A obesidade caracterizada pelo excesso de tecido adiposo está associada a comorbidades como diabetes mellitus tipo 2 (DMT2), hipertensão arterial, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer. Para pacientes considerados obesos mórbidos (OBM) (IMC>40Kg/m²) a melhor opção terapêutica é a cirurgia de bypass gástrico em Y de Roux (RYGB). Estudos clínicos mostram que após esse procedimento os indivíduos OBM com DMT2 melhoram seu estado. Uma explicação para esse fenômeno é a mudança anatômica que ocorre no trato gastrintestinal, alterando assim a produção das incretinas, GIP e GLP-1, que promovem a liberação de insulina. Essas incretinas são liberadas pela mucosa do intestino delgado na forma de próhormônios e necessitam da ativação feita pela enzima PC 1/3. Carboidratos e ácidos graxos estimulam sua liberação. Após exercerem sua ação são inativadas pela enzima DPP-IV. Logo o objetivo desse trabalho foi a quantificação de mRNA de pró-glucagon, GIP, PC1/3 e DPP-IV em jejuno proximal de OBM DMT2 e não diabetes mellitus tipo 2 (NDM2) , bem como avaliar o efeito, in vitro, de ácidos graxos monoinsaturados cis, trans e glicose sobre esse tecido. O jejuno foi obtido de indivíduos OBM submetidos RYGB. Para a quantificação basal do mRNA dos genes de interesse, o tecido (n=25) retirado na cirurgia foi diretamente imerso em TRIzol para a extração do RNA total. O mRNA foi quantificado pela reação em cadeia da polimerase (qRTPCR). Para avaliar o efeito dos ácidos graxos in vitro, o jejuno (n=5) foi fatiado (400 µm) e incubado em meio DMEM suplementado com 50 µM de acido oléico, elaidico, vaccênico ou 11 mM de glicose por 4 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 Entre OBM DMT2 e NDM2 não houve diferença estatística na expressão do mRNA de GIP, GLP-1 e DPP-IV, apenas observamos que indivíduos NDM2 tem tendência a uma maior expressão do mRNA de PC1/3 (p=0,065). No entanto, alguns pacientes não expressaram mRNA de PC1/3. A expressão dos genes estudados foi heterogênea, permitindo a divisão dos pacientes em alta e baixa expressão de GIP, sendo este utilizado como gene calibrador. Constatamos que a expressão de mRNA dos demais genes acompanham o perfil de expressão de GIP. Os testes in vitro revelaram que o ácido oléico diminuiu a expressão do mRNA de DPP-IV; o ácido vaccênico, aumentou significante a expressão do mRNA de próglucagon; e o ácido elaídico, não modulou a expressão dos genes estudados nesse trabalho. O tratamento com alta concentração de glicose aumentou o mRNA da enzimas PC1/3 e DPP-IV. Em conclusão, OBM NDM2 e DMT2 apresentaram expressão heterogênea desses genes não permitindo verificar diferença significativa entre os grupos. Alguns pacientes não expressaram o mRNA da PC1/3, e NDM2 transcreveram maior quantidade de mRNA desta enzima. Sugerimos que no jejuno proximal, os ácidos oleico e vaccênico da dieta, agem diretamente sobre as células e modulam os níveis das incretinas, diminuindo a expressão do mRNA da DPP-IV e aumentando o pró-glucagon, respectivamente. A glicose em altas concentrações estimula a transcrição das enzimas envolvidas na síntese e degradação das incretinas, podendo interferir na homeostase do metabolismo da glicose. Nossa pesquisa revela que a região do intestino que receberá diretamente o alimento após a cirurgia, pode ser modulada por este, principalmente se apresentar lipídeos e carboidratos na sua constituição. Maior atenção deve ser dada a estes pacientes do ponto de vista nutricional. / The obesity characterized by excess of adipose tissue is associated with comorbidities such as type 2 diabetes mellitus (T2DM), hypertension, cardiovascular disease and some types of cancer. For patients considered morbidly obese (OBM) (BMI> 40Kg/m²) the best therapeutic option is Roux- en- Y gastric bypass (RYGB). Clinical studies show that after this procedure, individuals with OBM T2DM improve this state. One explanation for this phenomenon is the anatomical change that occurs in the gastrointestinal tract, thereby altering the production of incretins, GIP and GLP-1, those promote the release of insulin. These incretins are released in the prohormones form by mucosa of small intestine and require the activation by the enzyme PC 1/3. Carbohydrates and fatty acids stimulate its release. After act they are inactivated by enzyme DPP-IV. Once the objective of