Made available in DSpace on 2016-06-02T20:18:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2162.pdf: 2859680 bytes, checksum: 1ac25f610994c5304705349cb7684259 (MD5) Previous issue date: 2008-10-10 / Universidade Federal de Minas Gerais / (resumos divididos nos capítulos)

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3461.pdf: 3248917 bytes, checksum: b02925f28a9fc50ea71c3af6beebca5c (MD5) Previous issue date: 2011-03-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / The desintegrinas are cys-rich polypeptides without enzymatic activity, some found in snake venoms with an adhesive motif to integrin, unleashing distinct responses. Several research groups have been studying snake venom disintegrins with focus in pharmacological applications in tumor progression and proliferation, angiogenesis, blood clotting, and osteoporosis. This work shows the results of the construction of cDNA library of Rhinocerophis alternatus venom gland, cloning and expression of ALT-C, a disintegrina-like protein, in bacterial system. The library was comprised of 812 sequences that were classified into: (i) coding for hypothetical protein or mismatched in databases (unknown) corresponding to 20.94%; (ii) transcripts for cellular process 17.86%; and (iii) transcripts coding for toxic protein with 61.21%. Among toxic proteins the SVMPs were the most abundant transcripts 58.59%. Other toxic transcripts were C-type lectins (15.56%), bradykinin potentiating peptides (11.8%), serineproteases (5.18%), cys-rich secretory proteins (2.28%), vascular endothelial growth factors (2.28%), L-amino acid oxidases (1.86%) and phospholipases A2 (1.45%). The percentages correspond to this snake venom effects, low enzymatic activity and hemorrhagic and clotting activity as main action, derived from the SVMPs, C-type lectin and serineproteases. One of the SVMPs contigs were chosen based on the similarity with ALT-C, the defined sequence was called ALT-Ch (ALT-C homologue) since there has 4 conservative substitutions compared to the previously determined sequence. The ALT-C-h sequence was used in PCR to inclusion the restriction site for BamHI and EcoRI, cloned in pGEX4T-1 and transformed into E. coli AD494 (DE3) for expression. The cell culture was grown until the log fase and induced with IPTG for 3 hours, the expressed protein's identity was confirmed by Western Blotting using Polyclonal antibody Anti-ALT-C. The construction of the R. alternatus venom gland cDNA library provides a source of interesting active biomolecules, such as desintegrinas, to pharmacological applications in pathologies involving integrins like angiogenesis, tumor progression and metastasis. / As desintegrinas são polipeptídeos sem atividade enzimática, ricos em cisteína, geralmente encontrados no veneno de serpentes, possuidoras de um motivo adesivo reconhecedor de integrinas antagonizando ou agonizando a atividade das mesmas. Diversos grupos de pesquisa vêm estudando desintegrinas de venenos de serpentes com o foco em aplicação farmacológica nos processos de progressão e proliferação tumoral, angiogênese, coagulação sanguínea, e osteoporose. Este trabalho apresenta os resultados da construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de Rinocerophis alternatus e a clonagem e expressão da ALT-C, uma tipo desintegrina, em sistema bacteriano. A biblioteca foi composta por 812 sequências que foram classificadas em: (i) codificantes para proteínas hipotéticas ou sem equivalência nos bancos de dados (unknown) correspondendo a 20,94%; (ii) transcritos para produtos celulares 17,86%; e (iii) transcritos codificantes para proteínas tóxicas 61,21%. Dentre as proteínas tóxicas as SVMPs foram os transcritos mais abundantes com 58,59% dos compostos tóxicos do tecido. Os demais transcritos tóxicos encontrados foram as lectinas do tipo-C (15,56%), peptídeos potenciadores de bradicinina (11,8%), serinoproteases (5,18%), proteínas secretórias ricas em cisteína (2,28%), fatores de crescimento endotelial vascular (2,28%), L-aminoácido oxidases (1,86%) e fosfolipases A2 (1,45%). As percentagens encontradas correspondem aos efeitos do veneno dessa serpente, que possui baixa atividade enzimática e predominate ação hemorrágica e de alteração na coagulação sanguínea derivada da ação das SVMPs, lectinas do tipo-C e serinoproteases. Um dos contigs para SVMPs foi eleito pela similaridade com a ALT-C. A sequência determinada por esse contig foi denominada ALT-C-h (homóloga da ALT-C) por apresentar 