Ochratoxin A (OTA) is a fungal secondary metabolite produced by Aspergillus and Penicillium species. It has been detected in a wide range of commodities, including cereals, coffee, grapes, raisins, must and wine. Within grape derivative products, the raisins, red wine and sweet wines have reported to contain the highest OTA levels. Aspergillus section Nigri (A. niger and A. carbonarius) are considered the OTA source in these commodities and they are commonly isolated among other fungi from grapes and raisins.Starting from this basis the objectives of this thesis were focused into three main aspects: (1) Evaluation of the food products: vine dried fruits and special wines, concerning the mycobiota and OTA occurrence and incidence; (2) Ecophysiological studies of the ochratoxigenic fungi and accompanying mycobiota as affected by environmental conditions; (3) Control and preventive methods such as the evaluation of residual activity of pre-harvest fungicides during grape dehydration and the use of modified atmospheres.Wine origin and winemaking procedure showed to be determinant for the final OTA content. All special wines analysed from northern European regions were negative for OTA while more than 50% of wines from warmer regions were positive for OTA contamination. The wines with higher OTA levels were fortified musts followed by those made from dried grapes. Acoholic and malo-lactic fermentations, biological 'crianza' (Flor yeast) and the action of Botrytis cinerea in noble rot of grapes may diminish the OTA levels in wine.In grapes, the presence of Aspergillus section Nigri became predominant at harvest and mainly during sun-drying. Prevalence of Aspergillus section Nigri can be explained by their adaptation to environmental conditions of sun-drying, and by their ability to dominate other fungal species involved when coming into contact with them. Among the Aspergillus section Nigri, A. niger aggregate was dominant, although A. carbonarius increased its inci

Per a modelar alguns aspectes bioquímics i anatomopatològics de la malaltia de Parkinson en la rata, en aquesta tesi hem començant utilitzant la neurotoxina MPP+, de relativament recent aparició i la més veterana 6-OHDA i hem acabat emprant el propi neurotransmissor de les neurones que degeneren, la dopamina, intentant esbrinar els seus mecanismes de lesió. L’estudi s’ha iniciat en el animal in vivo, ha continuat en talls gruixuts de teixit ex vivo i ha acabat en mitocondris in vitro. Hem volgut reproduir resultats d’altres grups però amb abordat¬ges experimentals més senzills i econòmics, al nostre abast. Hem volgut aplicar el nostre model animal per a estudis comparatius amb la malaltia humana Per a la introducció he partit d’uns 50 articles de revisió actualitzats, amb la voluntat d’adquirir una visió panoràmica de la malaltia de Parkinson: les hipòtesis etiopatogèniques, les manifestacions clíniques, els trets anatomopatològics i bioquímics, així com dels models animals que s’utilitzen per a reproduir-la. En aquests articles he trobat les referències biblogràfiques per aprofundir en els aspectes més directament relacionats amb els experiments realitzats. Per als resultats, que s’han de contemplar dins el marc de la participació en projectes dels nostre grup i d’altres que utilitzaven aquests models animals d’experimentació, hem triat aquells en els que he participat directament, treballs que en alguns casos han estat els preliminars per altres treballs de doctorat del grup. Pràcticament tots els resultats que presentem han estat publicats, com article, en revistes internacionals, aquí queden recollits en l’apartat d’annexes, raó per la qual en la introducció general no consten alguns conceptes introductoris que apareixen en cadascun d’ells.

L'ocratoxina A (OTA) és un metabolit secundari tòxic produït essencialment per fongsdels gèneres Aspergillus i Penicillium, sota diverses condicions. La seva presència en elcos humà es deguda a la ingestió de petites quantitats provingudes d'un ampli ventalld'aliments, tant d'origen vegetal com animal. Després dels cereals, el vi és l'element en ladieta europea que més contribueix a l'ingesta d'OTA.L'OTA és una potent toxina que afecta principalment els ronyons, on pot provocar tantlesions agudes com cròniques. A part de la nefrotoxicitat, estudis toxicològics ambanimals han demostrat que també te propietats genotòxiques, carcinogèniques iimmunosupressives. A més, es sospita que és la causa d'una malaltia mortal per alshumans observada en l'Europa de l'Est i coneguda com la 'Nefropatia Endèmica delsBalcans', així com de la formació de tumors en el tracte urinari d'humans.Breument, els objectius del present treball són: (i) fer una valoració del nivell decontaminació per OTA en begudes espanyoles derivades del raïm i estudiar la possibleinfluència de diverses variables en el contingut d'OTA de vins i productes derivats; (ii)estudiar la micoflora de diverses vinyes espanyoles durant quatre anys consecutiusmitjançant mostrejos de camp, per tal d'aclarir on, quan i fins a quin punt existeix OTAen aquest país; (iii) identificar i estudiar l'efecte de diversos factors ecofisiològics i de lesseves interaccions en fongs potencialment productors d'OTA aïllats de raïm devinificació, per tal de trobar les condicions que puguin minimitzar o prevenir el seucreixement i la formació de la toxina. Es van dur a terme estudis addicionals perinvestigar, en primer lloc, els efectes in vitro de l'aplicació de fungicides en raïm, i totseguit, l'efecte del diferents tractaments fungicides en raïm al camp. També s'haaconseguit visualitzar la colonització i els primers estadis d'infecció d'Aspergilluscarbonarius en raïm, amb l'ajut de la microscopia de fluorescència làser confocal, epi- iestereomicroscopia, desprès de transformar aquest fong amb el gen de la proteïna defluorescència verda (gfp).S'ha vist que prop d'un 20 % dels vins espanyols analitzats contenien OTA, la majoria aconcentracions per sota dels límits establerts per la UE, i que els Aspergillus negres sónels responsables de la producció