Cette thèse présente deux sujets de recherche indépendants concernant l'application de méthodes stochastiques à des problèmes issus de la dynamique moléculaire. Dans la première partie, nous présentons des travaux liés à l'interprétation probabiliste de l'équation de Poisson-Boltzmann qui intervient dans la description du potentiel électrostatique d'un système moléculaire. Après avoir introduit l'équation de Poisson-Boltzmann et les principaux outils mathématiques utilisés, nous nous intéressons à l'équation linéaire parabolique de Poisson-Boltzmann. Avant d’énoncer le résultat principal de la thèse, nous étendons des résultats d'existence et unicité des équations différentielles stochastiques rétrogrades. Nous donnons ensuite une interprétation probabiliste de l'équation non-linéaire de Poisson-Boltzmann sous la forme de la solution d'une équation différentielle stochastique rétrograde. Enfin, dans une seconde partie prospective, nous commençons l'étude d'une méthode proposée par Paul Malliavin de détection des variables lentes et rapides d'une dynamique moléculaire. / This thesis presents two independent research topics. Both are related to the application of stochastic problems to molecular dynamics. In the first part, we present a work related to the probabilistic interpretation of the Poisson-Boltzmann equation. This equation describes the electrostatic potential of a molecular system. After an introduction to the Poisson-Boltzmann equation, we focus on the parabolic and linear equation. After extending an existence and uniqueness result for backward stochastic differential equations, we establish a probabilistic interpretation of the nonlinear Poisson-Boltzmann equation with backward stochastic differential equations. Finally, in a more prospective second part, we initiate a study of a slow and fast variables detection method due to Paul Malliavin.

Orientador: Sergio Persio Ravagnani / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T03:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trochmann_JoseLuizLino_D.pdf: 1070584 bytes, checksum: 3407aee7ad6d88d9de0a1326aaf3d29d (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Neste trabalho de tese foi realizado um estudo do potencial de predição de propriedades de transporte em matrizes poliméricas de poli - imidas, utilizando a simulação dinâmica molecular de gases simples como Oxigênio, Nitrogênio e Dióxido de Carbono. A propriedade de transporte de interesse prático, a permeabilidade de uma membrana polimérica a um dado penetrante, envolve a determinação de propriedades de ordem cinética e termodinâmica, respectivamente a determinação do coeficiente de difusão e da solubilidade deste penetrante na matriz polimérica. Atenção especial foi conferida à propriedade cinética, pela predição do coeficiente de autodifusão dos penetrantes. Num procedimento experimental clássico é de vital importância para significância das conclusões derivadas dos experimentos, o uso de amostras de membranas poliméricas adequadamente preparadas quanto à composição química, estrutura física e morfologia. Analogamente, quando se utiliza a simulação molecular para a predição de propriedades, tais como o coeficiente de autodifusão, também é de fundamental relevância para os resultados obtidos, a qualidade dos modelos moleculares das matrizes poliméricas, que serão usados como base. Assim para a preparação de modelos moleculares com o adequado empacotamento, um procedimento para a obtenção de modelos bem equilibrados foi desenvolvido neste trabalho. Os modelos moleculares desenvolvidos foram usados para a obtenção dos valores de massa específica em função da temperatura, e comparados aos valores experimentais disponíveis e quando necessário a, valores preditos por meio da expressão de massa específica em função da temperatura, acima e abaixo da temperatura de transição. A capacidade do modelo molecular desenvolvido em predizer a massa especifica e temperatura de transição vítrea foi usada como critério para a validação da adequação do empacotamento proposto para o referido modelo molecular da matriz polimérica. Os modelos validados de empacotamento, células amorfas, foram utilizados para o cálculo do coeficiente de autodifusão dos gases acima mencionados, através do da simulação dinâmica molecular. A comparação dos coeficientes de autodifusão obtidos das poli-imidas aromáticas e éster imidas, BAAF, 6FDA-ODA, PMDA-ODA e BA-20DA, para os gases O2, N2 e CO2, com os dados experimentais, permitiu concluir a adequação das células amorfas e do esquema de simulação dinâmica molecular para a predição do coeficiente de autodifusão.. A versão preditiva de Vrentas e Duda, baseada na teoria do volume livre, foi utilizada para a predição dos coeficientes de autodifusão da água e do etanol para as poli-imidas acima. , Estes valores, quando comparados com os valores obtidos através da simulação dinâmica molecular mostram a validade de ambas as teorias para a predição da cinética de difusão de penetrantes em matrizes poliméricas complexas / Abstract: In this thesis a study of the predictive potential of the molecular dynamic simulation was performed for transport properties of