this study was to quantify the mRNA of proglucagon, GIP, PC1/3 and DPP-IV in the proximal jejunum of OBM without type 2 diabetes mellitus (NDM2) and with T2DM and to evaluate the effect in vitro of fatty acids cis and trans monounsaturated and high glucose on this tissue. The jejunum was obtained from individuals OBM undergo RYGB. For the quantification of basal mRNA of these genes, the tissue removed at surgery was directly immersed in TRIzol for extraction of total RNA. The mRNA expression was quantified by polymerase chain reaction (qRT-PCR). To evaluate the effect of fatty acids in vitro, the jejunum was sliced (400 µm) and incubated in DMEM supplemented with 50 µM of oleic, elaidic, vaccênic acid or 11 mM of glucose for 4 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO2. Between OBM T2DM and NDM2 no statistical difference was observed in the expression of mRNA of GIP, GLP-1 and DPP-IV, only NDM2 tend to have greater expression of mRNA of PC1/3 (p=0.065). Furthermore, some patients did not express mRNA of PC1/3. The expression of genes studied was heterogeneous, allowing the division of patients into high and low expression of GIP, which was used as a calibrator gene. So, we found that the expression of mRNA of other genes accompany this profile. The in vitro tests showed that oleic acid decreased the DPP-IV mRNA expression, the vaccenic acid, significantly increased the proglucagon mRNA expression and elaidic acid not modulated the expression of genes studied in this work. Treatment with high concentration of glucose increased the mRNA of enzymes PC1/3 and DPP-IV. In conclusion, OBM NDM2 and T2DM showed heterogeneous expression of these genes consequently did not permit verifying significant differences between groups. Some patients do not express the mRNA of PC1/3 and NDM2 transcribe major amount of mRNA of this enzyme. We suggest that in the proximal jejunum, the oleic and vaccenic acid of diet, act directly on cells and modulate incretins levels, reducing the expression of DPP-IV mRNA and increasing the proglucagon, respectively. Glucose at high concentrations stimulates the transcription of enzymes involved in synthesis and degradation of incretins and may interfere with the homeostasis of glucose metabolism. Our research shows that this intestine region that directly receives the food after the surgery, can be modulated by foods that contains especially fat and carbohydrate. Greater attention should be given to these patients about nutritional view.

A intenção deste trabalho é efetuar uma leitura do romance O Mensageiro, do autor inglês L.P. Hartley, na forma de uma jornada ao país estrangeiro do passado do protagonista-narrador. Tal leitura é uma espécie de convite aceito para a viagem, que esteticamente deixa sugestões sob a forma de truques, fragmentos de mensagens veladas, expressões ambíguas, sombras, vazios no caminho. Todavia, Mercúrio, o mensageiro dos antigos deuses, o protetor dos viajantes, o trapaceiro, é agora um ser indistinto, cuja imagem e função passou por grandes transformações ao longo da viagem até a modernidade. Guerras, restos de experiências traumáticas coletivas e pessoais são recuperadas na rota movediça do narrador melancólico, sob a forma de substância própria para a narração. Nietzsche e Walter Benjamin são companheiros na trajetória, provendo o suporte teórico básico para a viagem. / The intention of the present work is to make a reading of the novel The Go- Between, by the British writer, L.P. Hartley, in the form of a journey through the strange country of the protagonist/ narrator´s own past. Such reading comes as an accepted invitation to make the trip together with the narrator, who aesthetically leaves suggestions under the form of tricks, fragments of veiled messages, ambiguous expressions, shadows, gaps on his way. However, Mercury, the messenger of the ancient Gods – the protector of the travelers, the trickster is now is an indistinct being, whose image and function has undergone great transformations during the journey until modern times. Wars, remains of traumatic collective and personal experiences, are visualized in form of substantial fragmented material proper for narrative throughout the unstable route of the melancholy protagonist. Nietzsche and Walter Benjamin provide the basic theoretical support throughout the route.