4 substituições conservativas da sequência determinada anteriormente. A sequência foi utilizada em PCR para inclusão de sítio de restrição para BamHI e EcoRI, clonado em pGEX4T-1 e transformados em E. coli AD494(DE3) para ensaios de expressão. O cultivo foi crescido até a fase log e a indução expressão realizada com IPTG por 3 horas, a identidade da proteína expressa foi confirmada por western blotting utilizando anticorpo policlonal anti-ALT-C. A construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de R. alternatus fornece uma fonte de estudo interessante de biomoléculas ativas nos venenos como, por exemplo, as desintegrinas visando aplicações farmacológicas para patologias envolvendo integrinas como angiogênese, progressão e metástase tumoral.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2425.pdf: 1867201 bytes, checksum: 5e3f6810f116a13f8397936acba4c138 (MD5) Previous issue date: 2009-06-09 / Universidade Federal de Sao Carlos / As metaloproteases de matriz (MMPs) são cruciais para manutenção do tecido saudável. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade da MMP-2 nos músculos gastrocnêmio, sóleo, tibial anterior (TA) e extensor longo dos dedos (EDL) após treinamento de força em ratas ovariectomizadas. Ratas Wistar adultas foram alocadas nos grupos: sedentário (Sed-Intacto); sedentário ovariectomizado (Sed-Ovx); sedentário pseudo-ovariectomizado (Sed-Pseudo); exercício agudo (AgudoEx-Intacto); exercício agudo ovariectomizado (AgudoEx-Ovx); treinamento de força (CrônicoEx-Intacto) e treinamento de força ovariectomizado (CrônicoEx-Ovx) (n= 10 por grupo). Foi utilizado um treinamento de força de 12 semanas no qual os animais escalaram uma escada vertical de 1,1-m com pesos presos as suas caudas. As sessões foram realizadas com intervalo de três dias, 4-9 escaladas e 8-12 movimentos dinâmicos por escalada. A atividade da MMP-2 foi analisada por zimografia. Houve uma maior atividade da MMP-2 nos grupos CrônicoEx-Intacto e CrônicoEx-Ovx e menor atividade no AgudoEx-Ovx comparado com o grupo Sed-Intacto no sóleo (p≤0,05). Os grupos Sed-Ovx e CrônicoEx-Ovx apresentaram menor atividade da MMP-2 comparado com o grupo Sed-Intacto no TA. Houve maior atividade da MMP-2 no AgudoEx-Intacto e AgudoEx-Ovx comparado com Sed-Intacto e Sed-Ovx no TA, respectivamente (p≤0,05). Nos músculos TA e EDL o treinamento aumentou a atividade da MMP-2 comparado com o grupo Sed-Intacto. Não foram observadas alterações estatisticamente significativas para o músculo gastrocnêmio. O treinamento de força aumenta a atividade da MMP-2 nos músculos sóleo, TA e EDL, o que pode ser importante para o remodelamento muscular. A ovariectomia reduz a atividade da MMP-2 no TA e EDL, possivelmente comprometendo a função muscular.

A resistência natural do gambá Didelphis marsupialis ao veneno de serpentes se deve a fatores antibiotrópicos presentes em seu soro, do qual DM43 é um dos responsáveis pela inibição da atividade hemorrágica. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação desta proteína contra a metaloprotease contida no veneno pretendeu-se, neste trabalho, otimizar as condições de cristalização de DM43, na tentativa de determinar sua estrutura por difração de raios-X. Ensaios de cristalização revelaram que o sulfato de amônio é o precipitante mais eficiente na produção de cristais de DM43. A visualização e indexação dos padrões de difração destes cristais permitiram apenas a determinação dos parâmetros de sua cela unitária, devido a baixa qualidade dos mesmos. Deste modo, os seguintes parâmetros de cela unitária foram encontrados: a = b = 117.34 (0.03) Å, c = 193.39 (0.02)Å, ?=?=90° e ? = 120°, correspondentes ao sistema cristalino trigonal ou hexagonal. A recente determinação da sequência de aminoácidos de DM43, possibilitou modelar sua estrutura tridimensional por homologia utilizando o método de satisfação das restrições espaciais. Os três domínios tipo imunoglobulina de DM43 foram modelados em duas partes a partir da estrutura de referência KIR2DL1(1nkr) homóloga a dois domínios C-terminais de DM43, com apenas 27.72% de identidade. O domínio N-terminal denominado D0, foi modelado separadamente contra o domínio C-terminal de KIR2DL1 com um grau de identidade igual a 28.89%. A partir do programa GRASP e PATCHES, foram detectadas as prováveis regiões de ligação entre as duas partes da molécula e uma possível região responsável pela dimerização no domínio D2 de DM43. Interessantemente, resíduos polares em KIR2DLs que