Introdução - A bactéria Listeria monocytogenes é um agente zoonótico transmitido, principalmente, por alimentos. Dentre as fontes de contaminação, destacam-se os produtos de origem láctea, carnes e embutidos, além dos ambientes da indústria de processamento alimentício. Na última década, foram detectadas cepas de L. monocytogenes e L. innocua, em ambiente de frigoríficos e alimento. Estas apresentavam variação na intensidade da virulência para células eucarióticas decorrente de mutações nos genes de virulência. Esta alteração em ambas as espécies, e o relato de um caso fatal de listeriose humana ocasionada por L. innocua atípica demandam atenção, pois apresentam maior risco à saúde da população exposta a estes ambientes e alimentos tornando-se, portanto, uma importante questão de saúde pública. Objetivo - Pesquisar genes de virulência em cepas de L. monocytogenes e L. innocua, isoladas em pontos da linha de abate suíno e do comércio de carne no Estado de São Paulo. Material e Métodos Foram estudadas 40 cepas, dentre estas, isolados de L. monocytogenes e L. innocua com atividade hemolítica atípica. Foram realizados testes de atividade hemolítica e produção de fosfolipase A para caracterização dos isolados. A detecção dos genes de virulência foi realizada através da reação em cadeia pela polimerase (PCR). Para confirmação das sequências amplificadas e a análise das mesmas, os fragmentos obtidos foram sequenciados. A identificação molecular das espécies foi realizada por análise filogenética dos genes prs e 16S rRNA. Resultados Dos 40 isolados, cinco de L. monocytogenes e sete de L. innocua apresentaram atividade hemolítica atípica, sendo que nestes últimos também foi observado halo atípico no meio ALOA. As cepas de L. monocytogenes foram positivas para a detecção de todos os genes de virulência estudados. Dois dos isolados atípicos de L. innocua também foram positivos para todos os genes e os outros cinco foram positivos para hly, plcA e inlC. Foram detectadas mutações nas proteínas InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC e PrfA, nas cepas atípicas, que resultaram em alterações nas suas estruturas secundárias que podem explicar o fenótipo desses isolados. A confirmação de espécie apenas foi alcançada com a análise filogenética do 16S rRNA. Conclusões A partir desses resultados, foi proposta a utilização dos genes prfA, plcB e inlB, como forma de triagem, para diferenciar as espécies L. monocytogenes e L. innocua, de modo a complementar os testes fenotípicos / Introduction - The bacterium Listeria monocytogenes is a zoonotic agent transmitted, mainly, by food. Among the sources of contamination, stands out dairy products, meat and the environments of food processing industry. In the last decade, strains of L. monocytogenes and L. innocua have been detected in food and slaughterhouses environment. These presented variation in the intensity of virulence to eukaryotic cells due to mutations in the virulence genes. These changes in both species, and the report of a fatal case of human listeriosis caused by atypical L. innocua demand attention, because they present greater risk to the health of the population exposed to these environments and food and, therefore, it is an important public health issue. Objective - To search for the virulence genes in strains of L. monocytogenes and L. innocua isolated in points of swine slaughter line and meat trade in Sao Paulo State. Material and Methods 40 strains were studied, among these, isolates of L. monocytogenes and L. innocua with atypical hemolytic activity. Tests of hemolytic activity and production of phospholipase A were performed for isolates characterization. The detection of virulence genes was performed through polymerase chain reaction (PCR). For confirmation of the amplified sequences and analysis of the same, the obtained fragments were sequenced. The molecular identification of species was performed by phylogenetic analysis of 16S rRNA and prs genes. Results - Of the 40 isolates, five L. monocytogenes and seven L. innocua showed atypical hemolytic activity, and in these last ones an atypical halo was also observed in ALOA medium. The L. monocytogenes strains were positive for detection of all virulence genes studied. Two atypical L. innocua isolates were also positive for all genes and the other five were positive for hly, plcA and inlC. Mutations in InlC, InlB, InlA, PI-PLC, PC-PLC and PrfA proteins were detected, in the atypical strains, which resulted in changes in their secondary structures that may explain the isolates phenotype. Species confirmation was achieved only with phylogenetic analysis of 16S rRNA. Conclusions - From these results, it was proposed the use of prfA, plcB and inlB genes as a way of screening, to differentiate the species L. monocytogenes and L. innocua, in order to complement the phenotypic tests

