Le muscle squelettique est le plus grand organe du corps humain. Il est maintenant admis que c'est un organe sécréteur de cytokines qui jouent un rôle important comme signaux paracrines et endocrines. Récemment, il a été démontré que le muscle squelettique sécrète aussi des nanovesicules appelées « exosomes ». Dans ce contexte, notre équipe a démontré que les exosomes sécrétés par les cellules musculaires avaient un effet paracrine et étaient impliqués dans la prolifération et la différenciation musculaire. Comme il est admis que la masse musculaire est affectée par différentes situations physiologiques (la nutrition et l'activité physique) ou pathologiques (obésité, le diabète et la sarcopénie), nous nous sommes demandés, dans un premier temps, quel était le rôle des exosomes dans la régulation de la masse musculaire et s'ils pouvaient modifier les dialogues muscle-organes insulino-sensibles au cours d'un régime riche en acide gras saturé. Ces travaux ont donné lieu à 2 articles publiés dans « Diabetologia ». Dans ces deux articles, nous avons démontré dans un modèle de souris que le muscle, en situation d'insulino-résistance due à un régime riche en acide gras saturé, sécrète plus d'exosomes. De plus, ces exosomes ont une composition modifiée en acides gras et en microARN. In vitro, cette nouvelle population d'exosomes affectent la prolifération des cellules receveuses i.e. ; cellules musculaires et cellules béta pancréatiques, in vitro, en régulant les gènes du cycle cellulaire et de différenciation dans les cellules musculaires receveuses et le gène pitx2 dans les cellules beta. Ces travaux suggèrent que les exosomes sécrétés par le muscle squelettique, perturbent l'homéostasie musculaire et pancréatique durant un régime riche en acide gras saturé.Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une étude technique afin de déterminer les conditions optimales pour isoler la quantité maximale des exosomes, relarguées par les cellules musculaires. Cette étude, publiée dans « BMC Biotechnology », a démontré que cultiver des cellules musculaires dans un milieu sans exosomes de sérum de veau ou de cheval, ralentie leur prolifération et par conséquent leur différenciation. Ceci suggère que les exosomes des sérums des milieux de culture participent à la croissance des cellules musculaires. De façon intéressante, ce résultat mime le cross-talk entre myoblastes et myotubes précédemment démontré au laboratoire et laisse suggérer un rôle plus général des exosomes circulant dans les processus d'hypertrophie, hyperplasie mis en place durant le développement. De plus, ces résultats indiquent que les exosomes pourraient participer aux cross-talks entre espèces / Skeletal muscle (SkM) is considered as a secretory organ, it secretes cytokines named myokines that can act either locally (autocrine) or systemically (endocrine). In addition to myokines, SkM secretes nanovesicles named exosomes (SkM-Exos). Previous work from the laboratory have demonstrated that myotube- and myoblastderived exosomes were involved in the process of myogenesis and could transfer their content to target cells. In this work, we determined whether SkM-Exos wereinvolved in lipid-induced insulin resistance and participate in organ cross-talk during the development of obesity. Firstly, we determined the effect of high fat diet on SkM-Exo release and on their miRNA and lipid composition. In addition, we determined the biological effect of these exosomes on skeletal muscle and pancreatic recipient cells. Results are published in 2 separate papers in “Diabetologia”. In these two studies, exosomes were collected from quadriceps muscles of C57Bl/6 mice fed for 16 weeks with either a standard chow diet (SD) or an SD enriched with 20% palm oil (HP) or from C2C12 cells exposed to 0.5 mmol/l palmitate (EXO-Post Palm), oleate (EXO-Post Oleate) or BSA (EXO-Post BSA). We treated skeletal muscle cells or β pancreatic cells with these muscle-released exosomes. We found that exosomes from HP fed mice, EXO-Post Palm and EXO-Post Oleate induced myoblast and β pancreatic islet proliferation and modified the expressions of genes involved in cell cycle and muscle differentiation but did not alter insulin-induced Akt phosphorylation in muscle cells. Lipidomic analyses showed that exosomes from palmitate-treated cells were enriched in palmitate, indicating that exosomes likely transfer the deleterious effect of palm oil between muscle cells by transferring lipids. Also, we demonstrated that these exosomes likely transfer their miRNA contents resulting in beta pancreatic islet hypertrophy during type 2 diabetes mellitus (T2D). Moreover, muscle exosomes were incorporated into various tissues in vivo, including the pancreas and liver, suggesting that SkM could transfer specific signals through the exosomal route to key metabolic tissues in vivo. So, SkM derived exosomes altered muscle and β pancreatic cell homeostasis during lipid induced insulin resistant diet. Secondly, another work was conducted in order to answer to a technical problem about optimal conditions needed to obtain, in vitro, the highest concentration of exosomes from muscle cells when grown in a depleted-exosome medium. This work was published in “BMC Biotechnology”. In this study, we found that depleting culture media from exosomes affected skeletal muscle cell proliferation. In addition, removal of serum-EVs from culture medium affects gene and miRNA expressions and likely the proteome of the cells. Interestingly, our data showed that we can recapitulate the cross-talk between myoblast and myotubes previously demonstrated in the laboratory by using exosomes from serum as well. Indeed, serum derived-exosomes, like myotube derived-exosomes, can affect proliferation of myoblasts and induce their entrance in the differentiation process. This result implies that bovine exosomes can transfer specific signals to cells from unrelated species (i.e. ; to mice, rats and human) and thus that part of exosome composition is evolutionarily conserved between these lower and higher order mammalian species. Generally speaking, these results suggest that exosomes in body fluids could have an unsuspected function during embryogenesis and in the regulation of cellular adaptations that lead to hypertrophy, hyperplasia and metaplasia

