of alkaline phosphatase, osteocalcin, RANKL and mineralized matrix formation from osteoblasts after 16 days with osteogenic... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Nosso estudo tem como objetivo verificar a presença e distribuição das fibras do sistema elástico na mucosa do bulbo duodenal humano normal. Para isso, foram realizadas biópsias endoscópicas do bulbo duodenal de nove homens adultos voluntários, as quais foram histologicamente processadas e coradas seletivamente para as fibras do sistema elástico, e observadas através de microscopia óptica. As técnicas de coloração seletiva utilizadas para fibras do sistema elástico foram: orcinol-neofucsina, para fibras elásticas; resorcina-fucsina de Weigert sem oxidação prévia, para fibras elaunínicas e elásticas; e resorcina-fucsina de Weigert com oxidação prévia, para fibras oxitalánicas, elaunínicas e elásticas. Através destas técnicas, nosso estudo revelou a presença de: a) descontínuas e curtas fibras elásticas localizadas somente na muscular da mucosa, exibindo características que sugerem tratar-se de estruturas fibrosas da parede dos vasos sangüíneos presentes nesta camada; b) fibras elaunínicas dispostas em uma linha subepitelial ao nível das vilosidades, ao redor das glândulas de Lieberkühn e de Brunner, e na muscular da mucosa; c) fibras oxitalânicas dispostas em uma linha subepitelial ao nível das vilosidades, ao redor das glândulas de Lieberkühn e de Brunner, e na muscular da mucosa. Esta distribuição pode sugerir a participação das fibras oxitalânicas e elaunínicas nas importantes e necessárias funções de suporte mecânico e mobilidade da mucosa bulbar. Estes resultados nos permitiram a realização de um desenho esquemático da distribuição das fibras oxitalânicas, elaunínicas e elásticas na mucosa do bulbo duodenal humano normal. / Our objective by means of this study is checking up on the presence and distribution of the elastic system fibers in the normal human duodenal bulta mucosa. For this purpose, were performed endoscopic biopsies on duodenal bulb of nine voluntary adult men, being such biopsies histologically processed and selective coloring for the fibers of the elastic system, and observed through optical microscopy. The techniques of selective coloration used for elastic system fibers were as follows: orcinol-new fuchsin, to elastic fibers; Weigerfs resorcin-fuchsin without oxidation, to elaunin and elastic fibers; and Weigerfs resorcin-fuchsin with previous oxidation, to oxytalan, elaunin and elastic fibers. Through these techniques, our investigations revealed the presence of: a) short and discontinuous elastic fibers localized only on the muscularis mucosae, exhibiting characteristics which suggest to be fibrous structures frora the walls of blood vessels present in this stratum; b) elaunin fibers disposed in a subepitelial line at the levei of the villosities, around Lieberkühn•s and Brunner,s glands, and in the muscularis mucosae; c) oxytalan fibers disposed in a subepitelial line at the levei of the villosities, around Lieberkühn's and Brunner's glands, and in the muscularis mucosae. This distribution may suggest the participation of the oxytalan and elaunin fibers in the important and necessary functions of mechanical support and mobility of the bulbar mucosa. These results gave us the possibility of realizing a schematic drawing of the distribution of oxytalan, elaunin and elastic fibers on the normal human duodenal bulb mucosa.

