Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Introduction: HPV infection is the most common sexually transmitted disease in humans, which can cause benign diseases (warty lesion) or malignant as the anogenital cancer, oral cancer and, with the highest incidence, cervical cancer. Overall, the main HPV detection method is based on cytological evaluation of Papanicolaou; however, false-negative results and unsatisfactory sampling complicate the disease diagnosis and prevention. In this context, the investigation of new diagnosis platforms and prophylaxys has great interest. Objectives: The aim of this study was to conduct an epidemiological study of HPV infection in the women population of southeastern Brazil and then propose new diagnostic and vaccine approaches. Methodology: Genital samples of 5,223 women were evaluated by a new molecular tool based on PCR (Nested Multiplex PCR - NMPCR), using a cocktail of primers for simultaneous detection of 38 different HPV types, in single tube. Another molecular approach was proposed by Phage Display technique to select the IgA binding peptides from cervical samples of patients with HPV infection. In silico (Linear and 3D bioinformatics) and in vitro (ELISA, Slot blot and Bioelectrode) analysis were performed to validate the selected phages and synthetic peptides in cervical (n=91) and salivary specimens (n=66). The sensitivity and specificity parameters of HPV diagnosis were determined by ROC curve. To test the vaccine potential of synthetic peptides, in silico (3D bioinformatic), in vivo (female BALB/c mice immunization) or in vitro analyzes (MTT, ELISA, splenocytes culture, CBA and Neutralization assay) were carried out. Results: Among the 5,223 women evaluated, there was a prevalence of 58.9% of HPV infection, especially the types 53, 52 and 06, showing the relevance to propose new alternatives for HPV detection and prevention. In molecular approach of Phage Display, thirty-two distinct phage clones were selected against IgA from positive HPV cervical samples. Phage C.B1 showed higher reactivity against HPV samples compared to the negative control group by ELISA. This peptide is a putative epitope of HPV major capsid protein (L1) and has distinguished efficiently infection from HPV controls in cervical and saliva samples (p <0.0001), with high sensitivity (above 95%) and specificity (above 71%) in both fluids. The C.B1 peptide was also successfully incorporated (p<0.05) onto a graphite bioelectrode for HPV direct diagnosis in saliva. In the vaccine approach, three peptides (PEP1, PEP3 and PEP4) showed no toxicity in murine macrophages. Immunizations showed potent induction of serum IgG antibodies production by PEP3, and increase in IgA titer in the vaginal mucosa under PEP1 and PEP3 stimuli. The evaluation of cellular immune response indicated that the PEP1 and, particularly, the PEP3 chimeric peptide were able to polarize the immune response towards to Th1 profile and sensitize the cells to a pro-inflammatory \"status\", suitable for antiviral activity. The HPV-16 PsVs neutralization assay showed that PEP3 was able to reduce the infection by 49%. Conclusions: Overall, the studies presented here showed a high prevalence of HPV among Brazilian women by viral types still little explored in the literature. We selected mimotopes by Phage Display tool capable of detecting HPV in both saliva samples as in the cervical secretion, providing a low cost, simple and non-invasive diagnostics for population screening. In addition, the mimotopes selected have attractive applicability in vaccine formulations, but further studies are still needed. / Introdução: A infecção por HPV é a doença sexualmente transmissível mais comum em humanos, que pode causar doenças benignas (lesões verrucosas) ou malignas como o câncer anogenital, câncer oral e, com maior incidência, o câncer do colo uterino. Globalmente, o principal método de detecção do HPV baseia-se na avaliação citopatológica de Papanicolaou, entretanto, resultados falsonegativos e obtenção de amostras insatisfatórias dificultam o diagnóstico e a prevenção da doença. Neste contexto, a busca por novas plataformas diagnósticas e profiláticas para o HPV é de grande interesse. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi realizar um levantamento epidemiológico da infecção por HPV na populacão feminina da região Sudeste do Brasil e, a partir de então, propor novas abordagens diagnósticas e vacinais. Metodologia: Amostras genitais de 5.223 mulheres foram avaliadas por uma nova ferramenta molecular baseada em PCR (Nested Multiplex PCR - NMPCR), utilizando-se um coquetel de primers para detecção simultânea de 38 diferentes tipos virais de HPV, em um único tubo. Outra abordagem molecular foi proposta através da técnica de Phage Display, a fim de selecionar peptídeos ligantes a anticorpos IgA oriundos de amostras cervicas de pacientes com infecção por HPV. Análises in silico (Bioinformática linear e 3D) e in vitro (ELISA, Slot blot e Bioeletrodo) foram realizadas para a validação dos fagos selecionados e dos peptídeos sintetizados em espécimes cervicais (n=91) e salivares (n=66). Os parâmetros de sensibilidade e especificidade do diagnóstico do HPV foram determinados pela curva ROC. Para testar o potencial vacinal dos peptídeos sintéticos, análises in silico (Bioinformática 3D), in vivo (imunização em camundongos fêmeas BALB/c) e in vitro (MTT, ELISA, Cultura de esplenócitos, CBA e Ensaio de Neutralização) foram conduzidas. Resultados: Dentre as 5.223 mulheres avaliadas, houve uma prevalência de 58,9% de infecção por HPV, com predominância dos tipos 53, 52 e 06, evidenciando a relevância de se propor novas alternativas de detecção e profilaxia do HPV. Na abordagem molecular