L'hyperchylomicronémie est une maladie rare et complexe impliquant plusieurs gènes qui sont eux-mêmes fortement régulés par plusieurs mécanismes et dont les voies métaboliques sont étroitement dépendantes de facteurs environnementaux. La survenue de la pathologie due à la présence de variants ou d'une association de variants sur ces gènes n'est pas toujours clairement définie. Ce qui suggère l'intervention d'autres mécanismes mal élucidés dans le développement des hyperchylomicronémies et la régulation du métabolisme des triglycérides. Nous avons essayé d'appréhender certains mécanismes causals dans la survenue de l hyperchylomicronémie en lien avec la présence de variants sur les gènes régulateurs APOC3 et LMF1 du métabolisme des triglycérides. Le gène APOC3 présente le variant SstI (rs5128) en région 3' non codante associée significativement à l'hypertriglycéridémie dans notre cohorte, nous avons cherché à caractériser sa régulation post-transcriptionnelle éventuelle par des microARN hépatiques ou intestinaux. Nos résultats ne confirment pas l'hypothèse d'une régulation du variant SstI du gène APOC3 par un microARN hépatique ou intestinal ciblant directement l'extrémité 3'UTR du gène APOC3. Le gène LMF1, nouveau gène candidat pour étudier les mécanismes des hyperchylomicronémies, est encore peu investigué. Nous avons mis en place son diagnostic génétique au sein du laboratoire ainsi qu'une technique in vitro permettant d'évaluer l'impact de la présence de certains variants codants de LMF1 sur l'activité post héparinique de la lipoprotéine lipase (LPL) par mesure de la lipolyse des triglycérides des VLDL. Nous avons mis en évidence des activités LPL significativement diminuées suggérant une dysfonction de LMF1 en présence des variants p.Gly172Arg (rs201406396), p.Arg354Trp (rs143076454), p.Arg364Gln (rs35168378), et des deux variants non-sens déjà décrits p.Tyr439Ter (rs121909397) et p.Trp464Ter (rs587777626). Ces travaux permettent de confirmer l'effet fonctionnel des variants LMF1 sur la régulation de la sécrétion de la LPL. Nous avons également retrouvé dans notre cohorte de 385 patients 18 variants sur la région 3' non codante du gène LMF1. Pour les trois variants : c*231C>A (rs75476513), c*512G>A (rs117039680), et c*530G>A (rs139657279), les résultats in vitro suggèrent une régulation post transcriptionnelle par les microARN. Ce qui pourrait ainsi expliquer le mécanisme de l'association de ces variants non traduits à l'hypertriglycéridémie. Ainsi, des interrelations des multiples gènes impliqués dans le métabolisme des triglycérides et leurs régulations à plusieurs niveaux simultanés modulent le phénotype d'hyperchylomicronémie. Il est nécessaire d'étudier tous les mécanismes complexes impliqués dans la régulation de la triglycéridémie afin de mieux appréhender la physiopathologie et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques / Hyperchylomicronemia is a rare and complex disease involving several genes which are themselves highly regulated by several mechanisms and whose metabolic pathways are closely dependent on environmental factors. The occurrence of this disease due to the presence of variants or a combination of variants on these genes is not always clearly defined. This suggests the intervention of other ill-defined mechanisms in the development of hyperchylomicronemia and the regulation of triglyceride metabolism. We have tried to understand certain causal mechanisms in the occurrence of hyperchylomicronemia in relation to the presence of variants on the APOC3 and LMF1 known regulatory genes of triglyceride metabolism. APOC3 gene carries the SstI variant (rs5128) in the 3' untranslated region significantly associated with hypertriglyceridemia in our cohort. We sought to characterize its possible post-transcriptional regulation by hepatic or intestinal microRNA. Our results obtained in vitro do not support the hypothesis of a regulation of the SstI variant of the APOC3 gene by a hepatic or intestinal microRNA directly targeting the 3'UTR of APOC3 gene. LMF1 gene, a new candidate gene for studying the mechanisms of hyperchylomicronaemias, is still under investigation. We have established its genetic diagnosis in the laboratory and set up an in vitro method to evaluate the impact of LMF1 coding variants by measuring the release of post-heparin lipoprotein lipase (LPL) activity. We found decreased LPL activities suggesting a LMF1 dysfunction in the presence of variants p.Gly172Arg (rs201406396), p.Arg354Trp (rs143076454), p.Arg364Gln (rs35168378), and the two nonsense variants already described p.Tyr439Ter (rs121909397) and p.Trp464Ter (rs587777626). This study confirms the functional effect of LMF1 variants on the regulation of LPL secretion. In addition, we found 18 variants on the 3' untranslated region of LMF1 gene. For three variants : c*231C>A (rs75476513), c*512G>A (rs117039680), and c*530G>A (rs139657279), in vitro results suggest a post-transcriptional regulation by microRNA. These findings are an involvement of these untranslated variants in the occurrence of hypertriglyceridemia.Thus, complex interrelations of multiple genes involved in triglyceride metabolism and their simultaneous multi-level regulation modulate the phenotype of hyperchylomicronemic patients. It is necessary to study all the complex mechanisms involved in the regulation of triglyceridemia in order to better understand pathophysiology of hyperchylomicronemia and to develop new therapeutic targets

