Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_railson_schreinert_dos_santos.pdf: 1331296 bytes, checksum: 2121f264ff3310f6f460595517aafdab (MD5) Previous issue date: 2012-07-27 / Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important cereals in the world being cultivated in lowland ecosystems, which have a common characteristic: lack of drainage conditions. The lack of oxygen, due to submergence of seedlings, and iron toxicity are two of the major abiotic stresses which rice plants are subjected. Recently it was realized the importance of some ethylene responsive transcription factors (ERFs) in plant response to different stresses, especially to oxygen depletion. Considering it, two studies were made in order to evaluate the expression of ERFs under different stresses. In a first study seven genes were selected, based on previous results obtained from Genevestigator analysis, and had their transcriptional expression evaluated trough quantitative PCR (qPCR) in rice seedlings under oxygen depletion and iron overload. In the second study thirteen ERFs, which had no information available in the literature, also had their transcriptional levels evaluated in seedlings under conditions of hypoxia and anoxia through qPCR in a cultivar susceptible to flooding (Bonança) and a tolerant one (Nipponbare). As general conclusions it was once more emphasized the importance of ERF genes on plant response to environmental stresses. The specific function of each of these genes is yet to be studied. In silico analysis suggests the methylation of promoters as a possible way to regulate them. More studies about the function of these ERFs and about the role of methylation in plant stress response should be done. / O arroz (Oryza sativa L.) é um dos cereais mais importantes no mundo, sendo muito cultivado em ecossistemas de várzea, os quais apresentam uma característica comum: condições de deficiência de drenagem. A falta de oxigênio, devido à submergência das plântulas, e a toxidez por excesso de ferro são dois dos maiores estresses abióticos dentre os quais as plantas de arroz são submetidas. Recentemente percebeu-se a importância de alguns fatores de transcrição responsivos ao etileno (ERFs) na resposta vegetal à diferentes estresses, em especial à deficiência de oxigênio. Considerando-se o exposto efetuaram-se basicamente dois estudos visando avaliar a expressão de ERFs em diferentes estresses. Em um primeiro estudo sete genes foram selecionados a partir de resultados anteriores obtidos de análise no Genevestigator e estes tiveram sua expressão transcricional avaliada por PCR quantitativa (qPCR) em plântulas de arroz sob deficiência de oxigênio e excesso de ferro. No segundo estudo treze ERFs, os quais não apresentavam informações disponíveis na literatura, também tiveram seus níveis de expressão transcricional avaliados em plântulas sob condições de estresse por hipoxia e anoxia, também através de qPCR em uma cv. sensível à inundação (Bonança) e uma tolerante (Nipponbare). Como conclusões gerais se ressalta, novamente, a importância dos ERFs na resposta vegetal frente a estresses ambientais. A função específica de cada um destes genes ainda necessita ser estudada. Uma análise in silico nos promotores destes genes indica a metilação como possível forma de regulação transcricional. Mais estudos sobre a função destes ERFs e sobre o papel da metilação na resposta de arroz a estresses deverão ser feitas.

A cana-de-açúcar possui uma característica única entre as plantas de interesse econômico mundial: a capacidade de acumular altos níveis de sacarose no colmo. No Brasil, em virtude do aumento da demanda interna e mundial por fontes energéticas renováveis, é nítida a expansão da cultura canavieira para regiões menos propícias para cultivo, como as regiões secas do centro-oeste brasileiro. O déficit hídrico é um dos principais agentes que afetam o desenvolvimento das plantas e a obtenção de variedades melhor adaptadas é fundamental para a sustentabilidade e expansão da agroindústria canavieira. Neste sentido, genes regulados por seca são alvos importantes para a obtenção de plantas transgênicas mais tolerantes ao estresse. Como a expressão constitutiva do transgene pode causar efeitos indesejáveis nas plantas transgênicas, também é necessária a identificação de promotores induzíveis pelo estímulo ambiental. O objetivo deste trabalho é a identificação de genes e sequências promotoras reguladas pela seca em cana-de-açúcar que, além de contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância ao estresse, podem ser utilizados como alvos para obtenção de plantas transgênicas mais resistentes. Para a identificação de genes diferencialmente regulados por seca, utilizamos diferentes plataformas de microarranjo: SUCAST (com 1.830 genes relacionados à transdução de sinal), SUCAMET (com 4.594 genes relacionados a metabolismo) e CaneRegNet (com sondas para a identificação de transcritos senso e antisenso que