Orientadora : Dra. Andréa Rodrigues Ávila / Coorientador : Prof. Dr. Alexandre Haruo Inoue / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/02/2017 / Inclui referências : f. 151-158 / Resumo: Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma endemia da América Latina que afeta milhões de pessoas. Este parasita tem um ciclo de vida alternado entre hospedeiros vertebrados e invertebrados, e necessita se adaptar a mudanças em diferentes ambientes que encontra ao longo do ciclo de transmissão. O T. cruzi controla a expressão de genes a partir de eventos majoritariamente pós-transcricionais. Vias que controlam a estabilidade do mRNA ou a tradução de proteínas são bem conhecidas, enquanto que mecanismos moleculares de exportação de mRNA do núcleo para o citoplasma ainda não são bem compreendidos nem em tripanossomatídeos, nem em outros patógenos. Sabe-se, até o momento, que a maioria das proteínas envolvidas com o transporte de mRNA em outros eucariotos não está conservada em diversas espécies de parasitas. Exceto pela proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2), homóloga das proteínas de mamífero e levedura (UAP56/Sub2) e essencial para exportação de mRNA em tripanossomatídeos. Logo, para investigar os componentes desta via, nosso grupo tem investido em identificar proteínas exclusivas e essenciais para a exportação de mRNA em T. cruzi. Abordagens de proteômica, usando como alvo TcSub2, vem permitindo a identificação de fatores com função ainda desconhecida e/ou que são conservados apenas entre espécies de tripanossomatídeos, tornando-os alvos de interesse. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação de proteínas alvo com TcSub2 e seu papel na exportação de mRNA em T.cruzi. Duas proteínas não caracterizadas apresentaram motivos conservados e foram denominadas como TcFOP-like e TcAPI5-like. Interessantemente, estes motivos estão presentes em proteínas de outros organismos que estão envolvidas com a via de exportação de mRNA. Aqui, nós confirmamos que TcFOP-like e TcAPI5-like são proteínas nucleares e parecem interagir com TcSub2. Além disso, silenciamento e supereexpressão de TcFOP-like afeta o crescimento do parasita, e nós confirmamos sua interação com outros componentes da via de exportação de mRNA, tais como TcMex67 e TcHel45. Estas evidências suportam presença de components diveregentes na via de exportação de mRNA em Tripanossomatídeos. Palavras chaves: Trypanosoma cruzi. Exportação de mRNA. TcSub2.TcHel45 / Abstract: Trypanosoma cruzi is the protozoan causative of Chagas disease, an endemic disease in Latin America that affects millions of people. This parasite alternates between vertebrate and invertebrate hosts during his life cycle, and needs to adapt to the changes in different environments along the transmission cycle. T. cruzi controls the gene expression mostly by post-transcriptional events. Pathways that control mRNA stability or protein translation are well known, while the molecular mechanisms for mRNA export from nucleus to cytoplasm are still not well understood nether in trypanosomatids or other pathogens. So far, it's known that the most of the proteins that are involved in mRNA transport of other eukaryotes are not conserved in many species of parasites. One exception is T. cruzi Sub2 (TcSub2), a homologue of the proteins in mammalian and yeast (UAP56 / Sub2) and essential for mRNA export in tripanossomatids. Therefore, to investigate the components of this pathway, our group has invested in identifying unique and essential proteins for the export of mRNA in T. cruzi. Proteomic approaches, using TcSub2 as target, have allowed identification of factors with the unknown function and/or that are conserved only in species of trypanosomatids, turning into interesting targets. Then, the aim of this work was to evaluate the interaction of target proteins with TcSub2 and their role in the mRNA export pathway in T. cruzi. Two uncharacterized proteins presented conserved motifs and were named here as TcFOP-Like and TcAPI5-like. Interestingly, those motifs are present in proteins of other organisms which are involved in mRNA export pathway. Here, we confirmed that TcFOP-like and TcAPI5-like are nuclear proteins and seems to interact with TcSub2. Furthemore, knockdown and overexpression of TcFOP-like affect the growth of parasites and we confirmed its interaction with other components of the mRNA export pathway, such as TcMex67 and TcHel45. Those evidences supporte the presence of divergent components in the mRNA export pathway of Tripanossomatids. Keywords: Trypanosoma cruzi. Export of mRNA. TcSub2. TcHel45.