de Phage Display trinta e dois clones de fagos distintos foram selecionados contra a IgA de amostras cervicais positivas para o HPV. O fago C.B1 apresentou maior reatividade contra amostras de HPV em comparação ao grupo controle negativo, por ELISA. Este peptídeo é um epítopo putativo da proteína principal do capsídeo do HPV (L1) e tem discriminado eficientemente amostras HPV de controles, em amostras cervicais e salivares (p<0,0001); com alta sensibilidade (acima de 95%) e especificidade (acima de 71%) em ambos fluidos. O peptídeo C.B1 também foi incorporado com sucesso (p<0,05) em um bioeletrodo de grafite para o diagnóstico do HPV direto na saliva. Na abordagem vacinal, três peptídeos (PEP1, PEP3 e PEP4) não apresentaram toxicidade em macrófagos murinos. As imunizações revelaram potente indução na produção de anticorpos séricos IgG pelo PEP3, e aumento nos títulos de IgA na mucosa vaginal sob estímulo dos PEP1 e PEP3. A avaliação da resposta imune celular indicou que o PEP1 e, sobretudo o peptídeo quimérico PEP3, foram capazes de polarizar a resposta imune para o perfil Th1 e sensibilizar as células a um status pró-inflamatório, propício para atuação antiviral. O ensaio de neutralização de PsVs do HPV-16 mostrou que o PEP3 foi capaz de reduzir a infecção em 49%. Conclusões: De maneira geral, os estudos aqui apresentados evidenciaram uma alta prevalência de HPV em mulheres brasileiras por tipos virais ainda pouco explorados na literatura mundial. Nós selecionamos mimotopos pela ferramenta de Phage Display capazes de detectar o HPV tanto em amostras de saliva quanto em secreção cervical, possibilitando um diagnóstico simples, de baixo custo, e não invasivo para rastreios populacionais. Além disso, os mimotopos aqui selecionados possuem atraente aplicabilidade em formulações vacinais, porém estudos adicionais ainda são necessários. / Doutor em Genética e Bioquímica

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-05-05T19:00:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Winnie Castro Amorim e Albuquerque - 2017.pdf: 2279498 bytes, checksum: 160e4a276e405c6393dd5bb7742b106b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-10T13:37:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Winnie Castro Amorim e Albuquerque - 2017.pdf: 2279498 bytes, checksum: 160e4a276e405c6393dd5bb7742b106b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T13:37:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Winnie Castro Amorim e Albuquerque - 2017.pdf: 2279498 bytes, checksum: 160e4a276e405c6393dd5bb7742b106b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Outro / Bovine papillomavirus is the etiological agent of bovine papillomatosis, a disease that triggers warts throughout the skin, udder, roofs, genitalia and in more severe cases can develop extensive papillomas, cause neoplasia in the digestive tract and bladder, weaken the animal's health and cause losses in the Productivity and losses for livestock. The present study aims to detect and typify bovine Papillomavirus present in bovine tissue and blood samples with papillomatosis, to sequence the isolated viral types, to analyze the nucleotide sequences and the phylogeny of the detected viral types. As a result, amplification was obtained in five tissue samples (papilloma) from different bovines, not being successful in the amplification of blood samples. PCR reactions revealed the presence of BPV-1 in 60%, BPV-5 in 40%, BPV-9, BPV-10, BPV-13 and BPV-14 in 20% and BPV-12 in 40% of the analyzed samples. The presence of coinfection was verified in 60% of the lesions analyzed, with up to four viral types infecting the same sample. Alignments of viral type sequences 1, 5 and 14 were validated with identity ranging from 74% to 95%. The phylogenetic diagram showed a genetic approximation between viral types 1 and 14, both belonging to the genus Deltapapillomavirus, and distancing between nucleotide sequences of viral types 5, 9 and 14. Papillomaviruses of types 5 and 9 belong to different genera, Epsilonpapillomavirus and Xipapillomavirus, Respectively, the phylogenetic distance between these viral types, verified in the diagram, is justified. / Papilomavírus bovino é o agente etiológico da papilomatose bovina, doença que desencadeia verrugas por toda pele, úbere, tetos, genitália e em casos mais graves pode desenvolver papilomas extensivos, causar neoplasia no trato digestivo e bexiga, debilitar a saúde do animal e provocar perdas na produtividade e prejuízos para a pecuária. O presente estudo possui como objetivo detectar e tipificar Papilomavírus bovino presentes em amostras de tecido e sangue de bovinos com papilomatose, sequenciar os tipos virais isolados, analisar as sequências nucleotídicas e a filogenia dos tipos virais detectados. Como resultado, obteve-se amplificação em cinco amostras de tecido (papiloma) de diferentes bovinos, não obtendo sucesso na amplificação das amostras de sangue. As reações de PCR revelam a presença do BPV-1 em 60%, BPV-5 em 40%, BPV-9, BPV-10, BPV-13 e BPV-14 em 20% e BPV-12 em 40% das amostras analisadas. A presença de coinfecção foi verificada em 60% das lesões analisadas, com até quatro tipos virais infectando a mesma amostra. Os alinhamentos das sequencias do tipo viral 1, 5 e 14 foram validados com identidade variando de 74% a 95%. O diagrama filogenético demonstrou aproximação genética entre os tipos virais 1 e 14, ambos pertencentes ao gênero Deltapapillomavirus, e distanciamento entre as sequências nucleotídicas dos tipos virais 5, 9 e 14. Os papilomavírus dos tipos 5 e 9 pertencem a gêneros diferentes, Epsilonpapillomavirus e Xipapillomavirus, respectivamente, justifica-se dessa forma, a distância filogenética entre esses tipos virais, verificada no diagrama.