light gases in polyimide matrix. From de practical point of view permeability is the property of most interest, and involves kinetics as well as thermodynamics properties, diffusion coefficient and solubility of the penetrants molecule in the bulk polymeric matrix, this work will be focus in the former. As important as is in as experimental work, a well prepared polymeric membrane is essential for the significance of the draw conclusions. Therefore a special attention was take in the preparation of the bulk molecular polymeric model, the so called amorphous cell, in order to obtain well-equilibrated molecular packing models for the polyimide matrixes. The amorphous cells were prepared throughout thermodynamic transforms, using one or more of the statistical ensembles and cell specific volume obtained as a function of temperature, this data was compared against the experimental data available, and when necessary to data obtained via predictive methods. The molecular packing model ability to predict the glass transition temperature was used as criteria to validate de amorphous cell, to be used in the molecular dynamic' simulations allow the matrix to be locally flexible and coupled to the classic molecular dynamics simulation. The resulting self diffusion coefficients for the polyimide, BAAF, 6FDA-ODA, PMDA­ODA and BA-20DA for the gases O2, N2 e CO2 were compared to the experimental data. The lack of quality experimental diffusion data available for polyimide membranes for larger penetrants as water and ethanol, showed up as a good opportunity to assess the predictive capability of the molecular dynamic simulation for self diffusion coefficients, considering the relevant technological relevance of polyimide membranes for pervaporation process. The data of self diffusion coefficient produced by the predictive version of free-volume theory after Vrentas and Duda, was compared with the data produced via coupled molecular dynamic simulation for the water and ethanol penetrants, showing the relevance of both theories for the prediction of penetrants kinetic in complex polymeric matrixes / Doutorado / Ciencia e Tecnologia de Materiais / Doutor em Engenharia Química

L'observation et l'étude des milieux moléculaires tel que le milieu interstellaire requièrent une connaissance détaillée des vitesses des processus de peuplement radiatifs et collisionnels afin d'accéder aux caractéristiques physiques (températures, densités, abondances des molécules, ...) de ces milieux. Les hydrures d'azote sont très présents dans les milieux interstellaires où ils s'avèrent être des intermédiaires de réaction important dans la chimie de l'azote. L'interprétation des observations des hydrures d'azote réalisées grâce au satellite HERSCHEL et l'interféromètre millimétrique ALMA, nécessite de connaître avec suffisamment de précision les taux de collision de ces molécules. Nous nous sommes donc intéressés dans cette thèse à la détermination des taux de collisions inélastiques des hydrures NH, NH2 et NH3 avec Ne, H2 et H, respectivement. A partir de surfaces d’énergie potentielle, les sections efficaces ont été obtenues pour les trois systèmes par la méthode exacte des équations couplées en utilisant les codes de dynamique moléculaire MOLSCAT et HIBRIDON. Les taux de collision sont ensuite obtenus pour des températures allant de 5 à 200 K. Enfin, les nouveaux taux de collisions de NH2 avec H2 ont été utilisés dans un code de transfert radiatif afin de reproduire les observations de NH2 en direction d'un nuage de formation d’étoile massive W31C. Nous montrons que les nouveau taux de collisions calculés apportent des contraintes sur les conditions physiques du nuage moléculaire. / Observation and study of interstellar molecular clouds require the knowledge of molecular data to derive the physical conditions (temperature, gas density, molecular abundance) of these media. Nitrogen hydrides are highly abundant species in the interstellar medium and they are found to be important reaction intermediates in the nitrogen chemistry. The interpretation of nitrogen hydrides observations from the HERSCHEL spatial observatory and the ALMA interferometer, requires accurate collisional rate coefficients of these molecules. The present thesis focuses on the determination of new rate coefficients for NH, NH2 and NH3 molecules in collision with Ne, H2 et H, respectively. Inelastic cross sections for the rotational excitation of all the studied systems have been computed with a close coupling method using the molecular dynamic codes MOLSCAT and HIBRIDON. The cross sections are then used to calculate the collisional rate coefficients for temperatures ranging from 5 to 200 K. The new rate coefficients were included in radiative transfer calculations in order to model the observed transitions of NH2 towards high-mass star-forming region W31C. We show that using the previously published rate coefficients instead of these new ones have a significant impact on the modeling, leading to important differences on the density, abundance and on the OPR of NH2. The new data will allow to put interesting constraints on the physical condition of the molecular cloud.

