As células produtoras de anticorpos desempenham um papel chave na resposta efetora a microrganismos, sendo o foco principal da maioria das vacinas existentes. Entretanto, elas podem ter efeitos deletérios em doenças autoimunes e na rejeição a transplantes. Apesar de grandes avanços no controle da resposta humoral, alguns desafios permanecem e neste contexto, novos alvos terapêuticos têm sido explorados. Sabe-se que alterações metabólicas decorrentes da ativação de células B estão intimamente relacionadas com a função efetora destas células, o que anteriormente se imaginava ser apenas um reflexo de crescimento e proliferação celular. Estas alterações são controladas por sensores metabólicos ativados logo após a ativação de células B, como o mTOR, o qual é componente central de dois complexos: mTORC1 e mTORC2. Estudos anteriores já reportaram o papel positivo exercido por mTOR na via glicolítica em células T, bem como na função efetora destas células. Aqui, nós formulamos a hipótese de que a via do mTOR favorece a via glicolítica em detrimento de OXPHOS em células B, e que estas alterações metabólicas impactam as funções efetoras das mesmas. Desta maneira, para investigarmos alterações nestas vias em decorrência de mTOR, células B foram isoladas de animais controle (CT), ou de animais com células B deficientes de mTORC1 (RaptorΔB) ou mTORC2 (RictorΔB) e então estimuladas com LPS (lipopolissacarídeo) in vitro. Nossos dados indicam que a deficiência de mTORC2 beneficia OXPHOS em detrimento da via gicolítica, bem como a ativação de células B e a formação de plasmablastos. Na sequência, confirmamos que a redução nas taxas de glicólise, assim como a elevação da oxidação lipídica e de OXPHOS são cruciais para manter a elevada ativação de células B e formação de plasmablastos a partir de células B RaptorΔB e RictorΔB. Constatou-se ainda que a produção total de IgM é elevada em células RictorΔB após estímulo com LPS. Entretanto, identificamos que isso é decorrente do aumento de plasmablastos formados e não da capacidade individual de secreção dos mesmos. Diferentemente das células B deficientes, observamos que plasmablastos RaptorΔB e RictorΔB reduzem a atividade mitocondrial. Na sequência, confirmamos que a atividade mitocondrial via oxidação lipídica é fundamental para a produção de anticorpos. Além disso, demonstramos que a deficiência de mTORC2 eleva a troca de isotipo, enquanto a de mTORC1 a diminui após estimulo com LPS e IL4. Posteriormente, o impacto da deficiência de mTORC2 em células B foi avaliado in vivo em modelo de transplante de pele. Neste caso, não observamos diferenças significativas na sobrevida do enxerto entre CT e RictorΔB, mas foi constatado que apesar de ambos apresentarem formação de plasmócitos similares, animais deficientes apresentaram um número significativamente menor de células B na periferia. Assim, concluímos que a deficiência de mTORC1 ou mTORC2 em células B implica em uma maior diferenciação de plasmablastos e em uma maior produção total de anticorpos em RictorΔB in vitro, enquanto um papel funcional para essas moléculas no contexto das células B in vivo ainda precise ser determinado. / Antibodies are produced by Antibody Secreting Cells (ASCs), which are essential to fight infections. They are also the basis of most successful vaccines available, however they can present deleterious effects in autoimmune diseases and in graft rejection. Even though there have been great improvements in controlling the humoral response, its proper manipulation still remains a challenge, thus new targets need to be explored. It is known that metabolic shifts that occur upon B cell activation are not only essential for cell growth and proliferation, but are also interconnected with these cells effector function. Metabolic shifts are controlled by metabolic sensors, as the mTOR, which is a core component of two complexes, mTORC1 and mTORC2. Previous studies with T cells have already reported that mTOR exerts a positive role on glycolysis, which in turn impacts the effector function of T cells. We then hypothesized that mTOR favors glycolysis over Oxidative Phosphorylation (OXPHOS) in B cells, and that these metabolic changes impact the effector function of B cells. Thus, to investigate the impact of the mTOR pathway on B cells, we isolated B cells from mice with mTORC1 deficient B cells (RaptorΔB) or mTORC2 deficient B cells (RictorΔB) or Control mice (CT), and stimulated them in vitro with lipopolysaccharide (LPS). Our results indicate that the deficiency of mTORC2 favors OXPHOS over glycolysis, as well as B cell activation markers expression and plasmablast formation. Next, we confirmed that the reduced glycolysis levels, improved lipid oxidation and OXPHOS are in fact crucial for the enhanced