Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:21Z : No. of bitstreams: 1 Publico-178.pdf: 625763 bytes, checksum: bd311a8cd3f7ff010bc833233dd4c82b (MD5) / Objetivo: Desenvolvimento e aplicação de protocolos de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real para a detecção bacteriana e classificação de Gram em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com suspeita clínica de endoftalmite. Métodos: Especificidade analítica foi estabelecida utilizando 31 microrganismos clinicamente importantes, 20 gram-positivos e 11 gram-negativos. Reação cruzada com DNA humano e DNA fúngico foi testada. Amostras controles de humor aquoso coletadas após facoemulsificação foram incluídas. Sensibilidade analítica para as metodologias de PCR foram determinadas utilizando diluição seriada 1:10 de DNA extraído de S. epidermidis e E. coli. As técnicas foram posteriormente aplicadas e testadas em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de endoftalmite. Preparações comerciais de Taq DNA polimerase foram pré-tratadas com DNaseI. Resultados: Amplificação genérica do gene 16S rDNA foi positiva para todos os isolados bacterianos. Classificação de Gram pela técnica de Nested Multiplex PCR não foi possível apenas para isolados de Acinetobacter spp. Utilizando PCR Multiplex em Tempo Real, todos os isolados foram classificados por Gram, sendo que P. acnes exibiu um padrão misto de amplificação. Limite de detecção da metodologia de Nested Multiplex PCR foi de 1 fg/μl para S. epidermidis e E.coli. A sensibilidade de detecção para S. epidermidis e E. coli utilizando reação para detecção universal bacteriana por PCR em Tempo Real com SYBR Green foi de 100 fg/μl (E = 0,82 e 0,86; r2 = 0,99) e 1 pg/μl utilizando metodologia de PCR Multiplex em Tempo Real com Sondas TaqMan (E = 0,66 e 0,77; r2 = 0,99). A positividade da cultura para detecção bacteriana a partir de amostras de humor aquoso e vítreo foi de 47,6% e pelas metodologias de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real foi de 100% e 95,2% respectivamente. Entre as amostras negativas por cultura (n=10), a metodologia de Nested Multiplex PCR foi positiva para todas (100%) e PCR em Tempo Real em 90% dos casos (9/10). Entretanto, a proporção de falso-positivos pela metodologia de Nested Multiplex PCR (65,4%) foi superior aos valores obtidos por PCR em Tempo Real (7,7%). A classificação de gram foi obtida em 88,8% dos casos por Nested PCR e 100% por PCR em Tempo Real. A correlação entre a identificação clássica e classificação de Gram molecular foi 63,6% para ambas as técnicas. A identificação pelo sequenciamento dos produtos obtidos por Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real apresentou correlação de 100% e 88,8%, respectivamente, quando comparada a identificação fenotípica. Conclusões: As metodologias de PCR apresentaram boa correlação quando comparadas com os resultados da cultura e a detecção passou de 47,6% por cultura para 100%, demonstrando serem testes viáveis e mais sensíveis para a caracterização laboratorial de endoftalmite. / Objective: Development and application of Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays for detection and Gram classification of bacteria using aqueous and vitreous humor collected from patients with suspected endophthalmitis. Methods: Analytical specificity was established using 31 clinically important pathogens, 20 gram-positive and 11 gram-negative. Specificity was also tested using human DNA and fungal DNA. Control samples of non-infected aqueous humor collected at the end of phacoemulsification surgery were included. Analytical sensitivity was determined using a 10-fold dilution of S. epidermidis and E. coli DNA. After, methodologies were tested in aqueous and vitreous humor collected from patients with clinical diagnosis of endophthalmitis. Comercial Taq polymersase preparations were DNA decontaminated using DNaseI pretreatment. Results: Universal amplification of 16S rDNA was achieved for all bacterial isolated. Nested Multiplex PCR failed only to determine the Gram status of Acinetobacter spp. Gram classification was achieved for every bacterial isolates using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR, and only a P. acnes isolate showed a mixed signal. Limit of detection using Nested Multiplex PCR was 1 fg/μl for both S. epidermidis and E. coli. Sensitivity for detection of S. epidermidis and E. coli DNA using a SYBR Green 16S rDNA-based universal PCR was 100 fg/μl (E = 0.82 and 0.86; r2 = 0.99) and 1 pg/μl using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR (E = 0.66 and 0.77; r2 = 0.99). Culture was positive in 47.6% of aqueous and vitreous humor analysis. Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays were positive in 100% and 95.2% of these cases, respectively. Among negative culture samples, Nested Multiplex PCR was positive for all (100%) and Real Time PCR assays in 90% of cases (9/10). Gram classification was completed for 88.8% and 100% samples using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR methodologies, respectively. Correlation of 63.6% between microbiological and molecular Gram classification was observed using both molecular assays. 