Listeria monocytogenes é um microrganismo patogênico psicrotrófico e consequentemente de grande importância para alimentos conservados em refrigeração. Vários estudos têm demonstrado que é possível utilizar antimicrobianos naturais, como bacteriocinas e compostos fenólicos, para retardar a multiplicação desse patógeno em produtos cárneos refrigerados. Entretanto, sabe-se que a atividade antimicrobiana desses compostos pode ser influenciada pelos componentes da matriz alimentar. Esse trabalho de mestrado pretendeu avaliar a influência dos ingredientes de lingüiça frescal de suíno na ação inibitória de óleo essencial de orégano (OEO) e nisina sobre Listeria monocytogenes. Foram realizados testes com diferentes modelos alimentares preparados com carne suína moída adicionada de cada um dos ingredientes utilizados na fabricação de lingüiça frescal (sais de cura, açúcar, antioxidante, emulsificante, condimentos e NaCl) separadamente, comparando-se os resultados com os obtidos no modelo contendo todos os ingredientes simultaneamente. Pretendeu-se também avaliar a interferência do tempo de contato da nisina e óleo essencial de orégano com os diferentes modelos alimentares na ação antimicrobiana sobre L. monocytogenes. Os resultados indicaram que os antimicrobianos foram capazes de inibir a multiplicação de L. monocytogenes em todos os modelos analisados armazenados à 5ºC por até 72h. Comparando-se todos os modelos compostos por carne adicionada de apenas um dos ingredientes, a maior atividade antilisterial foi observada no modelo composto de carne com antioxidante. Entretanto, essa atividade inibitória foi menor do que a obtida no modelo contendo todos os ingredientes em conjunto. Quanto à influência do tempo prévio de contato entre os antimicrobianos e os modelos estudados na ação antilisterial, observou-se que na formulação com todos os ingredientes a ação foi mais intensa quando o contato foi de 2h. Entretanto, neste modelo o efeito mais duradouro foi obtido com 12h de contato prévio. Nos demais modelos, o maior efeito foi obtido no tempo zero. Os resultados permitem concluir que cada um dos ingredientes da formulação da lingüiça contribui com uma parcela na ação antilisterial do OEO e nisina nesse produto, e que essa ação é influenciada pelo tempo de contato prévio entre os modelos e os agentes antimicrobianos. / Listeria monocytogenes is psychrotrophic pathogen and, consequently, very important for cold-preserved foods. Many studies have demonstrated that natural antimicrobials such as bacteriocins and phenolic compounds can be used to inhibit the growth of this pathogen in refrigerated meat products. However, it is known that the antimicrobial activity of these antimicrobials may be influenced by components of the food matrix. The aim of the present study was to evaluate the influence of the ingredients of \"lingüiça\" in the inhibitory activity of O.E.O. and nisin against L. monocytogenes. The study was carried out with different food models prepared with minced raw pork meat added separately of each ingredient used for manufacturing \"lingüiça\" (curing salts, sugar, antioxidants, emulsifiers, condiments and NaCl), and results were compared to those obtained in a model containing all ingredients simultaneously. The study also aimed to evaluate the interference of the contact time between the food models and the antimicrobials on the effect against L. monocytogenes. Results indicated that the antimicrobials added to the models were able to inhibit the growth of the pathogen at 5ºC up to 72h. Comparing the models, the highest antilisterial activity was observed in the model containing pork meat and antioxidants. However, this inhibitory activity was lower than that observed in the model with all ingredients. What concerns the influence of contact time in antilisterial activity, we observed that in the model containing all ingredients the antilisterial activity was more intense after 2h of contact, but the more lasting effect was observed after 12h of contact. In the other models, the most intense effect was noted in time zero. The conclusions of the study are that each ingredient used in manufacture of \"lingüiça\" has its share in the antilisterial activity of nisin and OEO in this product and that this activity is influenced by the contact time between the food matrix and the antimicrobials.

A aplicação das bacteriocinas de bactérias láticas como agentes de bioconservação de alimentos é dependente de vários fatores, com destaque para composição química do alimento que pode interferir na eficácia da atividade antimicrobiana. Esse estudo objetivou avaliar a influência de ingredientes da matriz alimentar na multiplicação e produção das bacteriocinas por Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a e na atividade das bacteriocinas produzidas, trabalhando-se com um modelo composto de extrato de carne, extrato de levedura, proteose peptona e amido, adicionado de 4% de NaCl e/ou 0,5% de glicose e mantido em refrigeração (4° C) por até 10 dias. O estudo foi realizado com os seguintes materiais contendo as bacteriocinas: 1. sobrenadante concentrado livre de células obtido a partir da cultura de L. sakei 2a em caldo MRS; 2. extrato ácido neutralizado obtido do sedimento da cultura em caldo MRS e 3. extrato ácido neutralizado e semi-purificado por cromatografia líquida. Listeria monocytogenes Scott A foi empregada como microrganismo indicador da atividade antimicrobiana e Lactobacillus sakei ATCC 15521 como controle não produtor de bacteriocinas. Os resultados indicaram que nenhum dos ingredientes do modelo avaliado teve papel importante na multiplicação de L. sakei 2a e na bacteriocinogênese. No