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:37:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_SULAYNE JANAYNA ARAUJO GUIMARAES.pdf: 2540252 bytes, checksum: 857ace608d3bf1b7e0a27229b8b53d98 (MD5) Previous issue date: 2014-12-03 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The anal squamous cell carcinoma (SCCA) is rare, but its incidence has increased and have often been associated with human papilloma presence virus (HPV). Objective: In order to determine the prevalence of HPV infection in this histological variant, the study analyzed paraffin embedded samples of anal carcinoma in patients treated at the University Hospital of the Federal University of Maranhão (HUUFMA) and Maranhão Institute of Oncology Aldenora Bello (IMOAB) between 2001 and 2011. Methods: samples of anal cancer were included whose histological slides and paraffin blocks contained in patient files diagnosed in the Pathology Services IMOAB and HUUFMA and allowed confirmation of the diagnosis and evaluation of the proposed criteria this work. We collected demographic variables relating to the profile and clinical partner in the medical records and pathological reports of 27 patients. The tissue samples preserved in paraffin blocks were sent for DNA extraction using Qiagen column and Xylene Kit. The β-globin constitutive gene was amplified to certify the integrity of DNA in the samples. Later, there was amplification of HPV DNA by reaction technique Polymerase Chain (PCR) using the primer and SPF10 genotyping by reverse hybridization. Results: Among the patients evaluated, 74.07% were women; and 40.75% of the patients were aged between 42 and 52 years. Risk factors such as smoking (22.22%) and alcohol consumption (11.11%) were recorded in this group. Metastases were detected in 11.11% of cases with two cases of distant metastasis to the liver, rectum and vagina. HPV detection was at 81.48% of the positive samples. HPV16 was detected in 100% of the positive samples. High prevalence of HPV 11 was detected also in 11/27 (40.74%). Multiple infections showed 45.45% (10/22) of prevalence in the sample. Conclusion: Our results provide further evidence in support of the strong association of high-risk HPV infection in the development of anal SCC also highlighting a concern with late diagnosis and the need for monitoring and preventive measures for anal carcinoma. / Introdução: O carcinoma anal de células escamosas (SCCA) é raro, porém sua incidência vem aumentando e têm sido frequentemente associado à presença do papiloma vírus humano (HPV). Objetivo: Com o objetivo de verificar a prevalência da infecção por HPV nessa variante histológica, o estudo analisou amostras parafinadas de carcinoma anal em pacientes atendidos no Hospital Universitário da Universidade Federal do Maranhão (HUUFMA) e no Instituto Maranhense de Oncologia AldenoraBello (IMOAB), entre 2001 e 2011. Método: Foram incluídas amostras de câncer anal cujas lâminas histológicas e blocos parafinados constavam nos arquivos de pacientes diagnosticados nos Serviços de Anatomia Patológica do IMOAB e no HUUFMA e permitiram confirmação do diagnóstico e avaliação dos critérios propostos neste trabalho. Foram coletados variáveis referentes ao perfil sócio demográfico e clinico nos prontuários e nos laudos anatomopatológicos de 27 pacientes. As amostras de tecido conservadas em blocos de parafina foram encaminhadas para extração de DNA usando Xilol e Kit de coluna Qiagen. O gene constitutivo β-globina foi amplificado para atestar a integridade do DNA nas amostras. Posteriormente, realizou-se a amplificação do DNA do HPV pela técnica de Reação em Cadeia da Polymerase (PCR) utilizando o primer SPF10 e genotipagem por hibridização reversa. Resultados:Dentre os pacientes avaliados, 74,07% eram mulheres; e 40,75% dos pacientes estavam na faixa etária entre os 42 e 52 anos. Fatores de risco, como tabagismo (22,22%) e etilismo (11,11%) foram registrados no grupo estudado. Metástases foram detectadas em 11,11% dos casos tendo dois casos de metástase à distância para o fígado, reto e vagina. A detecção de HPV foi positiva em 81,48% das amostras. O HPV16 foi detectado em 100% das amostras positivas. Foi detectada alta prevalência também do HPV11 em 11/27 (40,74%). As infecções múltiplas apresentaram 45,45% (10/22) de prevalência na amostra estudada. Conclusão: Nossos resultados fornecem evidências adicionais em apoio à forte associação da infecção pelo HPV de alto risco no desenvolvimento do CCS anal, destacando também uma preocupação com o diagnóstico tardio e a necessidade de monitoramento e medidas de prevenção para o carcinoma anal.