activation and plasmablast formation observed in RaptorΔB and RictorΔB B cells. We also described that IgM secretion was elevated in B cells from RictorΔB after stimuli with LPS, however we found that this increase was due to the overall increase in plasmablasts in this group and not to their individual antibody secretion capacity. Interestingly, RaptorΔB and RictorΔB plasmablasts differently from B cells, reduce their mitochondrial activity. Subsequently, we confirmed that the mitochondria via lipid oxidation is actually essential for antibody secretion. In addition, we showed that mTORC2 deficiency increases isotype switching, while mTORC1 deficiency diminishes it when IL4 was added to LPS. We then sought to determine if mTORC2 deficiency in B cells would present an impact in vivo in a skin graft model. However, we did not observe a significant difference in graft survival between the CT and RictorΔB mice and in plasmacyte numbers, but we did observe a significant reduction in B cells in the periphery. Thus, we conclude that mTORC1 and mTORC2 deficiency leads to an improved plasmablast differentiation and an overall increase in antibody secretion in the last one in vitro, whereas the role of these sensors remains to be determined in vivo.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [117]-121. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

La production d'IVIg (immunoglobulines pour injection intraveineuse) est actuellement dépendante des dons de plasma, et ainsi limitée. C'est pourquoi pouvoir en produire in vitro est une entreprise importante. Comprendre et maîtriser les arcanes complexes, qui régulent la transformation des cellules B humaines en plasmocytes sécréteurs d'anticorps, est fondamental pour la mise au point des conditions nécessaires à cette production. L'un des éléments clé se nomme XBPIS, facteur de transcription issu de l'épissage particulier de l'ARNm du gène XBPl, qui survient lors de la réponse UPR et qui est également fortement impliqué dans la transformation plasmocytaire. Nous allons tout d'abord devoir surexprimer XBPl et XBPIS dans des lymphocytes B humains, via des constructions adénovirales Ad5/F35, porteuses de leurs ADNc (complémentaire). Et ensuite en étudier les répercussions sur les cultures de cellules B par différentes techniques d'analyses (RT-PCR, FACS, western blotting, ELISA). Les vecteurs adénoviraux pAd5/F35 construits montrent une très bonne capacité d'infection des cellules B. Si ces vecteurs permettent la surexpression d'XBPl et XBPIS dans les cellules 293A, 293 et L4.5, ils ne le permettent malheureusement pas chez les cellules B. Pourtant ces mêmes constructions permettent celle de YEYFP et de c-src dans ces dernières. Il semble donc que l'expression d'XBPJS soit réprimée spécifiquement au sein des cellules B, et que cela soit en relation avec le programme qui gère le stade de développement de la cellule. Provoquer la différenciation plasmocytaire via la surexpression d'XBPIS grâce aux virus Ad5/F35 ne semble pas réalisable. A moins de pouvoir lever ce mécanisme de répression, il faut songer à un autre moyen pour parvenir à la production d'anticorps in vitro.

Le lupus érythémateux disséminé est une maladie autoimmune systémique déclenchée par une combinaison de facteurs génétiques, hormonaux et environnementaux. Il se caractérise notamment par la présence d’autoanticorps dirigés principalement contre des éléments nucléaires. Les traitements proposés aux patients sont essentiellement palliatifs et non curatifs et engendrent de nombreux effets secondaires indésirables. Des nouvelles stratégies thérapeutiques plus spécifiques sont basées sur l’utilisation de peptides dérivés d’autoantigènes. Le peptide P140, découvert au laboratoire, est un candidat prometteur dans ce domaine. Il correspond à la séquence 131-151 de la protéine splicéosomale U1-70K et est chimiquement phosphorylé sur le résidu sérine 140. Son administration à des souris lupiques MRL/lpr diminue la sévérité des symptômes sans effet immunosuppresseur. Il est actuellement évalué chez l’homme dans un essai clinique de phase III. Le mécanisme d’action du peptide P140 commence à être bien connu chez la souris lupique. Récemment, mon équipe à montré que le peptide P140 affecte directement ou indirectement deux formes d’autophagie, la macroautophagie et l’autophagie médiée par les chaperonnes (CMA). De plus, il réduit l’expression des molécules du CMH-II ce qui conduirait à une baisse de la présentation antigénique et à une diminution de l’activation des LT autoréactifs. Finalement, une baisse de la production des autoanticorps, notamment des anticorps reconnaissant l’ADN double brin est observée suite à l’injection du peptide aux souris. L’objectif de mon projet de thèse a été de consolider