d'aquesta toxina en aquest país, sobretot Aspergilluscarbonarius. Malgrat el domini de les espècies de l'agregat A. niger en el raïm, i degut ala seva modesta capacitat de produir la toxina i a les baixes quantitats produïdes, la sevacontribució al problema de l'OTA és ínfima. Les espècies uniseriades foren descartadesen aquest aspecte, doncs no es va detectar toxina en cap de les soques aïllades.Els Aspergillus negres foren presents en el raïm des del quallat fins a la collita, en lamajoria de vinyes. Tanmateix, la seva incidència augmentà amb la maduració del raïm,doncs les altes temperatures i humitat afavoriren el desenvolupament i producció d'OTAd'aquests fongs. Es va demostrar l'habilitat d'A. carbonarius de créixer en l'interval 10-45 ºC i 0,88-0,995 d'activitat d'aigua (aw), amb l'òptim al voltant de 30 ºC i a les mésaltes aw. Les condicions de temperatura favorables per a la producció d'OTA foren mésrestringides, essent 20 ºC i les altes aw les condicions òptimes. També s'estudiaren altresfactors ecofisiològics com el país d'origen de les soques, les condicions de fotoperiode, l'alternança de temperatures, etc., doncs el coneixement dels factors que donen lloc a laproducció d'OTA pot ajudar a dissenyar estratègies per limitar la seva formació.En la part final d'aquesta tesi s'han suggerit diverses maneres de prevenir i controlar elsAspergillus negres i la seva micotoxina. Com que s'ha vist que la producció d'OTA perAspergillus negres és òptima poc temps desprès de la seva inoculació, la reducció deltemps de collita i transport al celler serà decisiva per reduir els nivells d'aquesta toxina.També s'ha de procurar minimitzar els danys en la pell del raïm, doncs s'ha vist que lesobertures fomenten la entrada del fong que es troba colonitzant la superfície,probablement afavorint la màxima producció d'OTA. L'execució d'altres mesurespreventives com el control de fongs patògens i d'insectes durant el creixement del raïm -es varen fer assaigs amb diversos fungicides in vitro i in vivo-, i d'altres bones pràctiquesagronòmiques, poden ajudar a reduir la contaminació per OTA del raïm.Com a conclusió general, s'ha vist que diversos factors poden ajudar a prevenir eldesenvolupament dels fongs ocratoxigènics, però és necessari aplicar un sistema demètodes combinats per tal de controlar el creixement i subseqüent producció d'OTA peraquests microorganismes. Les mesures preventives són sempre preferibles a les accionscorrectores, i junt amb un degut control de l'OTA en els derivats del raïm, asseguraranuna adequada protecció del consumidor. / La ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario tóxico producido esencialmente porhongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, bajo diversas condiciones. Su presenciaen el cuerpo humano es debida a la ingestión de pequeñas cantidades provenidas de unamplio abanico de alimentos, tanto de origen vegetal como animal. Después de loscereales, el vino es el elemento en la dieta europea que más contribuye a la ingesta diariade OTA.La OTA es una potente toxina que afecta principalmente los riñones, dónde puedeprovocar tanto lesiones agudas como crónicas. A parte de la nefrotoxicidad, estudiostoxicológicos en animales han demostrado que también tiene propiedades genotóxicas,carcinogénicas e inmunosupresivas. Además, se sospecha que es la causa de unaenfermedad mortal para los humanos observada en la Europa del Este y conocida como la'Nefropatía Endémica de los Balcanes', así como de la formación de tumores en el tractourinario de humanos.Brevemente, los objetivos del presente trabajo son: (i) valorar el nivel de contaminaciónpor OTA en bebidas españolas derivadas de la uva y estudiar la posible influencia devarias variables en el contenido de OTA de vinos y productos derivados; (ii) estudiar lamicoflora de distintos viñedos españoles durante cuatro años consecutivos mediantemuestreos de campo, para esclarecer dónde, cuándo y hasta que punto existe OTA en estepaís; (iii) identificar y estudiar el efecto de varios factores ecofisiológicos y de susinteracciones en hongos potencialmente productores de OTA aislados de uva devinificación, para encontrar las condiciones que puedan minimizar o prevenir sucrecimiento y la formación de OTA. Se llevaron a cabo estudios adicionales parainvestigar en primer lugar los efectos in vitro de la aplicación de fungicidas en uva,seguido del efecto de diferentes tratamientos fungicidas en uva en el campo. También seha conseguido visualizar la colonización y los primeros estadios de infección deAspergillus carbonarius en uva, gracias a la microscopia de fluorescencia láser confocal,epi- y estereomicroscopia, después de transformar este hongo con el gen de la proteína defluorescencia verde (gfp).Se vio que aproximadamente un 20 % de los vinos españoles analizados contenían OTA,la mayoría a concentraciones por debajo de los límites establecidos por la UE, y que losAspergillus negros son los responsables de la producción de esta toxina en este país,sobretodo Aspergillus carbonarius. Pese al dominio de las especies del agregado A. nigeren la uva, y debido a su modesta capacidad de producir la toxina y a las bajas cantidadesproducidas, su contribución al problema de la OTA es ínfima. Las especies uniseriadasfueron descartadas en este aspecto, ya que no se detectó toxina en ninguna de les cepasaisladas.Se detectaron Aspergillus negros en la uva desde el cuajado hasta la cosecha, en lamayoría de viñedos. No obstante, su incidencia aumentó con la maduración de la uva,pues las altas temperaturas y humedad favorecieron el desarrollo y producción de OTApor estos hongos. Se demostró la capacidad de A. carbonarius de crecer en el intervalo10-45 ºC y 0,88-0,995 de actividad de agua (aw), con el óptimo alrededor de 30 ºC y a lasmás altas aw. Las condiciones de temperatura favorables para la producción de OTAfueron más restringidas, siendo 20 ºC y las altas aw las condiciones óptimas. También seestudiaron otros factores ecofisiológicos como el país de origen de las cepas, lascondiciones de fotoperiodo, la