Introducción: el virus del papiloma humanos (VPH) representa una de las infecciones de transmisión sexual más comunes en la población. La infección persistente por el VPH, sobre todo los genotipos 16 y 18 es el factor de riesgo persistente para desarrollar un cáncer de cérvix por lo que resulta importante su detención precoz. Objetivo: nuestro objetivo principal ha sido conocer la prevalencia de los diferentes genotipos en las mujeres residentes en el departamento de salud de Torrevieja. Y conocer si la distribución es diferente en las distintas nacionalidades residentes en el departamento de salud. Material y método: Se trata de un estudio observacional, transversal y retrospectivo incluyendo a la población femenina mayores de 18 años, residentes en el departamento de salud de Torrevieja y usuarias de los servicios de sanidad pública. Para ello, se recogieron los resultados de las citologías con determinación de VPH de estas mujeres en el periodo entre el 2007 y 2015, realizando la técnica de PCR (CLART Papiloma humano 2) que detecta hasta 35 genotipos, 20 de alto riesgo y 15 de bajo riesgo. Resultados: La población a estudio fue de 15,709 mujeres con una media de edad de 45, 1, y 10, 2 años. Resultaron positivas un total de 3.572 (22,7 %) mujeres. Los genotipos más frecuentes encontrados fueron VPH16 con el 5,3%, seguido del VPH53 con el 3,1 % el VPH31, VPH51 y VPH66 con el 2,6%. Según los países de nacimiento de las mujeres existe una variación hasta de un 10% entre ellas, desde 18,6% de las pacientes de UK hasta el 29 % de las mujeres nacidas en Rumania. Conclusiones: La tasa de infección por virus del papiloma humano en mujeres residentes y usuarias de los servicios de salud pública del Departamento de Salud de Torrevieja fue del 22,7% que, en comparación con otras zonas de España, representa una tasa significativamente superior. Los genotipos VPH!& y VPH%·, ambos de Alto RIESGO (AR), son los más prevalentes para todos los grupos de edad estudiados. Reducir la infección por VPH en un departamento de prevalencia tan variable, pasa por elaborar estrategias orientadas a un cribado sistemático de los grupos de edad más vulnerables unido a actividades de educación para la salud, especialmente dirigidos a las mujeres extranjeras.

O principal fator etiológico da neoplasia do colo do útero é a infecção por HPVs (papilomavírus humano) de alto risco oncogênico, principalmente HPVs 16 e 18. A variabilidade intra-típica de ambos tipos virais tem sido extensivamente estudada. A análise da diversidade genética de isolados oriundos de diferentes regiões dos cinco continentes permitiu traçar a origem e filogenia destes vírus, e sugeriu-se que a evolução destes reflete a relação dos mesmos com seu hospedeiro. Considera-se uma variante molecular de um tipo de HPV um genoma que possui 98% ou mais de identidade nos genes Ll , E6 e E7 com um genoma já descrito. Entretanto, variantes moleculares apresentam aproximadamente 5% de diferença na seqüência da LCR (long contral region). Alguns grupos de pesquisa de diferentes partes do mundo relataram a associação epidemiológica entre variantes específicas de HPVs 16 e 18 e o risco aumentado de infecção persistente e de desenvolvimento de lesão do colo uterino de alto grau. No Brasil foi observada a associação positiva entre variantes não-européias de HPVs 16 e 18 e o risco de lesão do colo uterino em um estudo epidemiológico prospectivo que vem sendo conduzido em São Paulo. Neste estudo foi analisada a atividade transcricional dos promotores P97 e P105 de variantes moleculares de HPVs 16 e 18, respectivamente. A variante asiático-americana de HPV-18, B18-3, apresentou a maior atividade transcricional entre todos os isolados testados. Entre as variantes moleculares de HPV-18, o isolado europeu B18-2 foi o menos ativo transcricionalmente. Entre as amostras de HPV-16, a variante européia B-12 foi a que apresentou a maior atividade transcricional. Foi observado, também, que o promotor P105 de HPV-18 é mais ativo transcricionalmente que o promotor P97. Adicionalmente, foi analisada a capacidade de imortalização de queratinócitos humanos primários por E6/E7 de variantes moleculares de HPV-16. Essas variantes não diferiram muito quanto a eficiência de formação de colônias de queratinócitos crescidos em baixa densidade. Entretanto, a variante asiático-americana gerou um maior número de colônias potencialmente imortalizadas. Esses resultados têm implicações importantes na determinação do risco de desenvolvimento de lesões de colo uterino associadas ao HPV. / Infection by high-risk HPV (human papillomavirus) types, especially HPVs 16 and 18, is the major etiological factor of cervical neoplasia. Intratypic nucleotide variability of both HPV types has been extensively studied. Genetic diversity analyses of isolates from different regions of the five continents permitted to reconstruct the origin and phylogeny of this virus, and suggested that viral evolution reflects the relation between the virus and their host. A molecular variant of HPV possess 98% or more identity in L1, E6 and E7 genes with another viral