MicroARN (miARN) ont récemment émergé comme un acteur central du gène réseau de régulation impliqués dans la prise du destin cellulaire. L'apoptose, un actif processus, par lequel des cellules déclenchent leur auto-destruction en réponse à un signal, peut être contrôlé par les miARN. Il a également été impliqué dans une variété de maladies humaines, comme les maladies du cœur, et a été pensé comme une cible pour le traitement de la maladie. Tanshinone IIA (TIIA), un monomère de phenanthrenequinones utilisé pour traiter maladies cardiovasculaires, est connu pour exercer des effets cardioprotecteurs de l'infarctus du myocarde en ciblant l'apoptose par le renforcement de Bcl-2 expression. Pour explorer les liens potentiels entre le miARN et l'action anti-apoptotique de TIIA, nous étudié l'implication possible des miARN. Nous avons constaté que l'expression de tous les trois membres de la famille miR-34, miR-34a, miR-34b et miR-34c ont été fortement régulée à la hausse après l'exposition soit à la doxorubicine, un agent endommageant l'ADN ou de pro-oxydant H2O2 pendant 24 heures. Cette régulation à la hausse causé significativement la mort cellulaire par apoptose, comme déterminé par fragmentation de l'ADN, et les effets ont été renversés par les ARNs antisens de ces miARN. Le prétraitement des cellules avec TIIA avant l'incubation avec la doxorubicine ou H2O2 a empêché surexpression de miR-34 et a réduit des apoptose. Nous avons ensuite établi BCL2L2, API5 et TCL1, en plus de BCL2, comme les gènes nouveaux cibles pour miR-34. Nous avons également élucidé que la répression des ces gènes par MiR-34 explique l'effet proapoptotique dans les cardiomyocytes. Ce que la régulation positive de ces gènes par TIIA realisée par la répression de l'expression de miR-34 est probable le mécanisme moléculaire de son effet bénéfique contre ischémique lésions cardiaques. / MiRNAs (miRNAs) have recently emerged as a central player of gene regulatory network involved in decision of cell fate. Apoptosis, an active process that leads to cell death, has been shown to be controlled by miRNAs. It has also been implicated in a variety of human disease, such as heart disease, and established as a target process for disease therapy. Tanshinone IIA (TIIA), a monomer of phenanthrenequinones used to treat cardiovascular diseases, is known to exert cardioprotective effects in myocardial infarction by targeting apoptosis through enhancing Bcl-2 expression. To explore the potential link between miRNAs and the anti-apoptotic action of TIIA, we studied the possible involvement of miRNAs. We found that expression of all three members of the miR-34 family, miR-34a, miR-34b and miR-34c that have been known to mediate the apoptotic effect of p53 in cancer cells, were robustly upregulated after exposure to either the DNA-damaging agent doxorubicin or pro-oxidant H2O2 for 24 hr in cultured neonatal rat ventricular myocytes. This upregulation caused significant apoptotic cell death, as determined by DNA fragmentation, and the effects were reversed by the antisense to these miRNAs. Pretreatment of cells with TIIA prior to incubation with doxorubicin or H2O2 prevented upregulation of miR-34 and reduced apoptosis. We then established BCL2L2, API5 and TCL1, in addition to BCL2, as the novel target genes for miR-34. We further unraveled that repression of these genes by miR-34 accounts for its proapoptotic effect in cardiomyocytes whereas upregulation of these genes by TIIA through downregulating miR-34 is likely the molecular mechanism for its beneficial effect against ischemic myocardial injuries.

La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus fréquemment observé en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalité. Le traitement de la FA reste un défi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associés aux approches thérapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la FA est essentielle pour le développement de nouvelles thérapies offrant un meilleur rapport bénéfice/risque pour les patients. La FA est caractérisée par i) un remodelage électrique délétère associé le plus souvent ii) à un remodelage structurel du myocarde favorisant la récurrence et le maintien de l’arythmie. La diminution de la période réfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un élément clef du remodelage électrique. Le remodelage structurel, quant à lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altère la propagation de l’influx électrique dans les oreillettes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Récemment, le rôle des microARNs (miARNs) a été pointé du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont été i) d'acquérir une compréhension approfondie du rôle des miARNs dans la régulation de l’expression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rôle de ces molécules dans l’installation d’un substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectué une analyse bio-informatique combinée à des approches expérimentales spécifiques afin d’identifier clairement les miARNs démontrant un fort potentiel de régulation des gènes codant pour l’expression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifié un nombre limité de miARNs cardiaques qui possédaient ces propriétés. Sur la base de ces résultats, nous avons démontré que l’altération de l'expression des canaux ioniques, observée dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, l’ischémie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut être soumise à ces miARNs suggérant leur implication dans l’arythmogénèse. La régulation du courant potassique IK1 est un facteur déterminant du remodelage électrique auriculaire associée à la FA. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons émis l’hypothèse que l'altération de l’expression des miARNs soit corrélée à l’augmentation de l’expression d’IK1 dans la FA. Nous avons constaté que l’expression de miR-26 est réduite dans la FA et qu’elle régule IK1 en modulant l’expression de sa sous-unité Kir2.1. Nous avons démontré que miR-26 est sous la répression transcriptionnelle du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et que l’activité accrue de NFATc3/c4, aboutit à une expression réduite de miR-26. En conséquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin démontré que l’interférence in vivo de miR-26 influence la susceptibilité à la FA en régulant IK1, confirmant le rôle prépondérant de miR-26 dans le remodelage auriculaire électrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associé à la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et l’influx cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherché à déterminer i) si le canal perméable au Ca2+, TRPC3, jouait un rôle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) étudié le rôle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons démontré que les canaux TRPC3 favorisent l’influx du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dépendante ERK et en conséquence activent la prolifération des fibroblastes. Nous avons également démontré que l’expression du TRPC3 est augmentée dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empêche le développement de substrats reliés à la FA. Nous avons par ailleurs validé que miR-26 régule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montré que l'expression réduite du miR-26 est également due à l’activité augmentée de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi l’augmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel lié à la FA. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l'importance des miARNs dans la régulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rôle important dans le remodelage électrique et structurel associé à la FA et ce, en régulant IK1 et l’expression du canal TRPC3. Notre étude démasque ainsi un mécanisme moléculaire de contrôle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier représente apres ces travaux une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour traiter la FA. / Atrial fibrillation (AF) is the most frequently-encountered arrhythmia in clinical practice and constitutes a major cause of cardiac morbidity and mortality. The management of AF remains a major challenge as current therapeutic approaches are limited by potential adverse effects and high rate of AF recurrence/persistence. A better understanding of the mechanisms underlying AF is of great importance to improve AF therapy. AF is characterized by impaired electrical and structural remodeling, both of which favors the recurrence and maintenance of the arrhythmia. A key feature in electrical remodeling is the reduced atrial effective refractory period, due to ion channel alteration. Structural remodeling, on the other hand, mainly results from atrial fibrosis. However, the precise molecular mechanisms underlying these remodeling processes are still incompletely understood. The importance of microRNAs (miRNAs) in various pathophysiological conditions of the heart has been well established, but little is known with regard to cardiac arrhythmias. Emerging evidence suggests that dysregulation of miRNAs may underlie heart rhythm disturbances. The aim of the present work was to acquire a comprehensive understanding of miRNA-mediated regulation of ion channels in cardiac arrhythmias. Notably, we will focus on the mechanistic insights of miRNAs related to the control of AF. Currently available experimental approaches do not permit thorough characterization of miRNA targeting. For this purpose, we performed bioinformatic analyses in conjunction with experimental approaches to identify miRNAs from the database that potentially regulate human cardiac ion channel genes. We found that only a subset of miRNAs target cardiac ion channel genes. Based on these results, we further demonstrated that the dysregulation of ion channel gene expression observed in various cardiac disorders (e.g. cardiomyopathy, myocardial ischemia, and atrial fibrillation) can be explained by the dysregulation of miRNAs. These findings further support the potential implication of miRNAs in arrhythmogenesis under these cardiac conditions. The upregulation of the cardiac inward rectifying potassium current, IK1, is a key determinant of adverse atrial electrical remodeling associated with AF. The molecular mechanisms underlying this ionic remodeling are poorly understood. We hypothesized that altered miRNA expression is responsible for IK1 upregulation in AF. We found that miR-26 is significantly downregulated in AF and regulates IK1 by controlling the expression of its underlying subunit Kir2.1. Moreover, we demonstrated that miR-26 is under the transcriptional repression of the nuclear factor of activated T cells (NFAT) and enhanced activities of members of the NFAT family, NFATc3/c4, results in miR-26 downregulation, which accounts for IK1 enhancement in AF. Furthermore, we observed that in vivo interference of miR-26 affects AF susceptibility via the regulation of IK1, suggesting an important role of miR-26 in atrial electrical remodeling. Atrial fibrosis is a major constituent in AF-associated adverse atrial structural remodeling, involving the activation of fibroblasts and cellular Ca2+ entry. Here, we sought to determine whether the Ca2+ permeable channel, TRPC3, plays a role in AF-induced fibrosis by promoting fibroblast activation. Furthermore, we investigated the potential role of miRNAs in this context. We found that TRPC3 channels promote Ca2+-entry, which results in activation of Ca2+-dependent ERK-signaling and consequently fibroblast activation. We also demonstrated that TRPC3 is upregulated in AF and in vivo TRPC3 blockade suppresses the development of AF-promoting substrate. Furthermore, we observed that miR-26 regulates TRPC3 channels via controlling the expression of the underlying channel subunit and is downregulated in AF-fibroblasts. Finally, we showed that the reduced expression of miR-26 is also due to the enhanced NFATc3/c4 activities in AF-fibroblasts and accounts for AF-induced upregulation of TRPC3, suggesting the potential contribution of miR-26 in AF-related adverse structural remodeling process. In conclusion, our findings emphasize the importance of miRNAs in the regulation of cardiac ion channels. Notably, miR-26 plays a crucial role in AF-associated electrical and structural remodeling via the regulation of IK1 and TRPC3 channel genes. Thus, our study unravels a novel molecular control mechanism of AF at the miRNA level, suggesting miR-26 as a new and promising therapeutic target for AF.

