A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5684.pdf: 2471155 bytes, checksum: f035dbceafb88325d3cb0d3fb8280603 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / Financiadora de Estudos e Projetos / Matrix metalloproteinases (MMPs) are key factors in tumor progression that allow tumor cells to modify the extracellular matrix (ECM) and to release cytokines, growth factors being activated by cell surface molecules such as the integrins. Integrins are major adhesion receptors of cell surface that connect the cells to the external environment enabling its movement. Integrins activate signaling cascades that influence the adhesion, survival and cell proliferation. Important inhibitors of these molecules were found in snake venoms called disintegrins. Alternagin-C (ALT-C) a disintegrin from Rhinocerophis alternatus snake venom has affinity with α2β1 integrin therfore modulating cell adhesion, migration and proliferation. However, the effect of ALT-C on MMP activity has not been described yet. Here, we have found that, ALT-C increased cell migration in MDA-MB-231 at lower concentration (10 nM) and it decreased cell migration at higher concentrations (40, 100 and 1000 nM). ALT-C was able to inhibit MMP-9 activity in human breast cancer (MDA-MB-231) conditioned medium and MMP-2 activity in fibroblastas and human microvascular endothelial cells (HMEC-1) conditioned medium. ALT-C also modulated the expression of angiogenic genes such as VEGF, c-MYC, MMP-2 and MMP-9 and it was able to inhibit transendothelial migration of MDA-MB-231 cells at all concentrations (10, 40, 100 and 1000 nM). In conclusion, ALT-C affects the extracellular matrix remodeling by modulating the activity of MMPs and expression of angiogenic genes essential for tumor growth as well as decreased cell migration. / As metaloproteinases de matriz (MMPs) são fatores chave na progressão tumoral, pois participam do remodelamento da matriz extracelular (ECM), liberam citocinas, fatores de crescimento e são reguladas por moléculas da superfície celular (integrinas). As integrinas são os principais receptores de adesão da superfície celular. Elas interagem com proteínas presentes na matriz extracelular conectando as células ao meio no qual estão inseridas possibilitando sua locomoção e a participação em cascatas de sinalização que influenciam a adesão, sobrevivência e a proliferação celular. Importantes inibidores dessas moléculas foram encontrados em venenos de serpentes denominados de desintegrinas. Alternagina-C (ALT-C), uma desintegrina de veneno da serpente Rhinocerophis alternatus, tem afinidade para a integrina α2β1, modula a adesão, migração e a proliferação celular mas não há nenhum estudo publicado sobre sua influência na atividade das MMPs. Nesse estudo, a ALT-C foi capaz de aumentar a migração celular em MDA-MB-231 em baixa concentração (10 nM) e diminuir a migração em concentrações mais elevadas (40, 100 e 1000 nM). ALT-C também inibiu a atividade de MMP-9 em meio condicionado de células de carcinoma de mama (MDAMB- 231) e atividade de MMP-2 em meio condicionado de fibroblastos e células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1). A desintegrina também foi capaz de modular a expressão de genes angiogênicos como VEGF, c-MYC, MMP-2 e MMP-9 e inibir a transmigração das células tumorais através das células endoteliais. Conclui-se que a ALT-C atua no remodelamento da matriz extracelular do microambiente tumoral por modular a atividade de MMPs e a expressão de genes angiogênicos essenciais no crescimento tumoral, bem como diminuindo a migração celular.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Chapter II: In the present study, a metalloproteinase named BpMPI was isolated from Bothropoides pauloensis snake venom and its biochemical, enzymatic and immunochemical characteristics were determined. BpMPI was purified in two chromatography steps on ion exchange resins CM-Sepharose Fast flow and Sephacryl S-300. This protease was homogeneous on SDS-PAGE and showed a single chain polypeptide of 23 kDa under reducing conditions. The primary structure of the enzyme showed high similarity with other SVMPs enzymes from snake venoms. BpMPI showed proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at high temperatures. BpMPI was able to hidrolyse glandular and tecidual kallikrein substrates, but was unable to act upon factor Xa and plasmin substrates. The enzyme did not able to induce local hemorrhage in the dorsal region of mice even at high doses. Immunochemistry studies showed that BpMPI was high immunogenic and the antibodies anti-BpMP-I were very efficient to neutralize the hemorrhagic activity and systemic alterations induced by Bothropoides pauloensis snake venom. / Capítulo II: No presente estudo, uma metaloproteinase denominada BpMPI foi isolada da peçonha da serpente Bothropoides pauloensis e suas características bioquímicas, enzimáticas e imunoquímicas foram determinadas. BpMPI foi purificada utilizando dois passos cromatográficos em resinas de troca iônica CM-Sepharose Fast Flow e Sephacryl S-300. Esta protease mostrou-se homogênea em SDS-PAGE apresentando uma única cadeia polipeptídica de 23 kDa sob condições redutoras. A estrutura primária da enzima mostrou alta similaridade com outras enzimas SVMPs de venenos de serpentes. BpMPI mostrou atividade proteolítica sobre azocaseina e fibrinogênio bovino e foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina e β- mercaptoetanol. Além disso, esta enzima apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas. BpMPI também foi capaz de hidrolisar os substratos da calicreína glandular e tecidual, mas foi incapaz de hidrolisar os substratos do fator Xa e plasmina. A enzima não foi capaz de induzir hemorragia local na região dorsal de camundongos mesmo em altas doses. Estudos imunoquímicos demostraram que os anticorpos anti-BpMP-I foram eficientes em neutralizar a atividade hemorrágica e as alterações sistêmicas induzidas pela peçonha de Bothropoides pauloensis. / Mestre em Genética e Bioquímica