foram substituídos por hidrofóbicos em DM43, concentrando-se em uma face do domínio D2 ausente de sítios de glicosilação, o que coincide com as observações de dimerização do receptor do hormônio de crescimento. Um motivo estrutural característico de receptores hematopoiéticos identificados como WSXWS box, foi encontrado em todos os domínios de DM43, especialmente no domínio D2. Supõe-se que a sua existência esteja relacionada com a orientação relativa dos domínios por manter o primeiro triptofano do motivo posicionado exatamente na interface entre os domínios. Surge ainda uma fita extra (F´), no domínio D2, não pertencente ao enovelamento imunoglobulina devido a presença da Pro273, muito bem conservada, a três resíduos do motivo WSXWS. Esta fita parece desempenhar um papel importante na orientação do motivo pois além de formar ligações de hidrogênio com a fita G do domínio anterior, posiciona corretamente o primeiro triptofano do motivo na interface. Somando-se a isto, a presença de resíduos hidrofóbicos na interface dos domínios D1 e D2pode estar contribuindo para a orientação angular relativa menor que 90° entre os dois domínios. Uma interpretação análoga a de hormônios de crescimento sugere que, os loops entre as fitas AB, CC´ e EF do domínio 1, BC e FG do domínio 2 e o linker entre estes dois domínios, estejam envolvidos na interação da metaloprotease com DM43. / The natural resistance of the opossum, Didelphis marsupialis, towards snake venom is due to antibothropic factors present in the blood serum, of which DM43 is one. It is responsible for the inhibition of the hemorrhagic activity of the venom. With a view to better understanding the mechanism of action of this protein against venom metalloproteases, one of the aims of the present work was to optimize the crystallization conditions of DM43 in order to determine its three-dimensional structure by X-ray diffraction. Crystallization trials revealed that ammonium sulphate was the best precipitant. Visualization and indexing of the diffraction patterns from such crystals only allowed for the determination of the unit cell parameters due to their inherently low quality. The values obtained were a = b = 117.34 (0.03) \'ANGSTRON\', c = 193.39 (0.02) Å, ?=?= 90° e ? = 120°, corresponding to the trigonal or hexagonal crystal systems. The recent determination of the amino acid sequence of DM43 permitted the homology modelling of its three-dimensional structure by satisfaction of spatial restraints. The three immunoglobulin-like domains of DM43 were modelled in two separate parts from the reference structure KIR2DL1 (1nkr), homologous to the two C-terminal domains of DM43, with which its shares 27.72% sequence identity. The N-terminal domain, denominated D0, was separately modelled based on the C-terminal domain of KIR2DL1, with which it shares 28.89% identity. The programs PATCHES and GRASP were used to detect the probable interface region between the two separate parts of the molecule as well as a region probably responsible for dimerisation. Polar residues in KIR2DL1 which had been substituted by hydrophobic residues in DM43 are observed concentrated on one face of the molecule devoid of glycosilation sites (D2) coinciding with the dimerisation interface observed in the growth hormone receptor. A structural motif characteristic of the haematopoetic receptor family, identified as the WSXWS box, was observed to some extent in all three domains of DM43 and most evident in domain D2. It is speculated that the existence of this motif is related to the relative orientation of the domains, by maintaining the first tryptophan of the motif positioned at the domain interface. An additional ?-strand (F) in D2, which is not characteristic of the immunoglobulin fold, is observed due to the presence of the conserved Pro273, three-residues prior to the WSXWS box. This strand appears to play an important role in correctly positioning the motif as it forms hydrogen bonds with strand G of the previous domain thus orientating the first tryptophan of the motif at the interface. The presence of hydrophobic residues at the interdomain interface, may also contribute to stabilizing the acute angular relationship between D1 and D2. An analogous interpretation to that given for the growth hormone receptor, suggests that the loops between ?-strands AB, CC\' and EF of domain D1 and between strands BC and FG do domain D2 plus the linker region, are involved in the binding of metalloproteinase by DM43.

