Os macrófagos (M<font face=\"Symbol\">&#934;s) compõem uma população celular altamente heterogênea, e são extensivamente adotados como ferramenta experimental, em especial os M<font face=\"Symbol\">&#934;s peritoneais murinos. O objetivo desse trabalho foi revisitar o peritônio dando ênfase à heterogeneidade dos M<font face=\"Symbol\">&#934;s. Duas populações distintas compõem os M<font face=\"Symbol\">&#934; peritoneais residentes: LPM (Large Peritoneal Macrophage) e SPM (Small Peritoneal Macrophage). Todas as condições proporcionadas in vivo resultam no desaparecimento de LPM, aumento de SPM e influxo de monócitos. Em paralelo, ocorre uma diminuição na marcação para <font face=\"Symbol\">b-galactosidase (marcador de senescência) e um aumento na produção de Óxido Nítrico (NO) e na frequência de células F4/80+IL-12+ após a subseqüente estimulação com LPS e IFN-<font face=\"Symbol\">g, que parece ser às custas da SPM. Além disso, parece haver uma especialização onde LPM assume um perfil M2 após inoculação de zimosan, e SPM um perfil M1 após reestimulo com LPS ou IFN-<font face=\"Symbol\">g.Esses dados sugerem que renovação celular que ocorre no peritônio após estimulação, parece ser benéfica para a resposta celular frente a estímulos infecciosos. / Macrophages (M<font face=\"Symbol\">&#934;) are a heterogeneous population extensively adopted as experimental model, especially peritoneal M<font face=\"Symbol\">&#934;. Then, the aim of this work was to revisit peritoneal cavity looking for M<font face=\"Symbol\">&#934; heterogeneity. Peritoneal M<font face=\"Symbol\">&#934; comprise two distinct subpopulations: LPM (Large Peritoneal Macrophage) and SPM (Small Peritoneal Macrophage). The different conditions proporcioned in vivo, resulted in the disappearance of LPM and the accumulation of SPM and monocytes. In parallel, adherent cells isolated from stimulated mice displayed reduced staining for <font face=\"Symbol\">b-galactosidase (senescence marker). Further, an increase in nitric oxide (NO) production and IL-12-producing cells frequency was observed in response to LPS/FN-<font face=\"Symbol\">g re-stimulation. In addition, there was a specialization of activation profile marked by a M2 activation profile after zymosan administered in vivo assumed by LPM, and SPM showed a bias to M1 after re-stimulation with LPS/IFN-<font face=\"Symbol\">g. Then, the substitution of LPM by a robust SPM and monocytes in response to infectious stimuli greatly improves peritoneal effector activity.

INTRODUÇÃO: A urticária crônica é caracterizada pelo aparecimento de placas eritêmato-edematosas, pruriginosas, que perduram por mais de seis semanas. A etiologia é desconhecida na maioria dos pacientes sendo definida como idiopática (UCI). A desregulação imunológica na UCI pode ser devido a distúrbios na produção de citocinas e quimiocinas. OBJETIVOS: Avaliar o perfil citocinas e quimiocinas em pacientes submetidos ao teste de soro autólogo (ASST) avaliando os soros, a expressão de RNAm e a expressão intracelular de células mononucleares do sangue periférico (CMN) induzidas por estímulos policlonais. METODOLOGIA: Pacientes com UCI (n=37) foram selecionados do Ambulatório de Dermatologia do HC-FMUSP e submetidos ao ASST. O grupo controle foi constituído por indivíduos saudáveis (n=33). Os níveis séricos de citocinas e quimiocinas foram determinados por citometria de fluxo ou por ELISA e a expressão de RNAm de citocinas foi determinada por Real-Time PCR. RESULTADOS: Uma elevação dos níveis séricos de TNF-, IL-6, IL-1, IL-12p70 e IL-10 foi detectada nos pacientes com UCI comparados ao grupo controle, independente da resposta ao ASST. A secreção in vitro de citocinas por CMN estimuladas por fitohemaglutinina (PHA) mostrou aumento da produção de IL-2 nos pacientes com UCI e de IL-17A e IL-10 no grupo ASST positivo em relação ao grupo controle. A expressão de RNAm para IL-10 em CMN, foi diminuída no grupo ASST negativo comparado ao grupo controle. Além disto, um aumento da capacidade linfoproliferativa ao mitógeno Pokeweed foi observado nos pacientes ASST positivo em relação aos indivíduos controles. Os níveis séricos de CXCL8, CCL2, CXCL10 e CXCL9 foram encontrados elevados nos pacientes com UCI em relação aos controles. A secreção de quimiocinas in vitro, foi observado aumento dos níveis basais de CCL2 pelas CMN dos pacientes em relação aos controles, que se elevaram em resposta a enterotoxina A de Staphylococcus aureus (SEA). Já o estímulo com PHA promoveu aumento na produção de CXCL8 e CCL5 pelas CMN dos pacientes. A expressão intracelular de CXCL8 foi detectada principalmente nas células CD14+. A intensidade média de fluorescência (MFI) e a porcentagem da expressão de CXCL8 em CD14+ nos níveis basais e estimulados com SEA encontram-se diminuídos nos pacientes com UCI comparado ao grupo controle. A expressão intracelular de CCL2 em células CD14+ mostrou uma queda na porcentagem dos níveis basais somente nos pacientes ASST negativo em relação ao grupo controle. Além disto, em condições basais de cultura houve um aumento na porcentagem da expressão de CCR5 em células T CD8+ de pacientes com UCI, em função do aumento no grupo ASST positivo. CONCLUSÕES: Os resultados enfatizam o conceito de desequilíbrio imunológico na UCI, independente da resposta ao ASST, evidenciado pelo aumento na secreção de quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias. Estes dados sugerem que na UCI, os linfócitos e monócitos estão ativados, os quais podem contribuir para a imunopatogênese da doença / INTRODUCTION: Chronic urticaria is skin disorder characterized by recurrent and transitory itchy weals occurring regularly for more than 6 weeks. The aetiology is not identified in most patients being considered as idiopathic (CIU). The immunological