alternancia de temperaturas, etc., pues el conocimiento delos factores que dan lugar a la producción de OTA pueden ayudar a diseñar estrategiaspara limitar su formación.En la parte final de esta tesis se han sugerido varias maneras de prevenir y controlar losAspergillus negros y su micotoxina. Como que se ha visto que la producción de OTA porlos Aspergillus negros es óptima poco tiempo después de su inoculación, la reducción deltiempo de cosecha y transporte a la bodega será decisivo para reducir los niveles de estatoxina. También se ha de procurar minimizar los daños en la piel de la uva, pues se havisto que las aperturas fomentan la entrada del hongo que se encuentra colonizando lasuperficie, probablemente permitiendo la máxima producción de OTA. Laimplementación de otras medidas preventivas como el control de hongos patógenos y deinsectos durante el crecimiento de la uva -se ensayaron varios fungicidas in vitro e invivo-, y de otras buenas prácticas agronómicas, pueden ayudar a reducir la contaminaciónpor OTA de la uva.Como conclusión general, se ha visto que varios factores poden ayudar a prevenir eldesarrollo de los hongos ocratoxigénicos, pero es necesario aplicar un sistema de métodoscombinados para controlar el crecimiento y subsiguiente producción de OTA por estosmicroorganismos. Las medidas preventivas son siempre preferibles a las accionescorrectoras, y junto con un debido control de la OTA en los derivados de la uva,aseguraran una adecuada protección del consumidor. / Ochratoxin A (OTA) is a toxic secondary metabolite produced by moulds belongingessentially to the Aspergillus and Penicillium genera, under diverse conditions. Itspresence in the human body is due to the ingestion of small quantities present in a widerange of food commodities, both of vegetable and animal origin. Next to cereals, wine inthe European diet is the second major source of OTA.OTA is a potent toxin affecting mainly the kidneys, in which it can cause both acute andchronic lesions. Besides nephrotoxicity, toxicological studies on animals havedemonstrated that it has mainly, genotoxicity, carcinogenicity and immunosuppressiveproperties. Furthermore, it is suspected to be a possible cause of the fatal human diseaseknown as Balkan endemic nephropathy observed in South Eastern Europe, and of theurinary tract tumours in humans.Briefly, the objectives of the present project are: (i) to assess the level of OTAcontamination in Spanish grape-based beverages and to study the possible influence ofseveral variables in the OTA content of wines and derivatives; (ii) to survey themycoflora of several Spanish vineyards during four-year consecutive field samplings, inorder to clarify where, when and to what extent OTA occurs in this country; (iii) toidentify and study the effect of various ecophysiological factors and their interactions onpotential ochratoxigenic fungi isolated from wine grapes, in order to find out theconditions that might minimize or prevent their growth and OTA formation. Additionalstudies to investigate, first the impact of application of fungicides to grapes in vitro, andlater the effect of different fungicide treatments on grapes in the field, were carried out.Visualization of Aspergillus carbonarius grape colonization and early infection was alsoachieved with epi-, stereo- and confocal fluorescence microscopy, after thetransformation of this fungus with the reporter green fluorescent protein gene (gfp).It has been shown that nearly 20 % of the Spanish wines tested contained OTA, most ofthem at concentrations below the EU limits, and that black aspergilli are responsible forthe production of this toxin in this country, mainly A. carbonarius. Despite A. nigeraggregate species were dominant in grapes, because of their modest ability and lowamounts produced, their contribution to the OTA problem is rather small. Uniseriatespecies were discarded as a source of OTA in the surveyed regions, as no toxin wasdetected in any of the isolates.Black aspergilli were present on grapes from setting to harvest in most of the vineyards.However, their occurrence increased with grape maturity in the field, related to the factthat high temperature and humidity favoured black aspergilli development and OTAproduction. It was shown the growing ability of A. carbonarius in the range 10-45 ºC and0.88-0.995 of water activity (aw), with an optimum around 30 ºC and at the highest aw.Temperature conditions for OTA production were more restrictive, with optimumdetected at 20 ºC and at the highest water availability. Other ecophysiological factorssuch as the country of origin of the strains, photoperiod conditions, alternation oftemperatures, etc. were also studied, as understanding the factors leading to OTAsynthesis will enable strategies to limit its formation.Several effective ways for prevention and control of black aspergilli and their dangerousmycotoxin have been suggested in the final part of this thesis. As OTA production byblack aspergilli has been shown to occur optimally very early after inoculation,minimizing the harvesting and transport time to wine cellars might be crucial to reducethe toxin levels. Attention should also be paid in minimizing damages on grape skin, as itwas shown that openings trigger the entrance of the fungi colonizing the berry surface,probably enabling production of maximum amounts of OTA. The implementation ofother preventive measures such as controlling pathogenic fungi and insects during grapegrowing -some fungicides have been tested in vitro and in vivo-, and other goodagricultural practices, may help in the reduction of OTA contamination in grapes.As a general conclusion, several factors were found to help in the prevention ofochratoxigenic fungi development, but it may be necessary to apply a multiple barrierapproach to control the growth and subsequent OTA production of these microorganisms.Prevention measures are always preferable to corrective actions, and together with aproper control of OTA in grape-derivatives, should ensure the adequate protection of theconsumer.