Pontine et Reptine constituent de nouvelles cibles thérapeutiques encore très méconnues à ce jour. Outre leur activité ATPase, les complexes multimériques de Pontine et Reptine ont été décrits comme des hélicases capables d’ouvrir les acides nucléiques. La modélisation moléculaire constitue un outil puissant pour l’étude des systèmes protéiques et c’est pourquoi une approche par docking et dynamique a été envisagée. Au vue de la taille d’un complexe à douze sous-unités, les simulations prenant en compte tous les atomes se sont avérées trop coûteuses en termes de puissance de calcul. Une approche mésoscopique,appelée gros-grains, a donc été utilisée pour réduire le nombre de particules à traiter. Legain de temps de calcul offert par ce modèle nous a permis d’étudier les complexes de Pontine et Reptine en présence de partenaires de type ligands, l’ATP et l’ADP, et de type acide nucléique. Par le biais d’un retour au niveau atomique, une ouverture de la double hélice d’ADN a pu être observée ainsi qu’une orientation préférentielle des brins. Des hypothèses mécanistiques de l'activité hélicase du complexe ont alors pu être formulées sur la base de ces résultats. / Pontin/Reptin complexes offer new therapeutic opportunities despite the fact they are still notwell known. In addition to their ATPase activity, multimeric complexes of Pontin/Reptin were reported as hélicases able to unwind nucleic acids. Molecular modeling techniques are a powerful tool to study proteins, both a docking and molecular dynamics were applied.Considering the size of a twelve sub-units complex, simulations taking into account all atoms were too expensive in terms of computational costs. A mesoscopic approach, called coarse grain,was used to reduce the number of particles. The calculation time saved with this model allowed the study of Pontin/Reptin complexes in the presence of diverse partners like small ligands (ATP or ADP) and/or nucleic acids. Reverse transformation from coarse-grain to the atomic level led to a DNA double helix opening along to the single strands rearrangement.Several mechanistic hypotheses for the complex helicase activity were formulated from these results.

Le travail présenté dans ce mémoire de thèse est consacré aux études théorique et expérimentale du profil spectral des raies d'absorption de la vapeur d'eau, une espèce clé dans l'atmosphère de la Terre. Le but de ce travail est de proposer une approche générale permettant de modéliser précisément la forme des raies d'absorption de H2O.La première partie de cette thèse porte sur la mesure des paramètres spectroscopiques de H2O pur et de H2O dans l'air dans l'infrarouge proche en utilisant un système de diode laser à cavité externe et la technique de spectroscopie d'absorption directe. Différents modèles de profil spectral existants sont utilisés pour ajuster les spectres mesurés. Les résultats montrent que le profil de Voigt habituel mène à de larges différences avec les spectres mesurés et qu'il est nécessaire de prendre en compte à la fois les changements de vitesse et les dépendances en vitesse des paramètres collisionnels pour décrire correctement le profil spectral. Dans la deuxième partie, une nouvelle modélisation du profil spectral de H2O est proposée. Le modèle développé est basé sur des résultats obtenus à partir de simulations de dynamique moléculaire et de calculs semi-classiques. Ce modèle tient compte à la fois des effets de changements de vitesse dus aux collisions et des dépendances en vitesse des paramètres collisionnels. En particulier, nous avons montré qu'il est important, pour H2O, de prendre en compte la corrélation entre les changements de la vitesse et ceux de l'état interne. Le modèle proposé est en très bon accord avec des spectres de H2O (H2O/H2O, H2O/N2 et H2O/Air) mesurés par différentes techniques et pour de larges gammes de pression et domaine spectral. En raison de sa complexité et de son temps de calcul élevé, l'utilisation du nouveau modèle est difficile dans des applications pratiques telles que les calculs de transfert radiatif. Dans la troisième partie, ce nouveau modèle est donc utilisé comme une référence afin de tester les différentes approches simplifiées existantes. Les résultats montrent que le modèle pCqSDHC (partially-Correlated quadratique-Speed-Dependent Hard-Collision) est le plus adapté pour modéliser le profil spectral des raies isolées de H2O, mais aussi d'autres systèmes moléculaire. Il permet en effet un très bon compromis entre la précision et l'efficacité demandée dans des applications pratiques / This work is devoted to a theoretical and experimental study of the spectral shape of isolated transitions of water vapor, a key species of the Earth atmosphere. The purpose of these studies is to develop an accurate line-shape model taking into account different velocity effects affecting the spectral shape of H2O lines. In the first part of this thesis, spectroscopic line parameters of pure H2O and H2O diluted in air have been measured using an external cavity diode laser and a long-path absorption cell. Different existing line-shape models have been used to adjust the measurements. The results show that the widely-used Voigt profile leads to large differences with measured spectra and that it is necessary to take into account both