Orientador: Jose Antonio Rocha Gontijo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T10:17:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grigoletti_GabrielBoerLima_M.pdf: 3195983 bytes, checksum: 162e3819e6b1b271cfcaa92020a90fa4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O estresse gestacional afeta diversas regiões neurais incluindo hipocampo, amígdala, corpo caloso, neocortéx, cerebelo e hipotálamo e frequentemente resulta em redução no volume dos tecidos que compõem estas estruturas. A formação hipocampal tem sido alvo de diversos estudos devido a sua importância na plasticidade neural, na neurogênese e na regulação de processos cognitivos. Dessa forma, este estudo buscou avaliar os efeitos da restrição proteica, durante a gestação e amamentação, sobre a estrutura do hipocampo e o comportamento relacionado à memória e emoções (ansiedade/medo) bem como sobre a composição celular desta estrutura cerebral e, a influência sobre estes parâmetros morfológicos e comportamentais, da exposição da prole de ratos machos ao ambiente enriquecido. Os achados deste estudo representam o impacto pré e perinatal da desnutrição proteica correspondente à situação de estresse nutricional, no hipocampo que está envolvido no comportamento emocional bem como na memória e no aprendizado. O estudo revelou dissociação entre a resposta do teste comportamental e alterações no número de neurônios hipocampais, como consequência da programação fetal. A ausência de alterações basais no desempenho destes testes, ocorreram a despeito de redução no número de neurônios no giro denteado do hipocampo. Vários autores têm sugerido que a atrofia observada no hipocampo pode ser uma resposta compensatória para proteger o hipocampo de danos adicionais. Nós demonstramos, pela primeira vez, que a exposição materna a restrição proteica durante o desenvolvimento neural da prole causa importantes mudanças morfológicas no hipocampo podendo tornar estes animais vulneráveis a distúrbios neurais na idade adulta. O presente estudo pelo menos sob aspecto morfológico ponderal confirma a teoria do "cérebro egoísta", um paradigma recente que postula que, para manter estável seu próprio fornecimento de energia, o cérebro modula o metabolismo da energia na periferia regulando tanto a alocação quanto a ingestão de nutrientes. Neste trabalho, a ausência de alterações ponderais encefálicas não está associada às intensas modificações na composição citológica, particularmente hipocampal, nos diferentes grupos experimentais. Embora pareça que as alterações nutricionais promovam alterações irreversíveis ponderais na massa corporal, mas não no encéfalo e algumas de suas estruturas fundamentais, a composição e estrutura neuronal e sua recuperação a partir de células primordiais, são profundamente modificadas pela restrição dietética materna e, surpreendentemente, pela exposição ao ambiente enriquecido. Assim, podemos afirmar que a teoria do cérebro egoísta explica a manutenção da massa encefálica entretanto, a proporção dos diferentes tipos celulares é profundamente alterada o que pode expandir nosso entendimento sobre a adaptação ao estresse e a neuro-regeneração em estados neuro-comportamentais tidos como anormais. Além disso, devemos ressaltar que, embora tenhamos observado redução significativa no número de neurônios após o período de amamentação, demonstramos pela primeira vez que este parâmetro é revertido pelo estimulo em ambiente enriquecido / Abstract: he stress affects neural regions including gestational hippocampus, amygdala, corpus callosum, neocortex, cerebellum and hypothalamus and often results in a reduction in the volume of the tissues that make up these structures. The hippocampal gyrus training has been the subject of several studies due to its importance in neural plasticity in neurogenesis and regulation of cognitive processes. Thus, this study sought to assess the effects of protein restriction, during pregnancy and breastfeeding, on the structure of hippocampus, their duties on the memory and emotions (anxiety/fear) as well as on the cellular composition of this brain structure and influence over these morphological and behavioral parameters, the exposure of the offspring of male rats to the enriched environment. The findings of this study represent the pre and perinatal impact of malnutrition protein corresponding to situation of nutritional stress in the hippocampus, which is involved in emotional behavior as well as in memory and learning. The study revealed decoupling the behavioral test response and changes in the number of hipocampais neurons, as a consequence of fetal programming. The absence of basal changes in performance of these tests, occurred in spite of reduction in the number of neurons in the dentate gyrus of the hippocampus. Several authors have suggested that the observed atrophy in the hippocampus may be a compensatory response to protect the hippocampus of additional damage. We have demonstrated, for the first time, that maternal exposure to protein restriction during neural development of offspring cause important morphological changes in hippocampus may make these animals vulnerable to neural disorders in adulthood. The present study at least under morphological aspect by confirming the "selfish brain" theory, a recent paradigm that posits that in order to keep stable its own energy supply, the brain modulates the energy metabolism in the periphery by regulating both the allocation as the intake of nutrients. In this work, the