Neste trabalho descrevemos o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease hemorrágica, denominada BjussuMP-I. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu por combinação de dois passos cromatográficos, utilizando filtração molecular em Sephacryl S-200, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,0) seguida de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL-4B, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,6 mais NaCl 4 M) e eluída com gradiente de NaCl (4-0 M) a 25°C no mesmo tampão. BjussuMP-I é uma proteína com massa molecular de 60 kDa e pI 5,6, a qual induziu hemorragia após injeção intradérmica em camundongos, com uma dose hemorrágica mínima (DHM) de 4,5 g. A atividade hemorrágica da BjussuMP-I foi totalmente inibida após incubação com um agente quelante (EDTA), confirmando a dependência de metal da enzima para esse efeito. BjussuMP-I possui atividade proteolítica sobre a caseína e fibrinogênio e nenhum efeito sobre a gelatina. Por outro lado, demonstrou alta especificidade pela cadeia do fibrinogênio enquanto que a cadeia somente foi hidrolisada na presença de altas concentrações da metaloprotease. A protease foi ativa sobre o fibrinogênio em pH neutro e alcalino e inativada a 75 °C. A dependência de metal da enzima foi demonstrada pela inibição exercida por EDTA, EGTA e 1,10 fenantrolina. Verificou-se uma inibição parcial pelo ?-mercaptoetanol e PMSF, enquanto que leupeptina e aprotinina não afetaram a atividade fibrinogenolítica. A enzima foi ativada na presença de íons Ca++ e Mg++, sendo inibida por Mn++, Fe++, Zn++, Co++ e Ni++. Além disso, baixas concentrações da enzima produziram lise no coágulo de fibrina. BjussuMP-I também demonstrou inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP e atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Verificou-se que as atividades hemorrágica e proteolítica da BjussuMP-I foram neutralizadas pelo diterpenóide clerodane (Bt-CD) de Bacharis trimera. Também se observou uma inibição total do efeito hemorrágico, utilizando o extrato aquoso de Pentaclethra macroloba (EPema). A enzima foi reconhecida por anticorpos antineuwiedase, com uma reação de identidade imunológica parcial. A seqüência completa do cDNA da BjussuMP-I com 1540 pb codificou para uma proteína de 547 resíduos de aminoácidos, que conservou os domínios comuns a metaloproteases hemorrágicas de alto peso molecular da classe PIII: (i) pré-pró-peptideo, (ii) metaloprotease, (iii) disintegrina-símile e (iv) domínio rico em cisteína. / In this study the isolation, functional and structural characterization of a hemorrhagic metalloprotease, named BjussuMP-I is reported. The protein was isolated from Bothrops jararacussu snake venom by a combination of two chromatographic steps, using gel filtration on Sephacryl S-200 (0.01 M Tris-HCl, pH7.6 buffer) and Phenyl-Sepharose CL-4B chromatography (0.01 M Tris-HCl plus 4 M NaCl, pH7.6 buffer) followed by a concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. BjussuMP-I is a 60 kDa protein with a pI 5.6, which induced hemorrhage after intradermal injection in mice with a minimum hemorrhagic dose (MHD) of 4.5 g. The hemorrhagic activity of BjussuMP-I was totally abolished after incubation with a chelating agent (EDTA), corroborating the metal-dependence of this effect. BjussuMP-I shows proteolytic activity on casein, collagen and fibrinogen, although no effect on gelatin was observed. In addition, it presented a high specificity toward the -chain of fibrinogen, while the -chain was only hydrolyzed at high concentrations of the metalloprotease. The protease was active against fibrinogen in neutral and alkaline pH and was inactivated at 75°C. The metal dependence of the enzyme was confirmed through inhibition by EDTA, EGTA and 1,10 phenantroline. A partial inhibition was observed with -mercaptoetanol and PMSF, while leupeptin and aprotinin did not inhibit the fibrinogenolytic activity. The enzyme was active in the presence of Ca++ and Mg++ and it was inhibited by Mn++, Fe++, Zn++, Co++ and Ni++. In addition, low concentrations of the enzyme presented lyses in fibrin plate after 12 h of incubation. BjussuMP-I also displayed inhibitory effect on collagen- and ADP-stimulated platelet aggregation, as well as bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. It was reported that both hemorrhagic and proteolytic activities of BjussuMP-I were neutralized by the clerodane diterpenoide (Bt-CD) from Bacharis trimera. Full inhibition of hemorrhage was also observed by using aqueous extract from Pentaclethra macroloba (EPema). The enzyme was recognized by anti-neuwiedase antibodies in a reaction of partial immunologic identity. The complete cDNA sequence of BjussuMP-I with 1540 pb encoded open reading frames of 547 amino acid residues which conserved the common domains of P-III high molecular weight hemorrhagic metalloproteases: (i) pre-pro-peptide, (ii) metalloprotease, (iii) disintegrin-like and (iv) rich cysteine domain.