16S rDNA sequence-based identification using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR products showed 100% and 88.8% correlation respectively when compared with phenotypic identification. Conclusions: Both PCR methodologies presented good correlation when compared with culture-proven results and bacterial detection was improved from 47.6%% to 100% showing to be feasible tests for laboratorial characterization of bacterial endophthalmitis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A tuberculose (TB) é um importante problema de saúde pública, portanto, é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção rápida e confiável do Mycobacterium tuberculosis, prevenindo a transmissão da TB. O objetivo deste estudo foi avaliar dois testes moleculares para detecção de bactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) diretamente de amostras clínicas. Foi realizado um estudo transversal, no qual foram selecionadas 124 amostras respiratórias. As amostras foram avaliadas por dois testes moleculares “in house” para detecção do MTBC: NESTED-PCR (NPCR) e Real Time PCR (RT-PCR) ambos com primers para o IS6110. As amostras também foram avaliadas por um teste direto (pesquisa de BAAR). Os resultados foram comparados com a cultura para M.tuberculosis e também com os resultados da cultura juntamente com dados clínicos. Uma amostra comercial com quantificação de DNA conhecida foi utilizada para determinação do Limite de Detecção (LOD) dos testes moleculares. O LOD foi de 1 cópia/μL para o RT-PCR e de 25 cópias/μL para o NPCR. O BAAR apresentou baixa sensibilidade - SE - (40%) e alta especificidade - SP - (94%). Ambos os ensaios moleculares, apresentaram elevada SE e SP (RT-PCR 98% e 91%, NPCR 86% e 93%, respectivamente) em relação à cultura. Quando comparamos os resultados frente a cultura juntamente com os dados clínicos, a SE e a SP foram de 90% e 97% para a RT-PCR e de 80% e 99% para a NPCR, respectivamente. Houve um pequeno decréscimo da SE dos métodos moleculares, quando comparados com a cultura mais os dados clínicos em relação à cultura isoladamente, no entanto, a SP foi consideravelmente elevada para os três métodos avaliados. Avaliamos o custo dos insumos para os ensaios moleculares: o custo do NPCR foi de $ 17.77/teste enquanto que o custo do RT-PCR foi de $ 15.76/teste. Em relação ao tempo de execução dos testes o RT-PCR foi mais rápido (2 horas) do que o NPCR (4 horas). Este estudo confirma que técnicas de PCRs podem ser muito úteis para o diagnóstico rápido da TB respiratória, com altas taxas de SP. Ele também pode ser muito importante para a exclusão de diagnóstico, considerando o alto VPN encontrados no nosso estudo. Os resultados demonstraram que os ensaios moleculares visando IS6110 do M. tuberculosis podem ajudar a melhorar o diagnóstico da TB pulmonar, com muitos potenciais efeitos positivos para a gestão clínica e de controle da doença. / Tuberculosis (TB) remains as an important public health problem worldwide. Therefore, the rapid detection of M. tuberculosis is of primary importance to effectively reduce transmission among patients. The aims of this study were to evaluate two molecular tests to detect M. tuberculosis complex (MTBC) directly from clinical samples. The study included 124 respiratory samples which were evaluated by two in house molecular assays for MTBC detection: Nested PCR (NPCR) and Real Time PCR (RT-PCR). The respiratory samples were also evaluated by the direct test (AFB assay). The results were compared with the results of culture and also compared with the culture results plus clinical data of patients. We used a commercial DNA sample with known quantification to establish the Limit of Detection (LOD). The LOD was 1 copy/μL for RT-PCR and 25 copies/μL for NPCR. The AFB assay presented low sensitivity – SE - (40%) and a high specificity - SP – (94%). Both molecular assays, RT-PCR and NPCR presented high SE and SP (RT-PCR 98% and 91%, NPCR 86% and 93%, respectively) compared to culture. When the results of the molecular tests were compared to the culture plus clinical data the SE and SP were 90,20% and 97,26% for RT-PCR and 80,39% and 98,63% for the NPCR, respectively. It was possible to observe a slight decrease of SE of the molecular methods in comparison to culture plus clinical data in relation to culture; however, the SP was increased, since many cases of TB could not be confirmed by culture. Furthermore we evaluated the cost of molecular assays: the NPCR cost was $17.77/test while the RT-PCR cost was $15.76/test. The RT-PCR test was faster (2 hours) than the NPCR (4 hours) to be performed. Our study confirms that PCRs may be useful for rapid diagnosis of respiratory TB, with high SP rates. It may also be very important to exclude such diagnosis, considering the high NPV found in our study. In summary, PCRs targeting IS6110 of MTB improve the accuracy of the diagnosis of pulmonary TB, with many potential positive effects for clinical management and control of the disease.