Le cancer du sein est marqué par une grande hétérogénéité. C´est une maladie complexe, fortement influencée par l´environnement pourtant, elle dépend aussi d´une accumulation de mutations génétiques associées à la dérégulation épigénétique des voies clés. Les altérations présentes dans le profil d´expression génique observées dans la tumeur, peuvent être le résultat de mécanismes de régulation des gènes à différent niveaux, comme des modifications post-transcriptionnelles menées par le mécanisme d´ARN d´interférence sous forme de microARN (miARN). Ce mécanisme peut conduire au début et développement du cancer aussi bien qu’à la résistance aux thérapies. Les miARN font partie d’une classe d´ARN non-codants qui ont émergé ces dernières années comme l'un des principaux régulateurs de l'expression des gènes par sa capacité à réguler négativement l'activité des ARN messagers (ARNm). L´importance de cette régulation a été observée par la présence de ce type de contrôle dans plusieurs processus biologiques, parmi eux, des voies liées à la prolifération, différentiation et apoptose. Afin de mieux comprendre les mécanismes d’initiation et progression tumorale dans le cancer du sein, nous avons fait une analyse globale de l´expression des miARN, par la technique de microarray, dans la série de lignées cellulaires 21T. Cette série est un modèle in vitro de la progression tumorale, comprenant la lignée 16N, obtenue à partir de l’épithélium normal infecté par des virus HPV-16, les lignées 21PT et 21NT, qui correspondent au carcinome in situ et les lignées 21MT1 et 21MT2 obtenues à partir d´une effusion pleurale métastatique à l’endroit de la métastase. Etant donné que les miARN jouent un rôle dans la régulation de l´apoptose et d´autres mécanismes de réponse aux dommages fait à l´ADN et que l´irradiation dans des formes différentes est couramment utilisée comme outil diagnostique, par exemple dans des mammographies, nous avons évalué l´expression de miARN après avoir soumis les cellules à des irradiations de haute et basse énergie, et au traitement avec de la doxorubicine. Les tests ont été faits sur les lignées non tumorales (MCF-10A et HB-2) et sur les lignées tumorales (MCF-7 et T-47D). On a pu observer que le rayon X de basse énergie est capable de causer des cassures double brin à l´ADN et de conduire les cellules à l´apoptose. Une légère altération dans les profils d´expression des miARN impliqués dans cette voie, comme let-7a, miR-34a et miR-29b, a aussi été remarquée. En ce qui concerne la réponse aux dommages fait à l´ADN, une upregulation dans l´expression de miR-29b, qui sous des conditions physiologiques normales est régulée négativement, a été observée après les traitements. Le microARNome de la série 21 montre une importante sous-expression de miR-205, un enrichissement du facteur pro-métastatique ZEB-1 et une réduction conséquente dans les niveaux d’e-cadherine, observée par western blot, seulement dans les lignées métastatiques (21MT). L´ensemble des résultats, suggèrent que miR-29b peut être un bio-marqueur potentiel du stress génotoxique et que miR-205 peut participer du processus de transition épithélium-mésenchyme et, en outre, quand il est sous-exprimé, peut augmenter le potentiel métastatique des cellules de la série 21T. / Breast tumors are characterized by their high heterogeneity. Breast cancer is a complex disease, which has its development strongly influenced by environmental factors, combined with a progressive accumulation of genetic mutations and epigenetic dysregulation of critical pathways. Changes in gene expression patterns may be a result of a deregulation in epigenetic events as well as in post-transcriptional regulation driven by RNA interference endogenously represented by microRNA (miRNA). These mechanisms are capable to promote the initiation, maintenance and progression of carcinogenesis and are also implicated on the development of therapy resistance. miRNAs form a class of non-coding RNAs, which have emerged in recent years as one of the major regulators of gene expression through its capacity to silence messenger RNAs (mRNAs) containing a partially complementary sequence. The importance of regulation mediated by miRNAs was observed on their ability to regulate a wide range of biological processes, including cell proliferation, differentiation and apoptosis.To gain insights into the mechanisms involved in breast cancer initiation and progression we conducted a miRNA global expression on 21T series that are an in vitro model of breast cancer progression, comprising cell lines derived from the same patient, which include a normal epithelia (16N), primary in situ ductal carcinoma (21PT and 21NT) and cells derived from pleural effusion of lung metastasis (21MT-1 and 21MT-2). Considering the importance of miRNAs in the regulation of apoptosis, and that irradiation in different spectra is commonly used in diagnostic procedures, as mammography and on radiotherapy, we evaluated the miRNA expression after cell low and high energy irradiation and doxorubicin treatment to determine whether miRNAs are useful biomarkers to detect cell response after DNA damage. The experiments were done on the non-tumoral cell lines MCF-10A and HB-2 and on the breast carcinoma derived cell lines MCF-7 and T-47D. We observed that low energy X-rays is able to promote DNA strand breaks and apoptosis and to slightly change the expression of miRNAs involved on this pathway, such as let-7a, miR-34a and miR-29b. Regarding DNA stress response pathways, an upregulation on miR-29b expression, that in normal conditions is downregulated in tumor cell lines could be observed after all treatments. The microRNAome of 21T series revealed a significant downregulation of miR-205, an enrichment of the pro-metastatic factor ZEB-1, potential target for miR-205 and the consequent reduction of e-cadherin levels in 21MT cells checked by western blot. Our results indicate that miR-29b is a possible biomarker of genotoxic stress and that miR-205 can participate on the metastatic potential of 21T cells.