A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

Carcinona epidermóide é um prevalente tumor de cabeça e pescoço relacionado a altas taxas de mortalidade. Neste trabalho, verificamos se AG73 (RKRLQVQLSIRT, cadeia a1), peptídeo derivado da laminina-111, regula migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma epidermóide oral (OSCC). Cadeia a1 da laminina e MMP9 estão expressas neste tumor in vivo e in vitro. AG73 induziu aumento da taxa migratória de células OSCC em ensaios de ferida e migração, e também estimulou invasão em ensaio em câmaras bipartites com Matrigel. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram aumento dose-dependente de MMP9, detectado por zimografia. Buscamos receptores de AG73 que regulariam atividade nesta linhagem. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecana-1 e integrina b1, e silenciamento desses receptores com RNA de interferência promoveu diminuição de migração e invasão dependente de AG73 nestas células. Esses resultados sugerem que sindecana-1 e integrina b1, ativados por AG73, podem regular migração, invasão e secreção de MMPs em células OSCC. / Oral squamous cell carcinoma is a prevalent head and neck tumor, related to high mortality rates. Here we studied the role played by AG73 (RKRLQVQLSIRT, a1 chain) on migration, invasion and protease secretion of a cell line (OSCC) from human oral squamous cell carcinoma. Laminin a1 chain and MMP9 are expressed in oral squamous cell carcinoma cells in vivo and in vitro. AG73 increased migratory activity of OSCC cells, as shown by monolayer wound assays and migration assays. This peptide also stimulated cell invasion in chemotaxis chambers coated with Matrigel. OSCC cells cultured on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion, detected by zymography. We searched for AG73 receptors regulating activities in this cell line. OSCC cells grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin, and siRNA knockdown of these receptors decreased AG73-dependent migration and invasion of OSCC cells. Our results suggest that syndecan-1 and b1 integrin signaling downstream of AG73 regulate migration, invasion and MMP secretion by OSCC cells

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3128.pdf: 3115695 bytes, checksum: a3cd2a9e5289c0b15425f8203b8ca0c1 (MD5) Previous issue date: 2010-07-21 / INTRODUÇÃO: osteoporose é reconhecida mundialmente como sério problema de saúde pública, apresentando como característica principal a fragilidade óssea. A qualidade do osso é fator determinante nesse aspecto, e depende do colágeno. Um dos fatores intrínsecos que regula o colágeno é a atividade da metaloproteinase -2 (MMP-2). O treinamento de força é o melhor recomendado para preservar e/ou melhorar a qualidade da massa óssea. OBJETIVO: foi investigar a influência do treinamento de força na atividade da MMP-2 e nas propriedades mecânicas do osso de ratas ovariectomizadas (OVX) e intactas. MATERIAIS E MÉTODOS: 48 ratas maduras jovens foram distribuídas em 2 grupos distintos, ovariectomia (OVX) e Intactas (Int); a seguir, 3 subgrupos foram formados similarmente em cada grupo: sedentário (OVX-Sed e Int-Sed), exercício agudo (OVX-Ex-Ag e Int-Ex-Ag) e exercício crônico (OVX-Ex-Cr e Int-Ex-Cr) (n = 8 por grupo). Foi utilizado um treinamento de força de 12 semanas no qual os animais escalaram uma escada vertical de 1,1-m com pesos presos as suas caudas. As sessões foram realizadas com intervalo de três dias, 4-9 escaladas e 8-12 movimentos dinâmicos por escalada. Após o término do período experimental, foram realizadas análises da atividade da MMP-2 por zimografia e análises biomecânicas e biofísicas utilizando-se uma máquina de ensaio universal (Instron modelo 4444). RESULTADOS: a atividade da MMP-2 apresentou-se reduzida em 2 grupos OVX (OVXSed e OVX-Ex-Ag) comparada com todos os outros grupos (p ≤ 0,05). Em contrapartida, os grupos treinados cronicamente (OVX-Ex-Cr e Int-Ex-Cr) apresentaram aumento significativo da MMP-2. Esses resultados também foram observados nas análises biomecânicas e biofísicas, nas quais os grupos OVX-Sed e OVX-Ex-Ag apresentaram Densidade Mineral, Densidade Óssea, Carga Máxima e Carga de Fratura menores em relação à todos os outros grupos; na outra mão, os grupos treinados cronicamente, apresentaram índices maiores nas análises biomecânicas e biofísicas acima citadas. CONCLUSÕES: a ovariectomia reduziu a atividade da MMP-2, produzindo efeitos deletérios sobre a massa óssea. O treinamento de força proposto foi eficiente em combater esses efeitos, apresentando inclusive efeito modelador.