A tuberculose (TB) é um importante problema de saúde pública, portanto, é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção rápida e confiável do Mycobacterium tuberculosis, prevenindo a transmissão da TB. O objetivo deste estudo foi avaliar dois testes moleculares para detecção de bactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) diretamente de amostras clínicas. Foi realizado um estudo transversal, no qual foram selecionadas 124 amostras respiratórias. As amostras foram avaliadas por dois testes moleculares “in house” para detecção do MTBC: NESTED-PCR (NPCR) e Real Time PCR (RT-PCR) ambos com primers para o IS6110. As amostras também foram avaliadas por um teste direto (pesquisa de BAAR). Os resultados foram comparados com a cultura para M.tuberculosis e também com os resultados da cultura juntamente com dados clínicos. Uma amostra comercial com quantificação de DNA conhecida foi utilizada para determinação do Limite de Detecção (LOD) dos testes moleculares. O LOD foi de 1 cópia/μL para o RT-PCR e de 25 cópias/μL para o NPCR. O BAAR apresentou baixa sensibilidade - SE - (40%) e alta especificidade - SP - (94%). Ambos os ensaios moleculares, apresentaram elevada SE e SP (RT-PCR 98% e 91%, NPCR 86% e 93%, respectivamente) em relação à cultura. Quando comparamos os resultados frente a cultura juntamente com os dados clínicos, a SE e a SP foram de 90% e 97% para a RT-PCR e de 80% e 99% para a NPCR, respectivamente. Houve um pequeno decréscimo da SE dos métodos moleculares, quando comparados com a cultura mais os dados clínicos em relação à cultura isoladamente, no entanto, a SP foi consideravelmente elevada para os três métodos avaliados. Avaliamos o custo dos insumos para os ensaios moleculares: o custo do NPCR foi de $ 17.77/teste enquanto que o custo do RT-PCR foi de $ 15.76/teste. Em relação ao tempo de execução dos testes o RT-PCR foi mais rápido (2 horas) do que o NPCR (4 horas). Este estudo confirma que técnicas de PCRs podem ser muito úteis para o diagnóstico rápido da TB respiratória, com altas taxas de SP. Ele também pode ser muito importante para a exclusão de diagnóstico, considerando o alto VPN encontrados no nosso estudo. Os resultados demonstraram que os ensaios moleculares visando IS6110 do M. tuberculosis podem ajudar a melhorar o diagnóstico da TB pulmonar, com muitos potenciais efeitos positivos para a gestão clínica e de controle da doença. / Tuberculosis (TB) remains as an important public health problem worldwide. Therefore, the rapid detection of M. tuberculosis is of primary importance to effectively reduce transmission among patients. The aims of this study were to evaluate two molecular tests to detect M. tuberculosis complex (MTBC) directly from clinical samples. The study included 124 respiratory samples which were evaluated by two in house molecular assays for MTBC detection: Nested PCR (NPCR) and Real Time PCR (RT-PCR). The respiratory samples were also evaluated by the direct test (AFB assay). The results were compared with the results of culture and also compared with the culture results plus clinical data of patients. We used a commercial DNA sample with known quantification to establish the Limit of Detection (LOD). The LOD was 1 copy/μL for RT-PCR and 25 copies/μL for NPCR. The AFB assay presented low sensitivity – SE - (40%) and a high specificity - SP – (94%). Both molecular assays, RT-PCR and NPCR presented high SE and SP (RT-PCR 98% and 91%, NPCR 86% and 93%, respectively) compared to culture. When the results of the molecular tests were compared to the culture plus clinical data the SE and SP were 90,20% and 97,26% for RT-PCR and 80,39% and 98,63% for the NPCR, respectively. It was possible to observe a slight decrease of SE of the molecular methods in comparison to culture plus clinical data in relation to culture; however, the SP was increased, since many cases of TB could not be confirmed by culture. Furthermore we evaluated the cost of molecular assays: the NPCR cost was $17.77/test while the RT-PCR cost was $15.76/test. The RT-PCR test was faster (2 hours) than the NPCR (4 hours) to be performed. Our study confirms that PCRs may be useful for rapid diagnosis of respiratory TB, with high SP rates. It may also be very important to exclude such diagnosis, considering the high NPV found in our study. In summary, PCRs targeting IS6110 of MTB improve the accuracy of the diagnosis of pulmonary TB, with many potential positive effects for clinical management and control of the disease.