This PhD Thesis deals with the study of marine natural products as candidates in either drug discovery and development. In particular, the investigation focused on benthic organisms, i.e. those fixed or in a close relation with the sea bottom. These organisms, many of which are sessile or slow-moving invertebrates, thus unable to escape quickly from their predators, and devoid of physical protection (shell or hard texture), have developed alternative protective strategies as well as the production of chemical weapons. Compounds involved in the chemical defence, besides the ecological function, can display interesting pharmacological activities. Organisms of different phyla (Algae, Molluscs and Cnidarians) and from diverse geographical areas (Mediterranean Sea and China) were investigated. The benthic diatom Cocconeis scutellum is able to affect the sex reversal in the protandric shrimp Hippolyte inermis, inducing apoptosis (programmed cell death) in the crustacean's androgenic gland. Thus, we wondered whether these diatoms could act also in other crustaceans and on human cancer cells, in order to evaluate their applications in aquaculture and medicine. In fact, some commercially important crustaceans show a bimodal pattern of growth, in which males grow faster and are bigger than females. For this reason, the production of all-male populations is more advantageous. The administration of proapoptotic compounds in an early larval phase could be a method to manipulate the sex in these crustaceans. Nevertheless, our study demonstrated that diatom compounds did not induce apoptosis in the androgenic gland of other species, suggesting a targeted and specific action of C. scutellum metabolites. On the other hand, the biological assays on human cancer cell lines showed that solid tumours were more responsive to C. scutellum than haematological tumours and normal cells, suggesting a specific toxic action of the diatom compounds. In addition, we demonstrated that the most active fraction to induce apoptosis in cancer cells was that containing the highest amount of eicosapentaenoic acid (EPA), described in the literature for its anticancer and proapoptotic properties. This fraction detained the cell cycle at G2/M phase and the results in terms of apoptosis and reduced cell viability produced by this fraction were comparable with those induced by EPA. Western blotting experiments showed that diatoms triggered apoptosis by the extrinsic pathway, i.e. by means of activation of caspase 8, and confirmed the involvement of effector caspase 3. In addition, C. scutellum was studied for the first time from the chemical point of view. By GC-MC we identified more than 100 compounds, mainly fatty acids, sterols and glycerides, and excluded the presence of short chain aldehydes.In collaboration with the University of Athens, the chemical study on the anaspidean mollusc Aplysia fasciata was carried out. From its digestive and hermaphroditic glands 16 metabolites were isolated by a combination of chromatographic techniques, and they were identified by spectroscopic analysis. Six of them (6-hydroxy-1-brasilene, epibrasilenol acetate, (3Z,9Z)-7-chloro-6-hydroxy-12-oxopentadeca-3,9-dien-1-yne, 6-epi-beta-snyderol, 16-acetoxy-15-bromo-7-hydroxy-9(11)-parguerene), belonging to different classes of sesquiterpene, acetogenin and diterpene compounds, are new and related with metabolites isolated from different species of the red alga Laurencia, the animal's diet. In the Istituto di Chimica Biomolecolare (Italy), the chemical and biological investigation on the Chinese soft coral Sinularia sp. was performed. We isolated four new casbene compounds, i.e. bicyclic diterpenes characterized by a cyclopropane fused with a 14-membered macrocycle, which are usually found in Euphorbiaceae plants and rarely in marine organisms. Contrastingly to most natural cis ring-fused casbenes, in Sinularia co-existed cis and trans compounds and this suggested a non-stereospecific biosynthetic mechanism. The 4 casbenes were active against Gram+ bacteria and just casbene 3 also against Gram- bacteria, only hydroxylated casbenes displayed anti-feeding properties, and they did not exhibit antiproliferative activity. / "Metabolitos secundarios de organismos bentónicos: aspectos ecológicos y químicos" Depositada por Michela NappoTEXTO:El objetivo de esta Tesis es el estudio de los productos naturales marinos y su posible relevancia en el desarrollo de nuevos medicamentos. La investigación se enfocó sobre los organismos bentónicos, i.e. los que viven en contacto con el fondo marino y que, a pesar de la falta de protección física y la escasa movilidad de la mayoría de las especies, han desarrollado mecanismos de defensa alternativos, como la producción de armas químicas. Estos compuestos, dotados de propiedades ecológicas, a menudo exhiben también importantes actividades farmacológicas. Se consideraron organismos pertenecientes a diferentes phyla (algas, moluscos y cnidarios) y áreas geográficas. Las diatomeas Cocconeis scutellum afectan la reversión sexual del decápodo proterándrico Hippolyte inermis, induciendo apoptosis (muerte celular programada) en la glándula androgénica del crustáceo. En esta Tesis evaluamos también la capacidad de dichas diatomeas en afectar el cambio de sexo de otros crustáceos, en particular los de interés comercial, y de actuar sobre las células tumorales humanas, a fin de encontrar posibles aplicaciones en acuicultura y medicina. También se valoró el patrón metabólico de las diatomeas mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas, identificando más de 100 compuestos (ácidos grasos, esteroles y glicéridos), no constatándose la presencia de aldéhidos de cadena corta.En la Universidad de Atenas, se realizó el estudio químico del molusco anaspídeo Aplysia fasciata. Mediante diferentes técnicas cromatográficas y espectroscópicas, se aislaron 16 metabolitos, de los cuales seis eran nuevos (6-hidroxi-1-brasileno, epibrasilenol acetato, (3Z,9Z)-7-cloro-6-hidroxi-12-oxopentadeca-3,9-dien-1-ino, 6-epi-beta-snyderol, 16-acetoxi-15-bromo-7-hidroxi-9(11)-parguereno), relacionados con metabolitos de algas rojas del género Laurencia, que constituyen la dieta del animal.En el Instituto de Química Biomolecular (Pozzuoli, Italia) se realizó tanto el estudio químico como los experimentos biológicos con el coral blando Sinularia sp. procedente de China. De esta especie se aislaron 4 nuevos compuestos casbénicos (diterpenos bicíclicos formados por un anillo ciclopropánico fusionado a un macrociclo de 14 átomos) cuya estructura es frecuente en plantas de la familia Euphorbiaceae y bastante más rara en los organismos marinos. Los casbenos hidroxilados eran repelentes alimenticios; todos son activos frente a las bacterias Gram+ y sólo el casbeno 3 es también activo frente a las bacterias Gram- .