Submitted by Daniele Amaral (daniee_ni@hotmail.com) on 2016-10-10T20:10:53Z No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:44:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:45:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T13:45:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) Previous issue date: 2016-09-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Purpose: The aim of the present study was to investigate the influence of resistance training (RT) and hormone replacement (HR) on MMP-2 activity, biomechanical and physical properties bone of ovariectomized (OVX) rats. Methods: Sprague-Dawley female rats were grouped into six experimental groups (n = 11 per group): shamoperated sedentary (SHAM Sed), ovariectomized sedentary (OVX Sed), sham-operated resistance training (SHAM RT), ovariectomized resistance training (OVX RT),(OVX Sed-HR), and OVX RT-HR. HR groups received implanted silastic capsules with a 5% solution of 17β-estradiol (50 mg 17β-estradiol/ml of sunflower oil). In a 12-week RT period (27 sessions; 4–9 climbs) the animals climbed a 1.1 m vertical ladder with weights attached to their tails. Biomechanical and physical bone analyses were performed using a universal testing machine, and MMP-2 activity analysis was done by zymography. Results: Bone density and bone mineral content was higher in the RT and HR groups. The MMP-2 activity was higher in the RT and HR groups. The biomechanical analysis (stiffness, fracture load and maximum load) demonstrated better bone tissue quality in the RT associated with HR. Conclusion: The RT alone as well as when it is associated with HR was efficient in increasing MMP-2 activity, biomechanical and biophysical properties bone of ovariectomized rats. / Objetivo: o objetivo do presente estudo foi investigar a influência do treinamento resistido (TR) e reposição hormonal (RH) na atividade das metalloproteinases 2 (MMP- 2), nas propriedades biomecânicas e biofísicas do osso de ratas ovariectomizadas (OVX). Métodos: fêmeas albinas foram agrupadas em seis grupos (11 animais por grupo): Sham Sedentário (SHAM Sed); Ovariectomizado Sedentário (OVX Sed); Sham Operado Treinamento Resistido (SHAM TR); Ovariectomizado Treinamento Resistido (OVX TR); Ovariectomizado Sedentário com Reposição Hormonal (OVX Sed-RH) e Ovariectomizado Treinamento Resistido com Reposição Hormonal (OVX TR-RH). Os animais dos grupos que receberam RH tiveram capsulas de silastic implantadas com uma solução de óleo de girassol com 180μg de 17β-estradiol/mL. Os animais foram submetidos ao TR por 12 semanas (3 vezes por semana, onde realizavam de 4-9 escaladas), o treinamento acontecia em uma escada vertical de 1,1m com os pesos fixados em sua cauda. As análises biomecânicas e biofísicas foram realizadas utilizando a máquina de teste universal e a atividade da MMP-2 por zimografia. Resultados: a densidade óssea e o conteúdo mineral ósseo foram maior nos grupos TR e RH. A atividade da MMP-2 também foi maior nos grupos que foram submetidos ao TR e RH. A análise biomecânica (rigidez, carga no ponto de fratura e carga máxima) utilizada para demonstrar a qualidade do osso foi maios no grupo TR com associação do RH. Conclusão: nossos resultados indicam que o TR e RH foram eficientes em aumentar a atividade da MMP-2, as propriedades biomecânicas e biofísicas dos ossos de ratas ovariectomizadas.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-05T12:51:09Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1137139 bytes, checksum: e12ef38589083b7a6e2b1cbb011a5ed4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-05T12:51:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1137139 bytes, checksum: e12ef38589083b7a6e2b1cbb011a5ed4 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / DNA methylation is a key process for the regulation of gene expression by reversible inactivation of genes. Environmental factors such as solar radiation, can alter the DNA methylation profile. MMP-9 protein is part of a collagenases family whose function is to remodel the extracellular matrix, which presents itself very active in the early stages of cancer and photoaging. MicroRNAs are non-coding RNA molecules that act as post-transcriptional regulators of gene expression by degrading or repressing the target messenger RNA. It is estimated that about 10% of microRNA expression is controlled via DNA methylation. The microRNA-137 has tumor suppressor function in various types of cancer, including squamous cell carcinoma and melanoma. The aim of our study was to analyze the