the velocity changes and speed dependence effects to correctly model H2O line shapes. The second part of this work is devoted to the development of a new line-shape model, based on the results obtained from classical molecular dynamics simulations and semi-classical calculations. Both collision-induced velocity changes and speed dependence effects are taken into account by this model. Furthermore, we also show that the correlation between velocity changes and internal-state changes has to be accounted for to correctly describe H2O line shapes. Spectra of pure H2O, H2O in N2 and in air, calculated with the new model are in excellent agreement with those measured by different techniques and for large ranges of pressure and spectral domain. Its complexity and its large computational cost make the new model difficult to use for practical applications such as atmospheric radiative transfer. It is thus used, in the third part, as a “benchmark” in order to test different simplified line profiles and then to choose the proper one to fit measured spectra and to be used for atmospheric spectra prediction. The results show that the pCqSDHC (partially-Correlated quadratic-Speed-Dependent Hard-Collision) model is the most adapted to represent the line shape of H2O, but also of other molecules. This model offers a very good compromise between accuracy and computation efficiency and can be easily used in different practical applications

Dans le combustible nucléaire UO2, utilisé dans les réacteurs à eau pressurisée (REP), le Cs, élément volatil compte parmi les produits de fission (PF) les plus abondamment produits. De plus, l’isotope 137Cs est connu pour être particulièrement radiotoxique. En cas d’accident, le relâchement de cet isotope est donc problématique et son étude est cruciale pour la sûreté nucléaire. En France, l’IRSN (Institut de Radioprotection et de sureté nucléaire) développe des codes de prédictions du relâchement des PF depuis le combustible, tels que MFPR (Module for Fission Product Release). Ces codes nécessitent d’être alimentés par des données fondamentales sur le comportement des PF. Ainsi, la connaissance des coefficients de diffusion de ces éléments dans la matrice combustible en fonction de la température et de l’atmosphère (pouvant oxyder le combustible en UO2+x) est primordiale. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse, menée en collaboration avec l’IRSN, est d’étudier la migration du Cs dans le dioxyde d’uranium stœchiométrique et sur-stœchiométrique, en conditions représentatives d’un fonctionnement normal et accidentel d’un REP, avec et sans la présence de Mo. Ce dernier est un PF abondamment produit qui agit comme tampon d’oxydation du combustible et est capable d’avoir des interactions chimiques avec le césium. De telles interactions pourraient affecter le comportement du Cs, et donc son relâchement depuis le combustible. Il a donc été nécessaire d’envisager les éventuelles interactions entre le Cs et le Mo dans le cadre de notre étude. La démarche expérimentale a consisté à simuler la présence de Cs et/ou Mo dans des pastilles d’UO2 ou d’UO2+x. par implantations ioniques des isotopes stables 133Cs et/ou 95Mo. Des recuits à haute température (950-1600°C) sous atmosphère contrôlée ou des irradiations en régime électronique couplées en température ont ensuite été réalisés, permettant d’induire la migration du Cs et du Mo. La spectrométrie de masse à ionisation secondaire (SIMS) a été utilisée pour suivre l’évolution des profils de concentration des éléments implantés, permettant d’extraire les coefficients de diffusion apparents du Cs dans UO2 et UO2+x en fonction des différents traitements. Une étude complémentaire de la microstructure a été réalisée par spectroscopie Raman et microscopie électronique en transmission (MET). Le Cs est très mobile dans UO2 sous atmosphère réductrice même si une partie et piégée sous forme de bulles à faible profondeur. Nous avons mis en évidence que la présence de Mo diminuait fortement cette mobilité. La même tendance est observée dans UO2+x sous atmosphère oxydante. Néanmoins les mécanismes d’immobilisation du Cs par le Mo diffèrent selon les conditions redox de recuit. En atmosphère réductrice, les expériences MET ont montré la formation de paires bulles de Cs-précipités métalliques de Mo dans les échantillons co-implantés. En atmosphère oxydante, l’absence de mobilité du Cs pourrait être liée à l’oxydation du Mo rendant possible des interactions chimiques Cs-Mo. Pour la première fois, des potentiels semi-empiriques ont été utilisés pour réaliser des calculs de dynamique moléculaire sur la diffusion du Cs et du Mo dans UO2 et UO2+x. Ces calculs nous ont aussi permis de caractériser les mécanismes de diffusion de l’oxygène dans ces matériaux en présence de ces deux PF / In the nuclear fuel UO2, which is widely used in Pressurized Water Reactor (PWR), Cs is a volatile element and is one of the most abundant fission product (FP). Furthermore, 137Cs is known to be highly radiotoxic. During a hypothetical accident, release of Cs would be particularly problematic for the environment. Hence, study of this element is of major concern for nuclear safety. To assess this issue, the French nuclear safety institute (IRSN) develops codes to predict FP release from nuclear fuel