Els biofenols comprenen un gran grup de metabòlits secundaris que presenten una àmplia varietat d'estructures i una gran diversitat d'activitats biològiques. Específicament, l'interès en l'oliva i la llavor del lli (llinassa) està relacionat amb el seu perfil fenòlic i amb la influència directa d'aquest en la qualitat de productes derivats, Així com en el possible ús en aliments funcionals.Com a resposta a aquest plantejament, la tesi s'ha centrat a la investigació del paper dels compostos fenòlics durant el procés d'extracció de l'oli d'oliva i de llinassa.Es van tenir en compte dos importants aspectes: la transferència i les funcions antioxidants dels compostos fenòlics relacionats en el procés d'obtenció d'oli d'oliva. La influència dels tractaments d'irrigació, de l'índex de maduració i d'altres aspectes tecnològics del processament de l'oliva es traduí en un millor enteniment de la transferència i transformació dels compostos fenòlics.S'establiren les concentracions de fenols, en termes de transferència, corresponents a les fraccions de pasta d'oliva, pinyola, oliassa i oli d'oliva. Es reconegueren alguns d'aquests productes i subproductes com a valuosa font de compostos antioxidants. És per això que es va procedir a l'aïllament i purificació de determinats fenols amb la finalitat d'avaluar la seva capacitat antioxidant a través del paràmetre d'estabilitat oxidativa. També es va determinar l'efecte dels compostos fenòlics sobre l'atribut sensorial "índex d'amargor". Es van estudiar els alcohols simples, àcids fenòlics, secoiridoids, derivats secoiridoids, flavonoids i lignans. Es trobà un efecte significatiu a l'addicionar aquests compostos sobre diferents matrius d'oli d'oliva (refinat i verge extra). L'àcid gàlic, l'hidroxitirosol (3,4-DHPEA), l'àcid cafeic, la luteolina i la forma aldèhidica de l'àcid elenòlic lligat a l'hidroxitirosol (3,4-DHPEA-EDA), mostraren tenir una important activitat antioxidant.Es va investigar també la llinassa en funció de la seva composició fenòlica. L'existència de diversos i no comparables mètodes d'extracció de fenols es va prendre coma punt de partida per a l'estudi analític de la fracció fenòlica de la llinassa. L'extracció mitjançant solvents orgànics prèvia a una hidròlisi va permetre la identificació del principals compostos fenòlics de la llinassa, com ara el secoisolariciresinol diglucòsid o SDG. Posteriorment es va passar a l'estudi del sistema antioxidant de la llinassa, pel què es va avaluar el contingut de peròxids i aldèhids en mostres de farina de llavor reconstituïdes amb oli comercial de llinassa després d'una i dues setmanes de magatzematge. També s'analitzaren farines procedents de llavor sense clofolla i amb clofolla. La investigació preliminar va permetre concloure que l'SDG i d'altres compostos com ara les formes glucosídics del àcids ferúlic i p-cumàric no estan implicats directament al sistema responsable dels processos antioxidants de la llinassa. / Los biofenoles abarcan un amplio grupo de metabolitos secundarios de diversa estructura y reconocida actividad biológica. Específicamente el interés en el fruto de la oliva y en la semilla de lino está relacionado con su perfil fenólico y con su influencia directa en la calidad de productos derivados, así como con su posible uso en la producción de alimentos funcionales.Como respuesta a este reciente planteamiento, la tesis doctoral se centró en la investigación del papel de los compuestos fenólicos en el proceso de extracción de aceite de oliva y en la semilla de lino.Se tuvieron en cuenta dos importantes aspectos: la transferencia y la función antioxidante de los compuestos fenólicos implicados en el proceso de obtención de aceite de oliva. La influencia de tratamientos de irrigación, el índice de madurez y otros asuntos tecnológicos del procesamiento del fruto de la oliva trajeron como consecuencia un mejor entendimiento de la transferencia y transformación de los compuestos fenólicos. Se determinaron, entonces, datos cualitativos y cuantitativos en términos de transferencia, correspondientes a las concentraciones de fenoles en la pasta de oliva, orujo, alpechín y aceite de oliva. Algunos de estos productos y subproductos se han reconocido como valiosa fuente de compuestos antioxidantes. Por esta razón se procedió al aislamiento y purificación de determinados fenoles con el fin de evaluar su capacidad antioxidante a través del parámetro de estabilidad oxidativa. Igualmente se determinó el efecto de los compuestos fenólicos sobre el atributo sensorial de índice de amargor. Se estudiaron alcoholes simples, ácidos fenólicos, secoiridoides, derivados secoiridoides, flavonoides y lignanos, encontrándose un significativo efecto al adicionar dichos compuestos a distintas matrices de aceite de oliva (refinado y extra virgen). El ácido gálico, el hidroxitirosol (3,4-DHPEA), el ácido cafeico, la luteolina y la forma dialdehídica del ácido elenólico ligada al hidroxitirosol (3,4-DHPEA-EDA), mostraron tener efectividad como antioxidantes.De igual forma se investigó la semilla de lino en función de su composición fenólica. La existencia de disímiles métodos de extracción de los fenoles se convirtió en el punto de partida para el estudio analítico de la fracción fenólica de la linaza. La extracción con solventes orgánicos, seguida de un proceso de hidrólisis, permitió la identificación de los principales compuestos característicos de la semilla de lino, como el Secoisolariciresinol diglucosídico (SDG).Posteriormente se pasó al estudio del sistema antioxidante de la linaza, para lo cual se evaluó el contenido de peróxidos y aldehídos en muestras de harina de semilla reconstituidas con aceite comercial de lino después de una y dos semanas de almacenamiento. También se analizaron harinas procedentes de semilla sin cascarilla y con cascarilla. La investigación preliminar permitió concluir que el SDG y otros compuestos, tales como las formas glucosídicas de los ácidos ferúlico y p-cumárico, no están implicados directamente en el sistema responsable de los procesos antioxidantes de la semilla de lino. / Biophenols encompass a major group of secondary plant metabolites that display a wealth of structural variety and a large diversity of significant biological activities. An area of special interest concerning olive and flaxseed is their phenolic profile and its direct influence on the quality of derived-products and the production of potential functional foods.In response to this opportunity, the role of phenolic compounds during olive oil extraction process and their presence in flaxseed was the basis of the doctoral investigation.Two important areas: transfer and antioxidant function of phenolics during olive oil extraction were investigated. The influence of irrigation treatments, ripening index of olive fruit and different technological aspects in the production of olive oil allowed having a better understanding of the transference and transformations of the phenolic compounds.Quantitative data, in terms of transfer, were established for concentrations of phenolics in olive paste, pomace, wastewater and olive oil phases. Some of these products and byproducts have been studied and proven to be effective source of phenolic antioxidants.Therefore, isolation and purification of particular phenolics were performed to evaluate their individual antioxidant activity through the oxidative stability parameter. The bitter index, a sensorial attribute, was also evaluated as function of the addition of phenolic compounds. Simple alcohols, phenolic acids, secoiridoids, secoiridoid derivatives, flavonoids and lignans were studied. The addition of the mentioned phenolic compounds on refined and extra virgin olive oil had a remarkable effect on the oxidative stability of the oils. Gallic acid, hydroxytyrosol (3,4-DHPEA), caffeic acid, luteolin and the dialdehydic form of elenolic acid linked to hydroxytyrosol (3,4-DHPEA-EDA) were found to be effectiveantioxidants.Flaxseed phenolic fraction was also studied. Diverse studies on the extraction of phenolics provided a basis for establishing an analytical method to evaluate the phenolic composition of flax. A solvent extraction followed by hydrolysis treatments resulted in the identification of the main phenolic compounds occurred in flaxseed including ecoisolariciresinol diglycoside (SDG). A subsequent study to understand the flaxseed antioxidant system was developed using reconstituted flour meals with commercial oil and analyzing hulls and dehulled flour meals. Peroxide and aldehyde values were determined during two weeks of storage. It appeared that SDG and phenolic acids (ferulic and p-coumaric glycosides) might not be responsible of the main flaxseed antioxidant function.