correspondem a 14.522 genes únicos). Nestas plataformas, analisamos a expressão dos genes de quatro variedades de cana-de-açúcar, duas tolerantes e duas sensíveis à seca, submetidas a 24, 72 e 120 h de déficit hídrico. Dos genes diferencialmente expressos (alguns identificados como transcritos pelas fitas senso e/ou antisenso), 53 foram selecionados para validação por PCR em tempo real. As regiões promotoras de quatro dos genes selecionados foram identificadas por meio das técnicas de andamento cromossômico, de seleção e sequenciamento de cromossomos artificiais de bactéria contendo DNA de cana-de-açúcar e de análise de contigs obtidos por Whole Genome Shotgun. Sete sequências promotoras foram selecionadas e clonadas em um vetor contendo o gene repórter gus. As atividades promotoras destas sequências foram testadas e verificadas em transformações transientes de calos embriogênicos de cana-deaçúcar. Para obtenção de plantas de cana-de-açúcar transgênicas, selecionamos o gene induzido por seca que codifica uma PP2C. Através da transformação de calos embriogênicos de cana-de- açúcar com vetor de silenciamento de pp2c, obtivemos algumas plantas com expressão de pp2c reduzida. O transcriptoma das plantas transgênicas foi avaliado. Em comparação com plantas controles e em condições normais de irrigação, identificamos 352 transcritos com expressão alterada. As plantas transgênicas com pp2c silenciado e plantas controles também foram estudadas num experimento de supressão de rega. Os dados fisiológicos e as observações morfológicas demonstraram que um dos eventos transgênicos apresentou tolerância à seca. A comparação do transcriptoma das plantas irrigadas contra as submetidas à seca e da planta tolerante contra não tolerantes ao estresse mostrou que diversos genes estavam diferencialmente regulados, inclusive aqueles envolvidos na sinalização por ABA, via no qual o gene pp2c atua. / Sugarcane has a unique characteristic among crop plants in the world: the ability to accumulate high levels of sucrose in its stems. In Brazil, due to the local and global increasing demand for renewable energy sources, it is notable the expansion of sugarcane cultivation to areas less favorable for cultivation, such as the dry regions of central-western Brazil. Water deficit is one of the main agents that affect plant development. The production of better varieties is critical to the sustainability and expansion of the sugarcane industry. In this way, genes regulated by drought are important targets for obtaining transgenic plants tolerant to stress. Since transgene constitutive expression may cause unwanted effects in transgenic plants, it is also important to identify of stress inducible promoters. The goal of this work is the identification of genes and promoters regulated by drought in sugarcane that, in addition to contributing to the understanding of the mechanisms involved in stress tolerance, can be used as targets for the production of transgenic plants more resistant to water stress. For the identification of genes differentially expressed in response to drought, we have used different microarray platforms: SUCAST (contains 1,830 genes related to signal transduction), SUCAMET (contains 4,594 genes related to metabolism) and CaneRegNet (contains probes for the identification of sense and antisense transcripts that correspond to 14,522 unique genes). In these platforms we analysed gene expression of four different sugarcane varieties, two tolerant and two sensitive to drought, after 24, 72 and 120 h of water deficit. From the genes differentially expressed (some transcribed by the sense and/or antisense strand), 53 were selected for qPCR validation. Promoter regions of four genes were identified by Chromosome Walking, selection and sequencing of BACs and the analyses of Whole Genome Sequencing contigs. Seven promoter sequences were selected and cloned into a vector containing the gus reporter gene. Promoter activity was tested and verified through the transient transformation of sugarcane embryogenic calli. For sugarcane transgenics production we selected the drought-induced pp2c gene. Through the transformation of sugarcane embryonic calli with a vector for pp2c silencing we obtained transformed plants with pp2c gene expression reduced. The transcriptome of transgenic plants was analysed. In comparison with control plants and in irrigated conditions, we identified 352 differentially expressed transcripts. Transgenic plants with silenced pp2c and control plants were studied in a pilot drought experiment. Physiological data and morphological observations indicated that one of the transgenic events presented tolerance to drought. The comparison between irrigated and drought plants and between tolerant and no tolerant showed that a large number of genes was differentially regulated including genes related to the ABA signaling, pathway in which pp2c acts.