A la suite d’un criblage pangénomique, nous avons montré que l’inhibition d’un miARN de la famille let-7, miR-98, entraîne une forte accélération de la différenciation musculaire avec hypertrophie des myotubes. Lors de ma thèse, j’ai cherché à comprendre comment miR-98 retarde la différenciation du muscle strié squelettique. Des analyses transcriptomiques dans des myoblastes où ce miARN a été inhibé ont montré la perturbation de l’expression d’environ 240 gènes. Parmi eux, j’ai montré que le répresseur transcriptionnel E2F5 est important pour la régulation de la différenciation musculaire via miR-98, et est directement ciblé par ce miARN. L’inhibition de E2F5 permet de rétablir un niveau de différenciation normal malgré l’inhibition de miR-98. E2F5 est un régulateur important du cycle cellulaire. Sa fonction dans le muscle n’avait pas encore été explorée. Mes résultats montrent que E2F5 accélère le processus de différenciation musculaire. J’ai ensuite montré que E2F5 peut réguler directement des gènes répresseurs de la différenciation musculaire, comme ID1 et HMOX1, et indirectement des répresseurs de la voie TGF-β, expliquant son action sur la différenciation. Au final, miR-98 régule la différenciation du muscle strié squelettique en agissant directement sur l’expression de E2F5, et indirectement sur ses multiples cibles. Mes résultats ont ainsi mis en évidence une nouvelle voie de régulation de la différenciation musculaire : la voie let-7 – E2F5. / A genome-wide screen had previously shown that knocking-down miR-98, a miRNA of let-7 family, leads to a dramatic increase of terminal myogenic differentiation, with myotube hypertrophy. My PhD project aimed to understand how miR-98 delays skeletal muscle differentiation. Transcriptomic analysis of human myoblasts with knocked-down miR-98 revealed that approximately 240 genes were sensitive to miR-98 depletion. Among these potential targets, I have identified the transcriptional repressor E2F5, which turned out to be important for miR-98 regulation of muscle differentiation. Knocking down E2F5 and miR-98 simultaneously had almost fully restored normal differentiation. I have subsequently shown that E2F5, an important cell cycle regulator, is a direct target of miR-98 in muscle, where its function had never been investigated before. My results show that E2F5 is a positive regulator of the muscle differentiation process. E2F5 can directly repress inhibitors of muscle differentiation, such as ID1 and HMOX1, and indirectly regulate TGF-β pathway family members. In conclusion, miR-98 regulates skeletal muscle differentiation by directly regulating E2F5 expression, and thus controlling the expression of multiple E2F5 targets. My results have highlighted a new regulatory pathway of muscle differentiation: the let-7 – E2F5 pathway.

Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique. Un diagnostic précoce améliore les chances de survie. Le diagnostic repose essentiellement sur les examens d’imagerie comme l’échographie, la tomodensitométrie et l’IRM. Ces examens sont parfois associés à la biopsie et sont couteux et parfois invasifs. De plus, l’imagerie n’est pas capable de faire la distinction entre les tumeurs bénignes et les tumeurs malignes et entre les sous-types histologiques de carcinome à cellules claires qui est le plus fréquent. Il n’existe pas dans le cancer rénal de marqueur comme la PSA dans le cancer de la prostate ou la Foetoprotéine et l’HCG dans le cancer du testicule. Le but de cette étude est concentré sur la recherche des marqueurs mARNs ou miARNs dans les liquides biologiques (sérum, plasma, urine) pour le cancer du rein à cellules claires. Nous avons montré que les petits ARNs dans le sérum et les urines et l’intégrité des ARNs dans les urines étaient des outils diagnostiques dans le cancer du rein à cellules claires. Si ces petits ARNs circulants sont validés, on peut éventuellement imaginer l’intérêt pratique en clinique comme la détection des petits ARNs circulants dans l’urine pour prédire le cancer, la classification de la tumeur pour aider le clinicien, la prédiction d’une récidive ou d’une progression soit après néphrectomie soit au cours d’un traitement médical / Kidney cancer is a major public health problem. Early diagnosis improves the chances of survival. The diagnosis is mainly based on the imaging tests such as ultrasound, CT and MRI. These tests are sometimes associated with biopsy and are expensive and sometimes invasive. In addition, the imaging test is not able to distinguish between benign and malignant tumors and between histological subtypes of renal cell carcinoma. There don’t exist tumor marker in renal cancer such as PSA in prostate cancer or Fetoprotein and HCG in testicular cancer. For this purpose, the study has focused on finding markers mRNAs and miRNAs in biological fluids (serum, plasma, urine) for clear cell renal cell carcinoma. We have shown that the small cell-free RNAs in serum and urine and the integrity of cell-free RNA in urine were diagnostic tools for clear cell renal cell carcinoma. If these circulating small RNAs are validated, we can possibly imagine the interest in clinical practice as the detection of circulating small RNAs in urine to predict cancer, the classification of the tumor to help the clinician, the prediction of recurrence and progression after nephrectomy or during medical treatment

L’efficacité des traitements contre diverses pathologies dépend dans bien des cas de la précocité de la prise en charge des patients. Ce contexte pousse de nos jours les chercheurs à élaborer de nouvelles méthodes de diagnostic, généralement basées sur la détection de biomarqueurs spécifiques, permettant d’établir une corrélation entre un dérèglement moléculaire de l’organisme et la survenue d’une maladie. L’objectif de ces travaux était, par l’utilisation de la microfluidique digitale en gouttelettes, d’établir de nouvelles procédures simples et reproductibles, témoignant d’une sensibilité importante afin de déterminer d’infimes variations de l’état moléculaire de l’organisme à travers la recherche de biomarqueurs spécifiques. Pour cela nous avons élaboré une nouvelle gamme de tensioactifs fluorées adaptés aux applications biologiques en microfluidique digitale, ainsi que différentes stratégies d’étude des variations de l’expression de microARN extrait d’échantillons biologiques, basées respectivement sur les réactions induites par hybridation nucléotidique et sur la réaction de RT-PCR digitale. / Efficiency of treatments for various diseases depends in many cases in precocity of patient management. Nowadays, this context urges researchers to develop new methods of diagnosis, generally based on the detection of specific biomarkers. These new methods allowing to establish correlations between physiological disorders and arisen of diseases states.The aim of this study was, by the use of droplet-based microfluidic, to work out a simple and reproducible procedure, with an increased sensitivity, to determine tiny variations of physiological state through the detection of specific biomarkers. Thus, we developed a new range of fluorinated surfactants fitted to biological applications in droplet-based microfluidics as well as various strategies to study variations of microRNA expressions in a biological sample. These methods, based on DNA-template reaction and digital PCR reaction, allows performing a substantial number of simultaneous reactions in micro-compartments (microdroplets) of picolitre volumes.