unmodified brain mass, do not match with the intensity of cytological composition changes, particularly of the hippocampal nucleus, in different experimental groups. Although it seems that the nutritional changes promote irreversible changes in body mass, but not in the brain and some of its fundamental structures, composition and neuronal structure and its recovery from primordial cells, are deeply modified by the maternal dietary restriction and, surprisingly, by exposure to oxygen-enriched environment. Thus, we can affirm that the selfish brain theory explains the maintenance of brain matter however, the proportion of the different cell types is profoundly changed what can expand our understanding of the adaptation to stress and neuro-regeneration in neuro-behavioral States regarded as abnormal. Moreover, we must emphasize that, while we have observed a significant reduction in the number of neurons after the period of breastfeeding, we demonstrate for the first time this parameter is reversed by stimulus in enriched / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências

Les cellules épendymaires sont des cellules multiciliées qui tapissent les parois de toutes les cavités du cerveau. Une fois différenciées, ces cellules ne se divisent plus au cours de la vie. Le battement de ces multiples cils motiles joue un rôle important pour maintenir un flux constant de liquide cérébrospinal à travers toutes les cavités cérébrales. Les cellules épendymaires assurent également des fonctions critiques d’échanges moléculaires avec le liquide cérébrospinal. Dans son ensemble, l’implication des cellules épendymaires et de leurs cils motiles s’avère d’une importance majeure dans le maintien des circuits neuraux ainsi que dans le fonctionnement plus global du cerveau. Récemment, une nouvelle caractéristique des cellules épendymaires a été identifiée ; elles font partie d’un microenvironnement appelé une « niche » centrée autour de cellules souches neurales dans le cerveau du rongeur adulte. Ces cellules souches neurales adultes sont capables de produire de nouveaux neurones qui migreront vers le bulbe olfactif des rongeurs adultes. Concernant leur origine, il a été montré que les cellules épendymaires multiciliées dérivent des cellules souches neurales durant les stades tardifs embryonnaires. Ces mêmes cellules souches peuvent d’ailleurs donner naissance à la plupart des différents types de cellules du cerveau. Cependant, les mécanismes par lesquels les cellules souches décident de leur destin cellulaire restent largement méconnus. Dans ce projet, nous étudions quel type de division donne naissance à des cellules épendymaires et nous nous intéressons également au lignage épendymaire. Nos données suggèrent que les cellules épendymaires ne migrent pas après leur dernière division et qu’elles restent à proximité de l’endroit où elles ont été produites. Chose particulièrement intéressante, nous montrons que les cellules épendymaires peuvent être générées par division symétrique ou asymétrique. Nos résultats révèlent aussi que les cellules souches neurales embryonnaires se divisent de manière asymétrique pour donner naissance à la fois à une celluleépendymaire et à une cellule souche neurale adulte. Ces données viennent s’ajouter à la connaissance actuelle que nous avons du développement du cerveau. De plus, elles pourraient contribuer à ouvrir de nouvelles perspectives et stratégies thérapeutiques pour soigner les maladies neurodégénératives à beaucoup plus long terme. / Ependymal cells are multiciliated cells lining the walls of all brain cavities. Once they are mature, they do not divide during life. Their motile ciliary beating endorses a crucial role in maintaining a proper flow of cerebrospinal fluid throughout all brain cavities. Ependymal cells also ensure critical molecular exchanges of the cerebrospinal fluid. On the whole, the involvement of ependymal cells and their multiple motile cilia in the maintenance of the neural circuits and more globally in the well-functioning of the entire brain have proven paramount. More recently, a new characteristic of ependymal cells has been brought to light. Namely, they are part of a microenvironment so called a “niche” surrounding adult neural stem cells in the adult rodent brain. Noteworthy, these adult neuralstem cells are capable of producing new neurons that will migrate to the olfactory bulb of rodents. In terms of their origin, it was shown that multiciliated ependymal cells derive from neural stem cells during late embryonic stages. Besides, the same stem cells can give rise to most cell types of the brain. However, little is known about how fate-decision is made in neural stem cells. In this project, we tackle more particularly how multiciliated ependymal cells arise from the neural stem cells. Most specifically, we address the type of celldivision and the ependymal cell lineage. We find that ependymal cells are not migrating subsequent to their last division, but rather stay where they were first produced. Most interestingly, they can be generated through both symmetric and asymmetric cell division. We also show that embryonic neural stem cells divide asymmetrically to give rise to both an ependymal cell and an adult stem cell. We are confident that these data bring major new insights in the current understanding of neural development. Additionally, these findingscould contribute in opening new therapeutic perspectives and strategies to cure neurodegenerative diseases in a much longer term.

