A imaturidade do sistema imune adaptativo ao nascimento envolve alterações funcionais das células apresentadoras de antígenos. O objetivo foi avaliar a ativação via TLR-4 e resposta de monócitos de sangue de cordão umbilical de recém-nascidos (RN) pré-termo <34 semanas (Grupo 1), <font face=\"Symbol\">&#179;34 e <37 semanas (Grupo 2) e a termo (Grupo 3). Os resultados mostraram alta produção de IL-8, TNF-a, IL-1b e IL-6 e significativa menor produção de IL-10 por monócitos neonatais. O fator NF-kB apresentou ativação semelhante entre os neonatos e adultos. As moléculas p38, ERK-1/2 e IRAK-4 apresentaram-se mais ativadas em monócitos dos RN do Grupo 1 quando comparados aos RN do Grupo 3 e adultos. A capacidade fagocitária de monócitos e neutrófilos dos RN mostrou competência reduzida. A produção de H2O2 foi reduzida em monócitos e neutrófilos apenas dos RN pré-termo. Os resultados sugerem um perfil imunológico neonatal funcionalmente distinto, revelando um desequilíbrio da resposta imune inata, com uma menor eficiência no controle desta resposta, o que pode levar a uma predisposição à sepse. / The immaturity of the adaptive immune system at birth involves functional changes in antigen-presenting cells. The objective was to evaluate the activation via TLR-4 and response of monocytes from umbilical cord blood of preterm newborns (NB) < 34 weeks (Group 1), preterm NB <font face=\"Symbol\">&#179;34 and < 37 weeks (Group 2) and term NB (Group 3). The results show high production of IL-8, TNF-a, IL-1b and IL-6 and a significantly lower production of IL-10 by neonatal monocytes. NF-kB factor presented similar activation among neonates and adults. p38, ERK-1/2 and IRAK-4 molecules were more activated in monocytes of newborns from Group 1 as compared to newborns from Group 3 and adults. The phagocytic ability of monocytes and neutrophils from newborns showed a reduced competence. The H2O2 production was reduced in monocytes and neutrophils only in preterm newborns. The results suggest a functionally distinct neonatal immune profile, revealing an imbalance of the innate immune response, with a lower efficiency in the control of this response, which could lead to a predisposition to sepsis.

A lipoproteína de baixa densidade (LDL) pode sofrer modificações, oxidativas ou enzimáticas, gerando compostos, lipídicos e proteicos, capazes de interagir com macrófagos, contribuindo para a resposta inflamatória presente na aterosclerose. Os macrófagos interagem tanto com LDL contendo baixo ou alto grau de oxidação (LoxLDL e HoxLDL) e também com fragmentos proteicos provenientes da ApoB-100, os quais podem exercer efeitos biológicos em macrófagos, contribuindo para a formação de células espumosas. Neste trabalho demonstramos que formas modificadas da LDL interagem com monócitos e/ou macrófagos, dependendo do grau de oxidação. A expressão de FcgRII por HoxLDL em macrófagos é dependente de PPARg. Parte da expressão de CD36 induzida por LoxLDL e HoxLDL em macrófagos é dependente de PAF-R. A LoxLDL induz uma maior produção de IL-6 e IL-8. Já, a HoxLDL de TNF-a, IL-10 e TGF-b em macrófagos. Encontramos um peptídeo da ApoB-100 é capaz de aumentar o fluxo intracelular de cálcio, ativar a via das MAP quinases em monócitos humanos, induzindo a produção de IL-8. / The Low Density Lipoprotein (LDL) may undergo oxidative or enzymatic modifications, producing lipid or proteic compounds that interact with macrophages, contributing to inflammatory response in the atherosclerosis. Into the arterial intima, the macrophages interact with minimally modified LDL (LoxLDL) and with highly oxidized LDL (HoxLDL). Moreover, in the arterial intima, enzymes may induce cleavage of the apoB-100, releasing protein fragments, which may have biological effects on macrophages. In this study, we showed that modified forms of LDL interact with monocytes or macrophages, depending on oxidation degree. The expression of FcgRII-induced HoxLDL in macrophages is dependent on PPARg and part of the expression of CD36 induced by LoxLDL and HoxLDL in macrophages is dependent on PAF-R. In macrophages, LoxLDL induced higher production of IL-6 e IL-8, whereas HoxLDL induced TNF-a, IL-10 e TGF-b. Furthermore, we found one peptide from apoB-100 capable to increase calcium flux and activate MAP kinase pathway, inducing production of IL-8 in human monocytes.