Le Glypican-3 (GPC3) est surexprimé dans 72% des carcinomes hépatocellulaire (CHC). C’est un co-récepteur membranaire du récepteur WNT, qui appartient à la famille des protéoglycanes à sulfates d'héparane. L'objectif général de ma thèse vise à étudier les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle de l’expression du GPC3 dans le CHC. Pour cela, j’ai développé un test fonctionnel qui m’a permis de cribler une bibliothèque de 876 microARNs humains. Ceci a conduit à l’identification de 5 microARNs régulateurs de l’expression de l’ARNm codant pour le GPC3 via sa région 3’ non traduite (NT). Mon travail de thèse porte plus particulièrement sur le miR-1271 et le miR-1291 car ils sont dérégulés dans le CHC et sont respectivement inhibiteur et inducteur de l’expression du GPC3. Dans un premier projet, j’ai démontré que le miR-1271 cible directement la région 3’NT du GPC3 et diminue la stabilité de son ARNm. Ce microARN est sous-exprimé dans le CHC et son expression corrèle négativement avec celle de l'ARNm du GPC3 dans les CHC associés à une infection par le virus de l’hépatite B. Dans un deuxième projet, j’ai démontré que le miR-1291 régule positivement l’expression du GPC3 en inhibant un facteur intermédiaire. Une analyse in silico a permis d’identifier IRE1α comme candidat. IRE1α est une protéine transmembranaire du réticulum endoplasmique (RE) qui participe à « l’Unfolded Protein Response », une réponse adaptative activée lors de l’accumulation de protéines mal conformées dans le RE. J’ai démontré qu’IRE1α clive l’ARNm codant pour le GPC3 grâce à son activité endoribonucléase. D’autre part, le miR-1291 cible directement l’ARNm codant pour IRE1α dans sa région 5’NT ce qui inhibe son expression et induit une surexpression du GPC3. Le miR-1291 est surexprimé dans le CHC et son expression corrèle positivement avec celle de l’ARNm du GPC3. En conclusion, mon travail de thèse m’a permis de mettre en évidence et de caractériser deux nouveaux microARNs (miR-1271 et miR-1291) contrôlant l’expression du GPC3 par des mécanismes directs ou indirects. La pertinence physiopathologique de ces régulations dans le CHC est en accord avec les niveaux d’expression respectifs de ces microARNs, qui pourraient contribuer à la surexpression du GPC3 dans ces tumeurs. / Glypican-3 (GPC3) is overexpressed in 72% of hepatocellular carcinoma (HCC). It is a co-receptor for WNT receptor and belongs to the heparan sulfate proteoglycans family. The general objective of my PhD thesis was to study the mechanisms by which GPC3 is post-transcriptionnally regulated in HCC. To this end, I developed a functional test that allowed me to screen a library of 876 human microRNAs. This led me to identify 5 microRNAs that regulate the expression of GPC3 mRNA through its 3’Untranslated Region (UTR). The work presented in this thesis particulary focuses on miR-1271 and miR-1291 as both microRNAs present a deregulated expression in HCC and are respectively inhibitor and activator of GPC3 mRNA expression. In a first project, I demonstrated that miR-1271 directly binds to GPC3 mRNA 3’UTR and affects its stability. This microRNA is underexpressed in HCC and its expression negatively correlates with that of GPC3 mRNA in a subgroup of HCC corresponding to those associated with hepatitis B virus infection. In a second project, I demonstrated that miR-1291 postively regulates the expression of GPC3 mRNA by targeting an intermediate factor. An in silico analysis led to the identification of the Inositol Requiring Enzyme 1 alpha (IRE1α) as a potential candidate. IRE1α is an endoplasmic reticulum (ER) resident type I transmembrane protein and contributes to the signaling of the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR is an adaptive response activated upon accumulation of improperly folded proteins in the ER. I showed that IRE1α cleaves GPC3 mRNA through its endoribonuclease activity. Moreover I demonstrated that miR-1291 directly targets IRE1α mRNA through its 5’UTR, thereby decreasing its expression and contributing to GPC3 mRNA overexpression. MiR-1291 is overexpressed in HCC and its expression positively correlates with that of GPC3 mRNA. In summary, the work carried out during my PhD allowed the identification and the characterization of two new microRNAs (miR-1271 and miR-1291) that control the expression of GPC3 mRNA through direct or indirect mechanisms. The pathophysiological relevance of these regulatory mechanisms is in agreement with the respective expression levels of these microRNAs in HCC, which could therefore contribute to the overexpression of GPC3 in those tumors.

Le processus de formation des cils mobiles multiples (multiciliogénèse) est composé de nombreuses étapes. Récemment, nous avons démontré que les microARNs de la famille miR-449 contrôlent plusieurs de ces étapes. Au cours de mon travail, je me suis concentré sur le rôle joué par miR-449 dans deux aspects du développement de l'épithélium multicilié. Dans les cellules multiciliées, un réseau dense d'actine sous-jacent l'aspect apicale de la membrane cellulaire (coiffe d'actine) est nécessaire pour l'ancrage des multiples corps basaux, et donc pour une ciliogenèse approprié. Dans le cadre de mon travail, j'ai participé à l' identification de la petite GTPase R-Ras comme une des véritables cibles de miR-449. J'ai démontré que la réorganisation de la coiffe d'actine et l'ensemble du processus de multiciliogénèse étaient compromis lorsque l'ARN messager de R-Ras se trouve protégé de la liaison avec miR-449. J'ai aussi contribué à identifier une nouvelle cible de miR-449, le gène Steel, qui code pour le ligand du récepteur transmembranaire à tyrosine-kinase KIT. La repression de Steel par miR449 est impliquée dans le processus par lequel les cellules multiciliées atteignent leur position finale dans l'épiderme embryonnaire de Xenopus. STEEL, qui agit probablement comme une molécule de guidage pour les cellules multiciliées qui expriment KIT, doit être réprimé par miR-449 dans ces mêmes cellules en cours de migration pour assurer leur deplacement directionnel approprié. En conclusion, mon travail a contribué à élucider le rôle complexe joué par le miARN miR-449 dans le processus de multiciliogénèse chez les vertébrés. / The process of multiple motile cilia formation (multiciliogenesis) is composed of many different steps. Recently, we demonstrated that microRNAs of the miR-449 family control several of these steps. During my work, I focused on the role played by miR-449 in two aspects of the development of the mucociliary epithelium. In multiciliated cells, a dense actin network underlying the apical aspect of the cell membrane (actin cap) is required for the anchoring of the multiple basal bodies, and therefore for proper ciliogenesis. Small GTPases play important role in the formation of the actin cap. In the course of my work, I took part in the identification of transcripts coding the small GTPase R-Ras as bona fide targets of miR-449. I demonstrated that apical and subapical actin network reorganization and multiciliogenesis were impaired when R-Ras mRNA was protected from miR-449 binding. Moreover, the actin cap formation and multiciliogenesis were rescued when the translation of protected R-Ras transcripts was prevented. I also contributed to the finding that a new miR-449 target, the KIT receptor tyrosin kinase ligand STEEL, is involved in the process through which the multiciliated cells reach their final position within the developing frog epidermis. STEEL, which likely acts as a guidance molecule for the KIT-expressing multiciliated cells, needs to be repressed by miR-449 within the migrating cells to ensure their proper directional migration. Altogether, my work contributed to elucidate the complex role played by the miR-449 miRNA in the process of vertebrate multiciliogenesis.