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases.L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP.Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn.S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes.Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies.El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempeltsLa caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri.Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP.Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades. / Many bacteria pertaining to the fluorescent Pseudomonas group are able to control plant diseases caused by bacterial and fungal plant pathogens (BCAs). Also, some of them exhibit activity as plant growth promoting bacteria (PGPBs). Several metabolites like 2,4-diacetylphloroglucinol (PHL), phenazin-1-carboxilic acid (PCA), pyrrolnitrin (Prn), hydrogen cyanide (HCN), indol-3-acetic acid, siderophores and chitinases has been described accounting for their ability of being BCAs or PBPBs.The aim of the present work was to compare the phenotypic and genotypic characteristics of a selected group of fluorescent Pseudomonas by means of a polyphasic approach in order to establish relationships with the ability of being BCA and PGPB.Due to the importance of production of metabolites like Phl, PCA and Prn in biocontrol, the preliminary objective of this work was to search and isolate of metabolite producing strains. To achieve this objective a molecular approach was used based on the detection of biosynthetic genes, which are implicated in the metabolite production, instead of direct detection of the metabolites. The procedure was performed to avoid the effect of culture conditions on induction or repression of metabolite synthesis. Two procedures were used (i) assisted search of metabolite producing strains by means of phenotypic markers and subsequent confirmation by PCR analysis, (2) direct use of PCR for gene detection in direct extracts or enrichments from samples and subsequent colony-hybridization for assistance in strain isolation. The best method for isolation of Phl producers in the type of samples processed in the present work, where the frequency of Phl producers is very low, was the assisted search by means of phenotypic markers followed of a confirmation by PCR amplification of phlD gene. Four strains harboring the PCA genes, 15 strains with Phl genes, and one with Prn genes were isolated.A collection of 72 strains of Pseudomonas pertaining to the fluorescent group was made including 18 isolates derived from the present work which harbor the biosynthetic genes for PhL, PCA and Prn production; 6 strains from reference collections; 14 strains producing several antibiotics which were supplied by other colleagues; and a selection of 34 strains from a previous work performed by our research group. Within the collection there are many strains with promising potential as BCAs and PGPBs of several diseases and plant hosts.The collection was characterized phenotypically and genotypically. The phenotypic characterization included identification at the species level with the aid of API20NE kit and several specific biochemical tests; the production of metabolites such as PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, chitinases and siderophores; in vitro antagonism in several culture media against two fungi (Stemphylium vesicarium and Penicillium expansum) and three bacterial pathogens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae and Xanthomonas arboricola pv. juglandis); efficacy in biossays of inhibition of infection of plant material by P. expansum on apple fruit tissue and S. vesicarium on pear leaves, E. amylovora on immature pear fruit, and of growth promotion in two commercial Prunus rootstocks. P. expansum causes blue mold rot of apple and pear in postharvest, S. vesicarium cause brown spot of pear and E. amylovora is the causal agent of fire blight of rosaceous plants.The number of strains, over a total of 72 studied, producing IAA and chitinases was very low (4 producing IAA and 6 producing chitinases), whereas a high number of HCN producing strains (32) was detected which was associated to Phl production. In vitro antagonism against bacteria was highly dependent on indicator pathogen and growth medium, but the presence or absence of iron did not seem to affect. However, in the case of antagonism against fungi, no influence of the medium composition was observed. Among the collection a low frequency of strains exhibiting antagonism against 3 or 4 pathogens a total of 7 strains was observed in all tested media. Only two out of the seven strains were effective in infection inhibition bioassays caused by two of the three pathogens tested. Some of the effective strains in the in vivo assays were not antagonist for the indicator pathogen in any of the media tested. In the case of plant growth promoting strains, the growth in rootstock Marianna 2624 was more stimulated than in GF677, and there was a strain-host specificity. Genotypic characterization of strains was performed by means of restriction fragment length polymorphism analysis of the ribosomal DNA (RFLP-rDNA) and macrorestriction fragment length polymorphism analysis of chromosomal DNA separated by pulsed field gel electrophoresis (MRFLP-PFGE). Both techniques showed a high level of genotypic diversity within the collection of strains, and no relationships were observed between clusters and phenotypic characteristics or ability to be BCA or PGPB. Patterns of MRFLP-PFGE for the model bacterium P. fluorescens EPS288 were found stable within time and independent of cultivation conditions in the laboratory or under natural conditions. Therefore the method is highly suitable for identification of strains reisolated from natural samples previously inoculated with the bacterium.A further selection of strains which produce phloroglucinol were characterized by RFLP analysis and phlD sequencing. The groups observed were consistent among the RFLP-rDNA, RFLP-phlD and gene sequence data. Phylogenetic analysis obtained using phlD sequences showed a high level of polymorphism revealing three main clusters. These clusters appear to be related with metabolite production: a first cluster producing Phl, HCN and Prn, a second producing Phl and HCN, and a third producing only Phl. However, this groups were related neither to the geographic origin of strains nor to the activity as BCA or PGPB.A multivariate analysis (correspondence, pairwise Spearman rank correlation, and frequency analysis)was performed using data of phenotypic and genotypic characterization of strains. The results emphasize the importance of discarding from the database those strains being genetically identical because skew the final results. The three types of analysis did not revealed a significant and consistent relationship between the activity of infection inhibition or growth promotion of the strains and their characteristics.