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / AvaliaÃÃo dos efeitos da administraÃÃo diÃria, intragÃstrica (ig) e subcutÃnea (sc) prolongada do produto hidrossolÃvel da prÃpolis verde, extraÃda em L-lisina e do aminoÃcido L-lisina ig sobre a angiogÃnese de carcinomas de bexiga e a carcinogÃnese de bexiga induzida pelo BBN (N-butil-N{4-hidroxibutil}nitrosamina) em ratas Wistar. O total de 125 ratas foi distribuÃdo inicialmente em 14 grupos: I, IIA, IIB, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII e XIII. Os grupos de I a X receberam BBN por 14 semanas em Ãgua de beber. O grupo I foi tratado com prÃpolis ig 150 mg/kg/peso, por 44 s, iniciado 30 dias antes do inÃcio do BBN. Os grupos IIA, III e VIII foram tratados com prÃpolis (150 mg/kg/peso), por 40s, vias sc e ig iniciada simultaneamente com o BBN. Na 32Âs, os animais dos grupos IV, V, VI, VII e IX, apÃs ultrassonografia, foram estratificados e realocados em 4 grupos K, L, M e N, de forma que cada grupo recebesse o mesmo nÃmero de animais sem lesÃo vesical ou com imagem tumoral pequena, mÃdia e grande. As ratas dos grupos L, M e N, foram tratadas ig com: L-lisina (300mg/kg/peso), celecoxibe (30 mg/kg/peso) e prÃpolis (300 mg/kg/peso) respectivamente, da 32 a 40Âs. Os grupos controles positivos (que receberam apenas BBN) IIB e K foram tratados com Ãgua, via sc e oral, respectivamente, por 40 s. Os grupos controles negativos XI, XII e XIII receberam nesta sequÃncia, prÃpolis (150mg/kg/peso), L-lisina (150 mg/kg/peso) e Ãgua ig por 40 semanas (s). Os grupos III e VIII foram reunidos em um Ãnico grupo, o grupo III. Os animais foram sacrificados ao final da 40Âs. A carcinogÃnese foi estudada em todos os grupos. A angiogÃnese foi avaliada nos grupos K, L, M, N III e X, pela quantificaÃÃo da densidade microvascular em hot spots, atravÃs de imunomarcaÃÃo (CD-31), utilizando-se um programa de computador. O Ãndice de carcinogÃnese (21,00) e a incidÃncia de carcinomas (20%) no grupo I, tratado com prÃpolis 30 dias antes do inÃcio do BBN, foram menores (P<005) que os do grupo controle K (39,67% e 66,67%, respectivamente). A densidade microvascular de hot spot em carcinomas de bexigas foi menor (P<0,05) tanto em ratos tratados com prÃpolis por 40 semanas (grupo III), quanto em tratados com prÃpolis da 32 a 40Âs (grupo N), quando comparada com a densidade dos carcinomas de animais que receberam apenas carcinÃgeno (grupo K). A multiplicidade de carcinomas (P= 0, 00267), o Ãndice de carcinogÃnese (P<0,05) a densidade microvascular (P<0,05) no grupo X (tratado com L-lisina) foram maiores que os do grupo controle K. Somando-se a isso, a incidÃncia de carcinomas no grupo X foi de 100% e apresentando tumores mais invasivos (p= 0, 0039) que os verificados no grupo K. O grupo que recebeu apenas L-lisina nÃo apresentou lesÃes vesicais. Isso significa que a L-lisina por si sà nÃo gera carcinomas. NÃo hà descriÃÃo de efeito promotor da L - lisina na carcinogÃnese de bexiga na literatura pesquisada. A incidÃncia de 100% de carcinomas no grupo tratado com L- lisina pode fazer desta modelo para estudo da carcinogÃnese de bexiga. Conclui-se que o produto de prÃpolis verde administrado diariamente na dose de 150 mg/kg/peso ig, diminui a incidÃncia de carcinomas quando iniciada 30 dias antes do BBN e inibe a angiogÃnese de carcinomas de bexiga na dose de 150 mg/kg/peso quando iniciada simultaneamente ou na dose de 300 mg/kg/peso apÃs a 31 semana do inÃcio de BBN. / The present study evaluated the effects of prolonged, daily intragastric (ig) or subcutaneous (sc) administration of water-soluble derivative of green propolis extracted in L-lysine and of ig administration of L-lysine upon Wistar rat bladder carcinomas angiogenesis and bladder carcinogenesis induced with BBN (N-butyl-N-[4-hydroxybutyl] nitrosamine). At baseline 125 rats were distributed in 14 groups (I, IIA, IIB, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII and XIII). Groups I through X received BBN in drinking water for 14 weeks. Group I was treated with propolis ig (150 mg/kg body weight) during 44 weeks beginning 30 days before challenge with BBN. Groups IIA, III and VIII were treated for 40 weeks with propolis (150 mg/kg) sc and ig initiated concurrently with BBN. By the 32nd week, the animals in Groups IV, V, VI, VII and IX were ultrasound-scanned, stratified and reallocated into 4 groups (K, L, M and N) so that the groups contained the same number of animals with small, medium and large tumors or without lesions. Groups L, M and N were treated with L-lysine ig (300mg/kg), celecoxib (30 mg/kg) and propolis (300 mg/kg), respectively, from the 32nd to the 40th week. Groups IIB and K (positive control groups receiving BBN only) were treated with water sc and orally, respectively, during 40 weeks. Groups XI, XII and XIII (negative control groups) received propolis (150mg/kg), L-lysine (150 mg/kg) and water ig, respectively, for 40 weeks. Groups III and VIII were merged into a single group (Group III). The animals were euthanized after 