in normal and accidental conditions. This code requires fundamental data on FP behavior such as diffusion coefficient of these elements in UO2 as a function of temperature and atmosphere conditions (leading to UO2+x formation in oxidative conditions). The aim of this PhD, supported by the IRSN, is to study Cs migration in stoichiometric and hyper-stoichiometric uranium dioxide with and without the presence of Mo, in normal and accidental conditions of a PWR. This latter element is also an abundant FP, which is important to consider because it acts as an oxygen buffer in the fuel and may interact chemically with Cs. Such interactions may affect Cs behavior, hence its release from the fuel. Therefore, Cs-Mo interactions are considered in our study. The experimental procedure consists in simulating the Cs and/or Mo presence in UO2 and UO2+x pellets by ion implantation of stable isotopes 133Cs and/or 95Mo. Then, high temperature annealing (950 °C - 1600 °C) under controlled atmosphere or electronic excitations induced by irradiation coupled with temperature are performed to induce Cs and Mo migration. Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) is used to follow the concentration profile evolution of these elements, allowing extracting effective diffusion coefficients of Cs in UO2 and UO2+x as a function of irradiation or thermal treatment. Microstructure characterizations were made by Raman spectroscopy and transmission electron microscopy (TEM). We show that Cs is mobile in UO2 under reducing atmosphere, even though some of the Cs is trapped in Cs-bubbles located near the surface. We evidence that Mo presence prevents Cs to be mobile. The same tendency is observed in UO2+x under oxidizing atmosphere. Nevertheless, Cs immobilization mechanisms in presence of Mo vary upon redox conditions used during annealing. In reducing conditions, TEM experiments showed formation of Cs bubbles associated with Mo metallic precipitates in co-implanted samples. In oxidative conditions, absence of Cs mobility could be explained by Mo oxidation leading to possible Cs-Mo chemical interactions. For the first time, semi-empirical potentials were used to perform molecular dynamic (MD) calculations on Cs and Mo diffusion in UO2 and UO2+x. These simulations also allowed characterizing oxygen diffusion mechanisms in these matrixes in presence of Cs and Mo

Bien que largement étudiés, les mécanismes fondamentaux de prise de décision dans les processus de différenciation cellulaire restent mal compris. Les théories déterministes, souvent basées sur des études populationnelles, atteignent rapidement leur limite lorsqu’il s’agit d’expliquer les différences de choix individuels de cellules, pourtant exposées au même environnement. L’objectif de ma thèse est donc d’étudier les premières étapes de la différenciation des cellules hématopoïétiques à l’échelle de la cellule unique, par des analyses transcriptomiques, protéomiques et morphologiques. Ce travail a été effectué sur deux modèles de différenciation : les lymphocytes T régulateurs et les cellules CD34+ humaines issues de sang de cordon. Nous avons observé le comportement de ces cellules uniques après stimulation. Grâce à la combinaison de la microscopie en time lapse et des analyses moléculaires réalisées à l’échelle de la cellule individuelle, nous avons pu démontrer que le choix du devenir cellulaire n’était pas unique, programmé. La cellule passe d’abord par un état dit « multi-primed », métastable où elle exprime des gènes de plusieurs lignées différentes, puis elle passe par une phase dite « incertaine », instable où elle hésite entre deux phénotypes avant de se stabiliser dans un état fixe. Nos observations sont cohérentes avec une explication stochastique de la prise de décision. La différenciation serait donc un processus spontané, dynamique, fluctuant et non un processus prédéterminé. Les décisions du destin cellulaire sont prises séparément par les cellules individuelles. / Despite intensively studies, the fundamental mechanisms of cell fate decision during cellular differentiation still remain unclear. The deterministic mechanisms, often based on studies of large cell populations, cannot explain the difference between individual cell fates choices placed in the same environment. The aim of my thesis work is to study the first steps of hematopoietic cell differentiation at the single cell level thanks to transcriptomic, proteomic and morphological analyses. Two differentiation models have been used: T regulatory lymphocytes and human cord blood-derived CD34+ cells. The behavior of individual cells following stimulation has been analyzed. Using time-lapse microscopy coupled to single cell molecular analyses, we could demonstrate that the cell fate choice is not a unique, programmed event. First, the cell reaches a metastable “multi-primed” state, which is characterized by a mixed lineage gene expression pattern. After transition through an “uncertain”, unstable state, characterized by fluctuations between two phenotypes, the cell reaches a stable state. Our observations are coherent with a stochastic model of cell fate decision. The differentiation is likely to be a spontaneous, dynamic, fluctuating and not a deterministic process. The cell fate decisions are taken by individual cells.