dysregulation in CIU could be due to a disturbed cytokines and chemokines production. OBJECTIVES: To evaluate the pattern of cytokine and chemokine in CIU patients who undergone autologous serum skin test (ASST), assessing sera, mRNA expression and intracellular expression of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) through the secretion upon induced by policlonal stimuli. METHODS: CIU patients (n=37) were selected from the Dermatological Outpatient Clinic of the Hospital das Clínicas de São Paulo (HC-FMUSP) and submitted to the ASST. The control group consisted of healthy subjects (n=33). Cytokine and chemokine levels were assessed by flow cytometer and ELISA and mRNA expression was analyzed by Real-Time PCR. RESULTS: Elevated levels of TNF-, IL-6, IL-1, IL-12p70 and IL-10 were observed in sera from CIU patients compared to healthy control group. CIU patients also showed increased IL-2 production by PBMC stimulated with phytohemagglutinin (PHA). Moreover, it was observed higher IL-17A and IL-10 levels in the ASST+ group compared to control group. The IL-10 mRNA expression was diminished in the ASST- group compared to control group. Furthermore, an increased lymphoproliferative response to Pokeweed mitogen was observed in the ASST+ patients compared to healthy subjects. Seric levels of CXCL8, CCL2, CXCL10 and CXCL9 were higher in CIU patients. Regarding the in vitro chemokines secretion, it was detected higher basal levels of CCL2 in CIU patients, which was increased by Staphylococcus aureus enterotoxin A (SEA). Stimulation with PHA increased the CXCL8 and CCL5 production by CIU mononuclear cells. The main source of CXCL8 was the CD14+ cells. CIU CD14+ cells showed decreased mean fluorescence intensity and percentage of CXCL8 expression with and without SEA stimuli. The percentage of CD14+ producing CCL2 was lower in ASST- patients compared to healthy control subjects. Furthermore, in the absence of stimuli the percentage of CCR5-expressing CD8+ T cells was higher in CIU patients, mainly due to an increased expression by the ASST+ group. CONCLUSIONS: These results indicate an immunological dysregulation in CIU, without association to ASST response, which was evidenced by the increased production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. The data suggest a higher activation of monocytes and lymphocytes in CIU, which may contribute to its immunopathogenesis

Monócitos podem ser classificados em três subgrupos de acordo com o nível de expressão dos marcadores CD14 e CD16. Monócitos clássicos são os mais abundantes no sangue. Eles expressam um fenótipo CD14+CD16-CCR2+, conferindo a eles a habilidade de migrar rapidamente a sítios inflamatórios, através da resposta à quimiocina CCL2 (CC chemokine ligand 2). Aqui apresentamos a identificação e caracterização de uma expansão de um novo subgrupo de monócitos durante a infecção por SIV e HIV. Essas células são indistinguíveis dos monócitos clássicos quanto à expressão de CD14 e CD16; porém não expressam CCR2 de superfície. A análise do transcriptoma de células selecionadas confirmou que elas representam uma subpopulação distinta que expressa níveis mais baixos de citocinas inflamatórias e marcadores de ativação que as CCR2+. Elas exibem fagocitose alterada e quimiotaxia deficiente em resposta a CCL2 e CCL7, além de serem refratárias à infecção por SIV e apresentarem atividade antiproliferativa. Nós as denominamos monócitos clássicos atípicos CCR2- (ACC monocytes), e acreditamos que elas têm um papel importante na patogenia da AIDS, possivelmente refletindo uma resposta anti-inflamatória contra a excessiva imunoativação observada durante a infecção por SIV e HIV. Tratamento antirretroviral leva a um declínio dessa subpopulação tanto em macacos como seres humanos, sugerindo que a replicação viral é capaz de induzir esse fenótipo atípico / Monocytes have been categorized in three main subpopulations based on CD14 and CD16 surface expression. Classical monocytes are the most abundant subset in the blood. They express a CD14+CD16-CCR2+ phenotype, which confers on them the ability to migrate to inflammatory sites by quickly responding to CC chemokine ligand 2 (CCL2) signaling. Here we identified and characterized the surge and expansion of a novel monocyte subset during SIV and HIV infection. They were undistinguishable from classical monocytes regarding CD14 and CD16 expression, but did not express surface CCR2. Transcriptome analysis of sorted cells confirmed that they represent a distinct subpopulation that expresses lower levels of inflammatory cytokines and activation markers than their CCR2+ counterparts. They exhibited impaired phagocytosis and deficient chemotaxis in response to CCL2 and CCL7, besides being refractory to SIV infection and showing antiproliferative activity. We named these cells atypical CCR2- classical (ACC) monocytes, and believe they play an important role in AIDS pathogenesis, possibly reflecting an anti-inflammatory response against the extreme immune activation observed during SIV and HIV infection. Antiretroviral therapy caused this population to decline in both macaque and human subjects, suggesting that this atypical phenotype may be induced by viral replication

Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Ronei Luciano Mamoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T03:44:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_CamilaVicente_M.pdf: 3813230 bytes, checksum: eb3f394047f0186a26e4456a537b819c (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, que pode apresentar-se sob diferentes formas clínicas, dependendo da resposta imunológica do hospedeiro. Trabalhos recentes têm demonstrado a importância da resposta inata no direcionamento da resposta adaptativa. Células do sistema imune inato reconhecem patógenos por meio de receptores de reconhecimento padrão (PRRs). Dentre esses, podemos destacar a família dos receptores do tipo Toll (TLRs) e dos receptores de lectina do tipo C (CLRs), que possuem membros capazes de reconhecer antígenos fúngicos. Nosso trabalho teve por objetivo avaliar a expressão de TLR-1, TLR-2, TLR-4 e dectina-1 (CLR) em macrófagos e neutrófilos de indivíduos saudáveis, após exposição a células leveduriformes das cepas de alta (Pb 18) e baixa (Pb265) virulência de P. brasiliensis. Como controle positivo foram utilizados os ligantes específicos para TLR-4 (LPS) e TLR-2 e dectina-1 (zimosan). A análise por citometria de fluxo revelou a redução da expressão de TLRs e dectina-1, mais evidente em monócitos do que em neutrófilos e após 30 minutos de estimulação, indicando que o reconhecimento dos antígenos fúngicos resulta na rápida internalização dos receptores. Houve uma tendência a um aumento da expressão relativa do RNAm de TLR-2 e dectina-1 em resposta à estimulação fúngica, em especial à cepa Pb265. A análise da produção de citocinas (RNAm e proteína) mostrou que as células fúngicas induzem a produção de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias, mas razão TNF-a/IL-10 diminuída em resposta ao zimosan e leveduras Pb265 indica uma produção relativa maior IL-10 nestas condições, enquanto que o estímulo com Pb18 privilegia a produção de TNF-a. Leveduras de P. brasiliensis também estimulam a elevada produção de PGE2 tanto por macrófagos como por neutrófilos, indicando a importância deste mediador na relação parasita-hospedeiro. Em conjunto, nossos resultados sugerem a participação do TLR-2, TLR-4 e dectina-1 no reconhecimento e internalização do fungo, e conseqüente ativação da resposta imunológica ao P. brasiliensis. Além disso, no caso da infecção por Pb265 a indução de uma resposta inflamatória exacerbada seria contrabalançada pela maior produção de IL-10, o que levaria a um melhor controle da infecção pelo hospedeiro. / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is an endemic mycosis in Latin America caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The pattern of the immune responses to P. brasiliensis determines the disease progression and clinical outcome. Innate immune response is mediated by phagocytic cells, such as macrophage and neutrophils, which ingest and kill invading pathogens and then trigger the adaptive immune system through the secretion of cytokines and chemokines. The C-type like lectin receptors (CLR) and Toll-like receptors (TLRs) are the two main PRRs for fungal cells. The purpose of the present study was to evaluate the expression of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and dectin-1 (CLR) in monocytes and neutrophils from healthy individuals after stimulation with Pb18 (high virulence) and Pb265 (low virulence) yeasts of P. brasiliensis. As positive controls we used specific ligands to TLR-4 (LPS), TLR-2 and dectin-1 (zymosan). Our results demonstrated a decreased of TLRs and dectin-1 expression more evident on monocytes than on neutrophils as soon as 30 minutes after yeast cells stimulation. This decrease was similar to the one caused by zymosan stimulation and indicates that up binding the complexes are rapidly internalized. There was a tendency towards an increased TLR2 and dectin-1 mRNA expression in response to fungal cells, mainly Pb265. P. brasiliensis yeast cells induced the production of proinflammatory and antinflammatory cytokines (mRNA and protein) but the low ratio between TNF-a and IL-10 in response to zymosan and Pb265 point out to a preferential production of IL-10, while Pb18 predominantly induced TNF-a secretion. P. brasiliensis yeast cells also induced an elevated PGE2 production by monocytes and neutrophils showing the important role of this mediator in fungushost relationship. Altogether our results suggest the participation of TLR2, TLR-4 and dectin-1 in P. brasiliensis recognition and internalization and consequent activation of the immune response against the fungus. Moreover, concerning Pb265 stimulation the induction of an exacerbate inflammatory response could be counterbalanced by an increased IL-10 production, resulting in an efficient control of the infection by the host. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Os alimentos desempenham papel fundamental na nutrição e também na imunidade, pois podem conter substâncias que interagem direta ou indiretamente com o sistema imune, principalmente o de mucosas. Alguns polissacarídeos não-amido (PNAs) originados de plantas, algas e fungos comestíveis podem modular a função imune, contribuindo para a manutenção da saúde. A banana apresenta composição monossacarídica da parede celular similar à de plantas com efeitos imunomoduladores, permitindo formular a hipótese de que os PNAs dessa fruta também tenham essas propriedades. Assim, o objetivo foi extrair, purificar e caracterizar PNAs hidrossolúveis da polpa de banana das cultivares Nanicão e Thap Maeo e testá-los em cultivos de macrófagos RAW 267.4, células THP-1, macrófagos diferenciados por PMA THP-1 e células HL-60 in vitro avaliando a ação imunomoduladora através da dosagem de citocinas, NO e ensaios de fagocitose. As frações hidrossolúveis foram caracterizadas quanto ao seu conteúdo monossacarídico e ligações por hidrólise enzimática, identificando homogalacturonanos, mananos, arabinogalactanos, xilogalacturonanos e galactoglucomananos. As frações foram testadas para ausência de endotoxinas e viabilidade celular por MTT. Foram estabelecidas as doses não-tóxicas e ensaiadas as concentrações de 10, 50 e 200 &#181;g.ml-1 das frações polissacarídicas para os testes in vitro. Não houve toxicidade para macrófagos e monócitos, enquanto que para a linhagem de células pro-mielóciticas