Le carcinome rénal à cellules claires (cRCC) est le principal type histologique de carcinome rénal et l'une des tumeurs les plus résistantes à la chimio et à la radiothérapie. L'absence de biomarqueurs pour la détection précoce et pour le suivi des patients est responsable d'un mauvais pronostic. Il est nécessaire d'identifier de nouveaux biomarqueurs et des cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients. Les microARNs, des petits ARN non codants de 22 nucléotides, qui ont été précédemment montrés comme favorisant l'initiation et la progression tumoral, semblent être de bons candidats. Nous avons focalisé notre étude sur (i) miR-21 qui est le principal oncomiR surexprimé dans le cRCC et (ii) le récepteur nucléaire PPARα (Peroxisome Proliferator Activated Receptor), l'une des cibles de miR-21.D'une part, sur une cohorte de 99 échantillons de cRCC primaires, nous avons montré que l'expression de miR-21 était plus élevée dans les tissus cancéreux que dans les tissus non tumoraux adjacents. In vitro, miR-21 est également surexprimé dans les lignées cellulaires de carcinomes rénaux comparées à la lignée cellulaire épithéliale HK-2 provenant de tubes proximaux humains. De plus, nous avons également montré que la surexpression de miR-21 augmente les propriétés de migration et d'invasion des cellules cancéreuses rénales ainsi que les voies de signalisation prolifératives et anti-apoptotiques, alors que des résultats opposés ont été observés en utilisant une stratégie d'inhibition anti-miR-21. Enfin, nous avons évalué le rôle du miR-21 dans la chimiorésistance du cRCC et montré, en outre, que l'inhibition de miR-21 augmentait significativement la chimiosensibilité au paclitaxel, au 5-fluorouracile, à l'oxaliplatine et au dovitinib, diminuait l'expression des transporteurs à efflux MRP1-6/ABCC1-6 et augmentait l'expression des transporteurs à influx SLC22A1/OCT1, SLC22A2/OCT2 et SLC31A1/CTR1. Ces résultats ont permis la publication d'un article dans Tumor Biology se trouvant en annexe.D'autre part, dans les tissus de patients atteints de cRCC, nous avons montré pour la première fois que la surexpression de miR-21 est en corrélation avec une perte d'expression de PPARα. In vitro, nous avons montré que miR-21 cible le 3'-UTR de PPARα et diminue son expression protéique et que la surexpression de miR-21 diminue l'activité transcriptionnelle de PPARα. En outre, la surexpression et l'activation de PPARα diminuent l'expression de miR-21. En effet, PPARα interagit avec les facteurs de transcription AP-1 et NF-κB et empêche ainsi leur liaison au promoteur de miR-21 diminuant ainsi sa transcription.En conclusion, nous avons montré que (i) miR-21 est un acteur clé de la progression du cancer du rein et joue un rôle important dans la résistance aux chimiothérapies et (ii) qu'il existe une boucle de régulation négative entre miR-21 et PPARα dans le cRCC. / Renal clear cell carcinoma (cRCC) is the major histological type of renal carcinoma and one of the most chemo- and radio-resistant tumors. The absence of biomarkers for early detection and for monitoring patients is responsible of a poor prognosis. It is necessary to identify new biomarkers and therapeutic targets to improve patient care. MicroRNAs, small noncoding RNAs of 22 nucleotides, which have been previously shown to promote malignant initiation and progression, appear to be good candidates.We focused our study on (i) miR-21 which is the main overexpressed oncomirs in cRCC and (ii) the nuclear receptor PPARα (Peroxisome Proliferator Activated Receptor), one of miR-21 targets.In one hand, by using a cohort of 99 primary cRCC samples, we showed that miR-21 expression in cancer tissues was higher than in adjacent non-tumor tissues. In vitro, miR-21 was also overexpressed in renal carcinoma cell lines compared to HK-2 human proximal tubule epithelial cell line. Moreover, we also showed that miR-21 overexpression increased migratory, invasive, proliferative, and anti-apoptotic signaling pathways whereas opposite results were observed using an anti-miR-21-based silencing strategy. Finally, we assessed the role of miR-21 in mediating cRCC chemoresistance and further showed that miR-21 silencing significantly increased chemosensitivity of paclitaxel, 5-fluorouracil, oxaliplatin and dovitinib, decreased expression of multi-drug resistance genes and increased SLC22A1/OCT1, SLC22A2/OCT2 and SLC31A1/CTR1 platinum influx transporter expression. These results led to the publication of an article in Tumor Biology in annex.In other hand, in cRCC tissue patients, we showed for the first time that miR-21 overexpression correlates with a loss of expression of PPARα. In vitro, we showed that miR-21 targets PPARα 3'-UTR and decreases its protein expression and miR-21 overexpression decreases the transcriptional activity of PPARα. Furthermore, PPARα overexpression and activation decrease miR-21 expression. In fact, PPARα interacts with AP-1 and NF-kappaB transcription factors and thus prevents their binding to the miR-21 promoter thus decreasing its transcription.In conclusion, we have shown that (i) miR-21 is a key actor of renal cancer progression and plays an important role in the resistance to chemotherapeutic drugs and (ii) there is a negative regulatory loop between miR-21 and PPARα in cRCC.