Pas de résumé / Production of new neurons in the brain decreases dramatically with age due to progressive physiological depletion of stem and progenitor cell populations (NSCs). Recent studies indicate that circulating factors constitute a systemic aging milieu regulating the birth of new cells. Interestingly, some long-lived mouse strains such as Ames dwarf mutants, with low circulating levels of GH and IGF-1, show increased neurogenesis and preserved hematopoietic stem cell pool. Thus, the possibility that genes regulating lifespan and aging also quantitatively modulate stem cells in mammals is more and more explored. IGF-1 plays a pivotal role in aging in different species, and I am asking whether some of the well-known longevity effects resulting from down-regulation of this signaling pathway could be explained by local regulation of stem and progenitor cell compartments. To validate this hypothesis, I pursued a dual approach based on biological experiments and mathematical modeling. Using a novel triple transgenic mouse model, I inactivated IGF-1 signaling specifically in adult NSCs, and traced knockout cell lineages with a fluorescent reporter transgene. By analyzing the phenotype at different time points after KO induction, I could distinguish between short and long-term effects of IGF signaling on cellular regeneration and identify cumulative physiological consequences of down-regulation of this pathway using behavioral tests. In my mathematical models, the dynamics of regenerative cell populations were described by a set of differential equations depending on circulating “growth-factor like molecules” (GFs). My results suggest that in aging tissues, the optimal distribution of GFs is a function that decreases with time. In the olfactory system, I showed that inactivation of IGF signaling in adult NSCs enhanced long-term maintenance of neuroblasts and increased the overall production of neurons. Mutants started with the same number of adult-born neurons as controls one month after KO induction at 4 months of age, but ended up having significantly more differentiated cells integrating the olfactory bulb at long-term, i.e. at 16 months of age. This highly increased neurogenic activity occurred without depletion of neural stem/progenitor cell compartments. In contrast, IGF-1R deletion in adult hippocampal stem cells did not change neurogenesis dynamics, pointing out a niche-dependent effect of IGFs. The important cellular changes in the olfactory bulb led to improved olfactory memory and odor discrimination in aged mutants. Strikingly, mutants also displayed altered energy homeostasis and increased sensitivity to metabolic hormones, namely leptin and insulin. This metabolic shift could be linked to enhanced olfactory function, and to changes in hypothalamic neurogenesis. Indeed, we observed that IGF-1R deletion in hypothalamic stem cells (HySC) protected α-tanycyte pool from age-related decline and increased the number of newborn neurons in the hypothalamus. Taken together, my results validate the hypothesis that life-long inhibition of IGF signaling in adult NSCs delays age-related decline of neurogenesis, in a niche-dependent manner. These data also show that local modulation of neural cell replacement has important physiological effects at the level of the whole organism, pointing out a novel pathophysiological role for adult neurogenesis.

La production de nouveaux neurones, un processus appelé neurogenèse, persiste à l’âge adulte et est assurée par les cellules souches neurales (CSN) au sein de niches spécialisées telle que la zone sous-ventriculaire (ZSV). Cependant, la neurogenèse adulte diminue à la suite de diverses atteintes cérébrales et au cours du vieillissement, provoquant des déclins cognitifs pour l’heure irréversibles. A l’aide d’une méthode de cytométrie en flux développée au laboratoire, nous avons montré que le déclin progressif de la neurogenèse de la ZSV au cours du vieillissement est lié, non pas à une diminution du nombre des CSN, mais à une forte réduction de leur prolifération due, notamment, à l’allongement spécifique de la phase G1 médiée par l’augmentation du TGFβ1. Par ailleurs, nous avons isolé les CSN quiescentes et les CSN en prolifération afin de caractériser leurs propriétés cellulaires et établir leur profil d'expression génique. L’analyse comparative de ces deux populations de CSN a révélé plusieurs niveaux de régulation de la balance entre quiescence et prolifération, telles que l’intégration de signaux en provenance du microenvironnement et l’existence de programmes de transcription distincts. L’ensemble de ces résultats ouvrent des perspectives pour l’utilisation des CSN quiescentes endogènes comme cibles thérapeutiques au cours du vieillissement ou pour régénérer les tissus cérébraux lésés. / The production of new neurons, a process called neurogenesis, persists during adulthood and is ensured by neural stem cells (NSCs) that are located in specialized niches in the mammalian brain such as the subventricular zone (SVZ). However, adult neurogenesis declines dramatically following brain damage and during aging leading to irreversible cognitive deficits. Using a flow cytometry-based cell sorting strategy, we show that the progressive age-related decline in SVZ neurogenesis is not caused by a loss of NSCs but rather by a proliferation deficit of NSCs with the lengthening of their G1 phase due to increased levels of TGFβ1. We then sorted quiescent and proliferative NSCs to characterize their functional properties and define their gene expression profiles. Comparative analysis of the two populations of NSCs reveals that the balance between quiescence and proliferation is regulated at multiple levels with the integration of external signals from the microenvironment and distinct transcriptional programs. Taken together, our results open new vistas into the potential use of endogenous quiescent NSCs as therapeutic targets to increase neurogenesis in the aged brain and to participate to the regeneration of damaged brain tissue.