Introdução: O câncer de próstata atinge cerca de três quartos da população masculina acima de 65 anos, sendo esta neoplasia o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, e o mais prevalente em homens. O receptor de androgênios (AR) desempenha um papel crítico no desenvolvimento normal da próstata, bem como no câncer prostático. Sua atividade transcricional é regulada através da interação com diversas proteínas. O NCoR1 (correpressor de receptores nucleares) está envolvido na diminuição da atividade do AR sobre a transcrição de genes alvo. Objetivos: Desenvolver um modelo de cultura celular de câncer prostático a partir de fragmentos tumorais; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar os efeitos do silenciamento do AR e seu corregulador, NCoR1, sobre a proliferação celular e expressão gênica de PSA, um gene alvo do AR, em células de cultura primária e em células de uma linhagem de câncer prostático (LNCaP – Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Métodos: Fragmentos de tumores prostáticos coletados após prostatectomia radical ou prostatovesiculectomia foram plaqueados e mantidos em cultivo. As células que proliferaram a partir dos explants foram testadas para marcadores de epitélio (citoqueratinas) e de malignidade (racemase). Após 10 dias, as células foram silenciadas para o AR e, posteriormente, lisadas para a extração de RNA total ou de proteínas. Células LNCaP foram mantidas em cultura e silenciadas para o AR e o NCoR1, sendo avaliada também a proliferação celular nesta última condição. O cDNA obtido a partir das culturas primárias de CaP foi usado para a amplificação do mRNA de oito genes candidatos a normalizadores, além dos mRNAs do AR e PSA. O cDNA das células LNCaP foi usado para amplificação do mRNA do PSA, e o sobrenadante das células coletado para a dosagem do PSA secretado. Resultados: Apenas 47,7% do total de culturas primárias apresentaram adesão dos fragmentos e proliferação de células. Não foi observada associação entre a adesão dos fragmentos e o escore de Gleason dos tumores. As células cultivadas apresentaram positividade para os marcadores de células epiteliais e de malignidade de células prostáticas, indicando que as células em cultivo se tratavam de células tumorais prostáticas. Para análise da expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão foi o gene SDHA, e a melhor combinação de dois genes sugerida neste estudo foi SDHA e ALAS1. O silenciamento do receptor de androgênios foi observado 48 horas após a transfecção com siRNAs, sendo observada uma diminuição nos níveis do mRNA já em 24 horas após a transfecção. Observou-se uma diminuição da expressão gênica do PSA em 24 horas, em resposta à diminuição dos níveis do AR, tanto em cultura primária de CaP quanto na linhagem LNCaP. Em células LNCaP, a transfecção com siRNAs específicos para o NCoR1 não depletou completamente os níveis proteicos, porém estes diminuíram em 24, 48 e 72 horas após a transfecção. Foi verificado um aumento da expressão gênica de PSA 48 horas após o silenciamento do NCoR1, em células tradadas com diidrotestosterona. Não foi observado aumento da secreção de PSA no sobrenadante das células em cultivo 48 horas após o silenciamento. A proliferação das células LNCaP foi diminuída nos grupos transfectados com siRNAs específicos para o NCoR1 e siRNAs inespecíficos, em relação com grupo controle. Conclusões: O modelo de cultura celular a partir de fragmentos tumorais prostáticos é viável, e proporciona uma boa amostragem de células para análises moleculares de câncer de próstata sob diferentes condições experimentais. No entanto, a taxa de sucesso dos cultivos é moderada. Neste modelo, em que foram testados diversos genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene SDHA apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência sem nenhuma análise prévia de sua expressão, como beta-actina, GAPDH e beta-2-microglobulina. Assim, o SDHA, ou ainda a combinação SDHA e ALAS1, é indicado para as estratégias de normalização neste tipo de amostra. O silenciamento do AR em células tumorais prostáticas diminuiu a expressão gênica de PSA, como esperado. O silenciamento de seu correpressor, NCoR1, aumentou os níveis de mRNA do PSA, indicando que sua ausência resulta em um aumento da atividade transcricional do AR. A menor taxa de proliferação nos grupos transfectados pode estar mais relacionada ao estresse da transfecção do que à ausência de NCoR1 nas células. Mais análises poderão confirmar os efeitos da ausência deste correpressor sobre a resposta das células tumorais prostáticas, o que abrirá caminho para um melhor entendimento da fisiopatologia dos tumores prostáticos. / Introduction: Prostate cancer (PCa) occurs in seventy-five percent of men over 65 years old, and it is the sixth most common type of cancer in the world and the most prevalent in