genome. However, molecular variants have approximately 5% differences within the LCR (long control region). Some research groups from different parts of the world have described the epidemiologic association between specific variants of HPVs 16 and 18 and increased risk of persistent infection and development of squamous intraepithelial lesions. In Brazil, we observed a positive association between non-European variants of HPVs 16 and 18 and risk of cervical lesion in a prospective epidemiologic study that is being conducted in São Paulo. In this study we analyzed P97 and P105 transcriptional activity of molecular variants of HPVs 16 and 18, respectively. The Asian-American variant of HPV-18, B18-3, exhibited the highest transcriptional activity among all isolates tested. Among HPV-18 molecular variants, the B 18-2 European isolate was the less transcriptionally active. Among HPV-16 samples, the B-12 European variant exhibited the highest transcriptional activity. We also observed that the HPV-18 P105 promoter was more active than the HPV-16 P97 promoter. Furthermore, we analyzed the capacity of immortalization of primary human keratinocytes by E6/E7 molecular variants of HPV-16. These variants did not differ much in the efficiency of colony formation by low density keratinocyte plating. However, the Asian-American variant yielded a higher number of colonies potentially immortalized. These results have important implications in the determination of risk for development of HPV -associated cervical lesions.

O Papilomavírushumano (HPV) é um DNA vírus do grupo papovavírus, que é altamente transmissível sexualmente, sendo bastante encontrado na região anogenital e mucosa oral. A sua implantação oral pode ser por auto-inoculação ou pelo contato oro-sexual. As principais manifestações orais associadas ao HPV são: papiloma, condiloma acuminado, verruga vulgar e hiperplasia epitelial focal. O papiloma é uma lesão epitelial associada ao HPV e pode ocorrer em vários locais da mucosa oral. Histopatologicamente, o papiloma oral é caracterizado por coilocitose, disceratose, papilomatose, hiperceratose e acantose. A literatura ressalta a importância do estudo dessas lesões, uma vez que estudos demonstram que mesmo com os achados macroscópicos e histológicos serem compatíveis com a presença do vírus, somente técnicas de detecção podem comprovar a presença viral.O objetivo deste estudo foi verificar a presença do HPV, por meio das técnicas de hibridização in situ e PCR, em lesões diagnosticadas histopatologicamente como papilomas e comparar esses resultados com características clínicas e histológicas. Cinqüenta casos foram selecionados da Disciplina de Patologia Bucal e da Disciplina de Estomatologia Clínica da FOUSP. Esta seleção de 50 casos foi submetida à reação de hibridização in situ, e 10 casos dentre os mesmos por técnica da PCR e 100% casos foram negativos. Nenhuma das características histológicas previamente analisadas puderam formar estreita relação com a hibridização in situ e PCR. Conclui-se que a análise histopatológica ao HE não se correlaciona com os resultados das técnicas de hibridização in situ e PCR, porém importante ressaltar para detecção do HPV nas lesões estudadas é imprescindível o uso de técnicas de Biologia Molecular otimizadas como a hibridização in situ e PCR realizadas nesse estudo. / The Humanpapillomavirus (HPV) is a DNA virus from the group of papovavirus, which is highly sexually transmitted and it can be often found in the anogenital area and in the oral mucosal. The oral implantation can be by self-inoculation or by the oral sexual contact. The main oral appearances associated to HPV are: papilloma, condylomata acuminata, verruca vulgaris and focal epithelial hyperplasia. Papilloma is an epithelial lesion that is associated to HPV and can occurs in many places of the oral mucosal. Histopathologically, the oral papilloma is characterized by koylocitosis, dyskeratosis, papillomatosis, hyperkeratosis and acanthosis. The literature shows the importance of these lesions once studies show that macroscopic and histologic founds suggest the presence of the virus, only detection technics can prove the viral presence. The target of this study is to check the presence of HPV, by means of In situ hybridization and PCR, in lesions diagnosed histopathologically as papillomas and compare these results with clinic and histologic features. Fifty cases were selected from the Discipline of Oral Pathology and the Discipline of Oral Diagnose of FOUSP. This selection of 50 cases were submitted to the reaction of In situ hybridization, and 10 cases among the same by PCR and 100% of the cases were negative. None of the histologic features were previously analyzed could form a narrow relation with the In situ hybridization and PCR. Therefore it is concluded that the histopathologic analysis to HE do not correlate with the results of the In situ hybridization and PCR, however the detection of the HPV in the studied lesions it is absolutely necessary the use of Molecular Biology techniques as the In situ hybridization and PCR done in this study.