ces résultats et également d’étudier le mode d’action du peptide chez l’homme puisque ceci n’avait pas encore été fait. Nous avons démontré que comme chez la souris, le peptide P140 réduit l’expression des molécules du CMH-II à la surface des LB de patients lupiques. De plus, nous avons montré que plus le score d’activité de la maladie est élevé, plus l’effet du peptide sur l’expression du CMH-II est important. En revanche, bien que nous ayons confirmé la dérégulation de la macroautophagie dans les LT CD8+ de patients, le peptide P140 ne semble pas affecter ce processus cellulaire. Nous étudions actuellement l’effet du peptide sur la CMA. Enfin, nous avons montré que chez la souris MRL/lpr et chez l’homme, le peptide P140 réduit le nombre de plasmablastes. Cette altération de la différenciation des LB conduit à une baisse de la production des IgM et des IgG, ce qui explique son effet bénéfique sur la maladie lupique. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a systemic autoimmune disease triggered by genetic, hormonal and environmental factors. It is mainly characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear elements. Most of current treatments proposed to patients are palliative and not curative and lead to numerous side effects. New therapeutical strategies are based on the use of peptides derivated from autoantigens. The P140 peptide discovered in our laboratory is a promising candidate. It corresponds to the 131-151 sequence of the U1-70K spliceosomal protein and is phosphorylated on ser140 residue. Its administration to MRL/lpr lupus-prone mice reduces symptom severity without immunosuppressive effect. It is currently evaluated in phase III of clinical trial. The mechanism of action of P140 peptide has been mostly elucidated in lupus mice. Recently, my team has shown that P140 peptide affects direclty or indireclty macroautophagy and chaperone-mediated autophagy (CMA), two major forms of autophagy. Furthermore, it reduces the expression of MHC class II molecules, which leads to the decrease of antigenic peptide presentation and activation of autoreactive T cells. Finally, a reduction of autoantibodies levels against double stranded DNA is shown after P140 injection in mice. The aim of my thesis project was to consolidate these data and to study the mode of action of P140 in humans since this was not done until now. We have shown that like in lupus-prone mice, P140 peptide reduces expression of MHC-II molecules on the surface of B cells from SLE patients. Furthermore, we have demonstrated that higher the disease activity score was, higher the effect of P140 peptide was. Unfortunately, although we confirmed the dysregulation of macroautophagy in CD8+ T cells from SLE patients, P140 peptide does not seem to affect this cellular process. We are currently studying the effect of the peptide on CMA. Finally, we have shown that in both MRL/lpr mice and humans, P140 peptide reduces the number of plasmabasts. This alteration of B cell differentiation lead to the decrease of IgM and IgG production, thus explaining the P140’ benefical effect on the course of lupus disease.

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne caractérisée par la prolifération d’un clone plasmocytaire tumoral dans la moelle osseuse et d’une accumulation d’une immunoglobuline monoclonale dans le sérum et/ou les urines. La diversité des anomalies cytogénétiques, rendant la maladie plus ou moins agressive, et la variabilité de la réponse au traitement font du MM une maladie hétérogène. Le MM reste incurable dans la majorité des cas avec une médiane de survie de 5 à 7 ans. La rechute après traitement est due à la persistance de cellules tumorales au sein de la moelle osseuse, appelée maladie résiduelle ou en anglais « Minimal Residual Disease » (MRD). La cytométrie en flux multiparamétrique (CFM) est une technique sensible, simple et rapide qui permet d’identifier et de caractériser des cellules d’intérêt dans un échantillon biologique. C’est dans le but de simplifier le suivi de la MRD du MM que nous avons développé une solution complète basée sur la CFM. Cette solution comprend (i) la conception d’un panel à 5 couleurs, composés des anticorps (Ac) anti-CD38, anti-kappa et anti-lambda pour identifier les plasmocytes totaux et de deux pools d’Ac couplés au même fluorochrome (anti-CD19/anti-CD27, pool négatif et anti-CD56/anti-CD117/anti-CD200, pool positif) pour détecter les plasmocytes tumoraux ; (ii) le développement d’un préparateur afin d’automatiser l’ensemble des étapes de préparation de l’échantillon ; et (iii) l’automatisation de l’analyse des résultats de CFM grâce à un logiciel que nous avons créé. Cette solution simple et entièrement automatisée permet d’augmenter la reproductibilité et la