A tuberculose (TB) é um importante problema de saúde pública, portanto, é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção rápida e confiável do Mycobacterium tuberculosis, prevenindo a transmissão da TB. O objetivo deste estudo foi avaliar dois testes moleculares para detecção de bactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) diretamente de amostras clínicas. Foi realizado um estudo transversal, no qual foram selecionadas 124 amostras respiratórias. As amostras foram avaliadas por dois testes moleculares “in house” para detecção do MTBC: NESTED-PCR (NPCR) e Real Time PCR (RT-PCR) ambos com primers para o IS6110. As amostras também foram avaliadas por um teste direto (pesquisa de BAAR). Os resultados foram comparados com a cultura para M.tuberculosis e também com os resultados da cultura juntamente com dados clínicos. Uma amostra comercial com quantificação de DNA conhecida foi utilizada para determinação do Limite de Detecção (LOD) dos testes moleculares. O LOD foi de 1 cópia/μL para o RT-PCR e de 25 cópias/μL para o NPCR. O BAAR apresentou baixa sensibilidade - SE - (40%) e alta especificidade - SP - (94%). Ambos os ensaios moleculares, apresentaram elevada SE e SP (RT-PCR 98% e 91%, NPCR 86% e 93%, respectivamente) em relação à cultura. Quando comparamos os resultados frente a cultura juntamente com os dados clínicos, a SE e a SP foram de 90% e 97% para a RT-PCR e de 80% e 99% para a NPCR, respectivamente. Houve um pequeno decréscimo da SE dos métodos moleculares, quando comparados com a cultura mais os dados clínicos em relação à cultura isoladamente, no entanto, a SP foi consideravelmente elevada para os três métodos avaliados. Avaliamos o custo dos insumos para os ensaios moleculares: o custo do NPCR foi de $ 17.77/teste enquanto que o custo do RT-PCR foi de $ 15.76/teste. Em relação ao tempo de execução dos testes o RT-PCR foi mais rápido (2 horas) do que o NPCR (4 horas). Este estudo confirma que técnicas de PCRs podem ser muito úteis para o diagnóstico rápido da TB respiratória, com altas taxas de SP. Ele também pode ser muito importante para a exclusão de diagnóstico, considerando o alto VPN encontrados no nosso estudo. Os resultados demonstraram que os ensaios moleculares visando IS6110 do M. tuberculosis podem ajudar a melhorar o diagnóstico da TB pulmonar, com muitos potenciais efeitos positivos para a gestão clínica e de controle da doença. / Tuberculosis (TB) remains as an important public health problem worldwide. Therefore, the rapid detection of M. tuberculosis is of primary importance to effectively reduce transmission among patients. The aims of this study were to evaluate two molecular tests to detect M. tuberculosis complex (MTBC) directly from clinical samples. The study included 124 respiratory samples which were evaluated by two in house molecular assays for MTBC detection: Nested PCR (NPCR) and Real Time PCR (RT-PCR). The respiratory samples were also evaluated by the direct test (AFB assay). The results were compared with the results of culture and also compared with the culture results plus clinical data of patients. We used a commercial DNA sample with known quantification to establish the Limit of Detection (LOD). The LOD was 1 copy/μL for RT-PCR and 25 copies/μL for NPCR. The AFB assay presented low sensitivity – SE - (40%) and a high specificity - SP – (94%). Both molecular assays, RT-PCR and NPCR presented high SE and SP (RT-PCR 98% and 91%, NPCR 86% and 93%, respectively) compared to culture. When the results of the molecular tests were compared to the culture plus clinical data the SE and SP were 90,20% and 97,26% for RT-PCR and 80,39% and 98,63% for the NPCR, respectively. It was possible to observe a slight decrease of SE of the molecular methods in comparison to culture plus clinical data in relation to culture; however, the SP was increased, since many cases of TB could not be confirmed by culture. Furthermore we evaluated the cost of molecular assays: the NPCR cost was $17.77/test while the RT-PCR cost was $15.76/test. The RT-PCR test was faster (2 hours) than the NPCR (4 hours) to be performed. Our study confirms that PCRs may be useful for rapid diagnosis of respiratory TB, with high SP rates. It may also be very important to exclude such diagnosis, considering the high NPV found in our study. In summary, PCRs targeting IS6110 of MTB improve the accuracy of the diagnosis of pulmonary TB, with many potential positive effects for clinical management and control of the disease.