men. Androgen receptor (AR) plays a critical role in normal prostate gland development and also in prostate cancer. Its transcriptional activity is regulated by protein interaction and NCoR1 (nuclear receptor co-repressor) decreases the AR activity on target genes transcription. Objectives: To develop a prostate cancer cell culture model from tumor fragments; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in that cultured cells; to evaluate the effects of AR and NCoR1 silencing on cell proliferation and PSA gene expression, a AR target gene, in cells of primary culture of PCa and in a prostate cancer cell line, LNCaP. Methods: PCa fragments obtained from radical prostatectomy or prostatovesiculectomy were plated and maintained in culture. Proliferating cells were tested for markers of epithelium (cytokeratin) and malignancy (racemase). After ten days, cells were transfected with AR siRNAs and then lysed for total RNA or protein extraction. LNCaP cells were silenced for AR and NCoR1, and proliferation rate was also measured in the last condition. cDNA obtained from primary culture was used to amplify eight candidate to housekeeping genes mRNA, and also AR and PSA mRNA. cDNA from LNCaP cells was used to amplify PSA mRNA, and the cells supernatant was collected to dose secreted PSA. Results: Only 47.7% of the total number of primary cultures had fragment adhesion and cell proliferation. There was no association between explants adhesion and tumor Gleason’s score. Cells were positive for epithelium and malignancy markers, confirming the growth of prostate cancer cells. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was SDHA, and the best combination of two genes was SDHA and ALAS1. AR silencing was observed in 48 hours after siRNA transfection, with a decrease of mRNA levels in 24 hours after transfection. There was a decrease of PSA gene expression in 24 hours, either in primary culture or in LNCaP cells. In LNCaP cells, transfection with NCoR1 siRNA did not depleted entirely the protein levels. However, the levels of NCoR1 decreased in 24, 48, and 72 hours after transfection in relation to control group. There was an increase of PSA gene expression in 48 hours after NCoR1 siRNA transfection in cells treated with dihydrotestosterone. There was no increase in PSA secretion in cells supernatant in response to NCoR1 silencing. LNCaP cell proliferation was decreased in both transfected groups, the specific siRNA to NCoR1 and the unspecific control, in relation to control group. Conclusions: the culture cell model from explants of prostate cancer is practicable, and provides a good cell sampling to molecular analysis of prostate cancer under different experimental conditions. Nevertheless, the successful rate of cultures is moderate. In this model, several genes were tested for expression stability, and SDHA had presented the best values, unlike others classical housekeeping genes, as beta-actin, GAPDH and beta-2-microglobulin. Thus, SDHA, or the combination of SDHA and ALAS1, is indicated to normalization strategies in these samples. The silencing of AR in prostate cancer cells had decreased PSA gene expression, as expected. The silencing of its co-repressor, NCoR1, had increased the PSA mRNA levels, indicating that the absence of this coregulator results in an increase of AR transcriptional activity. The smaller proliferation of transfected groups in relation to control group could be related to the transfection stress, more than to the absence of NCoR1. More analysis can confirm the effects of NCoR1 silencing on tumor cells proliferation rate, and contribute to a better understanding of prostate tumors pathophysiology.

A intenção deste trabalho é efetuar uma leitura do romance O Mensageiro, do autor inglês L.P. Hartley, na forma de uma jornada ao país estrangeiro do passado do protagonista-narrador. Tal leitura é uma espécie de convite aceito para a viagem, que esteticamente deixa sugestões sob a forma de truques, fragmentos de mensagens veladas, expressões ambíguas, sombras, vazios no caminho. Todavia, Mercúrio, o mensageiro dos antigos deuses, o protetor dos viajantes, o trapaceiro, é agora um ser indistinto, cuja imagem e função passou por grandes transformações ao longo da viagem até a modernidade. Guerras, restos de experiências traumáticas coletivas e pessoais são recuperadas na rota movediça do narrador melancólico, sob a forma de substância própria para a narração. Nietzsche e Walter Benjamin são companheiros na trajetória, provendo o suporte teórico básico para a viagem. / The intention of the present work is to make a reading of the novel The Go- Between, by the British writer, L.P. Hartley, in the form of a journey through the strange country of the protagonist/ narrator´s own past. Such reading comes as an accepted invitation to make the trip together with the narrator, who aesthetically leaves suggestions under the form of tricks, fragments of veiled messages, ambiguous expressions, shadows, gaps on his way. However, Mercury, the messenger of the ancient Gods – the protector of the travelers, the trickster is now is an indistinct being, whose image and function has undergone great transformations during the journey until modern times. Wars, remains of traumatic collective and personal experiences, are visualized in form of substantial fragmented material proper for narrative throughout the unstable route of the melancholy protagonist. Nietzsche and Walter Benjamin provide the basic theoretical support throughout the route.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