productivité, de diminuer le coût du test, sans altérer la sensibilité ou la spécificité. En parallèle de ces travaux, nous avons construit un score de risque simple basé sur l’expression de gènes codant pour des protéines de surface (CD24, CD27, CD36 et CD302) permettant de prédire la survie des patients atteints de MM au diagnostic ainsi qu’à la rechute. / Multiple myeloma (MM) is a hematological malignancy characterized by clonal plasma cell proliferation in bone marrow and abnormal monoclonal immunoglobulin accumulation in the serum and/or urine. The heterogeneity of the disease is partly due to the cytogenetic abnormalities diversity making the disease more or less aggressive. MM is incurable in the majority of cases with a median survival between 5 and 7 years. The persistence of abnormal plasma cells in bone marrow after treatment is called minimal residual disease (MRD) and leads to the patient relapse. Multiparametric flow cytometry (MFC) is a sensitive, simple and fast technique to identify and characterize cells of interest in biological samples. In order to simplify MRD follow-up we have developed a complete solution based on MFC. This solution includes (i) the 5-color panel design, composed of anti-CD38, anti-kappa and anti-lambda antibodies (Ab) to identify total plasma cell population and two pools of Ab paired to the same fluorophore (anti-CD19/anti-CD27, negative pool and anti-CD56/anti-CD117/anti-CD200, positive pool) to detect abnormal plasma cells; (ii) the development of a device used to automatically prepare biological samples before MFC; and (iii) the analysis automation of MFC results using a homemade software. This fully automated solution increases reproducibility and productivity, decreases processing and analyzing time as well as test cost, without affecting sensibility and specificity. In parallel, we have built a simple risk score based on gene expression encoding surface proteins (CD24, CD27, CD36 and CD302) providing MM patient outcome at diagnostic and MRD follow-up.

La cavité buccale constitue une porte d’entrée et un site réservoir majeur pour une diversité de virus. Mis à part l’herpèsvirus simplex, peu d’études virologiques détaillent le rôle des virus pathogènes de la sphère orale dont le virus d’Epstein-Barr. Le consensus est que les inflammations orales surviennent principalement en réaction à des infections bactériennes et fongiques provoquant une dysbiose du biofilm oral. Toutefois, ce modèle n’est pas parfait et il explique mal les récidives observées après décontamination, le découplage entre dysbiose et poussées inflammatoires, la proximité de dents atteintes et saines dans un environnement bactérien similaire. L’hypothèse d'un mécanisme synergique combinant virus et bactéries a été proposée pour la parodontite. Selon ce modèle, l’action complémentaire des 2 types d’agents infectieux sur le microenvironnement immunitaire favoriserait la chronicité inflammatoire et l’évolution de la maladie. Nos travaux se concentrent sur l’étude de l’infection de la cavité orale par EBV. EBV est un virus ubiquitaire infectant l’homme de manière persistante. La cavité orale est le site privilégié pour sa réplication avec une production salivaire quasi-constante. Outre un rôle transformant majeur, l’implication de EBV est aussi suspectée pour plusieurs maladies inflammatoires. Tout d’abord, nous nous sommes intéressés au lichen plan oral (LPO), une maladie auto-immune dont l'étiopathogénie n’est pas clairement établie. Sur des biopsies de patients atteints de LPO (n=99), nous avons démontré par hybridation in situ que le LPO est fréquemment infecté par EBV (74%), notamment les formes cliniques érosives. Nous montrons que le degré d’infiltration des lésions par des cellules infectées par EBV (EBV+) est corrélé avec les paramètres inflammatoires et que les cellules EBV+ infiltrées sont des plasmocytes. Cela apporte un élément nouveau dans la mesure où les plasmocytes sont reconnus comme des cellules immunitaires régulatrices majeures. Nous décrivons des profils cytokiniques différents entre LPO infectés ou non, sans qu’il soit possible à ce stade de pouvoir impliquer directement les plasmocytes. Nous confirmons par microscopie électronique que les plasmocytes hébergent les stades tardifs du cycle d’EBV et produisent des virions dans le LPO, suggérant un mécanisme d’amplification locale de l'infection. Ensuite, nous nous sommes intéressés à la parodontite, maladie inflammatoire chronique commune qui détruit la structure parodontale et provoque le déchaussement dentaire. Cette maladie est clairement identifiée comme facteur aggravant de nombreuses maladies systémiques. Nos études avaient déjà mis en évidence un lien direct entre infection EBV et la sévérité de la parodontite. Mes