Environ 30% des patients ne répondent pas de manière adéquate à un traitement antidépresseur. Cette absence de rémission, voire aggravation de l’état dépressif après la mise en place du traitement est qualifiée de non-réponse au traitement. La résistance au traitement est caractérisée lorsque cet échec thérapeutique est récurrent pour différentes stratégies thérapeutiques de mécanisme d’action différents. Afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques visant à traiter les patients résistants, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques associés à la non-réponse/résistance est nécessaire. De nombreux travaux ont associé le phénomène de neurogenèse hippocampique adulte à la réponse antidépressive, et ont montré qu’un blocage de la neurogenèse altère la réponse antidépressive chez la Souris. Cependant, aucune étude n’a montré si la non-réponse/résistance au traitement était associée à des altérations de la neurogenèse. De plus, il n’existe à ce jour aucun modèle de résistance qui ne présente une validité translationelle à ce qui est observé chez l’Homme. Enfin, alors que 2/3 des patients dépressifs sont des femmes, la majorité des études précliniques sont réalisées chez des mâles. Le but de mon travail de thèse a donc été de modéliser la résistance au traitement antidépresseur chez la souris C57BL6 mâle et femelle.Le premier objectif de ce travail a été la modélisation chez la femelle d’un phénotype anxio-dépressif, en adaptant un modèle neuroendocrinien de la dépression élaboré chez le mâle, basée sur l’administration chronique de corticostérone. Le deuxième objectif a été l’étude de la comparaison de la neurogenèse entre les souris répondeuses et non-répondeuses à un traitement chronique de fluoxétine ou résistantes à 2 stratégies successives de traitement présentant un mécanisme d’action différent (fluoxétine puis imipramine).D’autre part, les données de la littérature clinique suggèrent qu’un marqueur périphérique, la protéine β-arrestine 1, serait un marqueur de l’état dépressif et de la réponse au traitement. Nous avons donc mesuré dans notre modèle les variations de ce potentiel biomarqueur clinique.L’ensemble de ces travaux de thèse a permis de montrer la complexité d’induire un phénotype anxio/dépressif chez la souris femelle de façon stable et robuste via l’administration chronique de corticostérone. Chez le mâle, nous avons pu modéliser la résistance au traitement antidépresseur dans le modèle CORT. Nous avons pu observer que les processus neurogéniques semblent jouer un rôle essentiel dans la réponse au traitement, puisqu’une absence de réponse est associée avec une altération de la neurogenèse hippocampique adulte. Si dans notre modèle, l’expression périphérique de la β-arrestine 1 n’est pas diminuée chez les souris présentant un phénotype anxio-dépressif, elle permet cependant de discriminer les souris répondeuses des souris résistantes au traitement, ce qui valide son intérêt en tant que biomarqueur de la réponse antidépressive. / Around 30% of patients do not respond adequately to chronic antidepressant treatments. This lack of response, or worsening of the depressive state after the onset of the treatment can lead to treatment resistant depression (TRD). TRD is characterized by a recurrent lack of therapeutic response to various antidepressant which display different mechanism of action. A better understanding of the mechanisms that underlies TRD is necessary to discover some new effective therapeutic strategies. Numerous studies in rodents have shown that chronic antidepressant treatment improves adult hippocampal neurogenesis, and that disrupting this phenomenon partially alters antidepressant response. However whether lack of response or resistance to antidepressant treatment is associated with altered neurogenesis has yet not been observed. Additionally, there is yet no model of TRD with a translational validity. As major depressive disorders affects women twice more than men, yet the preclinical studies are performed mostly in males. Thus, the aim of this thesis was to model non-response an resistance to antidepressant response in male and female C57BL6 mice.The first aim of this thesis work was to induce a anxio-depressive phenotype in female mice, by adapting a neurodencocrine model of depression developed in males and based on chronic administration of corticosterone (CORT). The second aim was to study adult hippocampal neurogenesis in animals that respond or not to chronic fluoxetine administration, and in animals that were resistant to two successive antidepressant treatment with a different mechanism of action (fluoxetine and then imipramine).Additionally, data from the literature suggests that peripheral β-arrestin 1 expression could be a potential biomarker of depressive state and antidepressant response in humans. Thus, we explore its validity in our model of TRD in mice.Overall, our results highlight the difficulty of inducing an anxio-depressive phenotype in female mice, using different dosage or treatment duration of corticosterone, which hampers the use of corticosterone to induce emotionality in female mice.However, in male mice, we showed that we were able model resistance to treatment in the using the CORT model. Lack of response to chronic fluoxetine and treatment resistance to fluoxetine/imipramine were associated with altered neurogenesis in the dentate gyrus of the hippocampus. This confirms that hippocampal neurogenesis is critical for a full antidepressant response. While peripheral β-arrestin 1 expression was not decreased after chronic CORT exposure, its differential expression between responder vs treatment-resistant mice confirms its validity as a biomarker for antidepressant response.

Les lésions médullaires traumatiques (LMT) conduisent à une atteinte des voies nerveuses sensitives et motrices. Leur taux de mortalité reste très élevé, d'où la nécessité de trouver de nouveaux traitements. Les Cellules Gliales Olfactives (CGOs) représentent un candidat intéressant de par leur fonction au sein du système olfactif primaire. La découverte d'une population de cellule souche neurale bordant le canal central de la moelle spinale (MS) adulte, appelées cellules épendymaires, suscite un nouvel espoir dans le domaine des biothérapies. Ce travail de thèse a permis d'étudier l'effet d'une transplantation de CGOs sue le comportement des cellules résidentes de la moelle spinale et notamment les cellules souches épendymaires qui, en association avec les astrocytes et les péricytes, participent aux mécanismes de guérison des LMT. L'utilisation du modèle murin hFoxJ1-CreERT2::YFP (permettant le suivi spécifique des cellules épendymaires et de leur progénie), a montré que les CGOs augmentaient in vitro le potentiel d'auto-renouvellement des cellules souches de la MS et modifiaient leur voie de différenciation vers un type neural. In vivo, la transplantation de CGOs augmente la prolifération des cellules épendymaires ainsi que leur différenciation en astrocytes hypo-réactifs conduisant à la formation d'un environnement post-lésionnel bénéfique à la survie neuronal et l'établissement d'une neurogenèse. Nos travaux ont montré pour la première fois que la transplantation de CGOs après LMT permettait la génération de nouveaux neurones. Ceci constitue un nouvel espoir dans l'établissement de stratégies thérapeutiques pour le traitement des LMT chez l'Homme. / The spinal cord injuries (SCI) lead to the damages of the spinal cord or nerves and often cause permanent changes in body functions leading to the death. Cell therapies have raised great hope for regenerative medicine. Clinical data showed that the olfactory ensheathing cells (OECs) enhanced functional recovery after SCI and could be a very attractive therapeutic approach. Moreover, the discovery of a new endogenous resident stem cell population, lining the central canal of the spinal cord, named ependymal stem cells, represents a new hope for the therapy. This thesis analyzed the role of OECs transplantation, on the behaviour of ependymal stem cells since these cells, together with astrocytes and pericytes significantly contribute to the recovery of SCI. The use of the mouse model hFoxJ1-CreERT2::YFP (allowing to specifically follow the ependymal stem cells ant their progeny) showed that OECs increased in vitro the self-renewal potential of spinal cord stem cells and modified their differentiation pathway towards a neural type. In vivo, OECs transplantation significantly increases the proliferation of ependymal cells and their differenciation into hypo-reactive astrocytes leading to the formation of a beneficial environment to neuronal survival and the neurogenesis establishment. Our results also showed for the first time that OECs transplantation after SCI allows the generation of new neurons by non-ependymal cell-derived progenitors. These results represent a new hope in the establishment of therapeutic strategies for the treatment of SCI in humans.