La implicación del papiloma virus humano (HPV) en carcinomas de cérvix está totalmente demostrada, pero esta infección se puede producir en otras regiones anatómicas con similares consecuencias patológicas. El estudio presenta la detección de HPV en carcinomas de pene y vulva mediante PCR, analizando la sensibilidad de diferentes sistemas, primers GP5+/6* y MY09/11. También se lleva a cabo la detección inmunohistoquímica de proteínas celulares como posibles marcadores diagnóstico de infección por HPV, las proteínas P53 y P16 su expresión supuestamente se altera por la infección de HPV en carcinomas de pene (77,5%), mientras que en los carcinomas de vulva la tasa de detección está dentro de los rangos esperados según trabajos previos publicados (29, 7). El estudio de la relación entre la presencia de HPV y la expresión de los marcadores celulares muestra su no asociación en estas patologías. / The infection of human papilloma virus (HPV) is clearly related with cervical carcinomas, but this infection can be found in other regions whit PCR, analyzing the sensitivity of HPV in penile and vulvar carcinomas whit PCR, analyzing the sensitivity of two differents systems, MY09/11 and GP 5+/6+. Also the immunohistochemical detection of cell proteines as diagnostic markers for the HPV in penile carcinomas in the study populations (77,5%), whereas in vulgar carcinomas . The detection rates is similar to the previously published data ( 29, 7%). The study of the relatioship between HPV and the expression of the cell markers shows no asocciation with the pahologies.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Adriana Tonani de Mattos.pdf: 2693529 bytes, checksum: 00310e354cac5ba29311696cfd985068 (MD5) Previous issue date: 2010-12-15 / Human papillomaviruses (HPV) are epitheliotropic viruses that infect skin tissue or mucous membranes, closely related to development of lesions in the genital tract, ranging from warts to invasive cervical cancer. These injuries are caused by different types of HPV that are classified into low and high risk types according to the association with cervical cancer. HIV seropositive women are mostly affected by HPV and are more prone to develop cervical cancer. The aim of this study was to evaluate the frequency of HPV types in seropositive and seronegative women for HIV. Therefore, cervical samples, part of the human bank samples of the Virology Laboratory, were analised from women known to be positive for HPV (n=87) attending the Reference Center STD / Aids Clinic in Vitória-ES, during March to December 2006. DNA was extracted by commercial kit QIAamp... / Os papilomavírus humanos (HPV) são vírus epiteliotrópicos que infectam tecido cutâneo ou mucoso e estão relacionados com desenvolvimento de lesões que, no trato genital, variam de verrugas ao câncer cervical invasivo. Estas lesões são causadas por diferentes tipos de HPV, que são classificados em baixo e alto risco conforme sua associação com câncer cervical. Sabe-se que mulheres soropositivas para HIV são mais acometidas por infecções por HPV e estão mais propensas ao desenvolvimento de câncer cervical. O objetivo desse estudo foi avaliar a frequência de tipos de HPV em mulheres soropositivas e soronegativas para HIV. Para isso foram analisadas amostras de escovado cervical, que faziam parte do banco de amostras do Laboratório de Virologia, de mulheres conhecidamente positivas para HPV (n=87) atendidas no Centro de Referência DST/AIDS, em Vitória-ES, no período de março a dezembro de 2006. O DNA das amostras foi extraído utilizando kit comercial QIAamp® DNA Mini Kit ou através do método de isotiocinanato de guanidina e sílica. DNA do HPV foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores degenerados MY09/MY11 ou PGMY09/PGM11 biotinilados e a genotipagem foi realizada por Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ou por Reverse Line Blot (RLB), respectivamente. Do total de amostras, 97,7% foram genotipadas e 31 tipos distintos detectados: 6, 11, 13, 16, 18, 26, 31, 31b, 32, 33, 34, 35, 42, 44, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 68, 71, 81, 82, 83 e 84. O tipo mais prevalente foi o HPV16, tanto nas mulheres soropositivas quanto nas soronegativas para HIV, seguido pelos tipos 6, 53 e 11. O tipo 13, incomum em amostras cervicais, foi observado nesse estudo, porém a quantidade de amostras não foi suficiente para a realização de seqüenciamento para a confirmação deste tipo viral. Os tipos oncogênicos foram mais comuns nas amostras de mulheres soropositivas para HIV, porém com número semelhante e o número de infecções múltiplas foi maior entre as mulheres HIV positivas. Este estudo revelou uma grande diversidade de tipos de HPV na região