40 weeks. Carcinogenesis was studied in all groups. Angiogenesis was evaluated for Groups K, L, M, N, III and X using quantifying microvascular density of hot spots in histological sections stained with the marker CD-31 and analyzed with specific software. The carcinogenesis index (21.00) and the carcinoma incidence (20%) in Group I (treated with propolis 30 days prior to challenge with BBN) were smaller (p<0.05) than for Group K (control; 39.67 and 66.67%, respectively). The microvascular density of bladder carcinoma hot spots was smaller (p<0.05) for rats treated with propolis for 40 weeks (Group III) and rats treated with propolis from the 32nd to the 40th week (Group N) than for rats receiving BBN only (Group K). Carcinoma multiplicity (p=0.00267), carcinogenesis index (p<0.05) and microvascular density (p<0.05) were greater for Group X (treated with L-lysine) than for group K. In addition, the carcinoma incidence in Group X was 100%, and tumors were more invasive (p=0.0039) than in Group K. The group receiving only L-lysine presented no vesical lesions, indicating that L-lysine in itself does not generate carcinomas. Our review of the literature identified no reports of L-lysine acting as a promoter of bladder carcinogenesis. However, the 100% carcinoma incidence observed in the group treated with L-lysine suggests the amino acid may serve as a model for the study of carcinogenesis. In conclusion, daily ig administration of water-soluble derivative of green propolis at 150 mg/kg body weight reduced the incidence of carcinoma when initiated 30 days prior to challenge with BBN, and inhibited angiogenesis in bladder carcinoma at 150 mg/kg when initiated concurrently with BBN or when administered at 300 mg/kg after 31a week of the initiate BBN.

O presente estudo buscou avaliar os efeitos dos Mananoligossacarídeos (MOS) como aditivo alimentar no desempenho de primíparas suínas em final de gestação e em lactação, bem como no desempenho e na saúde dos leitões até os 65 dias de idade. O experimento foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Suínos (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga SP. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial de tratamentos, sendo um fator o fornecimento dos MOS para fêmeas e o segundo para os leitões. Foram utilizadas 17 primíparas prenhes, tratadas a partir de 81 &plusmn;1,36 dias de gestação com 0,2% de MOS na dieta. Aos 82 &plusmn; 1,36 dias de gestação as fêmeas foram submetidas à coleta de sangue e à vacinação contra rinite atrófica progressiva, sendo pesadas quinzenalmente até a transferência para a maternidade, aos 109 &plusmn; 1,36 dias de gestação. Na segunda quinzena as fêmeas tratadas apresentaram uma vantagem numérica no ganho de peso médio diário (P=0,063). Durante o parto foram colhidas amostras de sangue e colostro para titulação de anticorpos contra o antígeno vacinal, sendo consideradas positivas 66,67% das fêmeas MOS e 42,86% das fêmeas controle. Os leitões aleitados por fêmeas tratadas tiveram um maior ganho numérico de peso na primeira semana (p=0,0614), significativo na segunda semana (p=0,047). Na terceira semana foi introduzido o segundo fator através do oferecimento de alimento sólido (0,4% de MOS). No período total, do nascimento aos 21 dias, foi observada uma vantagem numérica (p=0,0989) no ganho de peso a favor dos leitões de fêmeas MOS. As fêmeas, contudo, não diferiram quanto à variação de peso ou consumo durante a fase de lactação. Aos 23 &plusmn; 1,91 dias de idade dos leitões foi realizado o desmame abrupto com a transferência dos leitões para unidade de creche, onde foram alojados em gaiolas para 4 animais. O peso ao desmame foi maior nos leitões aleitados por fêmeas tratadas (p<0,0001), bem como em todas as pesagens semanais até a quinta semana pós-desmame. O consumo na primeira semana sofreu influência da suplementação de MOS nas fêmeas e do maior peso à desmama se mostrando superior nesses animais (P=0,049) influenciando diretamente o ganho de peso, superior na segunda semana (p=0,002). O MOS para os leitões aumentou o consumo de alimento (p=0,0784), e a conversão alimentar na segunda semana (p=0,0103). Aos 14 dias pós-desmame foram colhidas amostras de sangue para hemograma e realizada a aplicação oral de 108 UFC de Salmonella Typhimurium. Foram observadas diariamente a consistência das fezes por 28 dias e aferidas as temperaturas retais por 9 dias. Leitões tratados com MOS e os leitões oriundos de fêmeas MOS tenderam a apresentar o pico de hipertermia mais cedo que os demais (p=0,0629 e p=0,0976, respectivamente) e os leitões alimentados com MOS tenderam a ter uma temperatura de pico mais baixa (p=0,0989). Na última semana os leitões de fêmeas MOS apresentaram um maior consumo (p=0,0007) e uma incidência de Salmonella numéricamente inferior em linfonodos mesentéricos e nas fezes colhidas aos 36 dias pós-desafio. Pode-se concluir que a suplementação de MOS para primíparas prenhes e lactentes