travaux ont permis de montrer que le parodonte inflammatoire est infiltré par des cellules EBV+ qui semblent être majoritairement des plasmocytes. La présence de plasmocytes producteurs de virus au sein de la lésion inflammatoire pourrait expliquer l’infection des épithéliums adjacents. De plus, une étude clinique menée sur une petite cohorte de patients traités pour parodontite met en évidence une corrélation entre la diminution de la charge EBV salivaire et l’amélioration clinique de patients après traitement. Si ce résultat se confirme, il constituerait un argument supplémentaire en faveur d’une contribution de l’infection parodontale par EBV à la globalité de la charge EBV salivaire. En conclusion, nos données mettent en évidence la présence quasi constante d’EBV dans deux types de lésions orales inflammatoires. Cette infection virale contribue à aggraver une situation inflammatoire locale associée ou pas à une dysbiose bactérienne. L’observation majeure concerne la présence, souvent massive, de plasmocytes infectés dont le rôle reste à identifier. Ces observations constituent des avancées significatives qui permettent d’étayer un nouveau modèle de pathogénie orale associant virus et bactéries. / The oral cavity is a major entry point and reservoir site for a variety of viruses. Apart from herpesvirus simplex, few virological studies detail the role of oral pathogenic viruses, including Epstein-Barr virus. The consensus is that oral inflammation occurs mainly in response to bacterial and fungal infections causing dysbiosis of the oral biofilm. However, this model is not perfect and does not explain well the recurrences observed after decontamination, the decoupling between dysbiosis and inflammatory outbreaks, the proximity of affected and healthy teeth in a similar bacterial environment. The hypothesis of a synergistic mechanism combining viruses and bacteria has been proposed for periodontitis. According to this model, the complementary action of the 2 types of infectious agents on the immune microenvironment would promote inflammatory chronicity and disease progression. Our work focuses on the study of oral cavity infection with EBV. EBV is a ubiquitous virus that persistently infects humans. The oral cavity is the preferred site for its replication with almost constant saliva production. In addition to a major transformative role, EBV's involvement is also suspected for several inflammatory diseases. First, we focused on oral plan lichen (OPL), an autoimmune disease whose etiopathogeny is not clearly established. On biopsies of patients with OPL (n=99), we demonstrated by in situ hybridization that OPL is frequently infected with EBV (74%), particularly in erosive clinical forms. We show that the degree of infiltration of lesions by EBV-infected cells (EBV+) is correlated with inflammatory parameters and that the infiltrated EBV+ cells are plasma cells. This brings a new element to the extent that plasma cells are recognized as major regulatory immune cells. We describe different cytokinic profiles between infected and uninfected OPL, although it is not possible at this stage to directly involve plasma cells. We confirm by electron microscopy that plasma cells host the late stages of the EBV cycle and produce virions in the OPL, suggesting a local amplification mechanism of infection. Then, we focused on periodontitis, a common chronic inflammatory disease that destroys the periodontal structure and causes tooth loosening. This disease is clearly identified as an aggravating factor in many systemic diseases. Our studies had already shown a direct link between EBV infection and the severity of periodontitis. My work has shown that the inflammatory periodontium is infiltrated by EBV+ cells, which appear to be predominantly plasma cells. The presence of virus-producing plasma cells within the inflammatory lesion may explain the infection of adjacent epithelia. In addition, a clinical study conducted on a small cohort of patients treated for periodontitis showed a correlation between the decrease in salivary EBV load and the clinical improvement of patients after treatment. If this result is confirmed, it would be an additional argument in favour of a contribution of periodontal EBV infection to the overall salivary EBV burden. In conclusion, our data show the almost constant presence of EBV in two types of inflammatory oral lesions. This viral infection contributes to worsening a local inflammatory situation associated or not with bacterial dysbiosis. The main observation concerns the presence, often massive, of infected plasma cells whose role remains to be identified. These observations represent significant advances that support a new model of oral pathogenesis combining viruses and bacteria.