A lipoproteína de baixa densidade (LDL) pode sofrer modificações, oxidativas ou enzimáticas, gerando compostos, lipídicos e proteicos, capazes de interagir com macrófagos, contribuindo para a resposta inflamatória presente na aterosclerose. Os macrófagos interagem tanto com LDL contendo baixo ou alto grau de oxidação (LoxLDL e HoxLDL) e também com fragmentos proteicos provenientes da ApoB-100, os quais podem exercer efeitos biológicos em macrófagos, contribuindo para a formação de células espumosas. Neste trabalho demonstramos que formas modificadas da LDL interagem com monócitos e/ou macrófagos, dependendo do grau de oxidação. A expressão de FcgRII por HoxLDL em macrófagos é dependente de PPARg. Parte da expressão de CD36 induzida por LoxLDL e HoxLDL em macrófagos é dependente de PAF-R. A LoxLDL induz uma maior produção de IL-6 e IL-8. Já, a HoxLDL de TNF-a, IL-10 e TGF-b em macrófagos. Encontramos um peptídeo da ApoB-100 é capaz de aumentar o fluxo intracelular de cálcio, ativar a via das MAP quinases em monócitos humanos, induzindo a produção de IL-8. / The Low Density Lipoprotein (LDL) may undergo oxidative or enzymatic modifications, producing lipid or proteic compounds that interact with macrophages, contributing to inflammatory response in the atherosclerosis. Into the arterial intima, the macrophages interact with minimally modified LDL (LoxLDL) and with highly oxidized LDL (HoxLDL). Moreover, in the arterial intima, enzymes may induce cleavage of the apoB-100, releasing protein fragments, which may have biological effects on macrophages. In this study, we showed that modified forms of LDL interact with monocytes or macrophages, depending on oxidation degree. The expression of FcgRII-induced HoxLDL in macrophages is dependent on PPARg and part of the expression of CD36 induced by LoxLDL and HoxLDL in macrophages is dependent on PAF-R. In macrophages, LoxLDL induced higher production of IL-6 e IL-8, whereas HoxLDL induced TNF-a, IL-10 e TGF-b. Furthermore, we found one peptide from apoB-100 capable to increase calcium flux and activate MAP kinase pathway, inducing production of IL-8 in human monocytes.

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.

No câncer de mama, o metabolismo tumoral, ação dos moduladores de estrógenos são fatores que podem influenciar as células dendríticas (DCs). Neste trabalho avaliou o fenótipo de DCs em amostras tumorais, a diferenciação de DCs a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) das pacientes e comparou com voluntárias saudáveis. Os resultados mostraram que há alteração na capacidade de geração, no fenótipo, na capacidade aloestimuladora, maior produção de interleucina 10 e expressão de HSP27 nas DCs de pacientes, comparadas com as DCs de voluntárias saudáveis que produzem mais Interferon-gama. A via p38MAPK parece ser importante na diferenciação de PBMCs em DCs, entretanto, estímulos estressantes podem ativar esta via e induzir a síntese de HSP27 inibindo este processo. O tratamento com tamoxifeno parece modular a expressão de algumas moléculas de membrana. Desta forma, os resultados sugerem que as DCs diferenciadas de pacientes com câncer de mama apresentam alterações fenotípicas e funcionais causadas pelo microambiente tumoral. / In breast cancer, the tumor metabolism, the action of estrogens antagonists can influence dendritic cells (DC) generation. The aim of this work was to evaluate the frequency of DCs in tumor tissue and the differentiation of DCs derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and compared the phenotypic and functionally of these cells from healthy individuals and breast cancer patients. The results showed that patients PBMCs were unable to generate phenotypicaly, functionally mature DCs and presented larger production of interleukin 10 and higher expression of HSP27 when compared with healthy volunteers\' DCs, presented higher production of Interferon-gamma. The p38 MAPK signaling pathway seems to be important in PBMCs differentiation into DCs, and its activation by stress can induce the synthesis of HSP27, that inhibits DC generation. The tamoxifen treatment caused modulation of membrane DC markers expression. Therefore, these results show that patients\' DCs present phenotypic and functional alterations which can be caused by tumor microenvironment.