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-10-14T19:44:04Z No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:48:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:48:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T18:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The Human Papiloma Virus (HPV) is a Sexually Transmitted Disease (STD) very common in the world. It infects the human epithelium may persisting of asymptomatic form or causing some neoplasia. Many studies report the association between HPV and many kinds of cancer such as: lap utero, anus, penis, vagina and vulva. According to INCA data for the year of 2016 are expected 16.340 new cases of lap utero cancer, being the second most frequent case in the female population in Brazil. For the recognition of the virus, there`s a lots of tracking methods, as morphological test (pap test), that observes cytopathic effects caused by the virus on human cells, suggesting the existence of infection, however this type of test presents low results and has shown high taxes of false negative and positive results. To overcome this problems, countless studies has shown the effect of molecular techniques utilization to increase the sensibility and especially, getting recognize and genotyping the HPV virus. On this recent studies, were tested distinct molecular techniques for typing the HPV virus, as Conventional PCR followed by Sanger Sequencing , Real time PCR (SYBRGreen® e Taqman ®) and Sequencing of New Generation. Altogether were collected 318 samples pf cervix grated, and from this material were collected the DNA using an adapted protocol (POWELL; GANNON, 2002). Using the conventional PCR technique followed by Sanger Sequencing we obtained 65 positives samples for the HPV(21%), in 49 samples(75,3%) it was possible to identify the HPV type, in the other 16 samples(24,7%) it was not possible the identification, probably because the infection was formed for two or more types of the virus. With the real time PCR technique using SYBRGreen®, were accomplished an experimente with 30 samples, which was possible to confirm the results in 28 of it, using Sanger Sequencing. In two samples the results are not confirmed, being possible to positive the sample, showing high sensibility of the real time PCR technique. The methodology of New Generation Sequencing (NGS) it showed useful for HPV identification, being one of the first studies published for routine use. And it has great prospects because besides HPV can identify other microorganisms in the sample and quantifies them as well. / O Papilomavírus humano conhecido como HPV é uma doença sexualmente transmissível frequente em todo mundo, ele infecta o epitélio de seres humanos, podendo persistir de forma assintomática ou causar neoplasias. Diversos estudos relatam a associação entre o HPV (Alto Risco) e diversos tipos de câncer como: colo de útero, ânus, orofaringe, pênis, vagina e vulva. Segundo dados do INCA para o ano de 2016, são esperados 16.340 novos casos de câncer de colo de útero, sendo de maior frequência na população feminina no Brasil. Para a identificação do vírus existem inúmeros métodos de rastreio como testes morfológicos (exame do Papanicolau), que observam os efeitos citopáticos que o vírus provoca nas células sugerindo a existência da infecção, mas este tipo de teste apresenta baixa especificidade e vem apresentando altas taxas de falsos-negativos e positivos. Para contornar estes problemas inúmeros estudos têm demostrando a eficácia da utilização de técnicas moleculares, para aumentar a sensibilidade e especificidade, conseguindo identificar e genotipar o vírus do HPV. No presente estudo foram testadas diferentes técnicas moleculares para a identificação do vírus do HPV como: PCR convencional seguida por sequenciamento Sanger, PCR em tempo real (SYBRGreen® e Taqman®) e sequenciamento de nova geração. Ao todo foram coletadas 318 de amostras de raspado do colo cervical. Deste material foi extraído o DNA utilizando um protocolo adaptado (POWELL, GANNON, 2002). Utilizando a técnica da PCR convencional seguida por sequenciamento Sanger obtivemos 65 amostras positivas para o HPV (21%), destas 49 amostras (75,3%) foi possível identificar o tipo do HPV e em 16 casos (24,7%) não foi possível identificar o vírus, sendo possivelmente uma infecção formada por dois ou mais tipos do vírus. Com a técnica de PCR em tempo real utilizando SYBRGreen® foi realizado um experimento com 30 amostras sendo possível confirma o resultado destas com o sequenciamento Sanger em 28 casos. Em duas amostras os resultados não corroboraram, sendo possível positivar a amostra. Mostrando a maior sensibilidade da técnica de PCR em tempo real. A metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) se mostrou útil para identificação do HPV, demonstrada neste trabalho de maneira inédita. O uso do NGS apresenta boas perspectivas pois além do HPV pode identificar outros microrganismos na amostra e quantifica-los.