A obesidade caracterizada pelo excesso de tecido adiposo está associada a comorbidades como diabetes mellitus tipo 2 (DMT2), hipertensão arterial, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer. Para pacientes considerados obesos mórbidos (OBM) (IMC>40Kg/m²) a melhor opção terapêutica é a cirurgia de bypass gástrico em Y de Roux (RYGB). Estudos clínicos mostram que após esse procedimento os indivíduos OBM com DMT2 melhoram seu estado. Uma explicação para esse fenômeno é a mudança anatômica que ocorre no trato gastrintestinal, alterando assim a produção das incretinas, GIP e GLP-1, que promovem a liberação de insulina. Essas incretinas são liberadas pela mucosa do intestino delgado na forma de próhormônios e necessitam da ativação feita pela enzima PC 1/3. Carboidratos e ácidos graxos estimulam sua liberação. Após exercerem sua ação são inativadas pela enzima DPP-IV. Logo o objetivo desse trabalho foi a quantificação de mRNA de pró-glucagon, GIP, PC1/3 e DPP-IV em jejuno proximal de OBM DMT2 e não diabetes mellitus tipo 2 (NDM2) , bem como avaliar o efeito, in vitro, de ácidos graxos monoinsaturados cis, trans e glicose sobre esse tecido. O jejuno foi obtido de indivíduos OBM submetidos RYGB. Para a quantificação basal do mRNA dos genes de interesse, o tecido (n=25) retirado na cirurgia foi diretamente imerso em TRIzol para a extração do RNA total. O mRNA foi quantificado pela reação em cadeia da polimerase (qRTPCR). Para avaliar o efeito dos ácidos graxos in vitro, o jejuno (n=5) foi fatiado (400 µm) e incubado em meio DMEM suplementado com 50 µM de acido oléico, elaidico, vaccênico ou 11 mM de glicose por 4 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 Entre OBM DMT2 e NDM2 não houve diferença estatística na expressão do mRNA de GIP, GLP-1 e DPP-IV, apenas observamos que indivíduos NDM2 tem tendência a uma maior expressão do mRNA de PC1/3 (p=0,065). No entanto, alguns pacientes não expressaram mRNA de PC1/3. A expressão dos genes estudados foi heterogênea, permitindo a divisão dos pacientes em alta e baixa expressão de GIP, sendo este utilizado como gene calibrador. Constatamos que a expressão de mRNA dos demais genes acompanham o perfil de expressão de GIP. Os testes in vitro revelaram que o ácido oléico diminuiu a expressão do mRNA de DPP-IV; o ácido vaccênico, aumentou significante a expressão do mRNA de próglucagon; e o ácido elaídico, não modulou a expressão dos genes estudados nesse trabalho. O tratamento com alta concentração de glicose aumentou o mRNA da enzimas PC1/3 e DPP-IV. Em conclusão, OBM NDM2 e DMT2 apresentaram expressão heterogênea desses genes não permitindo verificar diferença significativa entre os grupos. Alguns pacientes não expressaram o mRNA da PC1/3, e NDM2 transcreveram maior quantidade de mRNA desta enzima. Sugerimos que no jejuno proximal, os ácidos oleico e vaccênico da dieta, agem diretamente sobre as células e modulam os níveis das incretinas, diminuindo a expressão do mRNA da DPP-IV e aumentando o pró-glucagon, respectivamente. A glicose em altas concentrações estimula a transcrição das enzimas envolvidas na síntese e degradação das incretinas, podendo interferir na homeostase do metabolismo da glicose. Nossa pesquisa revela que a região do intestino que receberá diretamente o alimento após a cirurgia, pode ser modulada por este, principalmente se apresentar lipídeos e carboidratos na sua constituição. Maior atenção deve ser dada a estes pacientes do ponto de vista nutricional. / The obesity characterized by excess of adipose tissue is associated with comorbidities such as type 2 diabetes mellitus (T2DM), hypertension, cardiovascular disease and some types of cancer. For patients considered morbidly obese (OBM) (BMI> 40Kg/m²) the best therapeutic option is Roux- en- Y gastric bypass (RYGB). Clinical studies show that after this procedure, individuals with OBM T2DM improve this state. One explanation for this phenomenon is the anatomical change that occurs in the gastrointestinal tract, thereby altering the production of incretins, GIP and GLP-1, those promote the release of insulin. These incretins are released in the prohormones form by