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4510_1.pdf: 1312401 bytes, checksum: 103b70bf03d8851fef2766e8bd0290f9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico e agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica de evolução aguda ou crônica que se não diagnosticada e tratada a tempo pode ser fatal. Um método molecular para caracterização e detecção de P. brasiliensis foi desenvolvido a partir da clonagem e do sequenciamento de um fragmento de DNA de ~750 pb, obtido por RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), presente em isolados virulentos e ausente em isolados avirulentos deste fungo. Uma região interna do fragmento de DNA seqüenciado foi usada para desenhar primers que posteriormente foram utilizados em uma reação de hemi-nested PCR em tubo único. A reação de PCR específica foi capaz de amplificar DNA de três isolados de P. brasiliensis reconhecidamente virulentos e três isolados recentemente obtidos de pacientes com paracoccidioidomicose. A especificidade desta PCR foi confirmada pela ausência de produtos amplificados com DNA genômico de isolados de Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Mycobacterium tuberculosis, Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni, DNA genômico humano (leucócitos) e de isolados de P. brasiliensis reconhecidamente avirulentas. A amplificação de cDNA de um isolado virulento sugere tratar-se de um gene expresso. A detecção específica de isolados virulentos de P. brasiliensis sugere ser este um candidato a marcador de virulência para este fungo. O potencial diagnóstico da PCR específica foi verificado com DNA extraído de aspirado de linfonodo de um paciente com paracoccidioidomicose

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:29:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO - HUGO DELLEON-1.pdf: 1681733 bytes, checksum: ec21194046431954674916776c620d9e (MD5) Previous issue date: 2009-05-27 / Although water is of vital importance for living beings, due to antropic action it becomes a way of dissemination of several microorganisms, which reach aquatic environments through the faeces of man and other animals and can cause several illnesses, especially for immunocompromised individuals. During routine environmental monitoring, coliform bacteria are normally used as a microbiological parameter of water quality, which does not evidence its contamination by viruses. Several researchers have proposed the detection of adenovirus (AdVs) by PCR as a molecular index to monitor other enteric viruses. AdVs are among the most persistent and ubiquitous enteric viruses present in water and associated with a variety of clinical manifestations. This study aimed to evaluate the quality of water collected from lakes and rivers in Goiânia as to the occurrence of AdVs. Water samples were collected monthly, from December 2007 to November 2008, at five different points in Goiânia (lakes of Bosque dos Buritis and Vaca Brava park, João Leite and Meia Ponte rivers downstream and upstream the municipal sewage treatment plant). The analyses were carried out at the Laboratório de Diagnóstico Genético e Molecular and Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Universidade Federal de Goiás. All the samples were filtered in a positively-charged nylon membrane followed by molecular detection using PCR and semi-nested PCR. Also, we performed physical-chemical and bacteriological tests to correlate these results with the occurrence of AdVs. Simultaneously, the Núcleo de Pesquisas em Agentes Emergentes e Re-emergentes carried out a meta-analysis to evaluate three methods of concentration of AdVs coupled to molecular detection in samples of untreated water. Since 29 out of the 54 water samples collected were positive for AdVs (39.2%), our results suggest the use of the methodology proposed in the present study for the detection of these pathogens in water. We observed statistically significant difference between nitrites, phosphates, fixed residues, total residues and the occurrence of AdVs, whereas no correlation was observed between fecal coliforms and AdVs. Furthermore, the occurrence of AdVs in the state of Goiás shows a seasonal trend. Based on the 33 studies selected for the meta-analysis, it was possible to get to the following interpretations: the most effective method to detect AdVs in samples from rivers or lakes was ultracentrifugation combined with nested-PCR; it is advisable to use a combination of microfiltration membrane and ultrafugation with the