Die Neubildung von Neuronen persistiert lebenslang in der Subgranularzellschicht des Hippocampus und der Subventrikularzone des Großhirns und wird als adulte Neuroge-nese bezeichnet. Es wird vermutet, dass diese beim erwachsenen Menschen einen rele-vanten Einfluss auf degenerative Veränderungen, verschiedene neurologische Krank-heitsbilder und auf die (Dys-)Funktion des Gedächtnisses hat. Im Tiermodell wurde eine Verringerung der Neurogenese nach chronischer Morphingabe nachgewiesen. Vorarbeiten zeigten einen Zusammenhang zwischen chronischem Heroinmissbrauch und reaktiver Astrogliose, Mikrogliose und einer vermehrten Expression des polysialylated neural cell adhesion molecule im humanen Hippocampus. Daraus leitet sich die Hypothese ab, dass chronischer Heroinmissbrauch, als Modell für eine Abhängigkeitserkrankung, einen Einfluss auf die adulte humane Neurogenese hat. Es wurden in Formalin fixierte Gewebeproben aus dem Hippocampus von Verstorbenen mit einer letalen Heroinintoxikation und mit bekanntem Heroinmissbrauch (n = 20) un-tersucht und mit einer nach Alter und Geschlecht angepassten Kontrollgruppe (n = 28) verglichen. Hierbei wurden spezifische Neurogenesemarker mittels immunhistochemi-scher Methoden angewendet und ausgewertet. Es bestand eine generell sehr geringe zelluläre Proliferationsrate und eine signifikante Reduktion Musashi-1 positiver neuro-naler Vorläuferzellen bei gleichzeitig unveränderter Anzahl Nestin positiver reifender und Calretinin positiver migrierender postmitotischer Neurone. Zudem wurde ein ver-ändertes Calretinin-Expressionsmuster als Hinweis auf eventuelle funktionelle neuronale Defizite bei Drogenabhängigen festgestellt. Der potentielle Einfluss von chronischem Heroinmissbrauch auf die adulte humane Neurogenese wird erstmals gezeigt. Die Ergebnisse weisen auf eine negative Beeinflus-sung im Stadium neuronaler Vorläuferzellen und der Zellfunktion migrierender Neurone in der Fallgruppe im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe hin. Diese Hemmung der Neurogenese könnte eine Erklärungsmöglichkeit für kognitive Defizite und Funktionsstörungen des Gedächtnisses infolge chronischen Drogenkonsums bieten und zugleich eine Bedeutung bei der Entstehung von Abhängigkeitserkrankungen haben. Insofern könnte sich hier ein Ansatzpunkt für zukünftige Therapiestrategien derartiger Erkrankungen oder ihrer Folgen bieten.:I. Inhaltsverzeichnis 1 II. Bibliografische Zusammenfassung 2 III. Abkürzungsverzeichnis 3 1. Einführung 4 1.1. Drogenabhängigkeit und Epidemiologie 4 1.2. Heroin 6 1.3. Hippocampus 9 1.4. Adulte Neurogenese 11 1.5. Aufgabenstellung und Ziel der Arbeit 14 2. Materialen und Methoden 18 2.1. Fall- und Kontrollgruppe 18 2.2. Toxikologisch-chemische Untersuchungen 20 2.3. Immunhistochemie 21 2.4. Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie 25 2.5. Quantifizierung, Datenanalyse und Statistik 26 3. Ergebnisse 28 3.1. Deskriptive Datenanalyse 28 3.2. Musashi-1 30 3.3. Nestin 31 3.4. Calretinin 32 3.5. Ki-67 34 3.6. Doublecortin 35 3.7. Doppelimmunfluoreszenz 36 4. Diskussion 37 4.1. Neurogenese – Proliferation (Ki-67) 38 4.2. Neurogenese – Differenzierung (MSI-1, Nestin) 39 4.3. Neurogenese – Reifung (Calretinin) 42 4.4. Methodische Grenzen und Fehlerbetrachtung 43 4.5. Fazit und Ausblick 46 5. Zusammenfassung der Arbeit 48 6. Literaturverzeichnis 52 7. Anlagen 1-8 65 IV. Selbständigkeitserklärung 73 V. Curriculum vitae 74 VI. Publikationen 75 VII. Danksagung 76

The high composition of fruits and vegetables in the daily diet is associated with cognitive well-being, especially in the elderly population. The phytonutrients are shown to have effects as antioxidants that neutralize oxidative stressors and can interact with molecular pathways to signal neuron survival. Adult hippocampal neurogenesis is a dynamic lifelong process of generating functional newborn neurons in the granular layer of the dentate gyrus from adult precursor cells. This process contributes to brain plasticity and plays a role in learning and memory. External stimuli such as environmental enrichment and physical activity are known to positively regulate this process. However, the role of nutrition and whether nutritional compounds have pro-neurogenic effects on adult hippocampal precursor cells are still elusive. In this study, I investigated the impact of dietary compounds in apples, a significant source of phytonutrients in our food, on adult hippocampal neurogenesis. I demonstrated that quercetin, the most abundant polyphenol in apple, induces cell cycle exit and differentiation of adult hippocampal precursor cells in monolayer culture. Furthermore, this compound also increases the number of surviving cells upon differentiation in vitro, through the activation of endogenous antioxidants in the Nrf2-Keap1 pathway and the prosurvival Akt pathway. Quercetin supplementation in vivo is also shown to significantly increase the number of surviving cells and new neurons in the dentate gyrus. To search for other potential active compounds in apple, I performed bioassay-guided fractionation whereby the flesh extract from apples of the Pinova cultivar was subjected to