L’insuffisance cardiaque (IC) est un problème majeur de santé publique. La pénurie des greffons cardiaques et la résistance de nombreux patients aux traitements conventionnels ont poussé les chercheurs à développer de nouvelles thérapeutiques dont la thérapie cellulaire. Bien que l’idée initiale de la thérapie cellulaire ait été de repeupler la partie nécrosée du cœur par l’administration de cellules viables et fonctionnelles, leur disparition rapide alors que les bénéfices perdurent dans le temps a conduit à l’hypothèse que les cellules agiraient via un mécanisme paracrine. Les vésicules extracellulaires (VE), incluant les exosomes et les microparticules, seraient principalement impliquées dans ce processus. Elles agiraient ainsi comme de véritables navettes transportant des biomolécules actives permettant d’activer des voies de réparation endogènes dans le tissu traité. Ce projet de thèse a pu mettre en évidence : 1) La non-infériorité des VE issues de progéniteurs cardiovasculaires (Pg) dérivés de cellules souches embryonnaires humaines par rapport à leurs cellules d’origine dans un modèle murin d’IC chronique (ICC). Ces VE activeraient des voies de signalisation endogènes impliquées dans la stimulation de la prolifération cellulaire, la survie cellulaire, la réparation de l’ADN et la diminution de la fibrose. Leur contenu moléculaire spécifique, et notamment les microARN, pourrait être impliqué dans ces phénomènes. 2) L’importance du choix du type cellulaire dans la production de VE efficaces sur le plan thérapeutique puisque ni les VE dérivées de cardiomyocytes matures ni celles de cellules souches mésenchymateuses n’ont eu d’effets bénéfiques sur la fonction cardiaque de souris en ICC. 3) L’implication des VE dans l’effet paracrine des cellules, confirmée par l’amélioration de la fonction cardiaque chez des souris présentant une ICC traitées avec des VE issues de Pg dérivés d’iPS. Des tests fonctionnels in vitro ont montré que les VE auraient un rôle pro-angiogénique, pro-prolifératif et amélioreraient la survie des cellules. Une thérapie a-cellulaire aurait une réelle pertinence clinique en réglant une partie des problèmes techniques, immunologiques et sécuritaires associés aux greffes de cellules. Si cette hypothèse est confirmée, il pourrait en résulter une simplification des problèmes réglementaires, une diminution des coûts de production et de ce fait une plus grande diffusion clinique de la méthode. / Heart failure (HF) is a major public health concern. The lack of donor hearts and the resistance of numerous patients to conventional treatments has led scientists to develop new therapies such as cell therapy. The initial goal of cell therapy was to repopulate the infarcted heart by directly injecting viable and functional cells. However, the rapid disappearance of the transplanted cells contrasts with their long term, ongoing functional benefits, suggesting that cells may act through a paracrine mechanism. Extracellular vesicles (EV), including exosomes and microparticles, may be key to this process, acting as shuttles to transport bioactive macromolecules that stimulate endogenous repair pathways in the host tissue. This PhD project demonstrates: 1) The non-inferiority of EV secreted by cardiovascular progenitors (Pg) derived from human embryonic stem cells as compared to their parent cells in a mouse model of chronic HF (CHF). These EV could act by the activation of endogenous signaling pathways implicated in cell proliferation, survival, DNA repair and decreased fibrosis. Their specific content, such as miRNA, could be involved in these benefits. 2) The importance of the cell type in the production of therapeutically effective EV, since EV derived from mature cardiomyocytes and mesenchymal stem cells did not improve cardiac function in mice with CHF. 3) The importance of EV in paracrine effects of cells, confirmed by the improvement of cardiac function in mice with CHF treated with EV secreted by Pg derived from iPS cells. In vitro data shows that EV might have pro-angiogenic, pro-proliferative and pro-survival effects. An acellular therapy should be clinically relevant by reducing technical, immunological and safety problems associated with cell transplantation. If this hypothesis is confirmed, regulatory concerns would be simplified and production costs reduced, facilitating large-scale production.