subsequent diagnosis using qPCR to detect AdVs in samples of treated and untreated sewage. This has been the first study carried out for the detection and monitoring of AdVs in water bodies in the Midwestern Region of Brazil and the present results may be useful to propose the eco-epidemiological profile of AdVs or even the routes of some neglected diseases, which points out the need to define a virus indicator / Embora a água seja de vital importância para os seres vivos, em decorrência da ação antrópica torna-se meio de disseminação de inúmeros microrganismos, que chegam aos ambientes aquáticos por meio das fezes do homem e de outros animais, podendo desencadear diversas doenças, sobretudo em indivíduos imunocomprometidos. Em rotina de monitoramento ambiental, normalmente são utilizadas bactérias do grupo dos coliformes fecais como parâmetro microbiológico de qualidade das águas, o que não evidencia sua contaminação por vírus. Alguns pesquisadores têm proposto a detecção de adenovírus (AdVs) por PCR como indexação no monitoramento de outros vírus entéricos. AdVs estão entre os mais persistentes e ubíquos vírus entéricos presentes em águas e associados com uma variedade de manifestações clínicas. Objetivou-se avaliar a qualidade da água de rios e lagos da cidade de Goiânia em relação à ocorrência de AdVs. Amostras de água foram coletadas mensalmente, entre dezembro de 2007 e novembro de 2008, em cinco diferentes pontos de Goiânia (lagos do Bosque dos Buritis e parque Vaca Brava e rios João Leite e Meia Ponte a jusante e montante da estação de tratamento de esgoto municipal). As análises laboratoriais foram realizadas pelo Laboratório de Diagnóstico Genético e Molecular e Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Universidade Federal de Goiás. Inicialmente, as amostras foram filtradas em membrana de nylon carregada positivamente e, em seguida, submetidas a detecção molecular por PCR e semi-nested PCR. Também foram realizados testes físico-químicos e bacteriológicos para correlacionar estes resultados com a ocorrência de AdVs. Concomitantemente, o Núcleo de Pesquisas em Agentes Emergentes e Re-emergentes conduziu uma metanálise avaliativa de três metodologias de concentração de AdVs acopladas à detecção molecular em amostras de águas não tratadas. Das 54 amostras coletas, 29 foram positivas para AdVs (39,2%), sugerindo o uso da metodologia proposta neste estudo para detectar estes patógenos em água. Foi observada diferença estatisticamente significativa entre nitritos, fosfatos, resíduos fixos, resíduos totais e a ocorrência de AdVs, mas não foi observada correlação entre coliformes fecais e AdVs. Além disso, a ocorrência de AdVs no estado de Goiás exibiu tendência à sazonalidade. Na metanálise, a partir dos 33 artigos selecionados foi possível fazer as seguintes interpretações: para detectar AdVs em amostras de rios ou lagos, o método mais eficiente foi a ultracentrifugação em combinação com nested-PCR; para a detecção de AdVs em amostras de esgoto tratado e não tratado é aconselhável utilizar uma combinação de microfiltração em membrana e ultrafiltração com subsequente diagnóstico por qPCR. Este foi o primeiro estudo a detectar e monitorar AdVs em cursos de água na Região Centro-Oeste do Brasil e os presentes resultados podem ser úteis para propor o perfil eco-epidemiológico dos AdVs ou até mesmo das rotas de algumas doenças que são negligenciadas, o que demonstra a necessidade de definir um indicador viral

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_marcelo_gotze.pdf: 556489 bytes, checksum: cb0ceeb57d3c58da117f1a655a510d0d (MD5) Previous issue date: 2010-03-18 / Bovine babesiosis caused by Babesia bovis and Babesia bigemina, is the most important disease transmitted by Rhipicephalus (Boophilus) microplus in tropical and subtropical areas in South America. Definitive diagnosis can be made by detecting infected erythrocytes in blood smears. However, the parasitemia in peripheral blood is often too low for this method to be used for diagnostic purposes. For this reason, several serological tests, including complement fixation, indirect hemagglutination and indirect immunofluorescence (IIF) have been used to detect antibodies in infected cattle. Although these tests allow the detection of persistently infected animals, they have limitations in specificity and/or sensitivity. The IIF has been the most sensitive, but cross-reactivity between species, subjective interpretation, and low production has limited its usefulness. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) have found wide application in the diagnosis of infectious diseases. The cELISA format (competitive) can provide an additional level of specificity, because the antibody is directed to a single epitope, specific for the organism to be detected. For these reasons, this study aimed to evaluate the sensitivity and specificity of cELISA compared to IIF and nested PCR (nPCR) for diagnosis babesiosis caused by B. bovis. Therefore, blood samples were collected from cattle in Brazil and Argentina, and processed for the diagnosis of B. bovis. The nPCR was used as the gold standard to validate the cELISA and the IIF as a comparative test. The cELISA for the diagnosis of B. bovis presented is easily processed with high levels of sensitivity and specificity. It is easily performed in a high number of samples, making it useful in cases of outbreaks of bovine babesiosis. / A babesiose bovina, causada por Babesia bovis e Babesia bigemina, é a doença mais importante transmitida por carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus em áreas tropicais e subtropicais da América do Sul. O diagnóstico definitivo pode ser feito através da detecção de eritrócitos infectados em esfregaços sanguineos, porém a parasitemia em sangue periférico é frequentemente muito baixa para que esse método seja utilizado de forma confiável para fins de diagnóstico. Por esse motivo, vários testes sorológicos, incluindo a fixação de complemento, hemaglutinação indireta e imunofluorescência indireta (IIF) têm sido usados para detectar anticorpos em bovinos infectados. Embora estes testes permitam a detecção de animais persistentemente infectados, eles têm limitações na especificidade e/ou sensibilidade. O IIF tem sido o mais sensível, mas a reatividade cruzada entre as espécies, interpretação subjetiva, e baixa produção tem limitado a sua utilidade. Os ELISA têm encontrado ampla aplicação no diagnóstico de doenças infecciosas. O formato cELISA (competitivo) pode fornecer um nível adicional de especificidade, pois o anticorpo é dirigido para um epitopo único específico para o organismo a ser detectado. Por estas razões, este estudo teve como objetivo avaliar a sensibilidade e especificidade do cELISA comparado com IIF e nested PCR (nPCR) para diagnóstico de babesiose causada por B. bovis. Para tanto, amostras de sangue bovino foram coletadas no Brasil e na Argentina e processadas para o diagnóstico de B. bovis. Utilizou-se o nPCR como teste padrão para a validação do cELISA, e a IIF como teste comparativo. O cELISA para diagnóstico de B. bovis apresentou-se de fácil processamento, com altos níveis sensibilidade e especificidade, além da rapidez no processamento de amostras em larga escala, sendo de grande utilidade para casos de surtos de babesiose bovina

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T12:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roesler_BrunaMaria_M.pdf: 3428404 bytes, checksum: ee37171bd6740210c88477c4839317fb (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa que está estritamente relacionada com o desenvolvimento de doenças gástricas, inclusive malignas, sendo classificada como carcinógeno do grupo I pela Agência Internacional para Pesquisa do Câncer. Apesar de grande parte da população mundial estar contaminada pela bactéria, a maioria dos indivíduos permanece assintomática. Muitas abordagens são sugeridas para diferenciar os isolados de H. pylori e diversas técnicas de biologia molecular têm sido aplicadas para caracterizar as amostras clínicas de diferentes pacientes. A análise de restrição (RFLP) usada em conjunto com a PCR tem sido amplamente utilizada para a tipagem de isolados clínicos, utilizando vários genes do genoma do H. pylori como alvos para esse método. Padrões de eletroforese da nested PCR e da PCR para as regiões dos genes urease C e urease B do H. pylori foram obtidos com enzimas de restrição e comparados entre pacientes com úlcera péptica e gastrite crônica. Os produtos da nested PCR para urease C foram digeridos com a enzima Mbo I e os produtos da PCR para urease B com a enzima Hae III, sendo os fragmentos obtidos analisados por eletroforese em gel de agarose. Foram encontrados 7 padrões de genotipagem para urease B e 17 padrões para urease C. O grupo prevalente para gastrite crônica obtido com essa última genotipagem foi o denominado grupo ureC MboI G, com fragmentos de 110, 120, 250 e 310 pares de bases, ocorrendo em 13 pacientes (15,7% dos casos). Em relação aos