Orientador: Benedicto de Campos Vidal / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T09:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_MarcelaAldrovani_D.pdf: 1521761 bytes, checksum: 9a7ab4633d89c9a2a2caa5f1bc35ce53 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Diabetes mellitus é uma doença crônica que afeta o metabolismo de lipídios, carboidratos e proteínas. Sua principal característica é a hiperglicemia devido à produção insuficiente de insulina ou a defeitos na resposta à insulina pelos tecidos periféricos. A hiperglicemia, quando muito acentuada, induz glicosilação não-enzimática de proteínas, que é responsável pela formação de produtos finais de glicosilação não-enzimática (AGEs) e de ligações cruzadas intermoleculares. Neste estudo, organização supramolecular, orientação espacial e propriedades ópticas foram investigadas em proteínas extracelulares da córnea e da aorta de camundongos diabéticos não-obesos (NOD) e não diabéticos (BALB/c). CÓRNEAS: Birrefringência e dicroísmo linear foram investigados em fibras colágenas do estroma corneal de camundongos NOD/Uni e BALB/c/Uni. A contribuição de proteoglicanos do estroma para as anisotropias da córnea também foi investigada. Retardo óptico foi medido em fibras colágenas de córneas intactas e seccionadas com 8 µm de espessura (sem coloração). Dicroísmo linear e índices dicróicos foram investigados em cortes de córnea corados com ponceau SS pH 2.5 e azul de toluidina pH 4.0, usando microespectrofotômetro de varredura e diferentes comprimentos de onda obtidos com régua monocromática. Análise morfológica das birrefringências revelou que fibras colágenas de camundongos NOD e BALB/c estão intercruzadas em vários planos espaciais e orientadas em mais que uma direção ao longo da trajetória corneal. Córneas de NOD apresentaram maiores valores de retardo óptico das birrefringências que o controle. Fibras colágenas coradas com ponceau SS apresentaram valores positivos de dicroísmo linear e índice dicróico. Esses valores foram maiores para as córneas de NOD. Após coloração com azul de toluidina, córneas de NOD e BALB/c apresentaram reação metacromática devido à presença de grupamentos aniônicos (glicosaminoglicanos de proteoglicanos) no estroma; e valores negativos de dicroísmo linear e índice dicróico. Não foi verificada diferença significativa entre córneas de NOD e BALB/c coradas com azul de toluidina. Esses resultados sugerem que o diabetes foi capaz de alterar as anisotropias ópticas da córnea, possivelmente por aumentar o empacotamento molecular das fibras colágenas. Entretanto, o diabetes não alterou a organização espacial dos proteoglicanos do estroma. AORTAS: Ocorrência de glicosilação não-enzimática foi verificada em aortas abdominais de camundongos NOD/Uni, usando azul de nitro-tetrazólio (NBT). Alterações moleculares e estruturais foram investigadas em lâminas elásticas e fibras colágenas, após colorações com cloreto de danzila e anilino-sulfato naftaleno (ANS). Alterações em auto-fluorescência e birrefringência arterial foram investigadas em aortas sem coloração. Proliferação de células musculares lisas também foi investigada em amostras coradas com a reação de Feulgen, usando microscopia confocal e análise de imagem. NBT demonstrou a formação de produtos de glicosilação (frutosamina) na matriz extracelular da aorta de NOD. Lâminas elásticas e fibras colágenas da aorta de NOD apresentaram fluorescência menos intensa que o controle, após colorações com cloreto de danzila e ANS. Entretanto, a auto-fluorescência arterial foi maior nos camundongos NOD. Análise da birrefringência revelou alterações no empacotamento molecular das fibras colágenas da aorta NOD. Nenhuma evidência de proliferação de células musculares lisas foi observada em aortas NOD coradas com a reação de Feulgen / Abstract: Diabetes mellitus is a chronic disorder of the carbohydrate, lipids and protein metabolism. A characteristic feature of this disorder is the hyperglycemia due to a deficient insulin production or to metabolic defects on its response in peripheral tissues. Hyperglycemia induces non-enzymatic glycosylation of proteins, which is responsible for advanced glycosylation end-products (AGEs), and intermolecular crosslinks reactions. In this study, supramolecular organization, spatial orientation and optical properties were investigated in extracellular proteins of the cornea and of the abdominal aorta from nonobese diabetic (NOD) mice and non-diabetic mice (BALB/c). CORNEAS: Birefringence and linear dichroism were investigated in corneal stroma collagen fibers from nonobese NOD/Uni mice and BALB/c/Uni mice. The contribution of stroma proteoglycans to optical anisotropies of the cornea was also investigated in NOD and BALB/c mice. Birefringence optical retardations were measured in stroma collagen fibers of unstained whole and sectioned (8 µm) corneas. Linear dichroism and dichroic ratios were investigated in cornea sections stained with ponceau SS pH 2.5 and toluidine blue pH 4.0, using scanning microspectrophotometer and different wavelengths that were obtained with a monochromator filter ruler. Morphological analysis of the birefringences revealed that NOD and BALB/c stroma collagen fibers are intercrossed in different spatial planes and oriented in more that one direction along the corneal trajectories. NOD corneas showed higher birefringence optical retardation values than the control. Ponceau SS-complexed collagen fibers showed positive