Poorly water-soluble drugs (PWSDs), to date, require advanced formulation techniques to improve solubility and achieve the required plasma concentration to show a therapeutic effect when orally administered. Lipid-based formulations (LBFs) are an enabling strategy that is being used to improve the oral delivery of PWSDs. The aim of this study was to investigate the effect of lipid-based formulation, Type IIIA-LC, on the solubilization patterns of PWSDs, namely, carvedilol and felodipine. Solubility studies, for both drugs, were performed with LBF dispersed in -1) dog intestinal fluid (DIF), and 2) water, to identify and compare the extent of solubility in different matrices, and in silico to identify interesting patterns with any correlations in experimental and computational data. Solubility studies showed that carvedilol had better solubility in LBF when compared to felodipine. Computational studies showed that both drugs solubilized in the colloid in both digested and undigested states. Effect of drug loading had no significant difference on the solubilization patterns of both drugs. The maximum drug loading done was for 100 molecules though there is the possibility of the colloid having a higher capacity. Digestion did not seem to have a significant effect on the distribution of both drugs. In vitro and in silico data were in qualitative agreement and therefore, this computational model can be further used to study the specific processes causing solubilization, improvement, and development of new LBFs.

Les amylosaccharases sont des α-transglucosylases catalysant naturellement la synthèse exclusive d’α-1,4-glucanes à partir du saccharose. Ces enzymes produisent également des composés secondaires et, en particulier, des isomères du saccharose tels que le turanose et le tréhalulose.L’objectif de cette thèse a consisté à utiliser un panel de techniques biophysiques et biochimiques afin d’étudier les amylosaccharases de Deinococcus geothermalis (ASDg) et Neisseria polysaccharea (ASNp) afin de comprendre les relations unissant la structure, la flexibilité et la fonction de ces enzymes.La première étude rapporte la caractérisation structurale et biophysique de l’amylosaccharase la plus thermostable connue à ce jour, l’amylosaccharase de Deinococcus geothermalis. La structure tridimensionnelle révèle une organisation dimérique en solution, jamais rapportée pour une amylosaccharase. Grâce à l’analyse de l’interface dimérique et à des travaux d’analyse de séquences, une séquence signature de dimérisation a été identifiée. En rigidifiant la structure de l’ASDg, la structure quaternaire contribue à l’augmentation de la stabilité thermique de la protéine. La spécificité de production des isomères du saccharose par les amylosaccharases a été étudiée. Les résultats décrivent, pour la première fois, les structures de l’ASDg et de l’ASNp en complexe avec le turanose. Dans l’ASNp, les résidus clefs forcent le résidu fructosyle à adopter une conformation linéaire positionnant idéalement le O3’ pour sa glucosylation expliquant la formation préférentielle de turanose par l’enzyme. Ces résidus sont absents ou placés différemment dans l’ASDg. En conséquence, l’ASDg lie principalement les formes furanoses du fructose avec un faible réseau d’interactions. La topologie du sous-site +1 permet donc différents modes de liaison du fructose en accord avec la capacité de l’ASDg à produire une plus grande quantité de tréhalulose par rapport à l’ASNp.Dans la seconde étude, des techniques de mutagenèse à saturation et combinatoire ciblées sur les acides aminés voisins du site actif ont été utilisées pour modifier la spécificité d'accepteur de l’ASNp. Le criblage de trois bibliothèques semi-rationnelles représentant un total de 20 000 variants a permis d’isoler trois doubles mutants montrant une amélioration spectaculaire de spécificité à la fois vis-à-vis du saccharose, le substrat donneur et de l’accepteur α-allyl-N-acetyl-2-désoxy-α-D-glucopyranoside par rapport au type sauvage de l’ASNp. De tels niveaux d'amélioration d'activité n'ont jamais été signalés auparavant pour cette classe d’enzymes actives sur les sucres. L’analyse par cristallographie des rayons X de la structure des meilleures enzymes mutantes suivie par des simulations de dynamique moléculaire ont montré une rigidité locale du sous-site -1 couplée à une flexibilité des boucles impliquées dans la topologie du site actif. Ces faits pourraient être à l’origine des performances catalytiques accrues de ces enzymes mutantes. L'étude démontre l'importance, lors de la