pode melhorar o desempenho e a saúde entérica de seus leitões nas fases de aleitamento e creche. / The present study evaluated the effects of mananoligossacarides (MOS) as a feed additive on the performance of primiparous sows in late gestation and lactation, as well as on performance and health status of their progeny up to 65 days of age. The experiment was conducted in the Laboratory of Swine Research (FMVZ/USP) Pirassununga SP. For this purpose a completely random factorial design was used, factors which corresponded to (1) feeding sows with MOS and (2) feeding piglets with MOS, characterizing 4 treatments: MM Feeding MOS to both sows and piglets, MC Feeding MOS only to the sows, CM Feeding MOS only to piglets, CC Control diets for both sows and piglets. A total of seventeen pregnant gilts were used, and divided into 2 groups: MOS (n=9) and Control (n=8). MOS gilts had 0,1% MOS added to their diets from 81 &plusmn; 1,36 days of gestation onward. On day 82 &plusmn; 1,36 blood was collected and vaccination against Progressive Atrophic Rhinitis was conducted. Animals were weighted biweekly until 109 &plusmn; 1,36 days of gestation, when transference to the farrowing unit was conducted. Between the first and second weighing, MOS gilts show a numerical advantage in daily weight gain (p=0,063). At farrowing, blood and colostrum samples were collected for determination antibodies titles against vaccine antigen, being considered positive 66,67% and 42,86% of MOS and Control sows, respectively. Piglets nursed by MOS sows had a numerical advantage in weight gain in the first week (p=0,0614), with statistical significance in the second week (p=0,047). On the third week, the second factor was introduced by the offering of solid feed (0,4% MOS). During the suckling period, from birth to 21 days of age, a numerical advantage in weight gain was observed for MOS sows piglets (p=0,0989). The sows themselves did not differ in weight change or feed consumption. At 23 &plusmn; 1,91 days of age, weaning was conducted, as piglets were transferred to nursing facilities and allocated in pens of 4 animals. Weight of MOS sows piglets was higher at weaning (p<0,001) and until the 5th week port-weaning. Feed consumption was affected by MOS supplementation of sows and by the higher weaning weight (p=0,0049), directly influencing weight gain, which was superior in the 2nd week. Feeding MOS to piglets enhanced feed consumption (p=0,0784) and feed conversion (p=0,0103) on the 2nd week. At 14 days of age, blood samples were collected for hemogram analysis and an oral dose of 108 CFU of Salmonella Typhimurium administered. Fecal consistency and rectal temperature were evaluated for 28 and 9 days, respectively. Piglets treated with MOS and MOS sows\' piglets tended to show a peek of hyperthermia earlier (p=0,0629 e p=0,0976, respectively). Piglets fed with MOS tended to show a lower temperature peek (p=0.0989). In the last week, MOS sows\' piglets show a higher feed consumption (p=0.0007) and a numerically inferior Salmonella incidence in mesenteric lymph nodes and feces 36 days after the bacterial challenge. In conclusion, supplementing primiparous sows with MOS during gestation and lactation can enhance their body weight gain and the performance and intestinal health of the offspring during the suckling and nursing period.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-13T14:30:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 392257 bytes, checksum: cedbde0495c381e0793f30277cca03c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-13T14:30:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 392257 bytes, checksum: cedbde0495c381e0793f30277cca03c4 (MD5) Previous issue date: 2001-09-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os genes Penicillium região pgg1 e pgg2, griseoroseum, codificadora do que codificam poligalacturonases foram clonados e gene pgg1 possui caracterizados. 1251 pares de em A bases (pb) e é interrompida por íntrons de 55 e 67 pb, posicionados por comparação com a seqüência do cDNA correspondente. Uma proteína de 376 aminoácidos (aas) foi obtida da tradução deste gene com e apresenta massa um molecular potencial e pI sítio estimados de em glicosilação 38,4 KDa (Asn 307 ), e 5,31, respectivamente. O gene pgg2, de 1165 pb, também é interrompido por dois íntrons de 58 pb. Os íntrons de pgg1 e pgg2 apresentam posições conservadas, embora o mesmo não tenha sido verificado com as suas seqüências. A proteína deduzida de pgg2 possui 369 aas, massa molecular 38,3 KDa, pI 8,31 e dois possíveis sítios de (Asn 300 glicosilação Asn 338 ). e A identidade entre as proteínas PGG1 e PGG2 foi de 57,5%. Análise mostrou por que hibridização do genes e os únicas no genoma gênero Penicillium pgg1 do fungo. foram DNA total de pgg2 estão Diferentes investigadas P. griseoroseum presentes espécies quanto em de à cópias fungos do presença de genes de PG em seu genoma. Os resultados revelaram que a essas