Les lymphomes anaplasiques à grandes cellules (LAGC) sont des lymphomes non-hodgkiniens dits de type T ou nul, représentant la majorité des lymphomes T pédiatriques (20 à 30%). Dans plus de 80% des cas, une translocation chromosomique réciproque aboutissant à l'expression anormale de protéines chimères de type X-ALK qui arborent constitutivement et de manière anormale l'activité tyrosine-kinase ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) est le moteur de la tumorigenèse (LAGC dits "ALK+ "). L'une des particularités de ces lymphomes, mise en évidence par mon équipe, est le fait que B-Cell Lymphoma-2 (BCL-2) demeure indétectable dans les cas ALK+ contrairement aux cas ALK-. Ce point est d'autant plus surprenant que BCL-2, oncogène largement établi comme prototype de protéines anti-apoptotiques ainsi que régulateur clé de l'autophagie, est fortement surexprimé dans la majorité des lymphomes. A l'inverse, Human Antigen R (HuR) est surexprimée dans les LAGC (comme dans la plupart des cancers). Il a été démontré que cette protéine de liaison aux ARN participait au maintien du phénotype tumoral, et que sa localisation subcellulaire et ses fonctions dépendaient étroitement de son statut de phosphorylation, lequel est régulé par ALK dans les LAGC ALK+. Au niveau du cytoplasme, HuR permet de stabiliser et d'augmenter la traduction d'ARNm possédant, dans leur région 3'-UTR, des séquences riches en adénine et uridine (AU-rich elements, "ARE"). De manière plus générale, HuR a la capacité de dialoguer avec les microARNs (miARN), soit en empêchant leur action par compétition, soit à l'inverse en coopérant avec ces derniers et en promouvant ainsi leur fonction de régulateur négatif sur certains transcrits cibles communs. Le transcrit Bcl-2, dont l'expression est réprimée dans les LAGC ALK+, fait partie des cibles potentielles de HuR. Au cours de ma thèse, j'ai ainsi cherché à comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la répression de l'expression de Bcl-2, en me focalisant sur le rôle de HuR et de miARN "partenaires" dans ce processus. Mes données semblent indiquer que ce mécanisme implique le recrutement par HuR du miR-34a sur l'ARNm Bcl-2, conduisant à la mise en silence de ce dernier. A l'inverse, quand l'activité tyrosine- kinase de ALK est inhibée, l'interaction entre HuR et le transcrit Bcl-2 diminue, ce qui limite le recrutement de miR-34a et conduit à une restauration de l'expression de cette oncogène majeur dans les cellules lymphomateuses. Dans le contexte des essais cliniques d'inhibiteurs ciblant l'activité tyrosine kinase de ALK tels que le Crizotinib, la question de cette ré-expression de BCL-2 éclaire d'une lumière nouvelle certains échecs thérapeutiques subis par cette molécule pourtant prometteuse. Je me suis donc également consacré, pendant ma thèse, à l'étude des conséquences de cette ré-expression de BCL-2 sur les LAGC ALK+ traités par le Crizotinib. Les résultats que j'ai obtenus in vitro et in vivo montrent que contrecarrer, par interférence à l'ARN, l'élévation du taux de BCL-2 consécutive au traitement par le Crizotinib, permet de potentialiser les effets de la drogue : cela se traduit en particulier par une potentialisation de la mort par apoptose induite par le traitement mais aussi, de manière fascinante, par une conversion de la réponse autophagique initialement cytoprotectrice et pro-tumorale en une autophagie incontrôlée et délétère, qui participe alors à l'effet thérapeutique accru de la drogue. De manière globale, ce travail permet d'envisager de nouvelles combinaisons et alternatives thérapeutiques pour les patients souffrants de LAGC ALK+, et illustre la complexité des régulations croisées entre processus apoptotiques et autophagiques. / Anaplastic large cell lymphoma (ALCL) are T/-null non-hodgkin lymphoma representing most of childhood T-cell lymphoma (up to 30%). More than 80% of cases bear reciprocal chromosomic translocation responsible for abnormal expression and constitutive activation of X-ALK type (Anaplastic Lymphoma Kinase) chimeric proteins (ALK+ ALCL). A striking characteristic of this lymphoma is that B-Cell Lymphoma-2 (BCL-2) remains undetectable in ALK+ cases compared to ALK- cases. This is all the more surprising as the BCL-2 oncogene, which is firmly established as a prototypic anti-apoptotic factor as well as a key autophagy regulator, has been shown to be overexpressed in a majority of lymphomas. On the other hand, the RNA-binding protein HuR (Human Antigen R) is overexpressed in ALCL (as in most cancers). It has been demonstrated that this protein was involved in the sustainability of the tumoral phenotype, and that its subcellular localization and functions were closely related to its phosphorylation status, which in turn heavily depends on ALK activity in ALK+ ALCL. In the cytoplasm, HuR has the ability to bind adenine and uridine-rich elements (ARE) located on the 3'-UTR of target mRNAs, and both protect them from degradation and increase their translation. From a general point of view, HuR is able to establish an interplay with microRNAs (miRNAs), either blocking them through competition, or actually cooperating with them and thus promote their function of negative regulators of gene expression on common target transcripts. The BCL-2 transcript, which expression seems to be silenced in ALK-expressing ALCL, has been described as a potential target of HuR. During my PhD