entanto, 4% de NaCl interferiu negativamente na produção das bacteriocinas, enquanto 0,5% de glicose auxiliou a produção, mesmo na presença de 4% de NaCl. Em relação à atividade das bacteriocinas, verificou-se que nem os ingredientes do modelo, nem 4% de NaCl e nem 0,5% de glicose apresentaram interferência marcante ao longo dos dez dias estudados, independentemente do material contendo as bacteriocinas testado. / The application of bacteriocins produced by lactic acid bacteria as biopreservatives in foods depends of several factors, such as the chemical composition of the food, which can interfere with the antimicrobial activity. This study aimed to evaluate the influence of food ingredients on the growth and production of bacteriocins by Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a, and on the activity of the bacteriocins produced, by means of a food model prepared with meat extract, yeast extract, proteose-peptone and starch, added of 4% 4% de NaCl and/or glucose, maintained under refrigeration (4° C) for up to 10 days. The study was carried out with the following bacteriocins-containing materials: 1. the concentrated cell-free supernatant from an overnight culture of L.sakei 2a in MRS broth; 2. acid extract obtained from the sediment of the overnight culture of L. sakei 2a in MRS broth and 3. acid extract submitted to a semi-purification by HPLC. Listeria monocytogenes Scott A was used as the antimicrobial activity indicator microorganism and Lactobacillus sakei ATCC15521 as the non-bacteriocinogenic negative control. Results indicated that none of the ingredients presented a significant role in the growth of L.sakei 2a, and in the production and activity of the bacteriocins. However, 4% of NaCl caused a reduction on the production of bacteriocins, while 0,5% of glucose stimulated their production, even in the presence of 4% of NaCl. The interference of the ingredients of the model, 4% of NaCl and/or 0,5% of glucose on the activity of the bacteriocins was not marked, regardless the materials used in the tests.

O controle de Listeria monocytogenes (Lm) nas plantas processadoras de alimentos é uma tarefa difícil, devido à sua capacidade em formar biofilmes e se adaptar às condições adversas do ambiente. A sobrevivência a altas concentrações de cloreto de sódio, além da multiplicação em temperaturas de refrigeração são outras duas importantes características de isolados de Lm, incluindo os dois sorotipos mais prevalentes da espécie (4b e 1/2a). Os objetivos deste estudo foram avaliar o comportamento de multiplicação, da expressão gênica global e da virulência dos dois principais sorotipos de Lm em ambientes de estresse encontrados por esses micro-organismos na indústria de alimentos. Para tanto, 22 cepas de Lm - 12 isoladas de casos clínicos (seis cepas sorotipo 4b e seis sorotipo 1/2a) e 10 isoladas de alimentos (seis sorotipo 4b e quatro sorotipo 1/2a) - além de uma cepa de Listeria monocytogenes Scott A e outra de Listeria innocua, foram inoculadas em caldo BHI com atividade de água (aw) 0,94 (11% NaCl) e incubadas a 4°C, 10°C e 25°C durante 73, 42 e 15 dias, respectivamente. A 4°C, a maior parte das cepas, tanto clínicas como de origem alimentar, conseguiu se manter viável ou ainda se multiplicar e aumentar até 2 log UFC/ml a partir da população inicial. Já a 10°C, a maioria das cepas conseguiu se multiplicar, porém diferenças significativas (p < 0,05) na duração da fase lag entre as cepas dos sorotipos 1/2a e 4b, independentemente da origem das mesmas, foram observadas (lag1/2a > lag4b). Diferenças estatísticas também foram observadas no que diz respeito às cepas de Lm sorotipo 4b, quando incubadas a 25°C em meio de cultura BHI com aw 0,94, apresentando maiores taxa de multiplicação e concentração populacional máxima (p < 0,05) em comparação às cepas de Lm sorotipo 1/2a submetidas às mesmas condições. Já com relação ao potencial de virulência das cepas, não foram detectadas diferenças estatísticas entre os sorotipos com relação a sua capacidade hemolítica, entretanto, a capacidade de invasão das cepas sorotipo 4b em células Caco-2 foi maior (p < 0,05) em comparação ao sorotipo 1/2a. Além disso, análises comparativas pré e pós-estresse osmótico confirmaram o aumento no potencial de invasão (p < 0,05) tanto das cepas sorotipo 1/2a, quanto 4b após o contato com elevadas concentrações de sal. O papel dos reguladores de transcrição Sigma B e PrfA na sobrevivência de Listeria monocytogenes, sob condição de estresse osmótico, também foi avaliado. Ensaios de microarray com cepas das linhagens I e II demonstraram maiores níveis de transcrição para 173 e 68 genes, respectivamente, na cepa selvagem quando comparada à cepa mutante &#916sigB, incluindo genes relacionados à virulência (internalinas), sobrevivência a condições de estresse e metabolismo. Os resultados obtidos confirmam a habilidade de cepas de Lm se manterem viáveis ou mesmo se multiplicarem em baixas temperaturas, bem como em ambientes com elevada pressão osmótica, independentemente do sorotipo ou origem, enfatizando a necessidade de tomada de medidas efetivas de controle desse patógeno pela indústria de alimentos uma vez que cepas de Lm podem, além de sobreviver às condições adversas, ter seu potencial de virulência aumentado. Os