Après un infarctus, les acteurs de l’immunité innée et adaptative contrôlent le remodelage et la fonction cardiaque. Dans un premier travail, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires définissant le rôle des monocytes et des macrophages, composants majeurs de l’immunité innée. En particulier, nous avons analysé le rôle de deux récepteurs MertK (myeloid-epithelial-reproductive receptor tyrosine kinase) et Mfge8 (milk fat globule epidermal growth factor-like factor 8), susceptibles d’être impliqués dans la reconnaissance des débris cellulaires peuplant la zone infarcie. L’invalidation de MertK et Mfge8 in vivo chez la souris augmente l’accumulation des cellules apoptotiques, aggrave la fibrose et accroit la taille de l’infarctus par rapport aux souris contrôles. De plus, l’expression du facteur pro-angiogenique VEGF-A, est significativement réduite 3 jours post-infarctus chez les souris chimères Mertk-/-Mfge8-/- par rapport aux animaux contrôles. Enfin, l’invalidation de l’expression de VEGF-A dans les cellules myéloides augmente la fibrose et la taille de l’infarctus et diminue la fonction cardiaque. Ainsi, la reconnaissance des débris cellulaires par Mertk et Mfge8 promeut la libération de VEGF-A par les monocytes et macrophages et participe à la restauration de la densité capillaire et de la fonction cardiaque post-infarctus. Dans un deuxième travail, nous avons abordé les voies de signalisation intracellulaires sous-tendant les effets d’un acteur majeur de l’immunité adaptative, le lymphocyte B. Après un infarctus, les lymphocytes B libèrent la chimiokine Ccl7, qui en se fixant sur son récepteur CCR2, déclenche une mobilisation des monocytes inflammatoires de la moelle osseuse vers le sang puis leur recrutement délétère dans la zone infarcie. Nous avons notamment montré que des activateurs des lymphocytes B, comme des stimuli inflammatoires, stimulent la libération de Ccl7, en partie en initiant des voies de signalisation intracellulaires dépendantes du micro-RNA (miR)21. L’administration exogène de lymphocytes B déficients pour miR-21 améliore d’ailleurs la fonction et le remodelage cardiaque post-infarctus chez des souris immunodéficientes. miR21 cible le gène suppresseur de tumeur PTEN et ainsi augmente l’expression du facteur de transcription HIF1α. De fait, l’analyse par échocardiographie effectuée 14 jours après l’induction de l’infarctus montre une amélioration de la fonction cardiaque ainsi qu’une diminution de la taille de l’infarctus et de la fibrose interstitielle chez les souris invalidées pour HIF1α spécifiquement dans les lymphocytes B par rapport aux contrôles. Les taux de la chimiokine CCL7 dans le plasma de ces souris sont aussi significativement réduits à J1 et J3 post infarctus ; ainsi que la mobilisation et le recrutement monocytaire. Il apparaît donc que la voie de signalisation impliquant miR21/HIF1α conditionne l’effet délétère des lymphocytes B dans un contexte d’infarctus aigu du myocarde. Ces travaux ont permis de révéler des facteurs majeurs de la régulation fine de la réaction inflammatoire post-ischémique, et de souligner l’efficacité potentielle de stratégies thérapeutiques modulant l’activité des cellules immunitaires dans le décours des pathologies cardiaques. / After a myocardial infarction, the innate and adaptive immunity play a role in post ischaemic remodelling and cardiac function. In a first work, we have been interested in the molecular mechanism of the role of monocytes and macrophages, the major innate immunity components. In particular, it has been analysed the function of, the myeloid-epithelial reproductive protein tyrosine kinase (Mertk) and the milk fat globule epidermal growth factor (Mfge8) and their implication in directing cardiac remodelling by skewing the inflammatory response after myocardial infarction. Compared with wild-type, Mertk-deficient (Mertk−/−), or Mfge8- deficient (Mfge8−/−) animals, Mertk−/−/Mfge8−/− mice displayed greater alteration in cardiac function and remodelling. In parallel, Mertk−/−/Mfge8−/− bone marrow chimeras manifested increased accumulation of apoptotic cells, enhanced fibrotic area, and larger infarct size, as well as reduced angiogenesis and VEFA expression. Combined Mertk and Mfge8 deficiency in myeloid cells either obtained from in vitro differentiation of bone marrow cells or isolated from infarcted hearts altered their capacity of efferocytosis and subsequently blunted vascular endothelial growth factor A (VEGFA) release. On the contrary, the recognition of necrotic cells by Mertk and Mfge8 promote VEGFA liberation improving cardiac function and angiogenesis. In the second work, we have focused on intracellular signalling pathway underlying the effects of another important actor of adaptive immunity, the B lymphocytes. After acute myocardial infarction multiple subtypes of inflammatory cells are known to orchestrate post-ischemic cardiac remodelling. In particular, Mature B lymphocytes selectively produce Ccl7 chimiokine and fixed on its CCR2 receptor it is able to induce monocyte mobilization and recruitment to the heart, leading to enhanced tissue injury and deterioration of myocardial function. Many B lymphocytes activators, such as inflammatory stimuli, may promote CCL7 release partially involving an intracellular signalling pathway depending on the micro-RNA miR21. We speculate that endogenous activation of the miR21/HIFα-related pathways balances the effect of B lymphocytes on post-ischemic cardiac remodelling. The treatment with TLR ligands resulted in induction of the microRNA miR-21, which targeted PTEN, leading to subsequent up regulation of HIF1α and HIF2α levels. In Rag1-/- immunodeficient mice with acute MI, we showed that re-supplementation with miR21-/- B lymphocytes restored cardiac repair and function when compared to injection of wild-type B cells. These effects were associated with a reduction in Ly6Chigh monocyte infiltration in the ischemic myocardium as well as with a decrease in infarct size and interstitial fibrosis. This work reveals several factors implicated in regulation of post-ischaemic inflammatory reaction, and underline the potential efficacity of a therapeutic strategy to module the activity of immune cells alongside the cardiovascular diseases.

Les altérations transcriptionnelles présentes dans le tissu cérébral et dans les leucocytes sanguins des patients souffrant de trouble dépressif majeur (TDM) ou de troubles schizophréniques (TSZ) pourraient être dues à des altérations de la machinerie épigénétique. Ce travail de thèse (i) a recherché des altérations transcriptionnelles des gènes codant pour la machinerie épigénétique dans le tissu cérébral et les leucocytes sanguins de patients souffrant de TDM ou de TSZ, (ii) a confronté les altérations transcriptionnelles périphériques aux altérations cérébrales afin d'évaluer leur significativité neurobiologique. Chez des patients avec TDM, une première étude utilisant la PCR en temps réel a identifié une surexpression des gènes codant pour des enzymes responsables de la mise en place de marques épigénétiques répressives vis-à-vis de l'expression génique dans le cortex préfrontal dorsolatéral (DLPFC), le cortex cingulaire et les leucocytes sanguins. Chez des patients avec TSZ, une deuxième étude de data-mining a identifié une surexpression des gènes codant pour la machinerie de biogénèse des microARNs dans le DLPFC et le cervelet, suggérant une augmentation de la production des microARNs dans ces deux régions cérébrales. Des altérations transcriptionnelles distinctes ont été observées dans les cellules sanguines mononucléées périphériques et l'épithélium olfactif. Une troisième étude utilisant la PCR en temps réel a identifié des réseaux de co-expression génique distincts dans les leucocytes et le tissu cérébral. Certains réseaux, exclusivement retrouvés chez les patients souffrant de TDM, pourraient participer à la constitution du phénotype pathologique. Dans le DLPFC et les leucocytes sanguins, le TDM est associé à une modification de la régulation transcriptionnelle des gènes intervenant dans les processus de stress et de sénescence cellulaires. Au total, ce travail retrouve une altération transcriptionnelle de la machinerie épigénétique dans le TDM et les TSZ. Dans le tissu cérébral, ces anomalies pourraient conduire à une répression de l'expression génique et participer aux altérations transcriptionnelles retrouvées dans le TDM et les TSZ. Dans les leucocytes périphériques, les altérations transcriptionnelles ne reflètent que partiellement les altérations centrales, suggérant que le TDM et les TSZ sont des affections systémiques. L'expression sanguine d'HDAC2 et celle de DICERl pourraient constituer de potentiels biomarqueurs périphériques, respectivement pour le TDM et les TSZ / Transcriptional abnormalities in brain tissue and blood leucocytes of patients with major depressive disorder (MDD) or schizophrenic disorders (SZ) may be due to alterations in the epigenetic machinery. This thesis work aimed to (i) identify altered expression of genes encoding the epigenetic machinery in brain and blood tissues of patients with MDD or SZ, (ii) and compare the peripheral transcriptional alterations to the cerebral ones in order to evaluate their neurobiological relevance.In MDD patients, a first study using real-time PCR identified overexpression of genes encoding enzymes which transfer repressive transcriptional marks in the dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC), the cingulate cortex and the blood leucocytes. In SZ patients, a second study using a data-mining software identified an overexpression of genes encoding the microRNA biogenesis machinery in the DLPFC and the cerebellum, suggesting an increase in microRNA production in these two brain regions. Distinct transcriptional alterations were observed in peripheral mononuclear blood cells and the olfactory epithelium. In MDD patients, a third study using real-time PCR identified MDD-specific, distinct co-expression networks of stress- and senescence-related genes in the DLPFC and blood leucocytes. This suggests that MDD is associated with a transcriptional regulatory shift in the DLPFC and blood leucocytes.Altogether, these studies report transcriptional alterations of the epigenetic machinery coding genes in the brain tissues and blood leucocytes of MDD and SZ patients. In the brain tissues, aberrant expression of the epigenetic machinery coding genes may lead to the repression of gene expression and participate in the transcriptional abnormalities associated with MDD and SZ. In peripheral leucocytes, transcriptional alterations only partially reflect central ones, emphasizing that MDD and SZ are systemic disorders. Finally, HDAC2 and DICER1 blood expression may represent clinically useful peripheral biomarkers for MDD and SZ, respectively

Le profil d'expression aberrant des micro(mi)ARN est une caractéristique typique de nombreux cancers, dont le carcinome hépatocellulaire (CHC), une tumeur hépatique maligne primaire qui se classe seconde dans le monde en termes de mortalité par cancer. Notre équipe a récemment montré la baisse d’expression de miR-4510 dans des échantillons de patients atteints de CHC et son activité « suppresseur de tumeur ». L'analyse de données protéomiques recueillies à partir de cellules Huh7 transfectées par miR-4510 a révélé une diminution importante de plusieurs oncogènes, dont la sérine / thréonine protéine kinase RAF1. J’ai également découvert que le taux de protéine RAF1 était significativement surexprimé chez les patients atteints de CHC. Le rôle de RAF1 et de miR-4510 dans le CHC étant mal compris, j’ai étudié la fonction du couple RAF1/miR-4510 dans la tumorigenèse du foie. Mes analyses ont montré que miR-4510 régule négativement les taux de protéine RAF1 et d'ARNm. Une analyse par le système de double fluorescence-FunREG a révélé que miR-4510 interagit directement avec la région 3’ non-traduite de l’ARN de RAF1 via un site unique. La déplétion de RAF1 dans deux lignées tumorales de CHC par miR-4510 ou ARN interférant désactive leur caractère tumorigène in vitro et in vivo. Collectivement, mes données suggèrent que miR-4510 participe à la carcinogenèse du foie via son action directe sur RAF1 et