work, I dedicated myself to understand the molecular mechanism at work in the silencing of BCL-2 expression with a focus on HuR and collaborating miRNA. The data I obtained point at a cooperation between HuR and miR-34a leading to the silencing of the BCL-2 transcript. However, when the ALK tyrosine kinase activity is inhibited, it appears the interaction between the BCL-2 mRNA diminishes, which limitates the miR-34a 's access to this transcript and ultimately results in a re-expression of the BCL-2 oncogene in these lymphoma cells. In the current context of clinical trials for ALK-targeting inhibitors, such as the Crizotinib, this BCL-2 re-expression observed upon ALK inhibition shed light on potential reasons behind some therapeutic failures that have recently been reported. Indeed, during my PhD work, I also studied the consequences of the BCL-2 re-expression observed in Crizotinib-treated cells. The data I obtained in vitro and in vivo show that, by blocking this re-expression using RNA interference, the Crizotinib anti-tumoral efficiency can be greatly potentiated. This potentiation took the form of an increase of apoptotic cell death induction and, interestingly, also affected the autophagic response triggered by the drug, making it switch from a cytoprotective- type, protumoral autophagic flux to an enhanced, deletary-type and tumor suppressive flux, adding to the therapeutic effect of the drug. This work in general provides insights for new therapeutic combinations that could potentially benefit to ALK+ ALCL patients, and illustrates the complex cross-regulations between apoptotic and autophagic pathway.

Introduction. Alors qu’elle constitue le seul traitement curatif du cholangiocarcinome intrahépatique (CCIH), la résection reste associée à un taux de récidive supérieur à 60% et un taux de survie réelle à 5 ans inférieur à 20%. Une estimation fiable du pronostic ainsi qu’une meilleure compréhension de la biologie tumorale est essentielle pour améliorer le pronostic.Méthodes. A l’appui des données clinico-biologiques de deux larges cohortes de patients avec CCIH réséqué (MSKCC, n=189 et AFC, n=522), trois objectifs ont été explorés. Tout d’abord, définir quel modèle pronostique publié est le plus performant. Ensuite, définir la fiabilité de l’évaluation pronostique préopératoire à partir de, respectivement, l’imagerie, des microARN (miR) circulants diagnostiques et du profil génomique tumoral. Enfin, évaluer l’impact pronostique de la survenue d’événements périopératoires tels que transfusion et morbidité.Résultats. Premièrement, les nomogrammes apportaient une meilleure estimation pronostique en comparaison à la classification AJCC 7ème édition. Deuxièmement, la taille et la multifocalité tumorale sur l’imagerie préopératoire permettaient de différencier deux groupes de patients de pronostic clairement distincts (p<0,001). L’existence d’une mutation d’un gène de remodelage de la chromatine (BAP1, ARID1A, PBRM1) tendait à être associé à une survie sans récidive plus favorable qu’en l’absence de mutation (p=0,09). Alors qu’ayant un potentiel comme marqueur diagnostique circulant, miR21 et miR221 n’étaient pas associé à la survie. Troisièmement, la transfusion peropératoire n’impactait pas la survie à long terme alors que la survenue d’une complication sévère (grade Dindo-Clavien > 2) était indépendamment associée à une survie globale plus courte (p=0,002).Conclusion. Alors que les nomogrammes postopératoires apportent une meilleure estimation pronostique, le développement de modèles pronostiques préopératoires est faisable notamment à partir de l’imagerie et de marqueurs biologiques tumoraux complémentaires. / Introduction. Complete resection stands as the only curative option for intrahepatic cholangiocarcinoma (IHCC). Still, prognosis remains poor after resection due to a recurrence rate over 60% leading to actual 5-year survival rates below 20%. Reliable prognostic estimation and better understanding of tumor biology would be of interest for improving IHCC prognosis.Methods. Using clinical and biological data from two large cohort of resected IHCC (MSKCC, n=189 and AFC, n=522), three objectives have been explored. First, assessing the performances of different published prognostic models. Second, defining the reliability of preoperative prognostic estimation using imaging, tumoral genomic profiling and circulating tumoral microRNA (miR). Third, evaluating the prognostic impact of perioperative events such as blood transfusion and morbidity.Results. First, nomograms displayed better prognostic accuracy over the AJCC 7th edition staging system. Second, tumor size and multifocality on preoperative imaging allowed patient stratification in groups statistically different regarding prognosis (p<0.001). Further, the presence of chromatine remodeling gene mutations (BAP1, ARID1A, PBRM1) tended towards longer recurrence-free survical (p=0,09). Some diagnostic circulating miR such as miR21 and miR221 were not associated with survival. Third, in contrast with intraoperative transfusion, the occurrence of severe morbidity (Dindo-Clavien grade > 2) was independently associated with shorter overall survival (p=0.002).Conclusion. Nomograms outperform conventional staging sytem. Preoperative prognostic estimation is feasible and reliable using imaging. Identifying new prognostic biomarkers would help refining preoperative prognostic estimation.