L’anticorps monoclonal anti-CD20 (Rituximab) est largement utilisé dans le traitement des maladies auto-immunes. L’analyse de la rate des patients souffrant d’un purpura thrombopénique (PTI) ou d’une anémie hémolytique auto-immune traités par anti-CD20 a mis en évidence que la déplétion lymphocytaire B favorisait la différenciation des plasmocytes (PC) normaux en plasmocytes à longue durée de vie (PLDV) auto-réactifs, expliquant en partie l’absence de réponse à ce traitement. L’enjeu de ce projet a été de savoir si la déplétion lymphocytaire B induit l’émergence de PLDV spléniques et de comprendre les processus impliqués dans la survie plasmocytaire. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2xRosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les cellules B lors de leur passage dans un centre germinatif au cours d’une réponse immune après ingestion de tamoxifène, puis de les suivre in vivo. Les PC EYFP+ ont été générés suite à 2 immunisations avec des globules rouges de mouton. Après avoir sélectionné un set de gènes permettant d’établir les signatures plasmablastiques et plasmocytaires, nous avons comparé par RT-PCR multiplex sur cellules uniques le profil d’expression des PC EYFP+ de la rate de souris traitées ou non par anti-CD20. Nous avons ainsi caractérisé dans le contexte de déplétion B une population plasmocytaire dans la rate homogène et mature, proche des PLDV de la moelle osseuse. Ce profil était différent de celui retrouvé dans la rate des souris contrôles, plus hétérogène, comprenant une majorité de PC intermédiaires entre plasmablastes et PC matures. Nous avons observé le même processus de différenciation paradoxale plasmocytaire dans la rate sous anti-CD20 dans le modèle murin lupique NZB/W, signifiant probablement un mécanisme général, que ce soit en contexte auto-immun ou non, chez l’homme et chez la souris. Nous avons identifié le BAFF (B-cell activating factor) comme un facteur essentiel dans le processus de survie des PC de la rate dans le contexte de déplétion B. En effet, le taux de BAFF augmente dans le sérum et le tissu splénique après traitement par anti-CD20, la combinaison in vivo des traitements anti-CD20 et anti-BAFF induit une diminution drastique des PLDV de la rate, sans générer d’hypogammaglobulinémie IgG. Les granuleux Gr1+ et en particulier les neutrophiles Ly6G+ semblent être la principale source de production de BAFF dans le contexte de déplétion B. Nous avons observé un effet similaire de la combinaison anti-CD20 et anti-BAFF sur les PLDV de la rate dans le modèle lupique NZB/W. Enfin, les LT CD4+ sont un autre composant important de la niche splénique dans le contexte de déplétion B. En effet, le nombre de PC EYFP+ diminue significativement avec l’association anti-CD20 et anti-CD4. Ces résultats suggèrent donc que l’association du traitement anti-CD20 à un inhibiteur de facteur de survie plasmocytaire spécifique de la rate, en particulier BAFF, pourrait avoir un bénéfice clinique au cours des maladies auto-immunes en interférant sur le processus paradoxal de maturation des PC. Un essai clinique associant les traitements anti-CD20 et anti-BAFF au cours du PTI débutera prochainement. / Previous data suggested that the monoclonal anti-CD20 antibody induced paradoxically the settlement of autoreactive splenic long-lived plasma cells (LLPC) in the spleen of patients with auto-immune cytopenia, explaining the treatment failure. To investigate whether this process had a general relevance and decipher its mechanism, we used the AID-CreERT2-EYFP mouse model, which allows the irreversible expression of EYFP in B cells engaged in an immune response after tamoxifen regimen to follow plasma cells at different times after immunization. When analyzed by multiplex PCR at the single-cell level, while the splenic EYFP+B220-PC of untreated mice displayed an intermediate profile between short-lived and long-lived PC, the PC from anti-CD20 treated mice composed a more mature homogeneous population, similar to the long-lived bone marrow PC. The absolute number of splenic EYFP+B220-PC did not change significantly upon anti-CD20 treatment indicating that B-cell depletion promoted PC differentiation rather than a long-lived PC selection. BAFF (B-cell activating factor) and CD4+ T-cells played a major role in plasma cell survival since combination of anti-CD20 with anti-BAFF or anti-CD4 antibodies dramatically reduced the number of splenic EYFP+B220- LLPC. Anti-CD20 treatment also promoted the differentiation of LLPC in the spleen in the lupus prone NZB/W model, while a treatment combining anti-CD20 with anti-BAFF induced a marked reduction in total splenic PC numbers. These results suggest that the process of PC maturation upon anti-CD20 treatment is a general mechanism and that interfering with anti-BAFF antibody at the time of B-cell depletion might greatly improve the response rate in auto-immune disease.