liquid- and solid phase separation and the active fraction was determined using primary neurosphere assays using cells derived from adult mouse dentate gyrus. Using mass spectometry, we revealed that the active compounds in the apple flesh extract are dihydroxybenzoate glycosides, which are non-flavonoid benzoic acid derivatives. I also confirmed that the isomers of these compounds; 2,3- and 3,5 dihydroxybenzoic acids significantly increase the number of neurospheres. Interestingly, 3,5 dihdroxybenzoic acid is an agonist of lactate receptor hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCAR1), with an even higher affinity than lactate. This receptor is suggested to mediate neurotrophic actions such as increasing production and release of BDNF. I also demonstrated for the first time that this receptor is presence in adult hippocampal precursor cells. To observe whether customary fruits or fruit-related products consumption affects adult hippocampal neurogenesis, I performed an experiment giving apple juice supplementation ad libitum to mice. I did not find a significant increase in net neurogenesis or the performance in the Morris water maze after apple juice supplementation. This is likely due to the low concentration of active compounds in apple juice failing to reach an effective concentration in the body. I conclude that apples provide potential proneurogenic compounds that can influence adult hippocampal neurogenesis through the activation of endogenous antioxidant mechanisms and molecular pathways for cell survival. Further studies are necessary to investigate the role of HCAR1 activation on adult hippocampal neurogenesis, which is a potential new mechanism to explain the health benefits of fruit and vegetable consumption. / Eine Ernährung die täglich reich an Obst und Gemüse ist, hat insbesondere bei älteren Menschen einen positiven Einfluss auf kognitive Fähigkeiten. Pflanzeninhaltsstoffe wirken als natürliche Antioxidantien, indem sie oxidative Stressoren neutralisieren. Weiterhin beeinflussen pflanzliche Nährstoffe molekulare Signalwege welche beim Überleben von Neuronen eine Rolle spielen. Die adulte hippocampale Neurogenese ist ein dynamischer, lebenslanger Prozess, bei dem aus Vorläuferzellen funktionelle neue Neuronen in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gebildet werden. Dieser Prozess trägt zur Plastizität des Gehirns bei und spielt eine bedeutende Rolle beim Lernen und für das Gedächtnis. Externe Stimuli wie zum Beispiel eine reizreiche Umgebung und körperliche Aktivität wirken als positive Regulatoren und begünstigen die adulte hippocampale Neurogenese. Welche Rolle die Ernährung dabei spielt und ob Nahrungsbestandteile einen proneurogenen Effekt auf adulte hippocampale Vorläuferzellen haben ist kaum bekannt. In diesem Projekt habe ich den Effekt von Nahrungsbestandteilen aus Äpfeln, welche eine bedeutende Quelle von pflanzlichen Nährstoffen in unserer Ernährung darstellen, auf die adulte hippocampale Neurogenese untersucht. Ich habe gezeigt, dass Querzetin, das am reichlichsten in Äpfeln enthaltende Polyphenol, in der Monolayer-Zellkultur den Austritt aus dem Zellzyklus induziert und die Differenzierung von adulten hippocampalen Vorläuferzellen fördert. Des Weiteren steigert Querzetin nach der Differenzierung in vitro die Anzahl an überlebenden Zellen. Dies geschieht durch die Aktivierung von endogenen Antioxidantien des Nrf2-Keap1-Signalweges und des für das Überleben von Zellen förderlichen Akt-Signalweges. Die Verabreichung von Querzetin in vivo als Nahrungsergänzungsmittel führte ebenfalls zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl an überlebenden Zellen und neu gebildeten Nervenzellen im Gyrus dentatus. Um weitere potentiell aktive Wirkstoffe von Äpfeln zu bestimmen, habe ich eine Bioassay-ausgerichtete Fraktionierung durchgeführt, wobei der Fruchtfleischextrakt von Äpfeln der Sorte Pinova einer Fest-/ Flüssig-Separation unterzogen wurde. Die aktive Fraktion wurde anhand der primären Neurosphäre-Assay-Methode mit Zellen aus dem Gyrus dentatus adulter Mäuse ermittelt. Mittels spektrometrischer Analyse habe ich gezeigt, dass die aktiven Wirkstoffe im Fruchtfleischextrakt von Äpfeln zur Gruppe der Dihydroxybenzol-Glykosiden gehören, welche den nicht-flavonoiden Benzoesäure-Derivaten zuzuordnen sind. Im in vitro Neurosphäre-Assay habe ich zudem gezeigt, dass die Isomere dieser Wirkstoffe, die 2,3- und die 3,5-Dihydroxybenzoesäuren, die Anzahl der Neurosphären signifikant erhöhen. Interessanterweise ist die 3,5-Dihydroxybenzoesäure ein Agonist des Laktatrezeptors Hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCAR1) und weist sogar eine noch höhere Affinität als Laktat auf. Es wird suggeriert, dass dieser Rezeptor neurotrophische Wirkungen vermittelt, wie zum Beispiel eine erhöhte Produktion von BDNF und dessen Ausschüttung. Zudem habe ich das Vorkommen dieses Reporters erstmalig bei adulten hippocampalen Vorläuferzellen nachgewiesen. Um zu untersuchen, ob der Konsum handelsüblicher Obstprodukte die adulte hippocampale Neurogenese beeinflusst, habe ich Mäusen Apfelsaft ad libitum verabreicht. Nach der Gabe von Apfelsaft