Durante la última década se han publicado un gran número de estudios de investigación sobre la ubicuidad de diferentes contaminantes orgánicos en todo tipo de matrices ambientales, principalmente en agua. Entre éstos, la presencia medioambiental de fármacos y en concreto de antibióticos ha sido investigada con especial interés, debido a sus altas tasas de consumo y elevada actividad biológica (promoción de resistencia bacteriana). A este deterioro de la calidad de los recursos hídricos se une además el problema de su escasez, sobre todo en las cuencas mediterráneas, de modo que la reutilización del agua se hace imprescindible. Sin embargo, la falta de eficacia de los sistemas convencionales de tratamiento de aguas residuales para eliminar estos contaminantes orgánicos pone de manifiesto su entrada continuada en las aguas superficiales receptoras mediante los efluentes de las depuradoras, y el riesgo que supondría esta reutilización. Así pues, queda patente la necesidad de disponer de información nueva y valiosa sobre la presencia medioambiental de las sulfamidas, familia de antibióticos de alto consumo y cuya presencia medioambiental tiene origen en un uso principalmente veterinario y agrícola, (sulfametazina, sulfadimetoxina), pero también humano (sulfametoxazol, sulfapiridina). Para ello, es necesario el desarrollo de diversas herramientas analíticas avanzadas que nos permitieran la determinación de esta familia de antibióticos en diferentes matrices de agua ambiental, así como en fango de depuradora y suelo agrícola. Con las diferentes metodologías analíticas se pretende evaluar la presencia y persistencia de estos antibióticos y de sus metabolitos mayoritarios en los diferentes ecosistemas acuáticos, evaluando la eficacia de las técnicas de tratamiento de aguas residuales convencionales aplicadas en la actualidad en diferentes EDARs, y también de varias alternativas como los bioreactores de membrana o los bioreactores de lecho fijo (MBR o FBBR, respectivamente). Asimismo, estudiando su biodegradabilidad y persistencia medioambiental, es posible conocer en mayor profundidad la naturaleza y comportamiento de estos compuestos. Considerando todo lo anterior, durante el desarrollo de esta Tesis nos hemos marcado como principal objetivo el desarrollo y aplicación de nuevas metodologías analíticas basadas en la cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas para la determinación de sulfamidas y sus metabolitos acetilados en aguas (residuales, superficiales, subterráneas) y matrices sólidas (fangos de depuradora y suelos agrícolas). Durante el análisis de aguas residuales, se evaluó también la eliminación de estos compuestos durante el tratamiento en las diferentes depuradoras, comparando la eficacia de diferentes tipos de tratamiento y su impacto en las zonas de vertido, comprendiendo así el destino de estos antibióticos en todo el ciclo del agua. Posteriormente, estudiamos la biodegradabilidad de diferentes sulfamidas mediante el tratamiento con hongos en medio líquido y sólido, y se llevó a cabo la identificación de los productos de transformación derivados mediante cromatografía de líquidos de ultra-alta resolución-espectrometría de masas en tándem con un sistema híbrido cuadrupolo tiempo de vuelo (UHPLC-QqTOF-MS/MS). También realizamos un estudio de destino de las sulfamidas, evaluando la fotodegradación de algunas de ellas y sus metabolitos acetilados en diferentes matrices acuosas, considerando también la aparición e identificación de los productos de fototransformación que se generan durante su fotólisis mediante UHPLC-QqTOF-MS/MS. Por último, mencionar que con los datos de presencia medioambiental obtenidos se llevó a cabo la evaluación del impacto medioambiental de las sulfamidas detectadas en los diferentes tipos de agua estudiados, estimando los coeficientes de riesgo asociados siguiendo las directrices marcadas por la Agencia Europea del Medicamento (EMEA). / Sulfonamides (SAs) are one of the most widely used antibiotics in human and especially in animal husbandry. So far, concern regarding the environmental presence of sulfonamides and other species of antibiotics has focused mainly on the potential spread of antimicrobial resistance. However, their biological activity and high resistance to biodegradation may lead to long residence times in both water and soil matrices. Long-term ecological risks and unpredicted effects can result from unintentional exposure of different organisms and even human health could be negatively affected. In this context, this PhD thesis aimed to study the environmental occurrence of the most relevant sulfonamides in all types of waters, sewage sludge and agricultural soils. In order to fully understand the fate and effects of this family of antimicrobials in the environment, further research on their resiliance and biodegradability has been carried out. The need of developing new advanced analytical methodologies, fast, robust and with high sensitivity for the analysis of sulfonamides and their acetylated metabolites at environmental levels was the first and one of the main objectives of this PhD Thesis. These analytical methodologies were succesfully applied for the analysis of real samples in different monitoring studies in wastewater treatment plants, rivers and aquifers. Sulfonamides and their acetylated metabolites were ubiquitous in all the water samples studied, with levels ranging from the low pg L-1 to μg L-1 (mainly in wastewater influents, but also in some surface water samples from the Llobregat River). Maximum levels detected in sewage sludge were up to 139.2 ng g-1 (sulfamethazine). The last part of the PhD focused on the biodegradability and behaviour of the sulfonamides in the environment. The efficiency of conventional wastewater treatments, usually based on activated sludge (CAS), was evaluated and removal rates were estimated for the different sulfonamides studied. The ability of white rot fungi Trametes versicolor to degrade sulfamethazine was also studied, as well as the photodegration kynetics of sulfapyridine, sulfamethazine and their respective acetylated metabolites in wastewater effluents and HPLC water under simulated irradiation.