Introdução: O fragmento C4d e os anticorpos anti-HLA doador específicos (DSA) são marcadores de resposta humoral em enxertos renais com rejeição, mas o papel das células B nesse processo ainda não é claro. Neste estudo foi avaliada a correlação entre C4d, DSA e células B de enxertos com disfunção e sua associação com aspectos morfológicos, função e sobrevida do rim transplantado. Material e Métodos: A marcação para C4d, células B CD20+ e plasmócitos CD138+ foi realizada por imunoperoxidase em biópsias por indicação de 110 receptores de transplante renal. Positividade para CD20 e CD138 foi definida por curva ROC (≥5 céls./mm2). O soro coletado concomitante a biópsia foi testado para DSA classe I e classe II. Estes marcadores foram correlacionados com dados clínicos e do transplante, a histopatologia de Banff e a evolução do rim transplantado. Resultados: Depósitos de C4d e DSA circulantes foram detectados em 100% e 70% dos pacientes com rejeição mediada por anticorpos (RMA) respectivamente, e nos casos de rejeição aguda celular (RAC) em 42% (p<0,001, vs. RMA) e 28% (p=0,003, vs. RMA). Estes dois marcadores correlacionaram-se positivamente (r=0,31, p=0,016). Houve correlação significativa entre DSA e plasmócitos CD138+ (r=0.32 p=0,006), mas as células CD20 e CD138 não se correlacionaram entre si. As células CD138+ predominaram na RMA, associadas com maior painel pré-transplante e DSA, mas não a C4d, e as células CD20+ predominaram na RAC e nas biópsias com fibrose intersticial/atrofia tubular, associadas a maior incompatibilidade HLA e a retransplantes. Pacientes com C4d+ tiveram pior função e sobrevida do enxerto em três anos de transplante, e aqueles com DSA+ uma pior 7 sobrevida do enxerto. Positividade para CD20 ou CD138 não foi preditiva da função ou sobrevida do enxerto. Na análise multivariada, somente o C4d foi fator de risco para perda do enxerto. Conclusões: Esses resultados confirmam o valor prognóstico do C4d e dos DSA para uma pior evolução do enxerto renal, e sugerem uma associação das células B CD20+ com parâmetros de rejeição celular e dos plasmócitos CD138+ com marcadores de resposta humoral. Entretanto, nesse estudo o infiltrado de células B na biópsia do enxerto não foi preditivo de uma pior evolução do rim transplantado. / Introduction: The fragment C4d and the donor specific anti-HLA antibodies (DSA) are markers of the humoral response in rejecting kidney grafts, but the role of B cells in this process is still unclear. In this study we evaluated the correlation between C4d, DSA and B cells in dysfunctional grafts, and their association with morphological features, and graft function and survival. Material and Methods: The staining for C4d, CD20+ B cells and CD138+ plasmocytes were done by immunoperoxidase in 110 kidney graft biopsies for cause. Positivity for CD20 and CD138 were established by ROC curve (≥5 cells/mm2). Serum collected at biopsy were tested for anti-HLA class I and II antibodies. These markers were correlated with clinical and transplant characteristics, Banff histopathology and graft outcomes. Results: C4d deposits and circulating DSA were detected in 100% and 70% of the patients with antibody-mediated rejection (AMR) respectively, and in cases with acute cellular rejection (ACR) in 42% (p<0.001, vs. AMR) and 28% (p=0.003, vs. AMR), respectively. Both markers were positively correlated (r=0.31, p=0.016), and there was also a significant correlation between DSA and plasmocytes CD138+ (r=0.32 p=0.006). CD20 and C138 cells were not siginificantly correlated. Plasmocytes CD138+ predominated in AMR, and were associated with higher pre transplant PRA and DSA positivity, but not with C4d. CD20+ B cells were highly expressed in ACR and in biopsies with interstitial fibrosis and tubular atrophy, in association with more HLA mismatches and re-transplants. Patients with C4d had poorer graft function and survival, and those 9 with DSA + also had a worse graft survival in three years of transplant. CD20 or CD138 cells were not predictive of graft outcomes. In multivariated analysis, only C4d remained a risk factor for graft loss. Conclusion: These results confirm the prognostic value of C4d and circulating DSA for a worse kidney graft outcome, and suggest an association of CD20+ B cells with parameters of cellular rejection whereas CD138+ plasmocytes correlated with markers of the humoral response. However, in this study the B cell infiltrate in graft biopsy was not predictive of adverse outcomes to the transplanted kidney.