A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer. / DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.

Metaloproteases/desintegrinas (MD) isoladas de venenos de serpentes são potentes inibidores de agregação plaquetária e de adesão celular, processos envolvidos em doenças como trombose e câncer. As MD pertencem a classe PIII das SVMPs (´snake venom metalloproteinases´) que são constituídas por três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) e rico em cisteína (C). A função dos três domínios nas atividades das moléculas ainda não é totalmente conhecida, e estudos com o objetivo de esclarecer suas funções são importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Algumas proteínas da classe PIII apresentam elevada atividade auto-proteolítica (liberando peptídeo constituído dos domínios D e C) enquanto que em outras PIII esta atividade não é menos evidente. Neste trabalho nós estudamos MD isoladas de veneno de Bothrops jararaca (bothropasina) e Bothrops alternatus (alternagina) em relação aos seus processos de autólise. Alternagina e bothropasina apresentaram diferentes comportamentos em relação à auto-proteólise, apesar do elevado grau de identidade entre as duas moléculas. Nesse trabalho, caracterizamos a estabilidade química e o comportamento de desenovelamento da proteína alternagina nativa pela guanídina HCl usando emissão de fluorescência intrínseca em combinação com espectroscopia de dicroísmo circular ´far´-UV. As amostras de alternagina, purificadas do veneno liofilizado, foram monitoradas por dicroísmo em comprimento de onda de 220nm e os resultados mostraram estruturas intermediárias no processo de desnaturação da proteína. Estudos semelhantes foram feitos com a bothropasina, com o objetivo de relacionar seus diferentes comportamentos auto-proteolíticos com os processos de desnaturação. Nas duas proteínas ocorreu uma alta correlação entre os estudos de auto-proteolise e de desnaturação. As MD isoladas de B. jararaca, jararagina e bothropasina, são isoformas descritas na literatura como isoláveis através de diferentes cromatografias. Neste trabalho, utilizamos os diferentes protocolos descritos para verificar a porção da isoforma majoritária no veneno. As amostras de proteína serão analisadas por espectrometria de massas, uma vez que a região N-terminal das proteínas está bloqueada. / Metalloproteinases/disintegrin (MD) isolated from snake venom are potent inhibitors of platelet aggregation and cell adhesion, processes involved in illnesses as cancer and thrombosis. MD belong to the PIII class of the metalloproteinase/disintegrin gene family and they are constituted by three domains: the catalytic domain, metalloprotease; disintegrin-like (D) and cysteine-rich (R). Some MD proteins are rapidly processed (producing the disintegrin-like/ cysteine-rich domains), while others MD are processed slowly. In this work, we studied the autolysis process of the MD isolated from the venom of Bothrops jararaca (bothropasin) and Bothrops alternatus (alternagin). Despite high sequence identity, alternagin and bothropasin showed different autolysis processes. The processing of the alternagin produces an intermediate with molecular mass of 43kDa whereas in the processing of the bothropasin this intermediate is almost not observable. In this work we studied alternagin and bothropasin under the viewpoint of chemical stability and the unfolding process to guanidine hydrochloride (Gnd-HCl) using dichroism circular and fluorescence spectrometry. The CD spectra (220nm) of the alternagin purified from the lyophilized venom showed an intermediate structure in the unfolding process. These studies were performed on bothropasin with the goal to relate the autolysis and unfolding process. These studies revealed a high correlation between both proteins . The MD isolated from B. jararaca, jararagin and bothropasin, are isophorms purified from different chromatograph processes reported in the literature. In this work, different purification processes were used to check the major isophorm. Due to the blocked N-terminal region, these proteins will be assessed by mass spectrometry.