de leucemia humana HL-60, as frações se mostraram citotóxicas. Houve aumento de atividade fagocítica nas frações WSP, UFP e HTP quando comparadas ao controle negativo de células, assim como a produção de citocinas inflamatórias como IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, além da quimiocina IL-8 nas células oriundas de THP-1 e diminuição nos marcadores TLR-2 com aumento de CD14 nas células THP-1, além do aumento do tamanho celular promovido pelas frações polissacarídicas mostrando diferenciação para série granulocítica. Portanto, PNAs de ambas as cultivares de banana possuem potencial imunomodulador seja inflamatório, anti-inflamatório ou de diferenciação de células THP-1 imaturas in vitro. / Food plays a major role in nutrition as in immunity, as they may contain substances that interact directly or indirectly with the immune system, especially those located on mucous membranes. Some non-starch polysaccharides (NSPs) originate from plants, algae, and edible fungi can modulate immune function, contributing to the maintenance of health. The banana presents cell wall monosaccharide composition like the other plant polysaccharides with immunomodulatory effects allowing to formulate the hypothesis that this fruit NSPs also have these properties. The objective was to extract, purify and characterize water-soluble banana pulp NSPs of Nanicão and Thap Maeo cultivars and test them in vitro on cell lineages of RAW 267.4 macrophages, PMA differentiated THP-1 macrophages, THP-1 monocytes, and HL-60, evaluating their immunomodulatory action by the dosage of cytokines, NO and phagocytosis assays. Water-soluble fractions were characterized as to their content and monosaccharide linkages by enzymatic hydrolysis, identifying homogalacturonans, mannans, arabinogalactans, xylogalacturonan, and galactoglucomannans in its composition. Fractions were tested for the absence of endotoxins and cell viability by MTT. Non-toxic concentrations doses of 10, 50 and 200 &#181;g.ml-1 of the polysaccharide fractions were established for in vitro testing. The NSPs fractions WSP, UFP, and HTP tested promoted an increase in phagocytic activity in THP-1 PMA derived macrophages compared to negative control cells, as well as the production of inflammatory cytokines such as IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6. An increase in the THP-1 CD14 cell receptor and decrease in CD33, CD123, CD11c and TLR-2 receptors were promoted by the banana polysaccharides. Besides, there was an increase in cell size showing cell differentiation towards granulocyte line and demonstrating that NSPs from both cultivars were immunomodulatory with a capacity of immature cell differentiation and proving that in vitro screening test is an efficient method to test other foodborne substances with immunomodulatory potential.

Introdução: A nefrite lúpica (NL) é o maior preditor de morbidade e mortalidade em pacientes portadores de lupus eritematoso sistêmico. Recentes estudos mostram que a proteína quimiotática de monócitos (MCP-1) está implicada na ativação de células inflamatórias, afetando a progressão e a severidade da NL, e que a excreção urinária do MCP-1 (uMCP-1) está aumentada em pacientes com NL em atividade. Na literatura os dados sobre o polimorfismo do gene MCP-1 A(-2518)G e do seu receptor CCR2 V(-64)I sobre a susceptibilidade para nefrite lúpica ainda estão em discussão. Objetivos: Avaliar a associação entre o polimorfismo do gene MCP-1 e do seu receptor CCR2 em pacientes com NL e indivíduos saudáveis, além da associação de ambos os polimorfismos com parâmetros clínicos e histológicos nos pacientes portadores de NL. Além disso, avaliar a associação entre a excreção urinária do MCP-1 em pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade com parâmetros clínicos e histológicos. Pacientes e Métodos: As genotipagens do MCP-1 e do CCR2 foram realizadas em 197 pacientes com nefrite lúpica através da extração do DNA genômico, seguido da técnica de reação em cadeia da polimerase, utilizando-se primers específicos. A dosagem urinária do MCP-1 foi realizada em 34 pacientes com nefrite lúpica em atividade através da técnica de ELISA. Resultados: Foram estudados 197 pacientes portadores de nefrite lúpica, do sexo feminino, com idade média de 28±9,8 anos, sendo 65,5% de etnia branca e 34,5% não-branca, acompanhados em nosso ambulatório durante o período de 69±37,1 meses. Como grupo controle, utilizou-se um grupo de 220 indivíduos saudáveis do sexo feminino, pareados de acordo com idade e etnia. Quanto à distribuição do genótipo do MCP-1, evidenciou-se que a freqüência do genótipo GG foi significativamente maior nos pacientes portadores de nefrite lúpica quando comparado ao grupo controle (12,7%x5,0%) (p=0,019), enquanto que o genótipo AA apresentou maior freqüência no grupo controle, porém sem significância estatística (48,7%x56,8%). Com relação aos alelos, a freqüência do alelo A foi significativamente maior no grupo controle (75,9%x68%) (p=0,007) quando comparada aos pacientes com NL. Já em relação ao polimorfismo do CCR2, não foi observada nenhuma diferença na freqüência do genótipo entre os dois grupos, porém foi observada maior freqüência do alelo V no grupo controle (89,8%x86,3%) (p=0,046). Não houve associação entre o genótipo e alelos do MCP-1 e do CCR2 com a função renal no início e no final do estudo, marcadores imunológicos, manifestações clínicas (SLEDAI) e a classe histológica. Porém, observou-se um predomínio significante dos flares moderado e grave nos pacientes portadores dos genótipos AA e AG (p< 0,05) em relação ao genótipo GG, enquanto que, em relação à distribuição alélica do MCP-1 e ao CCR2, não se notou diferença estatística. Não se evidenciou diferença estatística entre as curvas de sobrevida renal funcional