mucosa of small intestine and require the activation by the enzyme PC 1/3. Carbohydrates and fatty acids stimulate its release. After act they are inactivated by enzyme DPP-IV. Once the objective of this study was to quantify the mRNA of proglucagon, GIP, PC1/3 and DPP-IV in the proximal jejunum of OBM without type 2 diabetes mellitus (NDM2) and with T2DM and to evaluate the effect in vitro of fatty acids cis and trans monounsaturated and high glucose on this tissue. The jejunum was obtained from individuals OBM undergo RYGB. For the quantification of basal mRNA of these genes, the tissue removed at surgery was directly immersed in TRIzol for extraction of total RNA. The mRNA expression was quantified by polymerase chain reaction (qRT-PCR). To evaluate the effect of fatty acids in vitro, the jejunum was sliced (400 µm) and incubated in DMEM supplemented with 50 µM of oleic, elaidic, vaccênic acid or 11 mM of glucose for 4 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO2. Between OBM T2DM and NDM2 no statistical difference was observed in the expression of mRNA of GIP, GLP-1 and DPP-IV, only NDM2 tend to have greater expression of mRNA of PC1/3 (p=0.065). Furthermore, some patients did not express mRNA of PC1/3. The expression of genes studied was heterogeneous, allowing the division of patients into high and low expression of GIP, which was used as a calibrator gene. So, we found that the expression of mRNA of other genes accompany this profile. The in vitro tests showed that oleic acid decreased the DPP-IV mRNA expression, the vaccenic acid, significantly increased the proglucagon mRNA expression and elaidic acid not modulated the expression of genes studied in this work. Treatment with high concentration of glucose increased the mRNA of enzymes PC1/3 and DPP-IV. In conclusion, OBM NDM2 and T2DM showed heterogeneous expression of these genes consequently did not permit verifying significant differences between groups. Some patients do not express the mRNA of PC1/3 and NDM2 transcribe major amount of mRNA of this enzyme. We suggest that in the proximal jejunum, the oleic and vaccenic acid of diet, act directly on cells and modulate incretins levels, reducing the expression of DPP-IV mRNA and increasing the proglucagon, respectively. Glucose at high concentrations stimulates the transcription of enzymes involved in synthesis and degradation of incretins and may interfere with the homeostasis of glucose metabolism. Our research shows that this intestine region that directly receives the food after the surgery, can be modulated by foods that contains especially fat and carbohydrate. Greater attention should be given to these patients about nutritional view.

Células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos usadas em estratégias imunoterapêuticas, como as que utilizam híbridos de DCs e células tumorais. Este projeto avaliou a possibilidade de utilizar, como parceiro de fusão das DCs, células de linhagem tumoral previamente transfectadas com mRNA amplificado de células tumorais contra as quais se pretende induzir resposta. Os híbridos foram capazes de induzir uma resposta antígeno-específica e foi possível enriquecer uma célula com antígenos de outra, uma vez que células transfectadas passaram a apresentar mRNAs da célula doadora, e expressar GFP quando a célula doadora era positiva para GFP. Foi possível amplificar integralmente o mRNA para GFP e amplificar os mRNAs de uma célula, gerando um material contendo mRNAs do preparado inicial mas incapaz de aumentar a expressão das moléculas avaliadas nas células transfectadas, mostrando que o protocolo ainda precisa ser aperfeiçoado. Em conjunto, os resultados mostraram que a estratégia de imunoterapia aqui explorada é promissora e merece maior investigação. / Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells widely used in immunotherapy strategies, as the ones that utilize dendritic cell tumor cell hybrids. The present project evaluated the possibility of using cells from tumor cell lines, which were previously transfected with mRNA amplified from tumor cells against which a response is aimed, to fuse with DCs. The hybrids were able to induce a specific immune response. Also, it was possible to enriched one cell with antigens from another one, since transfected cells increased the amount of mRNAs from the donator cell, and expressed GFP when the donator cells expressed this protein. It was possible to successfully amplify the GFP specific mRNA. The mRNAs amplified from RNA of different cell lines contained mRNAs that were present in the total extracted RNA, but were not able to increase the expression of the molecules we attempted to detect in the transfected cells, showing that the protocol still need to be improved. Together, these results show that this new strategy is promising and deserves further investigation.