influence of sun exposure on the DNA methylation profile of matrix metalloprotease-9 (MMP9) and microRNA-137 (MIR137) genes of skin cells. To this purpose, skin samples were analyzed, which were obtained from sun-exposed and sun-protected areas from 28 corpses of both sexes, aged 30-89 years with no history of skin diseases obtained from the Brazilian Service of Death Investigation. Genomic DNA was extracted using Trizol and with the aid of a tissue homogenizer. The DNA methylation analysis was performed using Methylation Specific PCR (MSP) by previous modification of the DNA with sodium bisulfite. The amplified samples were subjected to electrophoresis on polyacrylamide gel followed by staining with silver nitrate. Statistical analysis was performed using the McNemar paired test at a significance level of 5%. No differences were found among the areas (p>0.05), with the partially methylated condition found to be a common event in skin for both MMP9 (96.4% of samples) and MIR137 (60.4% of samples). We conclude that sun exposure does not induce changes in DNA methylation status in the studied CpG sites. / A metilação do DNA constitui um dos principais processos para a regulação da expressão gênica através da inativação reversível dos genes. Fatores ambientais tais como a radiação solar, podem alterar o perfil de metilação de DNA. A proteína MMP-9 faz parte de uma família de colagenases cuja função é a remodelação da matriz extracelular, apresentando-se muito ativa em fases iniciais do câncer e do fotoenvelhecimento. Os microRNAs são moléculas de RNA não codificantes que agem como reguladores pós-transcricionais da expressão gênica através da degradação ou repressão do RNA mensageiro alvo. Estima-se que cerca de 10% da expressão de microRNAs é controlada via metilação de DNA. O microRNA-137 possui função de supressor tumoral em vários tipos de câncer, incluindo o carcinoma espinocelular e melanoma. O objetivo do trabalho foi analisar a influência da exposição solar sobre o perfil de metilação de DNA dos genes da metaloprotease de matriz-9 (MMP9) e microRNA-137 (MIR137) em células da pele. Para isso, foram analisadas amostras de pele obtidas de uma área exposta e não exposta ao sol de 28 cadáveres de ambos os sexos, com idade entre 30-89 anos sem histórico de doenças de pele obtidas no Serviço de Verificação de Óbitos da Paraíba (SVO). O DNA genômico foi extraído dos tecidos utilizando-se Trizol e após homogeneização com auxílio de um homogeneizador de tecidos. A análise de metilação de DNA foi realizada pela técnica de PCR Específica para Metilação (MSP), através da prévia modificação do DNA com bissulfito de sódio. As amostras amplificadas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida seguidas de coloração por nitrato de prata. A análise estatística foi realizada pelo teste pareado McNemar ao nível de significância de 5%. A análise revelou que não há diferença significativa entre as regiões exposta e não exposta ao sol, sendo a condição parcialmente metilada a mais frequente para ambos os genes MMP9 (96,4% das amostras) e MIR137 (60,4% das amostras) (p>0,05). Deste modo, concluímos que não há influência da exposição solar no perfil de metilação de DNA nos sítios CpG estudados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER II: Bothrops snake venoms contain proteins that contribute to the local and systemic effects seen after envenoming, such as edema, myonecrosis, coagulation disorders and hemorrhage. These effects can be triggered by the toxic action of metalloproteinases present in the bothropic venom. This study aimed to perform the purification, biochemical and functional characterization of a metalloproteinase called Moozincin, from Bothrops moojeni snake venom. Moozincin has approximate molecular mass of 28 kDa, displays relevant fibrinogenolytic activity and can be classified as a non-hemorrhagic fibrinogenolytic metalloprotease, in the class P-I. Moozincin was also able to induce edema, myonecrosis and hyperalgesia in experimental animals. Morphological analysis of the evolution of muscle injury revealed the occurrence of degenerative events and leukocyte infiltration already at three hours after application of Moozincin. These effects dominate until 48 hours after administration of the metalloprotease, when hemorrhagic effect was also demonstrated later in skeletal muscle, probably triggered by the action characteristic of metalloproteinases on vascular components and / or indirect action resulting from muscle injury. / CAPÍTULO II: As peçonhas de serpentes do gênero