Chez les patients atteints de cancer, les cellules néoplasiques échappent au contrôle du système immunitaire en raison de leur faible immunogénicité et d'une capacité exacerbée à moduler le micro-environnement. Nous décrivons ici les effets de ce micro-environnement tumoral sur la différenciation locale et systémique des monocytes et l'impact de la présence de Macrophages-Associés aux Tumeurs (TAM) CD163+ sur la survie des patientes atteintes de cancer du sein. Par une analyse de cytométrie en flux, nous décrivons un composition hétérogène des sous-types de TAM CD163low et CD163high, où nous avons observé l'association entre une fréquence élevée de TAM CD163high et une faible infiltration des lymphocytes T CD3+. Par immunohistochimie sur une analyse rétrospective (±12 ans), nous avons démontré une forte corrélation entre la fréquence élevée de TAM CD163+ et un risque accru de progression pour les patientes (log-rank *p<0.05, n=238). In vitro, les monocytes CD14+ conditionnés par le micro-environnement tumoral présentent une différenciation biaisée en faveur des MΦ CD163highCD86lowIL-10high, que non seulement ne stimulent pas la prolifération des lymphocytes T CD4+ naïfs, mais inhibent fortement l'expansion et la production d'IFN-γ et de TNF-α par les lymphocytes T CD4+ préalablement activé. Cette différenciation de MΦ en M2-like (CD163highIL-10high) est associée à des quantités élevées de TGF-β, M-CSF et VEGF dans le micro-environnement tumoral. Par ailleurs, les monocytes circulants des patientes atteintes de cancer du sein présentent un profil cytokinique immunosuppresseur et sont biaisés vers une différenciation en MΦ et Mo-DCs qui présentant des capacités suppressives / In cancer patients, the neoplastic cells escape from the immune control because of their low immunogenicity and their exacerbated capacity to modulate the microenvironment. Here we describe the local and systemic effects of the tumor microenvironment on monocyte differentiation and the impact of the presence of Tmor Associated Macrophages (TAM) CD163+ on the survival of breast cancer patients. By flow cytometry analysis, we describe a heterogeneous composition of CD163low and CD163high TAM subtypes, where we observed the association between high frequency of CD163high TAM infiltration and low CD3+ T lymphocytes presence. By immunohistochemistry on a retrospective analysis (±12 years), we have shown a strong correlation between high frequency CD163+ TAM and an increased risk of progression for patients (log-rank *p<0.05, n= 238). In vitro, CD14+ monocytes conditioned by tumor microenvironment exhibit a biased differentiation towards a CD163highCD86lowIL-10high macrophages (MΦ) phenotype, that not only failed to stimulate the proliferation of naive CD4+ T cells, but strongly inhibited the expansion and the production of IFN-γ and TNF-α by activated-CD4+ T cells. This differentiation into M2-like MΦ (CD163highIL-10high) is associated with high levels of TGF-β, M-CSF and VEGF found in the tumor microenvironment. Furthermore, circulating monocytes of breast cancer patients produced an immunosuppressive cytokine profile and are biased towards the differentiation into MΦ and Mo-DCs that show suppressive capacities / O desenvolvimento do câncer é normalmente associado a desvios no sistema imune, principalmente devido a sua falha em perceber, reconhecer e eliminar células neoplásicas de maneira eficiente. Nesse contexto, duas Células Apresentadoras de Antígenos (APCs), Células Dendríticas (DCs) e Macrófagos (MΦ), têm um papel crucial na identificação de alterações nos tecidos e na estimulação da imunidade adaptativa antitumoral. No entanto, fatores derivados de tumores modulam essas APCs, impedindo a iniciação das respostas imunes e culminando no estabelecimento do câncer. Investigamos aqui como o microambiente tumoral poderia modular a diferenciação de monócitos em APCs in vitro e de modo sistêmico. Nossos dados revelaram que em cânceres de mama e ovário, Macrófagos-Associados a Tumores (TAMs) são a subpopulação mais frequente em leucócitos CD45+MHCII+, e são encontrados em uma frequência variável de TAMs CD163low ou TAMs CD163high. O último, (TAMs CD163high) expressaram maiores níveis de PD-L1 e elevada produção de IL-10 sob a ativação de LPS. Além disso, a análise retrospectiva por imunohistoquímica revelou uma forte correlação entre a presença de TAMs CD163+ e uma baixa taxa de sobrevida em pacientes com câncer de mama. Ainda, a alta frequência de TAMs CD163high foi correlacionada com um baixo infiltrado de células T CD3+. Monócitos saudáveis condicionados por sobrenadantes de tumores de mama tiveram sua diferenciação in vitro direcionada para um fenótipo CD163highIL-10high, células capazes de suprimir a expansão de células T naive CD4+ e a produção de IFN- γ e TNF-α via IL-10. Esse fenótipo adquirido por monócitos condicionados foi associado à presença de altos níveis de CCL22, M-CSF, TGF-β1, TGF-β3, e VEGF no microambiente tumoral. Interessantemente, avaliando os efeitos sistêmicos dos tumores, monócitos circulantes de pacientes com câncer de mama falharam em diferenciar-se em M1- MΦ na presença de GM-CSF/IFN-γ e mantiveram um fenótipo alterado CD163+/-IL-10+TNF-α+