A presente dissertação tem por objetivo a realização de uma análise geral dos mensageiros divinos designados pelo termo malakh relatados na Bíblia hebraica. No texto bíblico o termo malakh é empregado por fazer referência a mensageiros humanos e ainda aos enviados sobrenaturais subordinadas a Deus. Todo o primeiro capítulo é reservado à investigação da etimologia do vocábulo em questão. Com o intuito de discernir nitidamente a relação ou até mesmo a oposição entre mensageiros humanos e divinos, o segundo capítulo trata de diversos episódios bíblicos onde homens exercem a função de mensageiros, não somente como portadores de uma mensagens divina, mas também com funções políticas e diplomáticas. Ainda tratando dessa modalidade de mensageiro, é destacada a presença dos profetas e sacerdotes que a despeito de pertencerem à esfera humana, desempenham a função de mensageiros da divindade. A seguir, o terceiro e último capítulo ocupa-se dos mensageiros divinos propriamente ditos, geralmente traduzidos ou compreendidos como anjos. Neste ponto, interpretações relacionadas à identidade, nomenclaturas e funções são destrinchadas pontualmente. Por fim, a atividade do mensageiro bíblico será analisada ainda à luz dos mensageiros correspondentes da literatura do antigo Oriente Médio. / This thesis aims at conducting a general analysis of the divine messengers described by the term malakh reported in the Hebrew Bible. In the biblical text is the term used by malakh refer to human messengers sent to the supernatural and still subordinate to God. The entire first chapter is devoted to the investigation of the etymology of the word in question. In order to clearly discern the relationship or even the opposition between human and divine messengers, the second chapter deals with various biblical episodes where men play the role of messengers, not only as bearers of a divine message, but also with political functions and diplomatic. Still dealing with this type of messenger, it is emphasized the presence of the prophets and priests who despite belonging to the human sphere, play the role of messengers of divinity. Then the third and final chapter deals with the divine messengers themselves, usually translated or understood as \"angels\". At this point, interpretations related to identity, classifications and functions are fleshed out on time. Finally, the activity of biblical Bible will be examined further in light of relevant messengers literature of the ancient Middle East.

Tanto os androgênios quanto os estrogênios possuem um papel significativo na próstata e são indispensáveis para o crescimento normal prostático. A enzima aromatase catalisa a reação de conversão de androgênios para estrogênios. O papel dos estrogênios e seus receptores na etiologia e progressão do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB) é muito pouco compreendido. Objetivo: Analisar a expressão do mRNA dos receptores de estrogênio ER , ER 2, ER 5 e da enzima aromatase. Analisar a expressão protéica do ER e ER nos grupos CaP e HPB. Métodos: Tecidos prostáticos oriundos de câncer de próstata e de hiperplasia prostática benigna foram submetidos à extração de RNA total com o reagente Trizol, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando RT-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio , 2, 5 e aromatase. A expressão protéica de ER e ER foi analisada por Western blot. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão do mRNA ER (P<0,001) e da proteína (P<0,038) em amostras de câncer comparada a HPB. A expressão do mRNA do ER 5 foi significativamente aumentada nos tecidos hiperplásicos comparada ao grupo câncer. A expressão do mRNA do ER 2 e da aromatase não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Nossos resultados também mostraram que a expressão protéica do ER não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Conclusões: O presente estudo indicou que a expressão protéica e gênica do ER e a expressão gênica do ER 5 são diferentes entre os grupos sugerindo que o aumento dos níveis do ER no CaP e do mRNA ER 5 na HPB pode ser importante na progressão das doenças prostáticas. / Both androgens and estrogens play a significant role in the prostate and are critical for normal prostate growth. The aromatase enzyme catalyzes the reaction to conversion of androgens to estrogens. The role of estrogen and its receptors in the etiology and progression of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) is poorly understood. Objective: The purpose of this study was to evaluate the estrogen receptors ER , 2, 5 and aromatase enzyme mRNA expression and to investigate also the ER and ER protein expression in groups PCa and BPH. Method: Total RNA of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues was extracted from each sample by the Trizol method and cDNA was performed. ER , ER 2, ER 5 estrogen receptors and aromatase gene expression were quantified by RT-PCR. ER and ER protein expression was evaluated by Western blot. Results: Comparisons of the hyperplastic and tumor prostate tissues indicated an overexpression of ER mRNA (P<0,001) and protein (P<0,038) in tumor specimens. The mRNA expression of ER 5 was significantly increased in hyperplastic tissues compared to tumor group. The mRNA expression of ER 2 and aromatase was not different between BPH and PCa groups. Our results also showed that the protein expression of ER was not different between BPH and PCa groups. Conclusions: The present study indicated that gene and protein expression ER and gene expression ER 5 are different between the groups suggesting that the ER increased levels in PCa and mRNA ER 5 in BPH may be important in progression of prostate diseases.