Bothrops contêm toxinas que contribuem com efeitos locais e sistêmicos vistos no envenenamento, como edema, mionecrose, distúrbios de coagulação e hemorragia. Grande parte desses efeitos pode ser desencadeada pela ação tóxica de metaloproteases presentes na peçonha botrópica. Este trabalho teve o objetivo de realizar a purificação e caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease, denominada Moozincina, presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni. A Moozincina tem massa molecular aproximada de 28 kDa e apresenta atividade fibrinogenolítica relevante, podendo ser classificada como uma metaloprotease fibrinogenolítica não-hemorrágica, pertencente à classe P-I. A Moozincina também foi capaz de induzir edema, hiperalgesia e mionecrose em animais experimentais. A análise morfológica da evolução da lesão muscular evidenciou a ocorrência de eventos degenerativos e infiltrado leucocitário já na terceira hora após a aplicação da toxina (Moozincina). Esses efeitos predominam até 48 horas após a administração da metaloprotease, quando também foi evidenciado efeito hemorrágico tardio no músculo esquelético, provavelmente desencadeado pela ação característica de metaloproteases sobre componentes vasculares e/ou por ação indireta decorrente da lesão muscular. CAPÍTULO III: Moozincina é uma metaloprotease recentemente isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. No presente trabalho foi realizada a caracterização farmacológica de efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. A aplicação intraplantar da Moozincina (5, 25 and 50 μg/pata) induziu edema e hiperalgesia na pata de ratos. Os efeitos edematogênico e hiperalgésico máximos foram observados 3 e 4 horas após a injeção da toxina, respectivamente. Alguns fármacos como dexametasona (2,5 mg/kg) e indometacina (8,0 mg/kg) reduziram significantemente o edema e a hiperalgesia, já a prometazina (15 mg/kg) e o ácido nordiidroguaiarético (100 mg/kg) reduziram apenas o efeito edematogênico, enquanto HOE-140 (10 μg/pata) e NG-monometil-I-arginina (100 μg/pata) reduziu apenas a hiperalgesia. Esses resultados demonstram a participação de metabólitos de ácido araquidônico em ambos os efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. Além disso, a ativação de receptores H1 de histamina está especificamente relacionada ao edema e a ação de bradicinina e de óxido nítrico à hiperalgesia. / Mestre em Genética e Bioquímica

Carcinona epidermóide é um prevalente tumor de cabeça e pescoço relacionado a altas taxas de mortalidade. Neste trabalho, verificamos se AG73 (RKRLQVQLSIRT, cadeia a1), peptídeo derivado da laminina-111, regula migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma epidermóide oral (OSCC). Cadeia a1 da laminina e MMP9 estão expressas neste tumor in vivo e in vitro. AG73 induziu aumento da taxa migratória de células OSCC em ensaios de ferida e migração, e também estimulou invasão em ensaio em câmaras bipartites com Matrigel. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram aumento dose-dependente de MMP9, detectado por zimografia. Buscamos receptores de AG73 que regulariam atividade nesta linhagem. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecana-1 e integrina b1, e silenciamento desses receptores com RNA de interferência promoveu diminuição de migração e invasão dependente de AG73 nestas células. Esses resultados sugerem que sindecana-1 e integrina b1, ativados por AG73, podem regular migração, invasão e secreção de MMPs em células OSCC. / Oral squamous cell carcinoma is a prevalent head and neck tumor, related to high mortality rates. Here we studied the role played by AG73 (RKRLQVQLSIRT, a1 chain) on migration, invasion and protease secretion of a cell line (OSCC) from human oral squamous cell carcinoma. Laminin a1 chain and MMP9 are expressed in oral squamous cell carcinoma cells in vivo and in vitro. AG73 increased migratory activity of OSCC cells, as shown by monolayer wound assays and migration assays. This peptide also stimulated cell invasion in chemotaxis chambers coated with Matrigel. OSCC cells cultured on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion, detected by zymography. We searched for AG73 receptors regulating activities in this cell line. OSCC cells grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin, and siRNA knockdown of these receptors decreased AG73-dependent migration and invasion of OSCC cells. Our results suggest that syndecan-1 and b1 integrin signaling downstream of AG73 regulate migration, invasion and MMP secretion by OSCC cells