dados obtidos também indicam a necessidade de mais estudos de avaliação comportamental e viabilidade de Lm em ambientes com concentração de sal modificada, uma vez que a discussão sobre a diminuição nos teores de sal em alimentos vem ganhando importância mundialmente. / The control of Listeria monocytogenes (Lm) in food processing plants is difficult due to its ability to form biofilms and adapt to adverse environmental conditions. The survival at high concentrations of sodium chloride and growing at low temperatures are two other important features of Lm isolates, including the two most prevalent serotypes (1/2a and 4b). The objectives of this study were to evaluate the growing behavior, global gene expression profile and virulence potential of the two main serotypes of Lm under osmotic stress environments encountered by these microorganisms in the food industry. 22 Lm strains - 12 isolated from clinical cases (six strains serotype 4b and six serotype 1/2a) and 10 isolated from food (six serotype 4b and four serotype 1/2a) - plus one L. monocytogenes Scott A and one Listeria innocua were inoculated into BHI broth with water activity (aw) 0.94 (11% NaCl) and were incubated at 4°C, 10°C and 25°C during 73, 42 and 15 days respectively. At 4°C, the majority of strains both clinical and food were able to remain viable and to grow (up to 2 log CFU/ml). At 10°C, most strains could grow but significant differences (p < 0.05) on the lag phase duration between the serotypes 1/2a and 4b strains, regardless their origin, were observed (lag1/2a > lag4b). Statistical differences were also observed related to Lm serotype 4b strains when grown in BHI with aw 0.94 at 25°C, that showed higher maximum growth rate and final density (p < 0.05) compared to Lm serotype 1/2a strains. Regarding the virulence potential, there were no statistical differences among serotypes with respect to its hemolytic activity, however, the invasiveness of serotype 4b strains in Caco-2 cells was higher (p <0.05) than serotype 1/2a. Furthermore, comparative analyzes before and after osmotic stress confirmed the increased potential for invasion (p < 0.05) in both serotypes (1/2a and 4b) after being submitted to high salt concentrations. The role of transcription regulators sigma B and PrfA in L. monocytogenes survival under osmotic stress condition was also evaluated. Microarray assay using lineage I and II strains showed increased transcription levels in 173 and 68 genes, respectively, when comparing the wild type strains to the mutant &#916sigB strain. This included genes related to virulence (internalina), survival under stress conditions and metabolic genes. The results confirm the ability of Lm strains in remain viable or even grow at low temperatures and in high osmotic pressure environments, regardless of serotype or origin. They also emphasize the need for effective measures to control this pathogen by food industry since it is possible that Lm strains survive under adverse conditions and also increase its virulence potential. The data also indicate the need for additional studies regarding the behavior of Lm in environments with modified sodium chloride concentration since the discussion about salt levels in foods is increasing worldwide.

Leite integral de búfala foi experimentalmente contaminado com Mycobacterium fortuitum e Listeria monocytogenes. Foi feita a análise quantitativa dos agentes imediatamente antes e depois de dois tratamentos térmicos: pasteurização (do leite) e filagem (da Mozzarella). Na análise da Listeria, foi empregada metodologia adaptada para a obtenção do NMP, usando os meios UVM, Fraser e Palcam como pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo e isolamento, respectivamente. O Mycobacterium foi semeado em placas com meio Löwenstein-Jensen modificado. Os resultados mostraram que a pasteurização do leite reduziu em média 6,0 log NMP/mL de Listeria sp e 4,0 log UFC/mL de Mycobacterium sp. A filagem da coalhada reduziu em média 8,37 log NMP/g de Listeria sp e 6,3 log UFC/g de Mycobacterium sp. Concluiu-se que a filagem da Mozzarella foi mais eficiente que a pasteurização do leite na redução do inóculo de Listeria monocytogenes e Mycobacterium fortuitum em cerca de 2 logaritmos de cada agente. / Whole buffalo milk was experimentally contaminated with Mycobacterium fortuitum and Listeria monocytogenes. The quantitative analysis of the agents was made immediately before and after two thermal treatments: pasteurization (of milk) and stretching (of Mozzarella). In the analysis of the Listeria, methodology adapted for the attainment of the MPN was used, employing UVM, Fraser and Palcam as not selective enrichment, selective enrichment and isolation, respectively. The Mycobacterium was plated onto modified Löwenstein-Jensen. The results had shown that the pasteurization of milk reduced 6,0 log MPN/mL Listeria sp on average, and 4,0 log CFU/mL de Mycobacterium sp. The stretching of the curd reduced 8,37 log MPN/g de Listeria sp on average, and 6,3 log CFU/g de Mycobacterium sp. It has been concluded that the stretching of Mozzarella was more efficient than the pasteurization of milk in the reduction of Listeria monocytogenes inoculum and Mycobacterium fortuitum in about 2 logarithms of each agent.