la régulation de la voie MAPK/ERK. En conclusion, mon étude soutient l’hypothèse selon laquelle un traitement à base de miR-4510 pourrait être efficace pour traiter les patients atteints de CHC de type avancé ou réfractaire à la chimiothérapie. / Aberrant micro(mi)RNA expression signature is a hallmark of many cancers including hepatocellular carcinoma (HCC), a primary malignant liver disease which ranks second in cancer mortality worldwide. Our team previously reported the downregulation of miR-4510 in HCC samples and identified this miRNA as a strong tumor suppressor in liver. Proteomic data analysis collected from Huh7 cells transfected by miR-4510 showed a significant decrease of multiple oncogenes including RAF1 serine/threonine protein kinase. I also found that RAF1 protein level is significantly increased in HCC patients. The role of RAF1 and miR-4510 in HCC being poorly understood, I studied the function of RAF1/miR-4510 pair in tumorigenesis of the liver. My results showed that miR-4510 overexpression significantly decreases both RAF1 protein and mRNA levels and inhibits MAPK/ERK signaling. The dual fluorescence-FunREG assay revealed that miR-4510 directly interacts with RAF1 3’-untranslated region through a unique site. Silencing of RAF1 in two hepatic cell lines by miR-4510 or a specific small interfering RNA suppressed important tumorigenic features (proliferation, migration….) both in vitro and in vivo. Collectively, my data suggest that miR-4510 participates in liver carcinogenesis through RAF1 targeting and MAPK/ERK signaling inactivation. In addition, my study suggests that miR-4510-based therapy may represent a promising strategy to treat patients with advanced or refractory HCC.

Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont pour but d’étudier les effets de différents niveaux d’activité physique, jusqu’à l’inactivité extrême sur des acteurs du dialogue inter-organe comme l’adiponectine et les microARNs, et sur le métabolisme, notamment dans le muscle ou le foie. Nous démontrons que l’inactivité physique extrême, dans le cadre d’un bedrest de 60 jours, augmente les marqueurs de l’inflammation hépatique, prémices du développement d’une stéato-hépatite non alcoolique. Nos données montrent que des exercices réguliers peuvent limiter les altérations métaboliques induites par l’inactivité physique. Nous montrons, ensuite qu’indépendamment des effets de l’activité et l’inactivité physique sur la masse grasse, les concentrations circulantes d’adiponectine sont inversement associées avec le niveau d’activité physique. Nous montrons notamment que les variations des taux circulants d’adiponectine totale avec le niveau d’activité physique sont principalement dû aux variations de la forme de haut poids moléculaire, et ne sont pas expliquées par des variations d’expression de l’adiponectine dans le tissu adipeux ou musculaire. Nous montrons également une relation inverse entre l’insulinémie plasmatique à jeun et les récepteurs de l’adiponectine, et un de ses effecteurs (APPL1) dans le muscle supportant l’amélioration de la sensibilité à l’adiponectine musculaire. Au cours d’une intervention contrastée et modérée sur le niveau d’activité physique chez l’homme et la souris, nous avons pu montrer que la transition d’un statut actif vers inactif augmentait le niveau d’expression de miR-148b dans le muscle, participant à la dégradation du métabolisme. Notre étude de modulation de l’expression de miR-148b in vitro dans les myotubes humains, montre son implication dans la voie de signalisation de l’insuline, et suggère que l’accumulation de miR-148b dans le tissu musculaire peut participer à l’altération de la sensibilité à l’insuline qui est caractéristique des comportements sédentaires persistants. L’ensemble de ces résultats démontrent que l’étude des acteurs de la signalisation inter-organe est cruciale pour comprendre les mécanismes mis en jeu par les comportements actifs et inactifs, et leurs effets sur la santé / Current lifestyle changes, notably sedentary behavior, are associated with chronic diseases, while regular activity improves metabolic functions The purpose of my work is to examine the effects of different level of physical activity, until extreme inactivity on cross-talk mediators, such as adiponectine and microRNAs, and on metabolism, notably in muscle or liver. We demonstrate a significant increase of hepatic markers under severe physical inactivity (60d bed-rest), showing the onset of a development of NASH. Our data support that regular exercise can limit these physical inactivity-induced metabolic alterations. We demonstrate that independently of effects of physical activity and inactivity on fat mass, adiponectin plasma concentrations were negatively related to physical activity level. Our data highlight that variations in total plasma adiponectin with physical activity level are mainly due to changes in HMW adiponectin plasma concentrations, and are unlikely explained by variations in expression of adiponectin in adipose tissue and muscle. We also show an inverse relation between fasting insulin plasma concentrations with both adiponectin receptors, and one of its downstream effector (APPL1) in the muscle, suggesting an improvement of adiponectin muscular sensitivity. During a contrasted and moderate physical activity intervention in human and mice, we show that transition from activity toward inactivity results in muscle miR-148b content increase, leading to muscle metabolism alteration. Our study on miR-148b expression modulation in vitro in human myotubes, show its involvement in insulin signaling pathway in muscle, suggesting that miR-148b accumulation in muscle could participate in the whole body insulin sensitivity degradation, which is a feature of persistent sedentary behavior. Altogether, these results demonstrate that the study of cross-talk actors is crucial to understand the mechanisms involved in active and inactive behaviors, and their effects on health