O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis

A doença de Behçet tem sua fisiopatologia caracterizada por hiperatividade neutrofílica, particularmente em relação à quimiotaxia, e períodos de atividade da doença podem ser desencadeados por exposição a estreptococos. Uma vez que células do sistema imune inato são ativadas pelo ácido lipoteicoico (LTA) de bactérias gram-positivas via receptor toll-like (TLR) 2 e CD14, cujas expressões são reguladas pelos fatores estimulantes de colônias de granulócitos (G-CSF) e granulócitos-macrófagos (GM-CSF), o objetivo principal deste estudo foi determinar se há hiperexpressão de TLR2 em neutrófilos de DB ativa e se a quimiotaxia de polimorfonucleares (PMN) neutrófilos na DB poderia ser hiperestimulada pelo LTA. Além do TLR2, foram medidas as expressões de TLR4, CD14, CD114 (receptor de G-CSF) e CD116 (receptor de GM-CSF) nos neutrófilos e nos monócitos de pacientes com doença de Behçet (DB), as concentrações séricas de CD14 solúvel (CD14s) e as respostas quimiotáxicas dos PMNs de DB sob diferentes estímulos. A expressão dos receptores foi medida pela citometria de fluxo, as concentrações séricas por ELISA e as respostas quimiotáxicas foram avaliadas em câmara de Boyden. Nos PMNs, os receptores foram igualmente expressos nos dois grupos e, estimulados com LTA, suas respostas quimiotáxicas também foram similares. Somente à incubação com plasma os PMNs de DB desenvolveram hiperquimiotaxia em relação aos PMNs controles. A expressão do TLR2 foi maior em monócitos de DB em relação aos controles, e a concentração de CD14s sérica, de origem monocitária, foi maior nos pacientes com DB ativa. Em conjunto, os resultados demonstram que PMNs de DB, isoladamente, não reagem exacerbadamente ao LTA, e suas respostas migratórias são estritamente dependentes de fatores estimulantes solúveis. / Expressions of toll-like receptor (TLR) 2, TLR4, CD14, CD114 and CD116 were assessed on polymorphonuclear (PMN) neutrophils and monocytes of patients with Behçets disease (BD). PMN chemotactic responses under different stimulations were also measured. The objective was to determine if BD PMN chemotaxis may be overstimulated by lipoteichoic acid (LTA) from gram-positive bacteria. Receptor expressions were measured by flow cytometry and PMN chemotaxis was assessed in a Boyden chamber. Only TLR2 expression was higher on monocytes of the BD group than in control group. On PMNs, however, TLR2 expression was similar in both groups and, when stimulated with LTA, BD PMN cells showed chemotactic responses similar to the controls. These cells only exhibited increased chemotaxis when incubated with plasma. In conclusion, isolated BD PMN did not overreact to LTA, and its hyperchemotaxis is strictly dependent on soluble stimulating factors