espécies contêm PGs codificadas por poucos genes, ao contrário do observado possuem em Aspergillus famílias de genes niger de PG e Botrytis constituídas cinerea, por no que mínimo cinco membros. A expressão dos genes pgg1 e pgg2 foi analisada por hibridização do RNA total e pela técnica de RT-PCR. Ambos os genes são transcricionalmente regulados, porém com expressão diferenciada entre si. A expressão do gene pgg1 foi verificada apenas em 76 horas de cultivo do micélio em meio com pectina suplementado com extrato de levedura, enquanto o transcrito do gene pgg2 expressão fontes não foi de de com detectado ambos os carbono, em todos genes como também sacarose extrato de levedura. detectados apenas na presença adição extrato de levedura. pgg2 de os e tempos foi de analisada glicose, de pectina, Contudo, a em pgg1 ou foram independente expressão A outras suplementadas Transcritos de cultivo. do da gene foi reprimida somente em meio contendo glicose. A adição de extrato de levedura ao meio de cultivo contendo glicose teve um efeito positivo sobre a expressão de pgg2, embora um nível maior de expressão tenha sido verificado na presença de sacarose e pectina. As regiões 5’ terminais dos genes pgg1 e pgg2 foram sequenciadas para caracterizar cis-elementos e analisar a interação com proteínas reguladoras. Ensaios de migração retardada em gel foram realizadas para comprovar a funcionalidade de alguns cis-elementos. Extratos a a protéicos nucleares foram diferentes proteína preparados fontes foi reguladora de carbono. visualizada do gene de quando pgg2 micélio A crescido em meio formação de complexos fragmentos de DNA contendo os cis-elementos da com DNA- região CCAAT e TATAATTAA foram utilizados. Um possível elemento de resposta ao cAMP foi localizado na posição -757. A região reguladora do gene pgg1 possui um potencial sítio de ligação para o regulador geral CREA sobreposto ao TATA “box”, o que pode ser uma explicação para a ausência de expressão deste gene na presença de glicose. / The polygalacturonase-encoding Penicillium griseoroseum were genes cloned pgg1 and and pgg2 from characterized. The 1251-bp coding region of the pgg1 gene is interrupted by two introns of 55 and 67 bp deduced by comparison with the cDNA sequence. A potencial glycosilation nucleotide mass polypeptide sequence was 38.4 KDa of with 376 site at pgg1. and consists of 1165 bp introns. The positions amino The with a acids residues with a was predicted from protein estimated molecular Asn 307 pI of and is also of the introns 5.31. The pgg2 gene by two 58-bp interrupted were the conserved in both genes however no conservation was seen in their sequences. The pgg2 encodes a protein of 369 residues with estimated mass and pI of 38.3 glycosilation KDa sites and were 8.31, respectively. identified at Asn 300 Two and putative Asn . 338 Based on the deduced amino acid sequence, PGG1 shows 57.5% identity with PGG2. The genome pgg1 of analysis. and P. The pgg2 genes griseoroseum presence of exist as as single copies in the revealed by total DNA blot corresponding PG genes in otherPenicillium species was investigated and the results show that these enzymes are encoded by few genes. A different pattern is reported for Aspergillus niger and Botrytis cinerea where the PG gene family consists of at least five members. RT-PCR and was employed to investigate the expression of pgg1 pgg2 genes. Both genes are regulated at the transcription level, seen. although The pgg1 cultivation while in pgg2 analyzed. some differences gene was pectin Total RNA detected extracted expression after supplemented was was their expressed medium transcript in 76 with in from hours yeast all were extract, time mycelia of points grown on sucrose or glucose, with or without yeast extract. Pectin was the only condition tested that induced the expression of pgg1, even in the expressed absence under of almost yeast all pgg2-specific mRNA could medium the addition while extract. conditions be The studied. observed on yeast extract of pgg2 gene was However, no glucose-containing abolished this repressive effect. The 5’ regions of the pgg1 and pgg2 genes were sequenced in order to interaction of characterize with regulatory electrophoresis extracts were sources. cis-acting proteins mobility prepared from DNA-protein elements was shift mycelia complexes investigated assays. grown were and on their by means Crude nuclear different carbon visualized when DNA fragments containing CCAAT and TATAATTAA were used. A putative cAMP response element translation initiation pgg1 has gene a was site. potential detected The 5’ at –766 upstream binding site from sequence for the the of the global repressor CREA which overlaps the TATA box. This could explain the repressive effect of glucose on pgg1 expression. Only few cis-acting elements are shared by the and this could justify the pgg1 and pgg2 promoters differential expression of the polygalacturonase-encoding genes from P. griseoroseum.

BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

En esta tesis se estudia la adsorción de los ácidos oleico y cis-3-hexenoico sobre las superficie Ni(111) y PtNi(111) mediante el método semiempírico de Hückel extendido implementado con el programa de Superposición Atómica y Deslocalización Electrónica (ASED) y el método de primeros principios basado en la teoría del funcional de la densidad (DFT) utilizando el programa de cálculo Viena Ab-initio Simulation Package (VASP). Se establecen las características estructurales en el proceso de adsorción de los ácidos monoinsaturados oleico y cis-hexenoico sobre catalizadores de Ni(111) y bimetálicos PtNi(111). Se determina la geometría de adsorción para obtener la energía mínima total y el sitio preferencial de adsorción. Se estudia la rotura de enlaces y se analiza la estructura electrónica y el enlace químico entre las especies involucradas en el proceso de adsorción. Se estudia el efecto catalítico que produce el agregado de promotores de diferentes elementos químicos en la superficie. Se realizan estudios teóricos sobre el espectro de frecuencias de vibración del ácido adsorbido. Se realizan estudios sobre la selectividad de los enlaces COOH y C=C. Se compara la actividad catalítica de los catalizadores estudiados. / In this thesis it is presented the study of the oleic and cis-3-hexenoic acids adsorption on Ni(111) and PtNi(111) surfaces through the extended semi-empirical Hückel method used within the Atomic Superposition and Electronical Delocation (ASED) program, and the first principles method based on the Density Functional Theory (DFT) using the Viena Ab-initio Simulation Package (VASP) calculation program. It is established the structural characteristics of the oleic and cis-hexenoic monounsaturated acids adsorption on Ni(111) and bimetallic PtNi(111) catalysts. The adsorption geometry is determined in order to obtain the total minimal energy and the adsorption preferential site. The bond breaking is studied and the electronic structure and the chemical bond are analyzed. It is studied the catalytic effect produced by the different chemical promoters added on the surface. Theoretical studies about the adsorbed acid vibration frequencies spectrum are developed. Studies about the COOH and C=C bonds selectivity are presented. A comparison of the catalytic activity of the studied catalysts is performed.

Conforme novas tecnologias e metodologias estão surgindo, e pesquisadores estão sedentos por ferramentas moleculares mas rápidas, mais eficientes e fáceis de usar, dominar os princípios e tecnologias do design de vetores e padronização de partes biológicas tornaram-se desafios fundamentais. Isso está abrindo espaço para o surgimento de uma disciplina inteiramente nova chamada Biologia Sintética. Esta área de estudo inovadora combina partes e módulos biológicos para criar sistemas mais confiáveis e robustos. Linhagens fúngicas são comumente alvo desses estudos, não apenas porque muitos achados fundamentais em relação à clonagem molecular surgiram das lições dadas por elas, mas também devido a um imenso e inexplorado potencial desses organismos em uma ampla gama de aplicações - desde biocombustíveis e produção de químicos finos até terapias biomédicas. Neste contexto, a presente dissertação é dividida em duas partes: a primeira diz respeito ao design e construção de uma ferramenta modular e versátil para ser aplicada em várias linhagens de fungos. Essa ferramenta é um plasmídeo binário para transformação mediada pro Agrobacterium tumefaciens, que foi construído em quatro diferentes versões contendo GFP ou mCherry como proteínas repórter e um gene sintético de resistência à higromicina como marcador de seleção. O vetor foi validado em Paracoccidioides lutzii, um patógeno oportunista humano dimórfico que é muito importante para medicina, mas ainda carecia de ferramentas genéticas eficientes. A segunda parte consiste na criação de uma biblioteca de promotores para a levedura oleaginosa Rhodosporidium toruloides, um promissor hospedeiro para a produção de bioprodutos a partir de biomassa, uma vez que pode eficientemente consumir açúcares C5 e C6 e aromáticos derivados da lignina. Vinte e nove promotores foram testados em um cassete de duplo-repórter - compreendendo ambas as proteínas fluorescentes GFP e mRuby - utilizando citometria de fluxo para análise de células únicas. A coleção de promotores apresentados neste trabalho é a maior disponível para R. toruloides até o momento e foi um avanço indispensável para superar a10 escassez de ferramentas para este organismo. Notavelmente, também apresentamos os primeiros promotores bidirecionais descritos para essa levedura e otimizamos o protocolo de transformação. Portanto, a Biologia Sintética foi eficientemente aplicada para expandir a coleção de partes biológicas padronizadas e otimizar vetores para transformação e manipulação genética