dos pacientes portadores de nefrite lúpica e os genótipos do MCP-1 e CCR2 e seus respectivos alelos. Notou-se diferença estatística na variação da creatinina sérica ao longo do seguimento (p<0,001). Foram também estudados 34 pacientes portadores de nefrite lúpica em atividade, do sexo feminino, com idade média de 28,4 ± 9,9 anos, sendo 26,5% pacientes de etnia branca e 73,5% de etnia não-branca. A dosagem do MCP-1 urinário foi realizada no início do quadro e após 3 e 6 meses de seguimento. Em relação ao uMCP-1, houve um aumento significante do mesmo no início do quadro renal quando comparado com 3 e 6 meses de tratamento (p<0,05). Evidenciou-se um aumento do uMCP-1 nos pacientes que apresentavam creatinina plasmática inicial > 1,2mg/dl (p<0,05), porém não houve associação entre uMCP-1 e a creatinina após 6 meses de tratamento. Não se observou associação entre os níveis de uMCP-1 com as manifestações clínicas (SLEDAI), classe histológica e marcadores imunológicos, exceto quanto ao anticorpo antifosfolípide, pois houve excreção aumentada do uMCP-1 em pacientes com anticorpo antifosfolípide positivo no início do quadro (p<0,05). Notou-se valores elevados do uMCP-1 nos pacientes que apresentaram flares grave e moderado em relação ao flare leve (p<0,05). Quanto à distribuição genotípica do MCP-1 em relação ao uMCP-1, foi observado uma associação do uMCP-1 em pacientes portadores dos genótipos AG e AA quando comparados ao genótipo GG (p<0,05). Já em relação à distribuição genotípica e alélica do CCR2, não se notou nenhuma diferença na freqüência dos mesmos e a dosagem de uMCP-1. Conclusões: Houve uma significante associação do genótipo GG do polimorfismo do MCP-1 em pacientes portadoras de NL na população estudada, além de uma associação entre os níveis do uMCP-1 com a severidade do flare renal e a função renal nas pacientes portadoras de NL. / Introduction: Lupus Nephritis (LN) contributes substantially to morbidity and mortality in patients with systemic lupus erythematosus. Literature data show monocyte chemoattractant protein (MCP-1) is implicated in the activation of inflamatory cells and has been suggested to affect the progression and severity of lupus nephritis and urinary MCP-1 levels (uMCP-1) are increased in LN patients during active renal disease. Literature data about genotype polymorphism of MCP-1 A(-2518)G and of its receptor CCR2 V(-64)I and susceptibility to LN is still open to discussion. Objectives: The aim of our protocol was to study association of the genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 with LN compared to a healthy matched population and study association these polymorphisms with clinical and histological parameters in LN patients. Moreover, investigate the relationship of uMCP-1 on the onset, severity and resolution of LN flare. Patients and Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral leukocytes from 197 LN patients and MCP-1 and CCR2 genomic variants were detected by polymerase chain reaction followed by restriction enzyme-fragment analysis. uMCP-1 levels were mesured by enzyme-linked immunosorbent assay from 34 LN flare patients. Results: One hundred and ninety seven (197) female patients with histological diagnosis de LN undergoing follow up in our institution and 220 ethnically matched healthy controls were enrolled in this study. Epidemiological characteristics of the LN group were: age 28±9.8 years, race 65.5% of caucasians and 34.5% of Brazilian afro-south-latins. Baseline values were collected at the onset of LN and final values in their last follow up (69±37.1 months). There was a significant association of the GG genotype polymorphism of MCP-1 with LN patients compared to controls (12.7%x5.0%) (p=0.019), while the allele A distribuition was associated with healthy controls (75.9%x68%) (p=0.007). Considering CCR2 -64 V/I polymorphism genotype there was a association of the allele V with the control group compared to LN (89.8%x86.3%) (p=0.046). Analyzing genotype polymorphism of MCP-1 and CCR2 there werent correlation with renal function, immunological markers, clinical manifestations (SLEDAI) or histological classes of LN. There was a significant association of the AA and AG genotypes polymorphism of MCP-1 with moderate and severe renal flares compared to GG genotype polymorphism of MCP-1 (p< 0.05). Kaplan-Meier analysis of the renal survival curves with respect to the studied genotypes did not show any influence in the progression of renal disease. There was a significant association of the creatinine onset and on follow up (p<0.001). Thrity four (34) female patients with criteria for active LN and histological diagnosis were enrolled and treated for six months. Each patient was evaluated once a month and uMCP-1 bimonthly. Epidemiological characteristics of the group showed: age 28.4±9.9 years and race 26.5% caucasians and 73.5% Brazilian afro-south-latins. uMCP-1 excretion at onset (T0) of LN was significantly increased when compared to uMCP-1 measured on the third (T3) and sixth months (T6) (p<0.05). Analyzing uMCP-1 values on T0 there was a correlation with creatinine (p<0,05), but not with, clinical manifestations histological classes of LN or immunological markers, except in patients with positive antiphospholipid autoantibodies demonstrated increased of uMCP-1 (p<0.05). Otherwise, uMCP-1 levels were associated with seriousness of nephritis flares, severe and moderate over mild (p<0.05). Considering MCP-1 polymorphism genotype there was association of the AA and AG genotypes with increased uMCP-1 in patients with active renal disease (p<0.05). Conclusions: There is a significant association of the GG genotype of MCP-1 -2518 A/G polymorphism with LN in our population. uMCP-1 levels in LN is associated with flare seriousness and renal function.