Les virus à ARN sont à l’origine de nombreuses épidémies depuis ces dernières décennies. Malgré des avancées thérapeutiques majeures, une majorité d’infection est orpheline de traitement. Le développement d’antiviraux à spectre large est une alternative thérapeutique pour maximiser le nombre de virus ciblés, minimiser les coûts de production et améliorer la prise pour les patients. Afin de trouver de nouvelles cibles cellulaires, la compréhension des mécanismes moléculaires utilisés par les virus pour infecter l’hôte est essentielle.Les virus utilisent des facteurs cellulaires pour survivre et se propager. Parmi ceux-ci, on trouve les microARNs (miARNs) et les longs ARNs non-codants (lncARNs) qui peuvent participer à la réponse antivirale mais peuvent également être détournés par les virus pour favoriser l’infection. Ces d’ARN non-codants peuvent interagir avec des protéines cellulaires (« RNA-binding protein » (RBP)) telles que la protéine KSRP. Cette RBP est impliquée dans le contrôle de l’expression des ARNs en participant à l’épissage de certains pré-ARNm, à la dégradation des ARNs contenant des séquences riches en AU et à la maturation de certains miARNs. Ses fonctions et sa localisation sont dépendantes de la phosphorylation de certains résidus par les kinases cellulaires Akt, ATM et p38/MAPK.Le but de ma thèse a été d’étudier la modulation de l’expression de ces deux classes d’ARN non-codants au cours de l’infection par des virus à ARN tels que le virus de l’Hépatite C (VHC) et la souche HCoV-229E des Coronavirus. Plus particulièrement nous avons cherché à étudier l’implication de KSRP dans la régulation d’ARN non-codants essentiels pour ces infections.Mes recherches ont commencé par l’étude de la maturation du microARN-122 (miR-122), un facteur proviral de l’infection par le VHC. Nous avons montré que KSRP phosphorylée sur le résidu S193 par Akt interagissait avec le complexe nucléaire DROSHA/DGCR8 et ainsi était essentielle à la maturation du pri-miR-122 en miR-122 favorisant la réplication virale. Notre avons ensuite étudié le rôle des phosphorylations de KSRP par ATM et p38/MAPK sur la réplication et sur la maturation du miR-122. La phosphorylation par ATM ne semble pas jouer un rôle majeur sur ces deux paramètres. En revanche, la phosphorylation de KSRP sur le résidu T692 par la kinase p38/MAPK semble jouer un rôle positif sur la réplication VHC.Dans un second temps, par homologie avec les résultats obtenus dans le cas du VHC, nous avons étudié le rôle de KSRP lors de l’infection par la souche HCoV-229E des Coronavirus. En transfectant un siKSRP ou un plasmide exprimant la protéine KSRP, nous avons pu démontrer que KSRP était un facteur proviral pour la réplication virale.Afin d’identifier les ARN non-codants modulés au cours de l’infection HcoV-229E et dont l’expression pouvait être régulée par KSRP, nous avons effectué deux analyses de séquençage à haut débit (« NGS »). L’analyse réalisée sur des cellules infectées vs non-infectées nous a permis d’identifier l’ensemble des miARNs et lncARNs dérégulés par le virus. Nous avons croisé ces résultats avec un second « NGS » fait sur des cellules infectées, inhibées pour KSRP et nous avons trouvé que l’expression du LinC00473 était modulée dans les deux conditions expérimentales. En étudiant ce facteur cellulaire au cours de l’infection nous avons observé une forte induction KSRP-dépendante du LinC00473 à 24 h post-infection, puis une diminution à 48 h post-infection. L’inhibition de ce facteur entraîne une diminution de la réplication virale suggérant que le LinC00473 est un facteur proviral au début de l’infection.Nos résultats ont permis de montrer le rôle proviral de la protéine KSRP lors de deux infections virales (VHC et HCoV-229E des Coronavirus). Son implication dans la régulation de l’expression des ARNs fait de cette protéine un outil efficace pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques ARN non-codants au cours d’autres infections virales. / Résumé en anglaisRNA viruses have been the cause of many epidemics in recent decades. Despite major therapeutic advances, a majority of infection is currently orphan for treatment. The development of new broad spectrum antivirals is a therapeutic alternative to maximize the number of targeted viruses, minimize production costs and improve access to population. In order to find new cellular targets for this type of therapeutic approach, understanding the molecular mechanisms used by RNA viruses to infect the host is essential.Viruses exploit cellular factors to survive and to disseminate. Among those factors, microRNA (miRNA) and long non-coding RNA (lnCRNA) can participate to cellular antiviral response but can also be hijacked by the virus to improve the infection. These two families of non-coding RNA could interact with cellular RNA-binding protein (RBP) such as KSRP. This ubiquitous protein is involved in RNA expression control via its participation to pre-mRNA splicing, decay of AU-rich element mRNA and maturation of microRNAs. The functions and localization of KSRP are dependent of post- modification by the cellular kinases Akt, ATM and p38/MAPK.The aim of my thesis was to study the modulation of the expression of these two classes of non-coding RNA during infection by RNA viruses such as the hepatitis C virus (HCV) and the HCoV-229E strain of the Coronaviruses. More