O Brasil tem uma grande produção leiteira, e, embora seu comércio seja ilegal, o leite cru é consumido por uma parcela da população, principalmente na zona rural. Visando avaliar o risco associado ao consumo de leite cru, esse trabalho estudou a ocorrência de Listeria monocytogenes e Salmonella spp. em leite cru produzido em quatro importantes regiões produtoras de leite do Brasil, fazendo uma correlação com os níveis de contaminação com outros microrganismos indicadores de qualidade do produto (bactérias aeróbias mesófilas totais, coliformes totais e Escherichia coli), bem como investigou a presença de substancias químicas empregadas no manejo do gado bovino (sanitizantes, antibióticos e defensivos agrícolas). Foi também avaliada a interferência de alguns fatores na detecção desses dois patógenos em leite cru, incluindo sensibilidade da metodologia analítica, possível ação inibitória dos resíduos químicos e o possível antagonismo microbiano da microbiota autóctone do leite sobre L. monocytogenes ou Salmonella spp. O estudo foi conduzido com amostras de leite cru obtidas em 210 fazendas leiteiras localizadas nos Estados do Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul e Minas Gerais, selecionadas de acordo com as diferentes práticas de ordenha e de equipamentos disponíveis. Os resultados indicaram ausência dos dois patógenos em todas as amostras estudadas, embora grande parte (48,6%) apresentasse contaminação microbiológica acima do especificado pela Instrução Normativa 51, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a vigorar a partir de julho de 2005. A presença de cloro não foi detectada em nenhuma das amostras, mas 11,4% foram positivas para antibióticos. A grande maioria das amostras (93,8%) foi positiva para organofosforados e/ou carbamatos. Quanto à sensibilidade das metodologias analíticas, verificou-se que sua capacidade de detectar os patógenos era dependente da contaminação microbiana presente. Os pesticidas não tiveram nenhuma ação inibitória sobre L. monocytogenes ou Salmonella spp. Das 360 colônias de bactérias isoladas das amostras de leite cru, 25,3% e 9,2% apresentaram antagonismo em relação à L .monocytogenes e Salmonella spp., respectivamente. A maioria dessas bactérias foi identificada como Lactococcus lactis subsp. lactis e Enterococcus faecium. Concluiu-se que L. monocytogenes e Salmonella spp. não devem ser considerados perigos de significância em leite cru produzido nas quatro regiões estudadas, mas resultados negativos devem ser interpretados com cuidado, pois há fatores que podem interferir no isolamento desses patógenos, especialmente em relação à L. monocytogenes, sendo a atividade antimicrobiana na microbiota autóctone o mais importante. / Brazil is a great milk-producing country, and despite illegal its commercialization, raw milk is consumed by certain groups of people, especially in rural areas. Aiming to evaluate the risk associated to consumption of raw milk, this study evaluated the occurrence of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in raw milk produced in four important milk producing regions in Brazil, correlating this result with the levels of hygiene indicator microorganisms (total aerobic counts, fecal coliforms and Escherichia coli) and the presence of chemical substances used in animal rearing (sanitizers, antibiotics and pesticides). The study also evaluated some factors that may interfere in the detection of both pathogens in raw milk, mainly sensitivity of the analytical method, potential inhibitory activity of chemical residues and antagonism of the autoctonous microbiota. The study was conducted with raw milk samples collected in milk farms located in four Brazilian States: Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul and Minas Gerais, selected according to milking procedures and machinery availability. Results indicated that both pathogens were absent in the samples, despite 48.6% of the samples were not in accordance to the standards of the Brazilian Ministry of Agriculture (Instrução Normativa 51), that will be in place next July 2005. Chlorine was not detected, but 11.4% of the samples were positive for antibiotics. The great majority (93.8%) was positive for organophosphorous and/or carbamate pesticides. Results conformed that the sensitivity of the analytical method is dependent on the level of microbial contamination of the samples. The pesticides presented no action over the tested pathogens. Among 360 bacterial colonies isolated from the milk samples, 25.3% and 9.2% were active against L. monocytogenes e Salmonella spp., respectively. Most of them were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis and Enterococcus faecium. It was concluded that L. monocytogenes and Salmonella spp. should not be considered relevant pathogens in raw milk produced in the four tested regions in Brazil, but the negative results should be interpreted with care because there are factors that may interfere in the isolation of the pathogens, mainly L. monocytogenes, being the antagonism of components of the autoctonous microbiota the most important.

Devido à gravidade da manifestação clínica e pelas altas taxas de mortalidade em populações de risco, o controle e a prevenção da listeriose, doença causada pela L. monocytogenes, representa um importante desafio às autoridades sanitárias. A dificuldade de recuperar organismos envolvidos nos surtos, a sub-notificação e a demora na realização de análises convencionais são alguns dos fatores que retardam ou impedem intervenções em situações de surto. Com o advento da biologia molecular,novas técnicas têm sido empregadas para a identificação e tipificação da L. monocytogenes, com o intuito de contribuir com os estudos epidemiológicos e de vigilância sanitária de alimentos. O presente estudo visou confirmar a taxonomia e o perfil genotípico de 31 cepas isoladas de diversos tipos de carne, supostamente identificadas como L. monocytogenes, por intermédio das técnicas de Reação de Cadeia pela Polimerase (PCR), com o emprego de iniciadores de identificação dos genes 16S rRNA e Internalina A e B, para confirmação da espécie. Os resultados indicaram que apenas 20 (65%) das cepas foram confirmadas como sendo da espécie investigada. Foi realizada ainda a avaliação de similaridade nas 20 cepas confirmadas, através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), que revelou grande diversidade genotípica, caracterizada por 18 diferentes perfis, segundo o coeficiente de similaridade de Pearson. Os resultados demonstraram que as técnicas moleculares são de grande utilidade para a identificação e tipificação de L. monocytogenes, caracterizando-se como importantes ferramentas epidemiológicas. / Due to the seriousness of clinical manifestations and high rates of mortality of the listeriosis disease in populations at risk, control and prevention of this disease, caused by L. monocytogenes, represent an important challenge to sanitation authorities. Difficulties of recovering organisms involved in outbreaks; sub notification; and, the delay in accomplishing conventional analysis are some of the factors that slow-down or even prevent health interventions in outbreak occurrences. With the advent of the molecular biology, new techniques have been employed for identifying and typifying the L. monocytogenes aiming at contributing to studies on epidemiology and sanitary surveillance of foods. The present study aimed at ratifying the taxonomy and the genotypic profile of 31 isolated stocks of varied types of meats supposedly identified as L. monocytogenes by means of the Polymerase Chain Reaction (PCR) employing identification starters of genes 16 rRNA and A and B Internalin in order to confirm the species. Results indicated that only 20 (65.0%) of the stocks were confirmed as being from the investigated species. Another evaluation of similarity were also carried out along with the 20 stocks ratified through pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which disclosed a great genotypic diversity characterized by 18 different profiles, according to the Pearson’s similarity coefficient. Results demonstrated that the molecular techniques are very helpful for identifying and typifying the L. monocytogenes, characterizing themselves as important epidemiological tools.

Este estudo objetivou analisar o potencial de deterioração da microbiota psicrotrófica presente em presunto cozido fatiado comercializado entre Maio e Junho de 2015 e Fevereiro e Março de 2016 no mercado público da cidade de Porto Alegre/RS e avaliar a influência de fatores ambientais na qualidade microbiológica do mesmo. Os presuntos foram coletados em 4 bancas desse local e foram realizadas contagens de bactérias psicrotróficas de 8 amostras e pesquisa de Listeria monocytogenes. Selecionaram-se 134 colônias de psicrotróficos isolados de presunto fatiado, 71 deles apresentaram atividade proteolítica, 58 atividade lipolítica e 12 apresentaram produção de exopolissacarídeo. Selecionaram-se 2 bactérias com a presença dessas atividades para identificação molecular, as quais foram identificadas como Kluyvera sp. e Carnobacterium sp. Além delas, mais 2 Listeria monocytogenes isoladas nesse trabalho foram submetidas ao teste de produção de biofilme, resultando como fracas formadoras e também ao teste de aderência em aço inoxidável, todas apresentando capacidade de adesão. A pesquisa de Listeria monocytogenes nos presuntos fatiados mostrou 100% de presença, sendo que 50% foram identificadas como L. monocytogenes, as quais pertenceram aos sorotipos 1/2a (1), 1/2b (2), 1/2c (2). Realizou-se análise de presunto cozido inteiro, em sua embalagem original, sendo que não foram encontrados micro-organismos Tratou-se o presunto fatiado com extrato de hibisco a 40% e pediocina a 0,5% e 1,0% e realizou-se contagem de mesófilos, psicrotróficos, Listeria spp., S. aureus e E.coli. O extrato de hibisco reduziu a carga desses micro-organismos. Pediocina 0,5% e 1% apresentaram pouca ação frente ao controle de mesófilos, psicrotróficos e E. coli, mas mantiveram a carga de S. aureus controlada e foram eficazes contra Listeria spp. Foram realizadas também contagens para Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesófilos e psicrotróficos em suabes oriundos de fatiador de alimentos, superfície de contato e utensílio utilizados nas bancas do mercado público. Em conclusão grande parte dos psicrotróficos apresentou atividade proteolítica e lipolítica, as quais alteram organolepticamente o alimento. Alguns apresentaram produção de biofilme e capacidade de aderência, fato indesejado, pois sua remoção é mais difícil no ambiente industrial, com isso nota-se que a legislação brasileira apresenta carência na contagem de psicrotróficos em produtos cárneos. / This study aimed to evaluate the microbiota present in sliced cooked ham sold in the public market in Porto Alegre/RS and evaluate the ability of compounds with antimicrobial activity of hibiscus extract and pediocin to control the microbiota found. Ham collected was stored refrigerated until to arrive the laboratory for analysis. Psychrotrophic bacteria counts were performed. Were selected 134 colonies of psychrotrophic microorganisms isolated for sliced ham and 71 of them showed proteolytic activity, 58 lipase activity, 12 showed production of exopolysaccharide. Two of these bacteria were selected for molecular identification which were identified as Kluyvera sp. and Carnobacterium sp. These two bacteria plus two Listeria monocytogenes isolated for sliced ham were subjected to testing of biofilm production (resulting as weak forming of biofilm) and were tested for adhesion in stainless steel and all showed this property. The research of Listeria spp. in sliced cooked ham showed 100% of presence, which 50% were identified as L. monocytogenes to serotypes 1/2a (1) 1/2b (2), 1/2c (2). Analysis was carried out of a whole piece of cooked ham in its original packaging and none microorganisms were found. The sliced ham was treated with hibiscus extract of 40% and pediocin of 0.5% and 1.0% and has been mesophilic, psychrotrophic, Listeria spp., S. aureus and E. coli counts The hibiscus extract reduced the quantity of these microorganisms. Pediocin 0.5% and 1,0% had little action against the control of mesophilic, psychrotrophic and E. coli, but in S. aureus counts were controlled bacteria charge and were effective against Listeria spp.. Also counts of Listeria monocytogenes, E. coli, S. aureus, mesophilic and psychrotrophic bacteria were performed from swabs of slicer food, contact surface and food tool (knife or spatula) used in public market stalls. In conclusion, most of the psychrotrophs presented proteolytic and lipolytic activity, which alter organoleptically the food. Some of them have presented biofilm production and adhesion capacity, undesirable fact because when the biofilm is formed is more difficult to remove it in the industrial environment. With this it is showed that the brazilian legislation presents a lack in the research of psychrotrophs in meat products kept refrigerated.

Listeria monocytogenes é um bastonete Gram-positivo, anaeróbio facultativo, psicrotrófico, patogênico a humanos e transmitido por alimentos. É causador da listeriose, doença severa que acomete grupos de risco específicos, tais como idosos, imunocomprometidos, gestantes, crianças e recém-nascidos. Neste trabalho foi investigada a expressão diferencial de L. monocytogenes na presença de óleo essencial extraído de Baccharis psiadioides, planta da família Asteraceae popularmente chamada de “alecrim-do-campo”, “vassoura” ou “erva formiga”, utilizada pela população como planta medicinal. Além disso, os genomas de dois diferentes sorotipos de L. monocytogenes, frequentemente associados a surtos de listeriose, foram sequenciados através de plataforma MiSeq Illumina, sequências estas depositadas no GenBank, e comparados com genomas de referência. Anteriormente à execução das análises genômica e transcriptômica, foi determinada a composição do óleo essencial extraído de B. psiadioides utilizado nos experimentos, através de cromatografia gasosa com espectrômetro de massa (GC – MS), a qual demonstrou uma maior quantidade de β-pineno na fração composta majoritariamente por monoterpenos, composto este frequentemente encontrado em plantas medicinais aromáticas e apontado como um dos responsáveis pelo potencial antimicrobiano das mesmas. Os demais resultados obtidos no presente trabalho indicam que o óleo essencial testado apresenta potencial ação bacteriostática na concentração estudada, sendo que genes relacionados à virulência do microrganismo foram menos transcritos na sua presença, ao contrário do que foi observado para genes de resposta ao estresse, que apresentaram maiores níveis de transcrição nesta condição. A comparação genômica entre os genomas bacterianos sequenciados neste trabalho e as cepas referência sugere um maior número de proteínas expressas em L. monocytogenes do sorotipo 4b relacionadas à defesa e metabolismo do microrganismo, indicando mecanismos que podem estar envolvidos com a capacidade deste sorotipo estar mais envolvido nos casos humanos de listeriose. / LLiisstteerriiaa mmoonnooccyyttooggeenneess is a Gram-positive rod-shaped microorganism, facultative anaerobic, psychrotrophic, pathogenic to humans and transmitted by food. It causes listeriosis, a severe disease that affects specific risk groups such as elderly, immunocompromised, pregnant women, children and newborns. In this study, differential expression of LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess in the presence of essential oil extracted from BBaacccchhaarriiss ppssiiaaddiiooiiddeess, a plant from AAsstteerraacceeaaee family popularly named as "alecrim-do-campo", "vassoura" or "erva formiga" used by population as a medicinal plant, was investigated. In addition, the genomes of two different LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotypes, often associated with listeriosis outbreaks, were sequenced through the MiSeq Illumina platform. These sequences were deposited in GenBank and compared with reference genomes. Prior to the execution of genomic and transcriptomic analyzes, composition of the essential oil extracted from BB.. ppssiiaaddiiooiiddeess used in the experiments was determined by gas chromatography with mass spectrometer (GC-MS), which demonstrated a higher amount of β-pinene in the fraction composed mainly by monoterpenes. This compound is often found in aromatic medicinal plants and also pointed as one of those responsible for their antimicrobial potential. The other results obtained in the present study indicate that the essential oil tested has a potential bacteriostatic activity at the concentration studied, and genes related to the virulence of the microorganism were less transcribed in its presence, contrary to what was observed for stress response genes, which presented higher transcription levels on that condition. Comparative genomics between the bacterial genomes sequenced in this work and the reference strains suggests a higher number of proteins expressed in LL.. mmoonnooccyyttooggeenneess serotype 4b related to the defense and metabolism of the microorganism, indicating mechanisms that may be involved with the greater ability of this serotype to cause human listeriosis.

Ready to eat (RTE) meat products are subject to recontamination after industrial processing, mainly by Listeria monocytogenes, a pathogenic microorganism that can persist for a long time in the environment. A RTE meat product that is contaminated with L. monocytogenes due to cross contamination during some stage after industrial processing, such as weighing, slicing or wrapping, can be an important causer of disease, due to absence of a kill step before consumption. The objective of this project was to measure the transfer of L. monocytogenes during slicing of cooked ham (cross contamination) at retail, simulating in the laboratory the practices in commercial slicing, and to develop a predictive model capable of describing this transfer. It was observed that in the first slices obtained after the experimental contamination of the slicer, the counts and the transfer rates of L. monocytogenes were higher than in the subsequent slices, and the counting curves presented a long tail as the slices were obtained. The data demonstrate that the slicer may be a relevant source of cross contamination of L. monocytogenes for RTE meat products, regardless of the level of contamination of the slicer. With the data obtained, a new transfer model was proposed called 4p-2se, as it contained four parameters (4p) and two environments (2se), and was independent of the quantification of the pathogen transferred to the slicer. The proposed model was compared to two pathogen transfer models previously described, and the predicted data presented lower RMSE (Root Mean Sum of squared errors) values than the other models. The 4p-2se model was able to satisfactorily predict the pathogen transfer data during slicing of cooked ham, which could assist the food retail establishments and regulatory agencies in the evaluation and control of cross contamination of RTE foods and in the design of proper risk management strategies. / Os produtos derivados da carne que são prontos para consumo estão sujeitos à recontaminação após o processamento industrial, principalmente por Listeria monocytogenes, um microrganismo patogênico capaz de persistir por longo tempo no ambiente. Um produto cárneo pronto para consumo que se contamina com L. monocytogenes devido à contaminação cruzada durante alguma etapa após o processamento industrial, tal como pesagem, fatiamento ou acondicionamento, pode ser um importante causador de enfermidade, pois não há uma etapa de eliminação do patógeno antes do consumo. Este projeto teve por objetivo mensurar a transferência de L. monocytogenes durante o fatiamento de presunto cozido (contaminação cruzada), simulando em laboratório práticas adotadas nos estabelecimentos comerciais de fatiamento de produtos prontos para o consumo, e desenvolver um modelo preditivo capaz de descrever esta transferência. Foi observado que nas primeiras fatias obtidas após a contaminação experimental do fatiador, as contagens e as taxas de transferência de L. monocytogenes eram mais altas que nas subsequentes, observando-se que as curvas de contagem apresentavam uma longa cauda ao longo do fatiamento. Os dados demonstram que o fatiador pode ser uma fonte importante de contaminação cruzada de L. monocytogenes para produtos cárneos prontos para o consumo fatiados, independentemente do nível de contaminação do fatiador. Com os dados obtidos, foi possível sugerir um novo modelo de transferência, denominado 4p-2se, formado por uma equação com apenas quatro parâmetros (4p) e dois ambientes (2se,) sendo esse modelo independente da quantificação do patógeno transferido para o fatiador. O modelo sugerido foi comparado a outros dois modelos de transferência previamente descritos, observando os dados preditos no modelo 4p-2se apresentavam valores de RMSE (Root Mean Sum of squared erros) mais baixos que os demais modelos. O modelo proposto mostrou-se capaz de predizer satisfatoriamente os dados de transferência de patógeno durante o fatiamento de presunto cozido, podendo auxiliar os estabelecimentos comerciais de alimentos e as agências reguladoras na avaliação e controle da contaminação cruzada de alimento prontos para consumo e na concepção de estratégias adequadas de gestão de risco.