As células dendríticas (DCs) são fundamentais no desencadeamento da resposta imune antitumoral. Mas, no microambiente tumoral há condições que impedem esta função imunoestimuladora das DCs. Este comprometimento funcional parece ser fruto da hiperativação de STAT-3. O presente estudo visou avaliar a capacidade de Ta1 de interferir na ativação de STAT-3. Então, monócitos e mo-DCs foram tratados ou não com Ta1 e comparados com o controle, o inibidor de STAT-3, JSI-124. Avaliou-se a expressão de moléculas de superfície e a capacidade de mo-DCs de estimular linfócitos T alogeneicos. Ta1 não interferiu na ativação de STAT-3. Além disso, Ta1 não reproduziu os efeitos encontrados em mo-DCs de pacientes com câncer. Já, o tratamento com JSI-124 levou a alterações nas mo-DCs fazendo com que exibissem perfil infamatório, com aumento de HLA-DR, CD86 e concomitante queda de PD-L1. Além disso, mostramos que STAT-3 está envolvido na expressão de leucointergrinas, uma vez que sua inibição proporcionou queda da expressão em nível proteico e gênico destas moléculas. / Dendritic cells ( DCs ) are critical in triggering antitumor immune response . But there are conditions in the tumor microenvironment that prevent this immunostimulatory function of DCs. This functional impairment appears to be the result of hyperactivation of STAT-3. The present study aimed to evaluate the ability of Ta1 to interfere in the activation of STAT-3. Then, monocytes and mo-DCs were treated or not with Ta1 and compared with the control, the STAT-3 inhibitor, JSI -124. We assessed the expression of surface molecules and the mo-DCs ability in stimulating allogeneic T lymphocytes. Ta1 did not affect the activation of STAT-3. In addition, Ta1 did not reproduce the effects found in mo-DCs from cancer patients. However, JSI -124 treatment led to changes in mo-DCs, that exhibited an inflammatory profile, with an increase of HLA-DR , CD86 and concomitant drop in PD- L1. Furthermore, we have shown that STAT-3 is involved in the expression of leukointergrins, since its inhibition resulted in down-regulation of expression level of this gene and protein molecules.

Os venenos de serpentes contêm concentrações elevadas de fosfolipases A2 secretadas (sFLA2), que apresentam homologia com as FLA2s de mamíferos, cujos níveis estão aumentados em doenças inflamatórias. Neste estudo, investigou-se a ativação e a expressão de fatores envolvidos na formação de corpúsculos lipídicos (CLs) em células fagociticas e o papel desses fatores na resposta imune inata, induzida pela MT-III, uma sFLA2s de veneno. A MT-III induziu aumento dos níveis de triacilglicerol, colesterol e lisofosfolipideos e a ativação e expressão dos fatores PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 e do CD36. Sob estimulo da MT-III, o receptor PPAR-b/d, as enzimas DGAT, ACAT e FAS foram relevantes para a formação de CLs e para a expressão da PLIN2. O CD36 participa da expressão da COX-2, sem modificar a liberação de PGE2. O TLR2 e a MyD88 foram essenciais para a formação de CLs e síntese da IL-1b e IL-10. Ainda, o TLR2 foi relevante para a liberação de PGE2, PGD2 e LTB4, enquanto MyD88 foi fundamental somente para a liberação de PGE2 e expressão da PLIN2, induzidas pela MT-III. / Snake venoms contain high concentrations of secreted phospholipase A2 (sPLA2) with homology to mammalian PLA2s, whose levels are elevated in inflammatory diseases. In this study, we investigated activation and expression of factors involved in lipid droplets formation (LDs) and participation that factors in the innate immune response induced by MT-III, sPLA2s from snake venom, in phagocytic cells. MT-III induced increase of triacylglycerol, cholesterol and lysophospholipids levels and activation and expression of factors PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 and CD36. PPAR-b/d receptor, DGAT, ACAT and FAS enzymes were relevant to LDs formation and critical to PLIN2 expression induced by MT-III. CD36 participates in COX-2 expression without modifying PGE2 release stimulated by MT-III. TLR2 and MyD88 were essential to LDs formation and IL-1b and IL-10 synthesis stimulated by MT-III. Moreover, TLR2 was relevant to PGE2, PGD2 and LTB4 biosynthesis, while MyD88 is essential only for PGE2 release and PLIN2 expression induced by MT-III.