specifically, we evaluated the involvement of KSRP in the regulation of non-coding RNAs essential for these infections.My research project began with the study of microRNA-122 (miR-122) the maturation. This miRNA is a proviral factor for HCV infection. We have shown that the Akt-dependent phosphorylation of S193-KSRP promoted the interaction of pri-miR-122 with the DROSHA / DGCR8 nuclear complex and thus was essential for the maturation of miR-122, finally promoting viral replication. We then investigated the role of KSRP phosphorylation by ATM and p38 / MAPK on viral replication and on miR-122 maturation. ATM phosphorylation does not seem to play a major role in these two parameters. In contrast, phosphorylation of KSRP on the T692 residue by p38 / MAPK kinase appears to play a positive role on viral replication.In a second step, by homology with the results obtained in the case of the HCV infection, we studied the role of KSRP during the infection with the HCoV-229E strain of Coronaviruses. After siKSRP transfection or exogenous expression of the KSRP protein, we were able to demonstrate that KSRP was a proviral cellular factor for HCoV-229E replication.In order to characterize the modulation of non-coding RNAs expression during HcoV-229E infection and to identify the non-coding RNAs whose expression could be regulated by KSRP, we performed two high-throughput sequencing ("NGS") assays. The analysis performed on infected and non-infected cells allowed us to identify all the miRNAs and lncRNAs whose expression was altered by the virus. We cross-examined these results with a second "NGS" performed on HCoV-229E infected cells inhibited for KSRP. We found that the expression of an InCARN (LinC00473) was modulated under both experimental conditions. We demonstrated a strong KSRP-dependent induction of LinC00473 expression at 24 h post-infection, then a decrease at 48 h post-infection. Inhibition of this factor results in decreased viral replication suggesting that LinC00473 is a proviral cell factor at the onset of infection.Our results have shown the proviral role of the KSRP protein during two viral infections (HCV and HCoV-229E of the coronaviruses). Its involvement in the regulation of RNA expression makes of KSRP an effective tool for discovering new non-coding RNA therapeutic targets for other viral infections

Les astrocytes sont des cellules gliales jouant un rôle primordial dans le fonctionnement cérébral. Ils remplissent de nombreuses fonctions allant de la régulation de l'homéostasie ionique, à la modulation de la transmission synaptique en passant par la régulation du métabolisme énergétique. Les transporteurs astrocytaires au glutamate GLAST et GLT-1 tiennent un rôle particulièrement important dans ces fonctions astrocytaires. La recapture du glutamate libéré dans la synapse module la neurotransmission et évite la stimulation excessive des récepteurs glutamatergiques qui peut induire des phénomènes d'excitotoxicité provoquant la mort des neurones. Le couplage neurométabolique entre astrocytes et neurones repose également sur l'activité de ces transporteurs. De nombreuses données indiquent que des déficits des transporteurs au glutamate sont impliqués dans la plupart des maladies neurodégénératives. Les astrocytes et les transporteurs au glutamate représentent ainsi de potentielles cibles thérapeutiques dans le cadre des maladies neurodégénératives. L'étude de ces interactions neurones-astrocytes, en particulier sur des modèles in vivo, nécessite des outils particuliers permettant de disséquer le rôle de chaque type cellulaire. Cependant, il existe peu d'outils spécifiques et efficaces pour cibler les astrocytes in vivo. Notre objectif a été de développer un nouveau vecteur viral permettant une transduction spécifique des astrocytes in vivo, avec une efficacité importante et pouvant être utilisé dans l'ensemble du cerveau avec de nombreux transgènes. Au cours de ce travail nous avons développé trois voies de recherche. Ainsi, nous avons modifié l'enveloppe du vecteur et tester trois glycoprotéines d'enveloppe, VSV, Mokola et Rabies. Nous avons également utilisé trois promoteurs différents, PGK, CMV et EAAT1 afin de moduler l'expression du transgène dans les astrocytes. Et enfin, nous avons développé une nouvelle méthode de régulation post-transcriptionnelle utilisant les microARN. Nos résultats permettent de conclure qu'un vecteur lentiviral avec l'enveloppe Mokola, contenant le promoteur PGK et des cibles de microARN spécifiques des neurones est un outil efficace pour cibler les astrocytes in vivo. Nous avons utilisé ce nouvel outil pour surexprimer les transporteurs astrocytaires au glutamate (GLAST et GLT-1) et pour inhiber leur expression grâce aux techniques de « RNA silencing ». La surexpression du transporteur GLAST permet une neuroprotection significative en condition excitotoxique tandis que l'inhibition de GLT-1 induit une diminution du métabolisme cérébral. Ces résultats préliminaires apportent la preuve de principe de l'efficacité de notre outil in vivo et confirment le rôle central des transporteurs astrocytaires. Il est ainsi possible d'anticiper que ce nouvel outil permettra à la fois une meilleure compréhension du fonctionnement des astrocytes in vivo et qu'il peut représenter un vecteur de choix dans la perspective d'une thérapie génique ciblant ces cellules.