Este trabalho investiga a influência de polimorfismos na região promotora do gene das metaloproteases 1, 3 e 8 na fisiopatogenia da insuficiência primária do tendão tibial posterior. A amostra de 150 pacientes selecionados é dividida em grupo-teste: 50 pacientes com diagnóstico clínico e anatomopatológico de tendinopatia do tendão tibial posterior e grupo-controle: 100 pacientes com tendão tibial posterior íntegro. O DNA dos voluntários é obtido a partir de células epiteliais da mucosa bucal mediante a extração com acetato de amônia. As técnicas de PCR e RFLP são utilizadas para análise dos genótipos. A análise estatística dos resultados é realizada pelo teste do qui-quadrado com nível de significância de 5%. Os resultados mostram que os polimorfismos -1607 da MMP-1 e -799 da MMP-8 estão relacionados com risco maior para tendinopatia primária do tendão tibial posterior, enquanto o polimorfismo -1612 da MMP-3 parece não influenciar essa tendinopatia / The aim of this study was to investigate the influence of polymorphisms in the promoter region of the gene of metalloproteinases 1, 3 and 8 in physiopatology of primary posterior tibial tendon insufficiency. The sample of 150 selected patients was divided into test group: 50 patients undergoing surgical procedures and pathological diagnosis of degenerative lesions of the posterior tibial tendon, and control group: 100 patients with posterior tibial tendon intact and no signs of degeneration. The DNA of the volunteers was obtained from oral mucosa epithelial cells, by extraction with ammonium acetate. PCR and RFLP were used for analysis of genotypes. Statistical analysis of results was performed by Chi-squared test with significance level of 5%. The results show that polymorphisms -1607 of MMP-1 and -799 of the MMP-8 are associated with increased risk for primary tendinopathy of the posterior tibial tendon, while the -1612 polymorphism of MMP-3 does not influence this tendinopathy

A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 mostrou-se com possibilidade de aplicação em processos envolvendo queratinólise, principalmente na hidrólise de penas de frango e depilação de couro bovino. No presente trabalho avaliou-se o efeito da composição do meio sobre o crescimento e atividade proteolítica deste isolado e uma protease queratinolítica (queratinase) foi purificada e caracterizada. O microrganismo mostrou-se adaptado à utilização de queratina como substrato durante o crescimento, produziu diferentes proteases dependendo do meio utilizado e a maior atividade proteolítica foi atingida quando utilizado meio de cultivo com penas como única fonte de carbono e nitrogênio. A adição de fonte extra de nutrientes resultou em uma parcial repressão catabólica. Uma protease extracelular (Q1) foi purificada cerca de 14 vezes utilizando cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL 4B e gel filtração em Superose H12R. Q1 mostrou ser uma proteína monomérica com peso molecular de 64 KDa determinado por SDS-PAGE e pH e temperatura ótimos de 8,5 e 50°C respectivamente. O perfil de inibição indica tratar-se uma metaloprotease e as seqüências internas dos peptídeos resultantes de digestão tríptica mostraram homologia ao sítio ativo e de ligação ao Zn da família M14 (Carboxipeptidase). A atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca2+ e Mg2+ e inibida por Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ e agentes redutores. Q1 apresentou atividade queratinolítica sobre o substrato keratin azure, mas não foi capaz de hidrolisar penas de frango sugerindo a necessidade de outras enzimas durante o processo de degradação de penas. Utilizando os iniciadores degenerados desenhados com base na seqüência dos peptídeos, foi amplificado um fragmento de 470 pb correspondente a uma região do possível gene desta metaloproteína utilizando DNA e cDNA como molde. A seqüência do fragmento pode estar sendo expressa, mas não apresentou similaridade e homologia a proteínas conhecidas e portando, indicativa de uma nova metaloprotease. / The strain Chryseobacterium sp. kr6 shown to be useful for biotechnological purposes such as hydrolysis of poultry feathers and de-hairing of bovine pelts. The effect of media composition on the protease production and growth by this strain was studied and a keratinolytic protease (keratinase) was purified and characterized. The strain was adapted to use keratin as substrate to growth, produced different proteases in different media composition and the higher proteolytic activity was reached when used feather as only source of carbon and nitrogen. The addition of sources of nutrients has resulted in partially repressed catabolism. An extracellular protease Q1) was purified 14-fold by chromatography using the hydrophobic interaction Phenyl-Sepharose CL 4B column and gel filtração in Superose 12HR. SDS-PAGE indicated that the Q1 is a monomeric protein with molecular mass of 64 KDa. and optima pH and temperature were 8,5 e 50°C, respectively. The inhibition profile indicates to be a Zn-metalloprotease and analysis of tryptic peptides sequence revealed sequence homology to the conserved active site and Zn binding site, which may characterize keratinase Q1 as a member of M14 metalloprotease family (Carboxipeptidase). The activity was stimulated by of Ca2+ and Mg2+ and inhibited by Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ and reducing agents. Q1 presented keratinolytic activity under substrate keratin azure, but was unable to hydrolyze poultry feather, suggesting the requirement by other enzymes in the feather hydrolysis mechanism. Degenerate primers amplified a 470 bp, corresponding to a probable gene region of this metalloprotein, with DNA and cDNA. The sequence is being expressed but do not showed similarity and homology to known proteins, thus indicating a new metalloprotease.