INTRODUÇÃO: Os receptores Toll-like 2 e 4 (TLR-2 e TLR-4) são capazes de ativar células imunes inatas em resposta a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, respectivamente. Na artrite psoriásica (APs), doença articular inflamatória crônica, fatores genéticos, ambientais e infecciosos parecem estar envolvidos. OBJETIVO: Avaliar as expressões dos receptores: TLR-2; TLR-4; CD114 e do CD116 em monócitos e neutrófilos do sangue periférico de pacientes com APs e adicionalmente a prevalência do HLA-B27. MÉTODOS: Quarenta e cinco pacientes com diagnóstico de APs conforme os critérios CASPAR e 32 indivíduos saudáveis foram estudados. Dentre os 45 pacientes, 27 apresentavam APs ativa (DAS28 > 2,6) e 18 APs inativa (DAS28 < 2,5). A leitura das expressões do TLR-2, TLR-4, CD14, CD66, CD114, CD116 e do HLA-B27 foi realizada por citometria de fluxo no FACSCalibur da marca Becton-Dickson, utilizando anticorpos monoclonais da BD Biosciences, anti-humanos produzidos em murino. Os anticorpos monoclonais (AcMo) para marcar receptores de membrana empregados foram: CD14 conjugado com PerCP-Cy5.5 para marcar população de monócitos; CD66 conjugado com PE e FITC para população de neutrófilos; CD114 para marcar receptor de fator estimulatório de colônias de granulócitos e CD116 para marcar receptor de fator estimulatório de colônia de granulócitos-macrófagos. A análise estatística utilizou o teste U de Mann-Whitney e o teste exato de Fisher. Os valores obtidos em porcentagem foram expressos como média ± intervalo interquartil, de acordo com uma distribuição não-paramétrica, avaliados pelo teste de Shapiro-Wilk. RESULTADOS: Demonstramos aumento de expressão do TLR-2 em monócitos periféricos de pacientes com APs, APs ativa e APs inativa comparados aos controles (p < 0,002; p < 0,001 e p < 0,04, respectivamente). A expressão do TLR-4 foi similar nos pacientes com APs, APs ativa e APs inativa e controles (p < 0,23; p < 0,33 e p < 0,29, respectivamente). A expressão do receptor GCSF (CD114) e do receptor GM-CSF (CD116) foi similar nos pacientes e controles nas populações de monócitos e neutrófilos (p > 0,05). O HLA-B27 foi positivo em 1/3 dos pacientes com APs e 6% dos controles. Nos pacientes HLA-B27+ comparados aos controles HLA-B27+, a porcentagem de expressão do TLR-2 nos monócitos foi significantemente maior (p < 0,004). CONCLUSÃO: O aumento da expressão do TLR-2 em monócitos de pacientes com APs reforça o papel da imunidade inata e sugere que a exposição a bactérias Gram-positivas possa ter um papel na indução da resposta inflamatória nesta doença / INTRODUCTION: Toll-Like receptors 2 and 4 (TLR-2 and TLR-4) are able of activating innate immune cells in response to Gram-positive and Gram-negative bacteria, respectively. In Psoriatic Arthritis (APs), chronic inflammatory joint disease and genetic, environmental and infectious factors seems to be involved. OBJECTIVES: Evaluate expressions of TLR-2; TLR-4; CD114 and CD116 receptors in monocytes and neutrophils from peripheral blood patients with APs and additionally the prevalence of HLA-B27. METHODS: Forty five patients diagnosed with APs according with CASPAR criteria and 32 health individuals were studied. Among the 45 patients, 27 presented active APs (DAS28 > 2,6) and 18 inactive APs (DAS28 < 2,5). The evaluation of the TRL-2, TLR-4, CD14, CD66, CD114, CD116 and HLA-B27 expressions was held by flow cytometry in FACSCalibur from Becton-Dickson, utilizing BD Biosciences\' monoclonal antibodies, anti-human produced in mice. The monoclonal antibodies (AcMo) used to mark membrane receptors were: CD14 in conjunction with PerCP-Cy 5.5 to mark population of monocytes; CD66 in conjunction with PE and FITC for population of neutrophils; CD114 to mark stimulatory factor receptor for granulocyte colonies and CD116 to mark stimulatory factor receptor for granulocyte-macrophage colony. The statistical analysis utilized Mann-Whitney\'s U test and Fisher\'s exact test. The values obtained as percentages were expressed as median ± interquartile range, consistent with a non-parametrical distribution, assessed by Shapiro-Wilk\'s test. RESULTS: Increased expression of TLR-2 in peripheral monocytes of patients with APs, active APs and inactive APs compared to controls (p < 0.002; p < 0.001 and p < 0.04, respectively). TLR-4 expression was similar in patients with APs, active APs and inactive APs and controls (p < 0.23; p < 0.33 and p < 0.29 respectively). The expression of the G-CSF (CCD114) receptor and GM-CSF (CD116) receptor were similar in patients and controls in populations of monocytes and neutrophils (p > 0.05). HLA-B27 was positive in 1/3 of the patients with APs and 6% of the controls. The percentage of expression of TLR-2 in HLA-B27 + patients compared to HLA-B27 + controls was significantly higher (p < 0.004). CONCLUSION: Increased of TLR-2 receptors expression in patients with APs monocytes reinforces the role of innate immunity and suggests that the exposure to Gram-positive bacteria may have a role in the induction of the inflammatory response in this diseases

Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que a melatonina (MLT) age em monócitos aumentando sua sensibilidade à IL-4 e, consequentemente, levando estas células a se diferenciarem em células dendríticas - quando in vitro e estimulados com IL-4 e GM-CSF (mo-DCs) com um perfil fenotípico e funcional mais ativado. Outros estudos do nosso grupo mostraram que mo-DCs de pacientes portadoras de câncer apresentam desvios funcionais capazes de comprometer a ativação de linfócitos por este tipo celular. Um outro apontamento de nosso grupo foi para o fato de que, muito provavelmente relacionado a estes desvios, está um comprometimento da via IL-4/STAT-6/SOCS-5, que se mostrou alterada em pacientes com leucemia linfóide crônica. Baseado nestes resultados, o presente trabalho objetivou investigar os efeitos da MLT na diferenciação in vitro de mo-DCs de doadoras saudáveis e de pacientes portadoras de câncer de mama, sob a hipótese de que este hormônio poderia agir na via IL-4/STAT-6/SOCS-5 de modo a gerar mo-DCs com fenótipo e função relacionados à maior ativação. Para tanto, monócitos provenientes do sangue periférico de indivíduos saudáveis e de pacientes foram tratados com MLT (2,5 nM 2 horas) e induzidos à diferenciação em mo-DCs; no quinto dia as células foram ativadas com LPS (100 ng/ml 24 horas). As análises, por citometria de fluxo, do fenótipo e das citocinas ao longo da diferenciação de mo-DCs não apontou efeitos consistentes acerca do tratamento com MLT, mas indicou maior expressão de CD83+ nos monócitos das pacientes (p=0,014) e maior concentração da citocina IL-12p70 no sobrenadante das culturas de mo-DCs destes indivíduos, ao final da diferenciação (p=0,02). Para a análise da capacidade linfoestimuladora das mo-DCs foi realizada co-cultura destas células com linfócitos T (LT) alogeneicos (1 DC: 30 LT) por 5 dias. Não houve diferença na indução de proliferação de LT estimulados por mo-DCs de saudáveis nem de pacientes. A MLT mostrou efeito apenas nas co-culturas com células saudáveis aumentando as concentrações de TNF, IFN-&#947; e IL-2 nos sobrenadantes. Nas co-culturas com células de pacientes sem tratamento, houve maior nível de IL-2 e IL-10, se comparadas com saudáveis. Os monócitos foram também tratados com MLT (2.5 nM) ou IL-4 (50 ng/mL) por 15 minutos, para avaliação da expressão de STAT-6, pSTAT-6 e SOCS-5. Não foi constatado efeito da MLT nesse caso, mas os monócitos de pacientes apresentaram maior expressão de STAT-6, porém menor de pSTAT-6, comparados com saudáveis. Tomados em conjunto, os resultados globais indicam algumas diferenças fenotípicas e funcionais entre monócitos de pacientes e controles, mas não entre suas mo-DCs. Quanto à MLT, os resultados apontam para o fato de que o hormônio gera alterações apenas em células provenientes de indivíduos saudáveis e somente com relação às citocinas encontradas nos sobrenadantes das co-culturas. / Previous studies at our lab have shown that melatonin (MLT) acts on monocytes increasing their sensitivity to Interleukin-4 (IL-4) and, consequently, generating dendritic cells (DCs) when in vitro and treated with IL-4 and GM-CSF (mo-DCs) phenotically and functionally more activated. Other studies from our group have shown that mo-DCs obtained from cancer patients have functional biases capable of compromising the activation of T lymphocytes. Another result from our group pointed to the fact that part of the mo-DCs\' functional bias in cancer patients could be attributed to the decrease in STAT-6 signaling, a pathway that is activated by IL-4 and down regulated by SOCS-5, whose levels, in turn, were found elevated in cancer patients\' monocytes. Based on these results, the present work aimed to investigate the effects of MLT on the in vitro differentiation of healthy donors and breast cancer patients mo-DCs, under the hypothesis that this hormone could act on the IL-4/STAT-6/SOCS-5 axis generating better activated mo-DCs. Peripheral blood monocytes from healthy donors and breast cancer patients were treated with MLT (2,5 nM 2 hours) and induced to differentiate into mo-DCs; on the fifth day cells were activated with LPS (100 ng/ml 24 hours). Flow cytometry analysis of phenotype and cytokines in supernatants during mo-DCs differentiation didnt show MLT effects, but indicated higher frequency of CD83+ (p=0,014) monocytes among mononuclear cells of the patients, when compared with healthy donors. In addition, higher concentration of IL-12p70 was found in mo-DCs cultures (sixth day - p=0,02). The capacity to stimulate allogeneic T lymphocytes was assessed by co-cultures (1DC : 30LT), maintained for 5 days. Results indicate an effect of MLT only in order to increase the TNF, IFN-&#947; and IL-2 concentrations in supernatants of co-cultures with healthy donors mo-DCs. Patients cells showed differences only when there was no hormone treatment, showing higher levels of IL-10 in the co-culture supernatants, when compared to healthy controls. Monocytes were also treated with MLT (2,5 nM) or IL-4 (50 ng/mL) for 15 minutes to evaluate STAT-6, pSTAT-6 and SOCS-5 expression. Results showed an increase of STAT-6 in patients monocytes and a lower capacity of these cells to phosphorylate this molecule, even when in presence of IL-4. Together, the results point to some phenotypic and functional differences between patients and healthy donors monocytes, but it was not shown in their mo-DCs. Results also point to the fact that MLT generates changes only in healthy donors cells and those effects were only seen with cytokines found in cultures supernatants.