linear dichroism and dichroic ratios values that were higher for NOD corneas. After staining with toluidine blue, NOD and BALB/c corneas showed metachromatic reaction verifying the presence of anionic groups (proteoglycan glycosaminoglycans) in the stroma, and negative linear dichroism values. No significant difference was observed between NOD and BALB/c corneas stained with toluidine blue. These results demonstrate that diabetes was capable of altering the optical anisotropies of the cornea, possibly to increase the number of intermolecular crosslinks in stroma collagen fibers, making them more crystalline and aggregate than the control. However, diabetes did not affect the spatial organization of the stroma proteoglycans. Nonenzymatic glycosylation was assessed in aorta extracellular matrix from NOD/Uni mice, using nitroblue tetrazolium (NBT). Molecular and structural changes were investigated in elastic lamellae and collagen fibers of diabetic mice aortas, after staining with dansyl chloride and anilinonaphthalene sulfonate (ANS). Alterations in arterial autofluorescence and birefringence of collagen fibers were investigated in unstained aortas. Smooth muscle cells proliferation was also investigated by confocal microscopy and image analysis, after Feulgen reaction. Assessment of nonenzymatic glycosylation demonstrated glycosylation products formation in the aorta extracellular matrix from NOD mice. Elastic lamellae and collagen fibers from diabetic aortas presented less intense fluorescence after staining with dansyl chloride and ANS when compared to controls. However unstained NOD aortas showed more intense autofluorescence when compared to controls. Birefringence analysis suggests alterations in the higher molecular packing of the arterial collagen fibers in diabetic aortas. In aortas stained by Feulgen reaction no evidence of smooth muscle cells proliferation was observed in diabetic aortas / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Jose Mauro Granjeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:41:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Demarchi_AnaClaudiaCardosodeOliveira_D.pdf: 5748533 bytes, checksum: fc7f80117afc19afea7b65b54245cd3e (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As fissuras orais exercem uma profunda influência sobre a vida de seus portadores. Esses indivíduos apresentam, desde o nascimento, dificuldades na alimentação, disturbios ósseos maxilar e mandibular, na arcada dentária, na fala e, em alguns casos, na audição. Além disto, fissurados e seus familiares enfrentam sérios problemas psicológicos decorrentes do comprometimento estético causado pela anomalia. Sem dúvida alguma, a morfogênese do palato secundário é um dos pontos mais críticos na formação da face e do palato. Depende de uma sequência complexa de eventos que possuem em comum o remodelamento de matriz extracelular (MEC), regulado, principalmente, pelas metaloproteinases de matriz (MMPs). Esta éa primeira vez que RECK, uma proteína indutora da reversão tumoral, rica em cisteína e com motivos kazal, é pesquisada neste processo. O primeiro objetivo deste estudo foi investigar se há expressão de RECK durante os eventos envolvidos na formação do palato secundário em camundongos. A partir dos resultados obtidos, indicando a presença de RECK nesses eventos, objetivou-se estabelecer um padrão temporal e espacial dessa expressão, assim como analisar o padrão de distribuição de MMP-2 e MMP-9, comparando os resultados obtidos entre si. Para tanto, cabeças inteiras e palatos dissecados de embriões de camundongos com 13; 14; 14,5 e 15 dias de desenvolvimento embrionário (DE) foram submetidos a reações de PCR em tempo real, hibridização in situ, imunoistoquímica e zimografia. As reações de PCR em tempo real indicaram a presença de mRNA de RECK (mRECK) em todos os períodos analisados, os níveis do transcrito aumentaram gradativamente e foram significativamente diferentes entre 13 e 15DE e entre 14 e lSDE. Os resultados de hibridização in situ e imunoistoquímica apontaram, consecutivamente, um padrão variável de distribuição de mRECK e da proteína RECK no mesênquima, epitélio e linha de junção (LI) formada entre as paredes palatais, no transcorrer dos períodos analisados. Com relação ao padrão de expressão das MMPs, a análise imunoistoquímica revelou a presença de MMP-2 no mesênquima, epitélio e LI em todos os períodos. A MMP-9 foi expressa no 14DE, 14,SDE e lSDE na LI e mesênquima palatal. A análise zimográfica confirmou a atividade de MMP-2 e MMP-9. Dessa forma, concluímos que RECK está presente nos principais eventos de formação do palato secundário, apresentando um padrão de expressão variável no tempo e espaço, que quando compar~o ao padrão de " expressão de MMP-2 e MMP-9 apresentam, na maioria das vezes, similaridades entre si. Esses , achados sugerem um provável envolvimento dessas moléculas na organogênese do palato secundário e uma possível interação/modulação entre elas / Abstract: The oral clefts show a great influence in the size of their hosts. They have, since birthy, difficulties in alimentation, problems in the maxilar bones, in dental arch, in speech, and in some cases, in hearing. In addition, the hosts and their families have serious psychological problems due to the esthetic lenght caused by anomalia. With no doubt, the formations of the secondary palate is one of the most critial phases during the formation of the surface and of the palate. Depending on a sequente of