A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 mostrou-se com possibilidade de aplicação em processos envolvendo queratinólise, principalmente na hidrólise de penas de frango e depilação de couro bovino. No presente trabalho avaliou-se o efeito da composição do meio sobre o crescimento e atividade proteolítica deste isolado e uma protease queratinolítica (queratinase) foi purificada e caracterizada. O microrganismo mostrou-se adaptado à utilização de queratina como substrato durante o crescimento, produziu diferentes proteases dependendo do meio utilizado e a maior atividade proteolítica foi atingida quando utilizado meio de cultivo com penas como única fonte de carbono e nitrogênio. A adição de fonte extra de nutrientes resultou em uma parcial repressão catabólica. Uma protease extracelular (Q1) foi purificada cerca de 14 vezes utilizando cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL 4B e gel filtração em Superose H12R. Q1 mostrou ser uma proteína monomérica com peso molecular de 64 KDa determinado por SDS-PAGE e pH e temperatura ótimos de 8,5 e 50°C respectivamente. O perfil de inibição indica tratar-se uma metaloprotease e as seqüências internas dos peptídeos resultantes de digestão tríptica mostraram homologia ao sítio ativo e de ligação ao Zn da família M14 (Carboxipeptidase). A atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca2+ e Mg2+ e inibida por Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ e agentes redutores. Q1 apresentou atividade queratinolítica sobre o substrato keratin azure, mas não foi capaz de hidrolisar penas de frango sugerindo a necessidade de outras enzimas durante o processo de degradação de penas. Utilizando os iniciadores degenerados desenhados com base na seqüência dos peptídeos, foi amplificado um fragmento de 470 pb correspondente a uma região do possível gene desta metaloproteína utilizando DNA e cDNA como molde. A seqüência do fragmento pode estar sendo expressa, mas não apresentou similaridade e homologia a proteínas conhecidas e portando, indicativa de uma nova metaloprotease. / The strain Chryseobacterium sp. kr6 shown to be useful for biotechnological purposes such as hydrolysis of poultry feathers and de-hairing of bovine pelts. The effect of media composition on the protease production and growth by this strain was studied and a keratinolytic protease (keratinase) was purified and characterized. The strain was adapted to use keratin as substrate to growth, produced different proteases in different media composition and the higher proteolytic activity was reached when used feather as only source of carbon and nitrogen. The addition of sources of nutrients has resulted in partially repressed catabolism. An extracellular protease Q1) was purified 14-fold by chromatography using the hydrophobic interaction Phenyl-Sepharose CL 4B column and gel filtração in Superose 12HR. SDS-PAGE indicated that the Q1 is a monomeric protein with molecular mass of 64 KDa. and optima pH and temperature were 8,5 e 50°C, respectively. The inhibition profile indicates to be a Zn-metalloprotease and analysis of tryptic peptides sequence revealed sequence homology to the conserved active site and Zn binding site, which may characterize keratinase Q1 as a member of M14 metalloprotease family (Carboxipeptidase). The activity was stimulated by of Ca2+ and Mg2+ and inhibited by Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ and reducing agents. Q1 presented keratinolytic activity under substrate keratin azure, but was unable to hydrolyze poultry feather, suggesting the requirement by other enzymes in the feather hydrolysis mechanism. Degenerate primers amplified a 470 bp, corresponding to a probable gene region of this metalloprotein, with DNA and cDNA. The sequence is being expressed but do not showed similarity and homology to known proteins, thus indicating a new metalloprotease.