A doença de Behçet tem sua fisiopatologia caracterizada por hiperatividade neutrofílica, particularmente em relação à quimiotaxia, e períodos de atividade da doença podem ser desencadeados por exposição a estreptococos. Uma vez que células do sistema imune inato são ativadas pelo ácido lipoteicoico (LTA) de bactérias gram-positivas via receptor toll-like (TLR) 2 e CD14, cujas expressões são reguladas pelos fatores estimulantes de colônias de granulócitos (G-CSF) e granulócitos-macrófagos (GM-CSF), o objetivo principal deste estudo foi determinar se há hiperexpressão de TLR2 em neutrófilos de DB ativa e se a quimiotaxia de polimorfonucleares (PMN) neutrófilos na DB poderia ser hiperestimulada pelo LTA. Além do TLR2, foram medidas as expressões de TLR4, CD14, CD114 (receptor de G-CSF) e CD116 (receptor de GM-CSF) nos neutrófilos e nos monócitos de pacientes com doença de Behçet (DB), as concentrações séricas de CD14 solúvel (CD14s) e as respostas quimiotáxicas dos PMNs de DB sob diferentes estímulos. A expressão dos receptores foi medida pela citometria de fluxo, as concentrações séricas por ELISA e as respostas quimiotáxicas foram avaliadas em câmara de Boyden. Nos PMNs, os receptores foram igualmente expressos nos dois grupos e, estimulados com LTA, suas respostas quimiotáxicas também foram similares. Somente à incubação com plasma os PMNs de DB desenvolveram hiperquimiotaxia em relação aos PMNs controles. A expressão do TLR2 foi maior em monócitos de DB em relação aos controles, e a concentração de CD14s sérica, de origem monocitária, foi maior nos pacientes com DB ativa. Em conjunto, os resultados demonstram que PMNs de DB, isoladamente, não reagem exacerbadamente ao LTA, e suas respostas migratórias são estritamente dependentes de fatores estimulantes solúveis. / Expressions of toll-like receptor (TLR) 2, TLR4, CD14, CD114 and CD116 were assessed on polymorphonuclear (PMN) neutrophils and monocytes of patients with Behçets disease (BD). PMN chemotactic responses under different stimulations were also measured. The objective was to determine if BD PMN chemotaxis may be overstimulated by lipoteichoic acid (LTA) from gram-positive bacteria. Receptor expressions were measured by flow cytometry and PMN chemotaxis was assessed in a Boyden chamber. Only TLR2 expression was higher on monocytes of the BD group than in control group. On PMNs, however, TLR2 expression was similar in both groups and, when stimulated with LTA, BD PMN cells showed chemotactic responses similar to the controls. These cells only exhibited increased chemotaxis when incubated with plasma. In conclusion, isolated BD PMN did not overreact to LTA, and its hyperchemotaxis is strictly dependent on soluble stimulating factors

O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis