Introdução: Mucopolissacaridose IVA ou Síndrome de Morquio A é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima lisossomal Nacetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), que resulta no acúmulo lisossomal dos glicosaminoglicanos: Queratan sulfato e Condroitin-6-sulfato nos tecidos causando as manifestações clínicas. Os fenótipos variam da forma clássica à forma atenuada, ambas sem comprometimento cognitivo. A prevalência de MPS IVA varia de 1/76.000 a 1/640.000 nascidos vivos. Objetivos: Analisar e caracterizar o genótipo de pacientes brasileiros com MPS IVA através de estudos de mutações no gene da GALNS, possibilitando a estimativa de frequência de mutações recorrentes e o estabelecimento um protocolo de rotina para triagem dessas mutações. Métodos: Análise molecular do gene da GALNS foi realizada em 26 pacientes brasileiros inicialmente através de PCR-ARMS para detecção de seis mutações recorrentes (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C e p.S341R) seguidas pela amplificação de regiões codificantes por PCR e sequenciamento. Resultados: Essas mutações foram encontradas em 61,5% da nossa amostra, com uma frequência alélica de 55,8%. Destas, a mutação mais frequente foi p.S341R (26,9%), seguida de p.R386C (21,1%) e p.G116S (7,7%). As mutações p.N164T, p.G139S, p.L307P não foram encontradas em nossa amostra. Além destas, foi encontrada por sequenciamento do éxon 5 uma mutação nova p.C165Y. Conclusão: O protocolo usado para detecção de mutações comuns mostrou-se adequado como um screening inicial de mutações no gene da GALNS, identificando mutações em 61,5% dos pacientes e permitiu a caracterização de 55,8% dos alelos. A mutação p.S341R foi encontrada apenas em pacientes do Nordeste. A identificação de indivíduos heterozigotos nessas famílias será importante para aconselhamento genético e para estimar a prevalência da doença nessa região. Estudos adicionais para identificação da origem dessa mutação, incluindo análises de segregação e haplótipo estão em andamento, e serão avaliadas em conjunto com dados epidemiológicos. / Background: Mucopolysaccharidosis IVA or Morquio A syndrome, is an autosomal recessive disorder caused by deficiency of lysosomal enzyme Nacetylgalactosamine- 6-sulfatase (GALNS), which results in lysosomal storage of glycosaminoglycans: Keratan sulfate and Chondroitin-6-sulfate in tissues causing clinical manifestations. The phenotypes vary from the classical to attenuated form, both without cognitive impairment. The prevalence of MPS IVA ranges from 1/76.000 to 1/640.000 live births. Objective: To analyze and characterize the genotype of Brazilian patients with MPS IVA, through molecular study of mutations in the GALNS gene, enabling the estimative of frequency of recurrent mutations and the establishment of a protocol for routine screening of these mutations. Methods: Molecular analysis of GALNS gene was performed in 26 Brazilian patients initially by ARMS-PCR to detect six recurrent mutations (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C and p.S341R) followed by amplification of coding regions by PCR and sequencing. Results: These mutations were found in 61.5% of our sample, which were present in 55.8% of the alleles. The most frequent mutation was p.RS341R (26.9%), followed by p.R386C (21.1%) and p.G116S (7.7%). Mutations p.N164T, p.G139S, p.L307P were not found in our sample. A novel mutation p.C165Y was found after sequencing of exon 5. Conclusion: The protocol used for detection of common mutations was shown to be adequate for a first screening of mutations at the GALNS gene, once it identified the genotype in 61.5% of patients and allowed the characterization of 55.8% of alleles. The p.S341R was found only in patients from the Northeast. The identification of heterozygous individuals within these families will be important for genetic counseling and for estimating the disease prevalence in this region. Further studies to identify the origin of this mutation, including haplotype and segregation analyses are in progress, and will be evaluated in conjunction with epidemiological data.

Introdução: A mucopolissacaridose tipo I é comumente classificada em três síndromes clínicas (Hurler, Hurler-Scheie e Scheie), de acordo com a gravidade do fenótipo. Devido à alta heterogeneidade da doença e à sobreposição de sintomas em pacientes, alguns autores consideram esta forma de classificação ultrapassada e defendem que a doença apresenta um espectro fenotípico mais amplo. Para tanto, seria muito útil o desenvolvimento de novas ferramentas que possam contribuir para uma melhor classificação dos pacientes. Objetivo: Avaliar um novo instrumento para a classificação fenotípica da MPS I e verificar a correlação dos resultados obtidos com o mesmo com as características bioquímicas e moleculares dos pacientes avaliados. Materiais e Método: Um instrumento elaborado por um grupo de especialistas foi por nós adaptado para avaliar a gravidade do fenótipo ao diagnóstico de 43 pacientes brasileiros com MPS I. Uma nota de zero a 14 foi obtida com a aplicação deste instrumento pela avaliação da presença ou ausência dos seguintes sinais e sintomas ao diagnóstico: atraso no desenvolvimento neuropsicomotor e/ou declínio cognitivo, rigidez articular/artropatia/contraturas articulares, cifose, disostose multiplex, macrocefalia e bossa frontal. Os pacientes incluídos foram também avaliados em relação aos mesmos parâmetros do instrumento e quanto ao seu fenótipo por três geneticistas com reconhecida experiência com essa doença. Dados bioquímicos e moleculares também foram utilizados para comparação com os resultados da aplicação do instrumento. Resultados: Os pontos de corte com melhor balanço de sensibilidade e especificidade encontrados a partir da aplicação do instrumento e a partir da avaliação dos geneticistas foram, respectivamente 7 e 9. Os parâmetros do instrumento para os quais foi observada diferença estatisticamente significativa foram atraso do desenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo (entre o fenótipo Hurler e os fenótipos Hurler-Scheie e Scheie) e disostose múltipla (entre os fenótipos Hurler e Scheie). Não foi observada correlação entre a nota obtida no instrumento e os valores de GAGs urinários, nos diferentes fenótipos. A maior parte dos pacientes com mutações sem sentido foi classificada como grave, tanto a partir do instrumento quanto pela avaliação dos geneticistas. Conclusões: Os pontos de corte encontrados podem ser úteis para a classificação dos pacientes em dois grupos distintos – grave e atenuado. O atraso no dsenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo e a disostose múltipla são achados importantes para predizer a gravidade da doença. Mutações sem sentido parecem determinar o fenótipo mais grave da síndrome. Não foi possível distinguir os diferentes fenótipos a partir dos valores de GAGs na urina. A ferramenta desenvolvida parece ser útil para auxiliar na classificação da gravidade da MPS I, mas é recomendável sua aplicação em um número maior de pacientes para melhor dimensionar sua potencial aplicação. / Introduction: Mucopolysaccharidosis type I is usually classified into three clinical syndromes (Hurler, Hurler-Scheie and Scheie) according to the severity of the phenotypic expression. Some authors believe this classification is not accurate because of disease variation and overlapping findings in some patients, and suggest that its phenotypic spectrum is wider. With this view, it would be useful the development of new tools which could contribute to a better classification of patients. Objective: To evaluate a new tool the phenotypic classification of MPS I and investigate whether the results obtained are correlated with biochemical and molecular characteristics of the patients. Material and methods: A tool developed by a group of specialists was adapted by us for the evaluation of the phenotypic severity at diagnosis in 43 Brazilian patients with MPS I. A score of zero to 14 was obtained using this tool, which evaluated presence or absence of the following signs and symptoms: delay in neurological and psychomotor development and cognitive decline; joint stiffness, arthropathy and joint contractures; kyphosis; dysostosis multiplex; macrocephaly; and frontal bossing. The same patients had the same parameters evaluated by three MDs with expertise in MPS who also provided their impression about the phenotype. Biochemical and molecular findings were also compared with the results obtained in the proposed tool. Results: The cut-off points with better balance of sensitivity and specificity found with the use of the tool and according to the experts' evaluations were 7 and 9, respectively. The tool parameters with statistically significant differences were neurological and psychomotor development delay and cognitive decline (when the Hurler phenotype was compared with the Hurler-Scheie and Scheie phenotypes), and dysostosis multiplex (for the comparison between the Hurler and Scheie phenotypes). There was no correlation between the scores obtained when using the tool and the urinary GAG values across the different phenotypes. Most patients with nonsense mutations were classified as severe according to the tool scores and to the experts’ evaluations. Conclusions: The cut-off points found in this study may be useful for the classification of patients into two distinct groups - severe and attenuated. Neurological and psychomotor developmental delay and cognitive decline, as well as dysostosis multiplex, are important findings to predict disease severity. Nonsense mutations seem to determine the most severe syndrome phenotype. The urinary GAG values do not allow differentiating the different phenotypes. The tool developed seems to be useful to help in the classification of the severity of MPS I, but it would be advisable its application in a larger number of patients to better evaluate its potential application.

Introdução: A mucopolissacaridose tipo I é comumente classificada em três síndromes clínicas (Hurler, Hurler-Scheie e Scheie), de acordo com a gravidade do fenótipo. Devido à alta heterogeneidade da doença e à sobreposição de sintomas em pacientes, alguns autores consideram esta forma de classificação ultrapassada e defendem que a doença apresenta um espectro fenotípico mais amplo. Para tanto, seria muito útil o desenvolvimento de novas ferramentas que possam contribuir para uma melhor classificação dos pacientes. Objetivo: Avaliar um novo instrumento para a classificação fenotípica da MPS I e verificar a correlação dos resultados obtidos com o mesmo com as características bioquímicas e moleculares dos pacientes avaliados. Materiais e Método: Um instrumento elaborado por um grupo de especialistas foi por nós adaptado para avaliar a gravidade do fenótipo ao diagnóstico de 43 pacientes brasileiros com MPS I. Uma nota de zero a 14 foi obtida com a aplicação deste instrumento pela avaliação da presença ou ausência dos seguintes sinais e sintomas ao diagnóstico: atraso no desenvolvimento neuropsicomotor e/ou declínio cognitivo, rigidez articular/artropatia/contraturas articulares, cifose, disostose multiplex, macrocefalia e bossa frontal. Os pacientes incluídos foram também avaliados em relação aos mesmos parâmetros do instrumento e quanto ao seu fenótipo por três geneticistas com reconhecida experiência com essa doença. Dados bioquímicos e moleculares também foram utilizados para comparação com os resultados da aplicação do instrumento. Resultados: Os pontos de corte com melhor balanço de sensibilidade e especificidade encontrados a partir da aplicação do instrumento e a partir da avaliação dos geneticistas foram, respectivamente 7 e 9. Os parâmetros do instrumento para os quais foi observada diferença estatisticamente significativa foram atraso do desenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo (entre o fenótipo Hurler e os fenótipos Hurler-Scheie e Scheie) e disostose múltipla (entre os fenótipos Hurler e Scheie). Não foi observada correlação entre a nota obtida no instrumento e os valores de GAGs urinários, nos diferentes fenótipos. A maior parte dos pacientes com mutações sem sentido foi classificada como grave, tanto a partir do instrumento quanto pela avaliação dos geneticistas. Conclusões: Os pontos de corte encontrados podem ser úteis para a classificação dos pacientes em dois grupos distintos – grave e atenuado. O atraso no dsenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo e a disostose múltipla são achados importantes para predizer a gravidade da doença. Mutações sem sentido parecem determinar o fenótipo mais grave da síndrome. Não foi possível distinguir os diferentes fenótipos a partir dos valores de GAGs na urina. A ferramenta desenvolvida parece ser útil para auxiliar na classificação da gravidade da MPS I, mas é recomendável sua aplicação em um número maior de pacientes para melhor dimensionar sua potencial aplicação. / Introduction: Mucopolysaccharidosis type I is usually classified into three clinical syndromes (Hurler, Hurler-Scheie and Scheie) according to the severity of the phenotypic expression. Some authors believe this classification is not accurate because of disease variation and overlapping findings in some patients, and suggest that its phenotypic spectrum is wider. With this view, it would be useful the development of new tools which could contribute to a better classification of patients. Objective: To evaluate a new tool the phenotypic classification of MPS I and investigate whether the results obtained are correlated with biochemical and molecular characteristics of the patients. Material and methods: A tool developed by a group of specialists was adapted by us for the evaluation of the phenotypic severity at diagnosis in 43 Brazilian patients with MPS I. A score of zero to 14 was obtained using this tool, which evaluated presence or absence of the following signs and symptoms: delay in neurological and psychomotor development and cognitive decline; joint stiffness, arthropathy and joint contractures; kyphosis; dysostosis multiplex; macrocephaly; and frontal bossing. The same patients had the same parameters evaluated by three MDs with expertise in MPS who also provided their impression about the phenotype. Biochemical and molecular findings were also compared with the results obtained in the proposed tool. Results: The cut-off points with better balance of sensitivity and specificity found with the use of the tool and according to the experts' evaluations were 7 and 9, respectively. The tool parameters with statistically significant differences were neurological and psychomotor development delay and cognitive decline (when the Hurler phenotype was compared with the Hurler-Scheie and Scheie phenotypes), and dysostosis multiplex (for the comparison between the Hurler and Scheie phenotypes). There was no correlation between the scores obtained when using the tool and the urinary GAG values across the different phenotypes. Most patients with nonsense mutations were classified as severe according to the tool scores and to the experts’ evaluations. Conclusions: The cut-off points found in this study may be useful for the classification of patients into two distinct groups - severe and attenuated. Neurological and psychomotor developmental delay and cognitive decline, as well as dysostosis multiplex, are important findings to predict disease severity. Nonsense mutations seem to determine the most severe syndrome phenotype. The urinary GAG values do not allow differentiating the different phenotypes. The tool developed seems to be useful to help in the classification of the severity of MPS I, but it would be advisable its application in a larger number of patients to better evaluate its potential application.

Introdução: Mucopolissacaridose IVA ou Síndrome de Morquio A é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima lisossomal Nacetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), que resulta no acúmulo lisossomal dos glicosaminoglicanos: Queratan sulfato e Condroitin-6-sulfato nos tecidos causando as manifestações clínicas. Os fenótipos variam da forma clássica à forma atenuada, ambas sem comprometimento cognitivo. A prevalência de MPS IVA varia de 1/76.000 a 1/640.000 nascidos vivos. Objetivos: Analisar e caracterizar o genótipo de pacientes brasileiros com MPS IVA através de estudos de mutações no gene da GALNS, possibilitando a estimativa de frequência de mutações recorrentes e o estabelecimento um protocolo de rotina para triagem dessas mutações. Métodos: Análise molecular do gene da GALNS foi realizada em 26 pacientes brasileiros inicialmente através de PCR-ARMS para detecção de seis mutações recorrentes (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C e p.S341R) seguidas pela amplificação de regiões codificantes por PCR e sequenciamento. Resultados: Essas mutações foram encontradas em 61,5% da nossa amostra, com uma frequência alélica de 55,8%. Destas, a mutação mais frequente foi p.S341R (26,9%), seguida de p.R386C (21,1%) e p.G116S (7,7%). As mutações p.N164T, p.G139S, p.L307P não foram encontradas em nossa amostra. Além destas, foi encontrada por sequenciamento do éxon 5 uma mutação nova p.C165Y. Conclusão: O protocolo usado para detecção de mutações comuns mostrou-se adequado como um screening inicial de mutações no gene da GALNS, identificando mutações em 61,5% dos pacientes e permitiu a caracterização de 55,8% dos alelos. A mutação p.S341R foi encontrada apenas em pacientes do Nordeste. A identificação de indivíduos heterozigotos nessas famílias será importante para aconselhamento genético e para estimar a prevalência da doença nessa região. Estudos adicionais para identificação da origem dessa mutação, incluindo análises de segregação e haplótipo estão em andamento, e serão avaliadas em conjunto com dados epidemiológicos. / Background: Mucopolysaccharidosis IVA or Morquio A syndrome, is an autosomal recessive disorder caused by deficiency of lysosomal enzyme Nacetylgalactosamine- 6-sulfatase (GALNS), which results in lysosomal storage of glycosaminoglycans: Keratan sulfate and Chondroitin-6-sulfate in tissues causing clinical manifestations. The phenotypes vary from the classical to attenuated form, both without cognitive impairment. The prevalence of MPS IVA ranges from 1/76.000 to 1/640.000 live births. Objective: To analyze and characterize the genotype of Brazilian patients with MPS IVA, through molecular study of mutations in the GALNS gene, enabling the estimative of frequency of recurrent mutations and the establishment of a protocol for routine screening of these mutations. Methods: Molecular analysis of GALNS gene was performed in 26 Brazilian patients initially by ARMS-PCR to detect six recurrent mutations (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C and p.S341R) followed by amplification of coding regions by PCR and sequencing. Results: These mutations were found in 61.5% of our sample, which were present in 55.8% of the alleles. The most frequent mutation was p.RS341R (26.9%), followed by p.R386C (21.1%) and p.G116S (7.7%). Mutations p.N164T, p.G139S, p.L307P were not found in our sample. A novel mutation p.C165Y was found after sequencing of exon 5. Conclusion: The protocol used for detection of common mutations was shown to be adequate for a first screening of mutations at the GALNS gene, once it identified the genotype in 61.5% of patients and allowed the characterization of 55.8% of alleles. The p.S341R was found only in patients from the Northeast. The identification of heterozygous individuals within these families will be important for genetic counseling and for estimating the disease prevalence in this region. Further studies to identify the origin of this mutation, including haplotype and segregation analyses are in progress, and will be evaluated in conjunction with epidemiological data.

A Mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), é uma doença lisossômica de depósito ocasionada pela degradação deficiente dos glicosaminoglicanos (GAG) queratan sulfato e condroitin-6-sulfato devido à deficiência da enzima N-acetilgalactosamina 6-sulfatase. Como a fisiopatologia desta doença ainda não está totalmente elucidada e muitos estudos vêm demonstrando o envolvimento do estresse oxidativo e inflamação na patogênese de outros tipos de mucopolissacaridoses, o objetivo principal deste trabalho foi investigar os parâmetros de estresse oxidativo e mediadores inflamatórios em pacientes MPS IVA sob terapia de reposição enzimática (TRE). Foram analisadas amostras de urina e sangue de pacientes MPS IVA sob TRE (n=17) e controles saudáveis pareados por idade (n=10-14). Os pacientes apresentaram diminuição significativa nos níveis de defesas antioxidantes, medida através dos níveis de glutationa reduzida (GSH), e aumento da enzima superóxido dismutase (SOD) em eritrócitos. Em relação ao dano a biomoléculas, foi observado nos pacientes um aumento de lipoperoxidação (aumento dos níveis de isoprostanos urinários) e de dano oxidativo a proteínas (aumento dos níveis urinários de di-tirosina e diminuição dos grupamentos sulfidrila no plasma) comparativamente aos controles. Nossos resultados também mostraram que os pacientes MPS IVA sob TRE apresentaram maior dano ao DNA, sendo este dano de origem oxidativa e atingindo bases purínicas e pirimidínicas. Além disso, os pacientes apresentaram níveis significativamente aumentados de interleucina-6 e esta, por sua vez, apresentou correlação negativa com GSH, mostrando uma possível relação entre inflamação e estresse oxidativo nesta doença. Considerando que os níveis de GAG urinários ainda se encontravam elevados nos pacientes em comparação com o grupo controle, pode-se supor que os mesmos estejam, pelo menos em parte, correlacionados com os danos oxidativos encontrados nestes pacientes. Os dados encontrados no presente trabalho sugerem que pacientes MPS IVA sob TRE apresentam uma condição pró-inflamatória e oxidativa e que a suplementação com antioxidantes em combinação com a TRE deve ser investigada com o intuito de melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Cabe ressaltar que este é o primeiro estudo em pacientes que relaciona MPS IVA com estresse oxidativo e inflamação. / The Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA) is a lysosomal storage disease caused by impaired degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfate glycosaminoglycans (GAG), due to a deficiency on the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulfatase. Since the pathophysiology of this disease is still not totally elucidated and many studies demonstrated the involvement of oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of other mucopolysaccharidoses types, the principal objective of this study was to investigate oxidative stress parameters and inflammatory mediators in MPS IVA patients under enzyme replacement therapy (ERT). Urine anda blood samples of MPS IVA patients under ERT (n= 17) and healthy age-matched controls (n= 10-14) were evaluated. Patients presented a significant decrease in antioxidant defenses levels, assessed by reduced glutathione (GSH), and increased superoxide dismutase (SOD) activity in erythrocytes. With regard to the biomolecules damage, was observed that patients presented lipid peroxidation (increase of isoprostanes urinary levels) and protein damage (increase of di-tyrosine urinary levels and decrease of sulfhydryl groups in plasma), when compared to controls. Our results showed higher DNA damage levels in MPS IVA patients compared to control group, in both pyrimidines and purines bases. The pro-inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) was significantly increased in patients and showed an inverse correlation with GSH levels, showing a possible link between inflammation and oxidative stress in MPS IVA disease. Considering that GAG urinary level were still high in ERT patients compared to the control group, we propose that GAG are, at least in part, related with oxidative damage found in MPS IVA patients. The data presented suggest that pro-inflammatory and pro-oxidant states occur in MPS IVA patients under ERT, and the supplementation of antioxidants in combination with ERT can be investigated with the purpose of improving the patient’s life quality. To the best of our knowledge, this is the first study in patients relating MPS IVA with oxidative stress and inflammation.

A mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI) ou Síndrome de Maroteaux-Lamy, é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima lisossomal Nacetilgalactosamina- 4-sulfatase (ARSB), a qual resulta no armazenamento lisossômico de dermatan sufato em vários tecidos e órgãos, dando origem a uma condição clínica de espectro variável, desde formas mais graves até formas mais atenuadas. O acúmulo de substrato não degradado causa um importante comprometimento ósseo, problemas respiratórios, baixa estatura e outros problemas, afetando os olhos, o coração e outros órgãos. Embora a síndrome de Maroteaux-Lamy não tenha uma incidência definida no Brasil, é reconhecido que, no nosso meio, é muito mais freqüente do que em outros países e regiões. Ela é particularmente freqüente no município de Monte Santo (Bahia), de aproximadamente 50.000 habitantes e onde já foram registrados 13 casos da doença. O diagnóstico é importante porque existe hoje um tratamento específico para a doença, a terapia de reposição enzimática (TRE), que vem mostrando bons resultados, especialmente quando iniciada em idade precoce. Descrevemos neste trabalho uma adaptação para microplacas da medida fluorimétrica da atividade de ARSB, e uma nova metodologia de análise molecular, ambas padronizados para sangue total impregnado em papel-filtro (STIPF). Essas técnicas foram desenvolvidas para incluir um teste de triagem neonatal para MPS VI, realizado nas amostras coletadas para o “teste do pezinho” nos neonatos do município de Monte Santo. Esses métodos permitem a detecção de pacientes com MPS VI e dos portadores da mutação específica que parece ser responsável pela alta incidência de MPS VI nessa localidade, uma vez que todos os pacientes lá diagnosticados apresentavam a mesma mutação (p.H178L) em homozigose. O trabalho foi desenvolvido em três etapas: na primeira foi realizada a padronização das técnicas em 100 amostras de STIPF; na segunda foi feito um teste-piloto com amostras de neonatos de Monte Santo, para avaliação das técnicas padronizadas e para o estudo de termoestabilidade em controles hígidos; na terceira foram analisadas amostras de STIPF de neonatos provenientes de Monte Santo pelos dois métodos (bioquímico e molecular). A padronização para realização da medida fluorimétrica da atividade enzimática de ARSB em microplacas indicou que o método é sensível, permitiu diferenciar os valores da população normal dos valores dos pacientes afetados e possibilitou a identificação segura de pacientes com MPS VI. Nas padronizações da análise molecular da mutação p.H178L em STIPF foi possível diferenciar os indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos. Os resultados preliminares disponíveis indicam que o protocolo de triagem neonatal para MPS VI desenvolvido no presente trabalho poderá ser facilmente incorporado por laboratórios de referência, contribuindo para a detecção e tratamento precoce dos pacientes afetados por MPS VI. / Mucopolysaccharidosis type VI (MPS VI) or Maroteux-Lamy syndrome, is an autosomal recessive disorder caused by deficiency of the lysosomal enzyme Nacetylgalactosamine- 4-sulfatase (ARSB), which results in lysosomal storage of dermatan sufate in various tissues and organs and leads to a variable clinical spectrum, including more severe and attenuated forms. The accumulation of undegraded substrate causes bone involvement, respiratory problems and short stature, among other signs and symptoms, affecting the eyes, heart and other organs. Although the Maroteaux-Lamy syndrome does not have a defined incidence in Brazil, it is recognized that in our environment it is much more frequent than in other countries and regions. It is particularly frequent in the municipality of Monte Santo (Bahia) approximately 50,000 inhabitants and where there have already been 13 cases of the disease. The diagnosis is important because today there is a specific treatment for the disease, enzyme replacement therapy (ERT) which has shown good results, especially when started at an early age. We describe herein the standardization of the microplate fluorometric method for the ARSB test and a new methodology of molecular analysis, both adapted for dried blood spots (DBS) samples. These techniques were developed for inclusion of MPS VI in the newborn screening program that already tests the neonates of the city of Monte Santo, Bahia, Brasil for metabolic diseases. The methods were developed to detect patients with MPS VI and also for carriers, once the disease seems to have a high incidence (around 1:5.000) at this location. Also, all patients that have already been diagnosed in this city presented the same mutation (p.H178L) in homozygosis. The study was conducted in three stages: in the first was performed in 100 DBS samples an standardization of the techniques; in the second was done a pilot test with samples of newborns of Monte Santo, for the evaluation of standardized techniques and for the thermostability study in healthy controls; in the third were analyzed newborns samples from Monte Santo for both biochemical and molecular methods. Standardization on microplate for fluorimetric enzyme activity of the ARSB showed the assay sensitivity, differentiating values between normal and affected and allowing a reliable detection of patients with MPS VI. On the standardization for molecular analysis in DBS it was possible to differentiate the results for normal individuals, heterozygous and affected for the mutation p.H178L. The preliminary results available indicate that the protocol of neonatal screening for MPS VI developed in this work can be easily incorporated by reference laboratories, contributing to the detection and premature treatment of MPS VI affected patients.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

Mucopolissacaridoses (MPS) são erros inatos do metabolismo, fazem parte das doenças lisossômicas de depósito e ocorrem devido à deficiência na atividade de enzimas que catalisam a degradação de glicosaminoglicanos (GAGs). São doenças crônicas e progressivas causadas pelo acúmulo de um ou mais GAGs nos lisossomos das células. A MPS do tipo IV (síndrome de Morquio) ocorre pelo acúmulo de queratan sulfato e condoitin-6-sulfato, causado pela deficiência de duas diferentes enzimas, que distinguem essa MPS em dois subtipos, deficiência de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (MPS IV tipo A) ou de β-galactosidase (MPS IV tipo B). Na MPS IV A as características clínicas predominantes são relacionadas ao sistema esquelético e na maioria das vezes o paciente tem inteligência normal; não há uma terapia efetiva para a doença, deste modo o diagnóstico precoce direciona para o início de tratamentos paliativos. A investigação inicial dessa MPS se baseia em avaliação clínica, radiografias, quantificação e identificação de GAGs urinários e o diagnóstico definitivo pela medida da atividade enzimática da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) em leucócitos ou fibroblastos. O objetivo desse trabalho foi estudar alguns parâmetros bioquímicos da enzima GALNS em leucócitos de indivíduos normais e adaptar a técnica de medida dessa atividade enzimática para sangue impregnado em papel filtro. O Km e a Vmáx da GALNS em leucócitos de indivíduos normais foi de 7,16mM e 77,3nmol/17h/mg de proteína, respectivamente. Também adaptamos a técnica da medida da atividade enzimática dessa enzima utilizando menor concentração de substrato (3mM), esta concentração teve correlação positiva com a concentração 10 mM, que é empregada na técnica original. A partir disto, foram estabelecidos os valores de referência em leucócitos para indivíduos normais e indivíduos afetados com MPS IV A. Os mesmos foram, respectivamente: 11,0 a 101,4 e 0,1 a 0,2 nmol/17h/mg de proteína. Foi também observado que, com o passar do tempo, a temperatura de 70ºC causa uma inativação gradual da atividade enzimática. Por último, apesar de várias alterações na técnica original em leucócitos, não foi possível adaptá-la para ser utilizada na medida da atividade da GALNS em sangue impregnado em papel filtro. A determinação dos parâmetros bioquímicos da GALNS é conveniente devido ao avanço nos estudos clínicos de desenvolvimento da terapia de reposição enzimática aos indivíduos afetados com MPS IV A e na distinção de indivíduos saudáveis, afetados e heterozigotos. Desenvolver técnicas fluorimétricas em amostras de sangue impregnado em papel filtro é de grande importância para serem utilizadas em triagem de recém-nascidos e populações de alto risco para MPS. Devendo ser confirmado por testes de atividade da enzima em leucócitos ou fibroblastos cultivados. A partir dos nossos protocolos, não foi possível desenvolver e padronizar uma técnica para medida da atividade da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase em sangue impregnado em papel filtro de modo a triarmos indivíduos com suspeita de MPS IV A. / Mucopolysaccharidosis (MPS) are inborn errors of metabolism, are part of the lysosomal storage diseases and occur due to the deficiency in the activity of enzymes that catalyze the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). They are chronic and progressive diseases caused by the accumulation of one or more GAGs in the lysosomes of cells. The MPS type IV (Morquio syndrome) occurs by the accumulation of keratan sulfate and condoitin-6-sulfate, caused by two different enzyme deficiencies, which distinguish this MPS into two subtypes, deficiency of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (MPS IV type A) or the enzyme β-galactosidase (MPS type IV B). In MPS IVA the predominant clinical features are related to the skeletal system and in most cases the patient has normal intelligence. There is no effective therapy for the disease, so early diagnosis directs for the beginning of palliative treatments. The initial investigation of this MPS is based on clinical evaluation, radiographs, quantification and identification of urinary GAGs and the definitive diagnosis by measure of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) activity in leukocytes or fibroblasts. The aim of this work was to study some biochemical parameters of the GALNS in leukocytes of normal individuals and adapt the technique of measuring this enzyme activity to blood impregnated on filter paper. The Km and Vmax of GALNS in leukocytes from normal subjects was 7.16 mM and 77.3 nmol/17h/mg of protein, respectively. We also adapted the technique of measuring the enzymatic activity of this enzyme using lower substrate concentration (3mM). This concentration had a positive correlation with 10 mM concentration, which is used in the original technique. From this, the reference values for normal and individuals affected with MPS IVA in leukocytes were established. They were 11.0 to 101.4 and 0.1 to 0.2 of nmol/17h/mg of protein, respectively. It was also observed that over time the temperature of 70°C causes a gradual inactivation of enzyme activity. Finally, despite several changes to the original technique in leukocytes, it has not been possible to adapt it to be used in measuring the activity of GALNS blood impregnated on filter paper. The determination of biochemical parameters of GALNS is convenient due to the advancement in clinical studies for the development of enzyme replacement therapy for individuals affected with MPS IVA and to distinguish between healthy and affected heterozygous individuals. The development of fluorometric techniques in blood impregnated on filter paper is of great importance for use in newborn screening and in high risk populations to MPS. It should be confirmed by tests of enzyme activity in leukocytes or cultured fibroblasts. Unfortunately, from our protocols, it was not possible to develop and standardize a technique for measuring the activity of the enzyme N- acetylgalactosamine-6-sulfatase in blood impregnated on filter paper for to screen individuals suspected of MPS IVA.

A Mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), é uma doença lisossômica de depósito ocasionada pela degradação deficiente dos glicosaminoglicanos (GAG) queratan sulfato e condroitin-6-sulfato devido à deficiência da enzima N-acetilgalactosamina 6-sulfatase. Como a fisiopatologia desta doença ainda não está totalmente elucidada e muitos estudos vêm demonstrando o envolvimento do estresse oxidativo e inflamação na patogênese de outros tipos de mucopolissacaridoses, o objetivo principal deste trabalho foi investigar os parâmetros de estresse oxidativo e mediadores inflamatórios em pacientes MPS IVA sob terapia de reposição enzimática (TRE). Foram analisadas amostras de urina e sangue de pacientes MPS IVA sob TRE (n=17) e controles saudáveis pareados por idade (n=10-14). Os pacientes apresentaram diminuição significativa nos níveis de defesas antioxidantes, medida através dos níveis de glutationa reduzida (GSH), e aumento da enzima superóxido dismutase (SOD) em eritrócitos. Em relação ao dano a biomoléculas, foi observado nos pacientes um aumento de lipoperoxidação (aumento dos níveis de isoprostanos urinários) e de dano oxidativo a proteínas (aumento dos níveis urinários de di-tirosina e diminuição dos grupamentos sulfidrila no plasma) comparativamente aos controles. Nossos resultados também mostraram que os pacientes MPS IVA sob TRE apresentaram maior dano ao DNA, sendo este dano de origem oxidativa e atingindo bases purínicas e pirimidínicas. Além disso, os pacientes apresentaram níveis significativamente aumentados de interleucina-6 e esta, por sua vez, apresentou correlação negativa com GSH, mostrando uma possível relação entre inflamação e estresse oxidativo nesta doença. Considerando que os níveis de GAG urinários ainda se encontravam elevados nos pacientes em comparação com o grupo controle, pode-se supor que os mesmos estejam, pelo menos em parte, correlacionados com os danos oxidativos encontrados nestes pacientes. Os dados encontrados no presente trabalho sugerem que pacientes MPS IVA sob TRE apresentam uma condição pró-inflamatória e oxidativa e que a suplementação com antioxidantes em combinação com a TRE deve ser investigada com o intuito de melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Cabe ressaltar que este é o primeiro estudo em pacientes que relaciona MPS IVA com estresse oxidativo e inflamação. / The Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA) is a lysosomal storage disease caused by impaired degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfate glycosaminoglycans (GAG), due to a deficiency on the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulfatase. Since the pathophysiology of this disease is still not totally elucidated and many studies demonstrated the involvement of oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of other mucopolysaccharidoses types, the principal objective of this study was to investigate oxidative stress parameters and inflammatory mediators in MPS IVA patients under enzyme replacement therapy (ERT). Urine anda blood samples of MPS IVA patients under ERT (n= 17) and healthy age-matched controls (n= 10-14) were evaluated. Patients presented a significant decrease in antioxidant defenses levels, assessed by reduced glutathione (GSH), and increased superoxide dismutase (SOD) activity in erythrocytes. With regard to the biomolecules damage, was observed that patients presented lipid peroxidation (increase of isoprostanes urinary levels) and protein damage (increase of di-tyrosine urinary levels and decrease of sulfhydryl groups in plasma), when compared to controls. Our results showed higher DNA damage levels in MPS IVA patients compared to control group, in both pyrimidines and purines bases. The pro-inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) was significantly increased in patients and showed an inverse correlation with GSH levels, showing a possible link between inflammation and oxidative stress in MPS IVA disease. Considering that GAG urinary level were still high in ERT patients compared to the control group, we propose that GAG are, at least in part, related with oxidative damage found in MPS IVA patients. The data presented suggest that pro-inflammatory and pro-oxidant states occur in MPS IVA patients under ERT, and the supplementation of antioxidants in combination with ERT can be investigated with the purpose of improving the patient’s life quality. To the best of our knowledge, this is the first study in patients relating MPS IVA with oxidative stress and inflammation.

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