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ErikaGL_DISSERT.pdf: 2372644 bytes, checksum: 71509c6c298fb6e35890d8d13548037c (MD5) Previous issue date: 2012-12-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The genital HPV infection is very common between men and women worldwide, affecting particularly young women, constituting a serious public health problem in less developed regions, favored by the poor living conditions of population. The cytology and colposcopy have notorious importance in the diagnosis of precursor lesions of cervical cancer and therefore its prevention. However, even with such diagnostic tools, the number of women who develop cervical cancer is still high. This study aims to assess the prevalence of genital tract infection by HPV in pregnant and nonpregnant women, evaluating the profile of the immune response presented by the women of these two groups in order to establish correlations among profile of immune response, presence of virus and occurrence of lesions of the uterine cervix. We analyzed specimens obtained from the cervix of 221 patients, 91 pregnant and 130 non-pregnant, aged 14-72 years. The women were subjected to colposcopic and cytologic evaluation detect possible changes in the cervix and then samples were collected in order to perform HPV detection by PCR and real-time PCR for detection of mRNA of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. In the present study, the overall prevalence of HPV genital infection was 28.1%; of which 31.9% were pregnant patients and 25.4% in non-pregnant women. Young women under 30 years and those with low educational level education showed a higher risk of HPV infection. Colposcopy showed better correlation with detection of HPV DNA by PCR, when compared to cytology. Generally, HPV infected patients, pregnant or not, exhibited reduced mRNA expression of both pro-inflammatory (IFN-&#947;, TNF-&#945;) and anti-inflammatory (IL -10) cytokines, when compared to patients not infected by HPV. Nonpregnant patients infected presented increase mRNA expression of IL-17 in patients without injury, whereas those with lesion showed higher mRNA expression of TGF-&#946;. Pregnant women without injury infected exhibited increased mRNA expression of TGF-&#946;. There was no difference in HPV prevalence between pregnant and nonpregnant women. There was a reduction of pro-inflammatory cytokines, except IL-17, in all women infected by HPV. Moreover, we observed an increase of TGF-&#946; in HPV-infected women who are pregnant or not. The results suggest that, in women in this study, HPV infection promoted changes in the profile of cytokines necessary for activation of effective immune response, possibly favoring viral persistence / A infec??o genital pelo v?rus do papiloma humano (HPV) ? muito frequente entre homens e mulheres em todo o mundo, afetando em especial mulheres jovens, constituindo-se em grave problema de sa?de p?blica nas regi?es menos desenvolvidas, sendo favorecida pelas condi??es prec?rias de vida da popula??o. A citologia onc?tica e a colposcopia t?m not?ria import?ncia no diagn?stico das les?es precursoras do c?ncer do colo uterino e, portanto, na sua preven??o. No entanto, mesmo com a disponibilidade dessas ferramentas diagn?sticas o n?mero de mulheres que desenvolvem c?ncer do colo do ?tero ainda ? elevado. Esse estudo tem por objetivo avaliar a preval?ncia de infec??o do trato genital por HPV, em mulheres gr?vidas e n?o gr?vidas, avaliando o perfil da resposta imune apresentado pelas mulheres desses dois grupos, visando estabelecer correla??es entre o perfil de resposta imune, a presen?a do v?rus e ocorr?ncia de les?es da c?rvice uterina. Foram inclu?das neste estudo 221 pacientes, sendo 91 gr?vidas e 130 n?o gr?vidas, com idade variando de 14 a 72 anos. As mulheres foram submetidas a uma avalia??o colpocitol?gica para a detec??o de poss?veis altera??es na c?rvice uterina e em seguida coletados esp?cimes para an?lise por meio da rea??o em cadeia da polimerase (PCR) convencional para detec??o do HPV e PCR em tempo real para detec??o de RNA mensageiro (RNA-m) de citocinas pr?-inflamat?rias e anti-inflamat?rias. A preval?ncia global da infec??o genital pelo HPV, encontrada neste estudo, foi de 28,1%, sendo 31,9% em pacientes gr?vidas e 25,4% nas n?o gr?vidas. As mulheres jovens com at? 30 anos e aquelas com baixa escolaridade apresentaram maior risco de ter infec??o pelo HPV. A colposcopia apresentou melhor correla??o com a detec??o do DNA do HPV por PCR, quando comparada ? citologia. De um modo geral, as pacientes infectadas pelo HPV, gr?vidas ou n?o, apresentaram uma redu??o da express?o de RNA-m tanto para as citocinas pr?-inflamat?rias (IFN-&#947;, TNF-&#945;), quanto para a citocina anti-inflamat?ria (IL-10) em rela??o ?s pacientes n?o infectadas com HPV. Nas pacientes n?o gr?vidas e infectadas, a express?o do RNA-m para IL-17 mostrou-se aumentada nas pacientes sem les?es, enquanto que, aquelas com les?o apresentaram maior express?o do RNA-m para TGF-&#946;. As mulheres gr?vidas e infectadas pelo HPV e sem les?o, apresentaram aumento na express?o do RNA-m para TGF-&#946;. N?o houve diferen?a de preval?ncia do HPV entre mulheres gr?vidas e n?o gr?vidas. Observou-se uma redu??o da produ??o de citocinas pr?-inflamat?rias, exceto IL-17, em todas as mulheres infectadas pelo HPV, e um aumento de TGF-&#946;, nas mulheres infectadas pelo HPV gr?vidas ou n?o. Os resultados sugerem que, nas mulheres deste estudo, a infec??o pelo HPV promoveu uma altera??o no perfil de citocinas necess?rias para a ativa??o de uma resposta imune efetiva, possivelmente favorecendo a persist?ncia viral