conception des bibliothèques de variants, de tenir compte de la conformation locale des résidus catalytiques ainsi que de la dynamique des protéines au cours du processus catalytique / Amylosucrases are sucrose-utilizing α-transglucosylases that naturally catalyze the synthesis of α-glucans, exclusively linked through α-1,4 linkages. Side-products and in particular sucrose isomers such as turanose and trehalulose are also produced by these enzymes.The objective of this thesis concerned the application of biophysical and biochemical techniques to study amylosucrases from Deinococcus geothermalis (DgAS) and Neisseria polysaccharea (NpAS) in order to investigate relationships between structure, flexibility and function of these enzymes.In the first study, we report the first structural and biophysical characterization of the most thermostable amylosucrase identified so far, the amylosucrase from Deinoccocus geothermalis. The 3D-structure revealed a homodimeric quaternary organization, never reported before for other amylosucrases. A sequence signature of dimerization was identified from the analysis of the dimer interface and sequence alignments. By rigidifying DgAS structure, the quaternary organization is likely to participate in the enhanced thermal stability of the protein. Amylosucrase specificity with respect to sucrose isomer formation (turanose or trehalulose) was also investigated. We report the first structures of the DgAS and NpAS in complex with turanose. In NpAS, key residues were found to force the fructosyl moiety to bind in an open state with the O3' ideally positioned to explain the preferential formation of turanose by NpAS. Such residues are either not present or not similarly placed in DgAS. As a consequence, DgAS binds the furanose tautomers of fructose through a weak network of interactions to enable turanose formation. Such topology at subsite +1 is likely favoring other possible fructose binding modes in agreement with the higher amount of trehalulose formed by DgAS.In the second study, iterative saturation mutagenesis and combinatorial active site saturation focused on vicinal amino acids were used to alter the acceptor specificity of NpAS and sort out improved variants. From the screening of three semi-rational sub-libraries accounting in total for 20,000 variants, we report here the isolation of three double-mutants displaying a spectacular specificity enhancement towards both sucrose, the donor substrate, and the α-ally-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside acceptor compared to wild-type N. polysaccharea amylosucrase. Such levels of activity improvement have never been reported before for this class of carbohydrate-active enzymes. X-ray structural analysis of the best performing enzymes followed by Molecular Dynamics simulations showed both local rigidity of the -1 subsite and flexibility of loops involved in active site topology which both account for the enhanced catalytic performances of the mutants. The study well illustrates the importance when designing enzyme libraries of taking into account the local conformation of catalytic residues as well as protein dynamics during the catalytic process

As ligações de hidrogênio (LH), fundamentais na determinação da estrutura da água, proteínas, etc., são muito importantes no reconhecimento molecular e nos mecanismos de reações enzimáticas. A determinação da energia das LHs intramoleculares em proteínas e intermoleculares entre uma proteína e o solvente água, porque fornece informações sobre a estrutura secundária, terciária e quaternária das proteínas. Um método para quantificar e qualificar as LHs foi desenvolvido utilizando critérios de distância, geométricos e energéticos a partir das trajetórias obtidas por simulações de dinâmica molecular. O método foi testado com o monômero de uma fosfolipase A2 homodimérica, sem atividade catalítica, isolada do veneno da Bothrops asper(BaspMT-II). No dímero, a análise das LHs mostrou que elas são também essenciais na manutenção da estrutura quaternária. Essa análise permitiu identificar movimentos do tipo dobradiça acompanhados da formação transitória, na interface dimérica, de LHs controladas pelo triptofano na posição 77. Esses movimentos podem estar associados à ação danosa às membranas, uma vez que podem promover a inserção da região C-terminal na membrana. Estudos prévios mostraram que o peptídeo sintético (3Y codificado pelos aminoácidos 115-129 da BaspMT-II) apresenta atividade bactericida e citolítica. Um outro peptídeo (3W), mutante de 3Y, no qual três resíduos