Le myélome multiple (MM) est caractérisé par une accumulation de plasmocytes tumoraux dans la moelle osseuse. Les cellules de MM (MMC) présentent de nombreuses anomalies cytogénétiques qui ne sont pas suffisantes pour induire la survie et la croissance de ces cellules qui sont dépendantes de l'environnement médullaire. Ce microenvironnement expriment des molécules d'adhésion et synthétisent des cytokines indispensables à la croissance du clone myélomateux. Dix principales familles de facteurs de croissance sont identifiées dans le MM (MGF) mais leur rôle respectif dans cette pathologie n'est pas établi. Ces facteurs de croissance sont produits soit par l'environnement tumoral ou soit par les cellules elle-même. La multiplicité de ces facteurs de croissance rend difficile la compréhension de la biologie du MM et l'émergence du clone tumoral in vivo. L'étude sur la coopération des 5 MGF les plus documentés nous a permis d'identifier l'IGF-1 comme un facteur de croissance majeur du MM : un inhibiteur d'IGF-1R bloque la croissance de 7/8 lignées de MM (HMCL) et la boucle autocrine de l'IGF-1 essentielle à l'activité de croissance de l'IL-6, d'HB-EGF et d'HGF. De plus, nous avons identifié que la présence d'IGF-1R (présent dans 44% des MMC) était un facteur de mauvais pronostic. L'IL-6 qui est le deuxième MGF majeur induit la croissance de 7/8 lignées. L'IL-6R, exprimé dans toutes les MMC, est aussi un facteur de mauvais pronostic quand il a une fortement exprimé dans les MMC de patients. Par la suite, nous avons étudié l'effet de l'insuline, cytokine de forte homologie avec l'IGF-1. Nous avons montré que l'insuline avait le même effet que l'IGF-1. Son activité nécessite l'activation d'IGF-1R qui est transduit par la présence du récepteur hétérodimère IGF-1R/INSR (hybrid-R) à la surface des MMC. L'insuline ne pouvant pas activer l'homodimère IGF-1R à des concentrations physiologiques, ce qui montre que l'hybrid-R confère à l'insuline la capacité à activer l'IGF-1R donc de devenir un MGF. Un inhibiteur ciblant l'IGF-1R mais également l'Hybrid-R en association avec un anti-IL-6 semblerait donc être un traitement prometteur dans la pathologie du MM pour les 44% des patients exprimant l'IGF-1R.

La réponse humorale à immunoglobulines A (IgA) constitue un des principaux mécanismes immunologiques permettant de maintenir l'homéostasie intestinale. L'initiation de la réponse IgA se déroule dans les tissus lymphoides associés à l'intestin, où la reconnaissance des antigènes intestinaux entraine l'activation des lymphocytes B naïfs, la commutation isotypique vers IgA et leur différenciation en plasmocytes. Mon travail de thèse a consisté à étudier la contribution du foie et des cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dans la réponse IgA intestinale. L'utilisation de deux modèles murins permettant la déplétion sélective des pDC nous a permis de démontrer que, en dépit de données publiées montrant leur capacité à engager la réponse IgA in vitro, les pDC ne sont pas nécessaires in vivo pour l'induction ou le maintien de la réponse IgA homéostatique. Nous montrons ensuite que le foie abrite une population importante de plasmocytes à IgA. Chez la souris, nous montrons que ces cellules possèdent des caractéristiques phénotypiques distinctes des plasmocytes de l'intestin et proviennent de lymphocytes B récemment activés dans les plaques de Peyer. A l'homéostasie, ces plasmocytes hépatiques secrètent des IgA dirigées contre les bactéries de la flore intestinale. Enfin, dans un modèle murin de consommation chronique d'alcool, nous montrons une corrélation entre une augmentation de cette population cellulaire, une élévation sérique des IgA et des dépôts d'IgA hépatiques, deux désordres fréquemment observés chez les patients atteints d hépatopathies alcooliques. Nos données indiquent donc que le foie constitue un site effecteur alternatif de la réponse / IgA humoral response is one of the main mechanisms by which immune homeostasis is maintained in the intestine. The IgA response is initiated in gut-associated lymphoid tissues, where recognition of intestinal antigens drives naïve B cell activation, IgA class-switch recombination and plasma cell differentiation. My thesis work addressed the contribution of the liver and plasmacytoid dendritic cells (pDCs) in intestinal IgA response. By using two complementary mouse models allowing for selective depletion of pDCs, we have demonstrated that, in contrast to published work showing their ability to drive IgA response in vitro, pDCs are dispensable in vivo for the induction and the maintenance of homeostatic intestinal IgA responses.Then, we showed that the liver contains an important population of IgA plasma cells. In mice, we demonstrated that these cells harbor distinct phenotypic characteristics in comparison to intestinal IgA plasma cells, and are derived from B cells recently activated in Peyer’s patches. At homeostasis, hepatic IgA plasma cells secrete IgA directed against bacteria from intestinal flora. Finally, in a mouse model of chronic ethanol consumption, we found a correlation between an increase in hepatic igA plasma cell population, elevation of serum iGA and IgA deposits in liver sinusoids, two disorders frequently observed in alcoholic liver disease patients. Thus, our results indicate that the liver constitutes an alternative effector site for IgA response initiated in the intestine