sah ich keinen signifikanten Anstieg der Gesamtneurogenese und keine Verbesserung der Leistungsfähigkeit im Morris-Wasserlabyrinth-Test. Dies ist bedingt durch eine zu geringe Konzentration der aktiven Wirkstoffe im Apfelsaft wodurch die wirksame Konzentration im Körper nicht erreicht wird. Ich schlussfolgere, dass in Äpfeln potentielle pro-neurogene Inhaltsstoffe enthalten sind, welche die adulte hippocampale Neurogenese beeinflussen. Dies wird insbesondere durch die Aktivierung endogener antioxidativer Mechanismen und molekularer Signalwege vermittelt, die für das Überleben von Zellen von Bedeutung sind. Weitere Studien sind nötig, um zu bestimmen wie sich die Aktivierung von HCAR1 auf die adulte hippocampale Neurogenese auswirkt. Dies stellt einen potentiellen neuen Wirkmechanismus dar, welcher die gesundheitlichen Vorteile von Obst- und Gemüsekonsum belegt.

Dans le système nerveux central adulte, la glycine est principalement connue pour son rôle de transmission d’un signal inhibiteur à l'intérieur des neurones matures, régulant ainsi l'activité du réseau neuronal. Paradoxalement, durant l'embryogenèse, ce même neurotransmetteur génère une transmission excitatrice produisant ainsi le premier signal électrique dans les neurones immatures. Le rôle et la signification fonctionnelle de ce changement d’activité durant le développement neurologique restent toujours inconnus. En utilisant l’embryon du poisson-zèbre comme modèle, nous avons exploré les mécanismes moléculaires et cellulaires dépendants de la signalisation de glycine dans les cellules souches neuronales (CSNs). En premier lieu, nous avons développé un outil d’analyse basé sur une combinaison de deux éléments: une lignée transgénique qui exprime du GFP dans les CSNs et la technique de séquençage de l’ARN total. Nous avons utilisé cette technique pour isoler et déterminer les mécanismes moléculaires régulés par la glycine dans les CSNs. Ceci a permis d’identifier plusieurs gènes candidats dont l’expression est modulée par l’activité glycinergique. Ces gènes appartiennent principalement à cinq différentes voies de signalisation canoniques incluant la voie de signalisation du calcium, TGF-bêta, Shh, Wnt et p53. Pour en apprendre davantage sur ces mécanismes moléculaires, nous avons exploré l’un d’entre eux soit la régulation de la signalisation p53 par l’activité glycinergique. En effet, nous avons démontré que l’activité glycinergique favorise la survie des CSNs par la régulation de la signalisation de p53 et agit spécifiquement sur la sous-population CSN-nestin+ durant la neurogenèse. Dans un autre projet, nous avons examiné la régulation de l’expression de lnx1 par l’activité glycinergique. Nous avons démontré que la signalisation de glycine/lnx1 régule la prolifération des CSNs via la modulation de l’activité de Notch durant la neurogenèse. En conclusion, dans ce projet de thèse, j’ai mis en lumière plusieurs mécanismes moléculaires et cellulaires modulés par l’activité glycinergique dans les CSNs. Ceci peut contribuer dans le futur à la compréhension de la physiopathologie liée au dysfonctionnement de cette dernière ainsi qu’à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / In the adult central nervous system, glycine is mainly known as an inhibitory neurotransmitter in mature neurons, thereby regulating the neural network activity. Paradoxically, during embryogenesis, the same neurotransmitter generates excitatory transmission and induces the first electrical signal in immature neurons. The role and functional significance of this change in glycinergic activity during neurogenesis are still unknown. In this study, we used zebrafish embryos as a model to explore the glycine-dependent molecular and cellular mechanisms in neural stem cells (NSCs). First, we developed an in vivo analysis method based on two main elements: a transgenic line that expresses GFP within NSCs and the RNA sequencing technique. This method of analysis was used to determine glycine-dependent molecular mechanisms in NSCs. We identified several candidate genes whose expression is modulated by the glycinergic activity. These genes participate in five different canonical signaling pathways including the calcium signaling pathway, TGF-beta, Shh, Wnt and p53. To further understand these molecular mechanisms, we focused our investigation on the regulation of p53 signaling by the glycinergic activity. Indeed, we have demonstrated that glycinergic activity promotes the survival of NSCs by regulating p53 signaling and more specifically acting on NSC-nestin + subpopulation during neurogenesis. Finally, we explored the regulation of lnx1 expression by glycinergic activity. We have demonstrated that glycine/lnx1 signaling regulates the proliferation of NSCs via the modulation of Notch activity during neurogenesis. In conclusion, during this thesis project, I highlighted several molecular and cellular mechanisms modulated by the glycinergic activity in NSCs. These relevant results may contribute in the future to the understanding of the physiopathology related to glycinergic activity dysfunctions and the identification of new therapeutic targets.