tirosina são substituidos por triptofano, apresenta um aumento do dano às membranas e do efeito miotóxico. Os mecanismos de ação desses peptídeos e as suas estruturas foram estudados por dinâmica molecular, dicroísmo circular (DC), microscopia de fluorescência e monocamadas de Langmuir (Mlang). As adsorções dos peptídeos em monocamadas de ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA) e dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) se processam por mecanismos diferentes ocasionados pelas diferentes naturezas físico-químicas dos resíduos tirosina e triptofano. A microscopia de fluorescência acoplada a Mlang de DMPA com 3W adsorvido mostra um aumento da fluidez da monocamada, enquanto que o 3Y modifica os domínios do DMPA para pequenas estruturas circulares. Foram realizadas simulações dos peptídeos 3Y e 3W em meio aquoso e nas regiões interfaciais água/n-hexano e água/bicamadas de DMPC. Os resultados confirmam os obtidos por Mlang, demonstrando que os peptídeos interagem diferentemente com as membranas por adotar conformações alternativas definidas previamente. Essas conformações, diferentes das observadas em meio aquoso, dependem da natureza da interface. As estruturas encontradas no final das simulaçoes corroboram o mecanismo proposto por Mlang, assim como as estruturas sugeridas por DC. Isso sugere que a atividade biológica reduzida do peptídeo 3Y ocorre porque os seus dois resíduos Leu se adsorvem na interface sem penetrá-la. Ao contrário de 3W, os resíduos carregados do peptídeo 3Y não estão localizados corretamente para promover uma interação suficientemente atrativa para permitir a sua inserção na membrana celular. / Hydrogen bonds (HB) are highly important in the determination of the structure of the water and proteins. They also play a important role in molecular recognition and in enzyme reaction mechanisms. The determination of protein/water intermolecular and protein intramolecular HB energies provide information with respect to the formation and stabilization of secondary, tertiary and quaternary protein structure. A method that quantifies and qualifies the properties of HB was developed using distance, geometric and energy criteria as applied to data obtained from the atomic trajectories generated by molecular dynamics simulations. The method was tested with a monomer of a catalytically inactive homodimeric phospholipase A2 from Bothrops asper(BaspMT-II) venom. HBs at dimmer interface are essential for maintaining the quaternary structure, and are highly conserved during hinge-like movements of the dimmer. HB formed by tryptophan residue at position 77 controls this movement. These motions can be associated to the membrane damaging action since they facilitate the insertion of the C-terminus into the cellular membrane. Previous studies have shown that synthetic peptide (3Y, coding the amino acids 115-129 of BaspMT-II ) presents bactericidal and cytolitic activities. A peptide variant ( 3W ), in which tyrosine residues were substituted by tryptophan residues, presents an enhanced membrane damaging activity increased miotoxic effect. The mechanism of action of the peptides and their structures were studied by molecular dynamics simulations, circular dichroism (CD), fluorescence microscopy and Langmuir monolayers (Mlang). The adsorption of the peptides on a monolayer composed of dimiristoyl phosphatidic acid (DMPA) and dimiristoylphosphatidyl choline (DMPC) occurs through different processes due to the differences in the physic-chemical nature of the tyrosine and tryptophan residues. Fluorescence microscopy together with Mlang of DMPA with adsorbed 3W indicates an increase of the membrane fluidity while small circular domains are formed with DMPA. Simulations were conducted with the 3Y and 3W peptides in aqueous media, is a water/n-hexane and water/DMPC bilayers. The results confirm the Mlang results, showing that the peptides interact differently with the membranes by adopting alternative previously defined conformations. These two conformations, both of which are different to those observed in water, are dependent of the nature of the interfaces. The final simulated configurations confirm the mechanism proposed by Mlang and the structures proposed by CD. It is suggest that the reduced biological activity of the 3Y peptide is due to the two Leu residues that only adsorb to the cellular membrane without penetrating the bilayer. In contrast to the 3W peptide, no charged residue is correctly located to promote the interaction and insertion of the 3Y peptide into the membrane.