complex events that have in common the remodeling of the extracellular matrix (ECM), mainly regulated by matrix metalloproteinases (MMPs). This is first time that the presence of RECK, a reversion-inducing cystein-rich protein with kazal motifs, this is process is researched. The first objective of this study was to investigate the RECK expression during events involved in formation of the secondary palate in mice. Based on the results obtained, which indicated the presence of RECK in these events, the objective was to establish a temporal and spatial pattern of such expression, as well as to analyze the pattern of distribution of MMP-2 and MMP-9, comparing the results obtained to each other. For that purpose, whole heads and dissected palates of mice aged 13, 14, 14.5 and 15 days of embryonic development (ED) were submitted to real-time PCR, in situ hybridization, immunohistochemistry and zymography. The real-time PCR indicatedthe presence of mRNA of RECK (mRECK) in all periods analyzed; the transcript levels were gradually increased and were significant1y different between 13 and 15ED and between 14 and 15ED. The results of in situ hybridization and immunohismchemistry consecutively indicated a variable pattern of distribution of mRECK and RECK protein in the mesenchyme, epithelium and in midline edge seam (MES) formed between the palatal shelves during the study periods. With regard to the pattern of expression of MMPs, immunohistochemical analysis revealed the presence of MMP- 2 in the mesenchyme, epithelium and MES in all periods. The MMP-9 was expressed in the MES and palatal mesenchyme at 14ED, 14.5ED and 15ED. Zymographic analysis confirmed the activity of MMP- 2 and MMP-9. Therefore, it was concluded that RECK is present in the main events of formation of the secundary pala te, presenting a variable pattern of expression along time and space, which often present similarities to each other compared to the pattern of expression of MMP-2 and MMP-9. These findings suggest probable .involvement of these molecules in the formation of the secondary palate and possible interaction/modulation among them / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

Nosso estudo tem como objetivo verificar a presença e distribuição das fibras do sistema elástico na mucosa do bulbo duodenal humano normal. Para isso, foram realizadas biópsias endoscópicas do bulbo duodenal de nove homens adultos voluntários, as quais foram histologicamente processadas e coradas seletivamente para as fibras do sistema elástico, e observadas através de microscopia óptica. As técnicas de coloração seletiva utilizadas para fibras do sistema elástico foram: orcinol-neofucsina, para fibras elásticas; resorcina-fucsina de Weigert sem oxidação prévia, para fibras elaunínicas e elásticas; e resorcina-fucsina de Weigert com oxidação prévia, para fibras oxitalánicas, elaunínicas e elásticas. Através destas técnicas, nosso estudo revelou a presença de: a) descontínuas e curtas fibras elásticas localizadas somente na muscular da mucosa, exibindo características que sugerem tratar-se de estruturas fibrosas da parede dos vasos sangüíneos presentes nesta camada; b) fibras elaunínicas dispostas em uma linha subepitelial ao nível das vilosidades, ao redor das glândulas de Lieberkühn e de Brunner, e na muscular da mucosa; c) fibras oxitalânicas dispostas em uma linha subepitelial ao nível das vilosidades, ao redor das glândulas de Lieberkühn e de Brunner, e na muscular da mucosa. Esta distribuição pode sugerir a participação das fibras oxitalânicas e elaunínicas nas importantes e necessárias funções de suporte mecânico e mobilidade da mucosa bulbar. Estes resultados nos permitiram a realização de um desenho esquemático da distribuição das fibras oxitalânicas, elaunínicas e elásticas na mucosa do bulbo duodenal humano normal. / Our objective by means of this study is checking up on the presence and distribution of the elastic system fibers in the normal human duodenal bulta mucosa. For this purpose, were performed endoscopic biopsies on duodenal bulb of nine voluntary adult men, being such biopsies histologically processed and selective coloring for the fibers of the elastic system, and observed through optical microscopy. The techniques of selective coloration used for elastic system fibers were as follows: orcinol-new fuchsin, to elastic fibers; Weigerfs resorcin-fuchsin without oxidation, to elaunin and elastic fibers; and Weigerfs resorcin-fuchsin with previous oxidation, to oxytalan, elaunin and elastic fibers. Through these techniques, our investigations revealed the presence of: a) short and discontinuous elastic fibers localized only on the muscularis mucosae, exhibiting characteristics which suggest to be fibrous structures frora the walls of blood vessels present in this stratum; b) elaunin fibers disposed in a subepitelial line at the levei of the villosities, around Lieberkühn•s and Brunner,s glands, and in the muscularis mucosae; c) oxytalan fibers disposed in a subepitelial line at the levei of the villosities, around Lieberkühn's and Brunner's glands, and in the muscularis mucosae. This distribution may suggest the participation of the oxytalan and elaunin fibers in the important and necessary functions of mechanical support and mobility of the bulbar mucosa. These results gave us the possibility of realizing a schematic drawing of the distribution of oxytalan, elaunin and elastic fibers on the normal human duodenal bulb mucosa.