casos de úlcera péptica, o grupo de genotipagem mais prevalente foi o denominado ureC MboI E, com 110, 180 e 500 pares de bases, ocorrendo em 11 pacientes (24,4% do total de casos). O grupo prevalente obtido com a genotipagem para urease B foi o denominado ureB I, com um fragmento único de 750 pares de bases. Esse grupo foi o prevalente tanto para os casos de úlcera péptica (27), com 60,0%, quanto para os de gastrite crônica (53), com 63,9%. Não foram observadas diferenças significativas entre os padrões encontrados para ambas as doenças. A nested PCR para detecção prévia do DNA do H. pylori também foi realizada, obtendo-se 100% de concordância. Os métodos de tipagem dos produtos obtidos por nested PCR e PCR proporcionam um esquema funcional e de grande reprodutibilidade para estudos epidemiológicos e de caracterização de cepas / Abstract: Helicobacter pylori is a gram-negative bacterium that has been implicated as a major human gastric pathogen responsible for gastritis and peptic ulcer disease. It has been classified as a group I carcinogen by the International Agency for Research on Cancer and is regarded as a primary factor for gastric cancer. A significant proportion of the world population is infected with H. pylori, even though most infections are asymptomatic. To isolate H. pylori, many approaches have been presented and several molecular techniques have been applied to separate clinical isolates from different patients. PCR-RFLP analysis has been widely developed for the typing of clinical isolates, with several genes within H. pylori having been targeted by this method. Eletroforesis patterns of nested PCR and PCR to urease C and urease B gene regions of H. pylori were obtained by restriction fragment length polymorphism and compared among patients with peptic ulcer and chronic gastritis. Nested PCR products for urease C were digested with MboI enzyme and PCR products for urease B with Hae III enzyme, and the obtained fragments were analyzed by eletroforesis in agarosis gel. We have encountered 7 genotyping patterns for urease B and 17 patterns for urease C. The prevalent group for chronic gastritis which was obtained with this last genotyping was named ureC MboI G group, with fragments of 110, 120, 250 and 310 base pairs, occurring in 13 patients (15,7% of the cases). Regarding the peptic ulcer cases, the most prevalent genotyping group was named ureC MboI E group, with 110, 180 and 500 base pairs, occurring in 11 patients (24,4% of the cases). The prevalent group obtained with the genotyping for urease B was named ureB I, with only one fragment of 750 base pairs. This group was the prevalent one both in peptic ulcer cases (27) with 60,0%, and in chronic gastritis case (53), with 63,9%. We haven¿t found meaningful differences among the encountered patterns for both diseases. Nested PCR for previous detection of H. pylori DNA has also been performed, and we have obtained 100% of concordance. The typing methods of the products obtained by nested PCR and PCR show a functional scheme and of great reproduction for epidemiologic studies and of H. pylori strains characterization / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Gopherus polyphemus, commonly known as the Gopher Tortoise, is a dryland reptile native to the southeastern United States. It is commonly a resident of longleaf pine and dry oak sand hill habitats. It is considered a keystone species because they dig deep burrows that provide shelter to them as well as many other animals. Habitat loss, fragmentation, and disease are major threats and have caused this species to be federally listed as a threatened species under the Endangered Species Act (ESA). Disease is a major threat to the gopher tortoise’s survival, and with declining populations, the need to investigate pathogens is crucial. Herpesvirus, is known to contribute to upper respiratory tract diseases (URTD) in G. polyphemus and is the primary focus of this project. Due to high mutation rates in the virus, a modified version of PCR, nested PCR, was conducted on eye and nose swabs and blood samples obtained from G. polyphemus to detect the presence of the alpha herpesvirus pathogen. The positive samples were then sent for genetic sequencing to confirm the occurrence of the pathogen. The detectability of Herpesvirus in eye and nose swabs was compared to blood and lymph samples and statistical tests concluded that both sample types had the same detectability.

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