Während der Entwicklung des Organismus führen naive Zellen aufgrund eines streng regulierten Transkriptionsprogramms zu differenzierten Zelltypen und Geweben. Obwohl viele Aspekte dieses Differenzierungsprozesses noch wenig verstanden sind, ist allgemein anerkannt, dass Transkriptionsfaktoren (TFs), die mit cis-regulatorischen Modulen (CRMs), nämlich Enhancern, interagieren, einen wesentlichen Beitrag zur Regulierung der räumlich-zeitlichen Genexpression leisten. Um die regulatorischen Wechselwirkungen von Enhancern zu verstehen, verwendete ich eine Technik namens inSTEP, von zwei wichtigen neurogenen Enhancern und einem mesodermalen Enhancer zu entschlüsseln. inSTEP ist eine Abkürzung für in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics und beinhaltet die Präzipitation eines ausgewählten Enhancers zusammen mit all seinen gebundenen Elementen aus einem bestimmten Gewebe zur Identifizierung durch Massenspektrometrie (MS), wodurch die Identifizierung von regulatorischen Kandidaten ermöglicht wird, die die Neurogenese vorantreiben. Das Herunterfallen von mindestens zwei der mutmaßlichen Regulierungskandidaten CG4707 und CG2962 führte zu einem veränderten Reportergen-Expressionsmuster, das vom vndenhancer gesteuert wurde, was darauf hindeutet inSTEP ist in der Lage, neue regulatorische Proteine zu identifizieren, die an der Regulation der Genexpression im sich entwickelnden Nervensystem beteiligt sind. Einer der Enhancer, an denen ich am meisten interessiert bin, ist ein Enhancer für das Gen vnd, das einen entscheidenden TF für die Neurogenese codiert. Ich habe mein Projekt daher über die Frage hinaus erweitert, wie vnd-Expression reguliert wird, um auch die Rolle einzubeziehen, die Vnd selbst bei der Neurogenese spielt. Ich habe ChIP-seq-Experimente durchgeführt, um die genomweiten Bindungsprofile von Vnd aufzuklären, und ich habe Werkzeuge entwickelt, die die isoformspezifische Rolle von Vnd aufklären. / During organismal development, naive cells give rise to differentiated cell types and tissues as a result of a tightly regulated transcriptional programs. Although many aspects of this differentiation process are still poorly understood, it is widely accepted that transcription factors (TFs) interacting with cis-regulatory modules (CRMs), namely enhancers, are major contributors to regulate spatio-temporal gene expression. In order to understand the regulatory interactions of enhancers, I used a technique called inSTEP to unravel the enhancer-protein interactions on two major neurogenic enhancers (for the vnd and rho genes) and one mesodermal enhancer (1070enhancer), for which no target genes are known. inSTEP is an acronym for in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics and entails precipitation of a chosen enhancer together with all its bound elements from a specific tissue, for identification by mass spectrometry (MS), thus enabling the identification of regulatory candidates driving neurogenesis. I have identified candidate regulators in the ventral column and selected ten to do follow-up experiments The knock down of at least two of the vndenhancer putative regulators, CG4707 and CG2962, led to an altered reporter gene expression pattern driven by the vndenhancer, suggesting that inSTEP is able to identify new regulatory proteins involved in the regulation of gene expression in the developing nervous system. One of the enhancers I am most interested in is an enhancer for the gene vnd, which encodes a crucial TF for neurogenesis. I have therefore expanded my project beyond the question of ‘how’ vnd expression is regulated, to also include the role Vnd itself plays in neurogenesis. I have conducted ChIP-seq experiments to elucidate the genome-wide binding profiles of Vnd and I have developed tools that will elucidate the isoform-specific role of Vnd.