El control d'herbicides i altres anàlits orgànics presents en el medi ambient constitueix una pràctica habitual en els laboratoris des de l'establiment de legislacions que limiten la seva concentració. Per aquesta raó, cal el desenvolupament de noves metodologies analítiques per al seguiment de compostos orgànics en el medi. Molt sovint aquests anàlits es troben a nivells traça en aigües i sòls, conjuntament amb un alt contingut de substàncies húmiques i fúlviques. Així, un dels reptes existents és el tractament de la mostra (extracció, concentració i "clean-up" d'aquests anàlits per a una bona quantificació). Aquests processos han de venir complementats per tècniques cromatogràfiques que permetin la mesura final dels anàlits.La investigació que es presenta en aquesta tesi es centra en el desenvolupament d'un mètode per a la determinació de 2,4-D i MCPA i els seus metabòlits fenòlics i d'un altre per a la determinació de cafeïna. El primer dels procediments desenvolupats s'ha aplicat al seguiment dels herbicides i els metabòlits fenòlics en sòls d'un camp de golf, mentre que el segon s'ha emprat per a la determinació de cafeïna en aigües naturals i, posteriorment, en aigües residuals. / The control of herbicides and other organic pollutants present in the environment has become a routine practise in many laboratories since the establishment of legislations that indicates the maximum allowed levels for these compounds. For this reason, it is necessary to develop new analytical methodologies for the monitoring of organic compounds in the environment. These analytes are often found at trace levels in waters and soils, with a high humic and fulvic organic matter content associated. One of the most important challenges in this field is the sample treatment (i.e. extraction, concentration and clean-up of the compounds to obtain a correct quantification). These procedures have to be coupled to chromatographic techniques to allow the determination of the compounds. This study is devoted to the development of a method for the determination of 2,4-D, MCPA and their phenolic metabolites and another method for the determination of caffeine. The first method has been applied for the monitoring of the herbicides and their metabolites in soils from a golf course; the second has been applied to the determination of caffeine in natural and urban wastewaters.

El di(2-etilhexil) ftalat (DEHP) és un plastificant que s’afegeix als productes de clorur de polivinil (PVC) per a dotar-los de més flexibilitat. El material mèdic fet de PVC, i en particular els dispositius i bosses que s’utilitzen en les transfusions de sang, conté el DEHP com additiu. Així, el receptor d’una transfusió està altament exposat a aquest compost. L’objectiu de la tesi va ser estudiar els metabòlits del DEHP en orina com a possibles marcadors de la pràctica d’una transfusió de sang en l’esport. Es va desenvolupar i validar un mètode d’anàlisi per cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem per a la quantificació dels principals metabòlits del DEHP en orina humana: mono-(2-etilhexil) ftalat (MEHP), mono-(2-etil-5-hidroxihexil) ftalat (MEHHP), mono-(2-etil-5-oxohexil) ftalat (MEOHP), mono-(2-carboximetilhexil) ftalat (2cx-MMHP) i mono-(2-etil-5-carboxipentil) ftalat (5cx-MEPP). El mètode es va aplicar a mostres procedents de voluntaris sans (grup control), de pacients hospitalitzats que havien rebut una transfusió de sang i de pacients hospitalitzats sotmesos a tractaments mèdics amb materials de PVC i no a transfusions. Es van obtenir diferències significatives en les concentracions dels tres metabòlits estudiats (MEHP, MEHHP, MEOHP) entre les mostres dels pacients transfosos respecte els altres dos grups de població. El mètode també es va aplicar a mostres d’orina de vint-i-cinc voluntaris sans que s’havien sotmès a un procediment d’autotransfusió. Els resultats van indicar concentracions elevades dels cinc metabòlits del DEHP en orina fins a les 48 hores després d’haver rebut la sang. Finalment, es van determinar les concentracions dels cinc metabòlits de DEHP en una població d’esportistes i es van calcular límits de referència que permetessin sospitar d’una transfusió. Així doncs, els resultats indiquen que la mesura dels metabòlits de DEHP en orina pot ser usada com una eina pel cribatge de l’ús de transfusions en l’esport. / The plasticizer di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) is used in polyvinyl chloride products (PVC) to increase its flexibility. Medical devices made of PVC, especially blood bags used in blood transfusions, contain DEHP as additive. Therefore, subjects submitted to blood transfusion are widely exposed to this compound. The aim of the project was to evaluate DEHP metabolites in urine as possible markers of the use of a blood transfusion in sports. An analytical method was developed and validated to quantify the main DEHP metabolites mono-(2-ethylhexyl)phthalate (MEHP), mono-(2-ethyl-5-hydroxyhexyl)phthalate (MEHHP), mono-(2-ethyl-5-oxohexyl)phthalate (MEOHP), mono-(2-carboxymethylhexyl)phthalate (2cx-MMHP) and mono-(2-ethyl-5-carboxypentyl)phthalate (5cx-MEPP), in human urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry. The methodology was applied to samples belonging to healthy volunteers (control group), hospitalized patients subjected to blood transfusions and hospitalized patients subjected to medical treatments involving plastic material different to blood transfusions. Significant differences were obtained in the concentrations of the three metabolites studied (MEHP, MEHHP, MEOHP) between transfused patients samples’ and the other two population groups. The method was also applied to urine samples from twenty-five healthy volunteers who were subjected to an autologous blood transfusion. The results indicated high concentrations of the five DEHP metabolites in urine up to 48 hours after the blood transfusion. Finally, the concentration of the five DEHP metabolites were evaluated in a sportsmen population and reference limits to allow suspicion of blood transfusion were calculated. Thus, the results indicate that the DEHP metabolites could be used as markers of blood transfusions in sports.