de fungos. Estas ferramentas são de valor imediato e são aplicáveis a desafios muito distintos, mas igualmente importantes: a busca de novas soluções para a saúde humana e para uma economia bio-sustentável. / As new technologies and methodologies are surfacing, and researchers are now eager for fast, enhanced and easy-to-use molecular tools, mastering the principles and technologies of vector design and standardization of biological parts have become fundamental challenges. This is making room for the rise of an entirely novel discipline called Synthetic Biology. This innovative field of study combines biological parts and modules to create more reliable and robust systems. Fungal strains are commonly the target of these studies, not only because several fundamental findings regarding molecular cloning arose from lessons given by them, but also due to an immense and much unexplored potential of those organisms in a wide range of applications - ranging from biofuels and fine chemicals production to biomedical therapies. In this context, the present dissertation is divided in two parts: the first one concerns the design and construction of a modular and versatile tool to be applied in several fungal strains. This tool is a plasmid binary vector for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, which was built in four different versions containing either GFP or mCherry as reporter proteins and a synthetic hygromycin resistance gene as selection marker. The vector was validated in Paracoccidioides lutzii, a dimorphic human opportunist pathogen that is very important for health care but was still lacking efficient genetic tools. The second part consists in the creation of a promoter library for the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides, a promising host for the production of bioproducts from biomass since it can efficiently consume C5 and C6 sugars and lignin-derived aromatics. Twenty-nine promoters were tested with a dual-reporter cassette - comprising both GFP and mRuby fluorescent proteins - using flow cytometer for single-cell analysis. The assortment of promoters presented in this work is the largest set available for R. toruloides until now and was an imperative advancement to overcome the scarcity of tools for this organism. Remarkably, we also presented the first bidirectional promoters described for this yeast and optimized the transformation protocol. Thus, we efficiently applied Synthetic Biology to expand the collection of standard biological parts and to12 optimize vectors for fungal transformation and genetic manipulation. These tools are of immediate value and are applicable for very distinct but equally important challenges: the pursuit of new solutions for human health and for a sustainable biobased economy

O emprego de novas tecnologias, como a transgenia, associadas ao melhoramento convencional de cana-de-açúcar apresenta grande potencial no combate a pragas e desenvolvimento de novas variedades. Entretanto, a falta de especificidade na expressão temporal e/ou local dos genes introduzidos tem se mostrado um fator limitante para o sucesso de produtos derivados da transgenia. Os promotores das metalotioneínas, por exemplo, podem representar uma alternativa ao uso de promotores constitutivos, particularmente, aqueles de metalotioneínas do tipo 1 (MT1) por apresentarem níveis elevados de expressão, em diferentes tecidos/órgãos e serem responsivos a estresses bióticos e abióticos. O uso de promotores sintéticos, contendo apenas elementos-cis, como GCG-like, W boxes e JERE, tem sido relevante por induzirem a expressão gênica local em resposta ao ataque de agentes bióticos. Este trabalho teve por objetivo a caracterização funcional de promotores de genes de metalotioneínas de cana-de-açúcar e o uso de elementos regulatórios sintéticos e, em paralelo, avaliou-se o uso de promotores sintéticos no controle da expressão gênica em cana-de-açúcar. Após as análises de expressão transiente, verificou-se que o promotor SoMT1b apresentou atividade GUS e GFP em epitélios de cebola e os promotores sintéticos, 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE e 4xW 4xS-box, e o promotor SoMT1b foram capazes de dirigir a expressão do gene repórter uidA (GUS) em calos embriogênicos de cana-de-açúcar. Em análise de expressão estável, o promotor SoMT1b foi capaz de dirigir a expressão do gene GUS para os frutos e sementes de tomate \'Micro-Tom\', mas não foi responsivo a estresse por herbivoria, cádmio e cobre. Também foi realizada a transformação de plantas de cana-de-açúcar, as quais ainda estão sendo analisadas. Os resultados obtidos demonstram a funcionalidade do promotor SoMT1b / New technologies, like genetic transformation, associated with conventional breeding of sugarcane have a large potential in developing new varieties tolerant to biotic and abiotic stress. However, the lack of specificity in the spatial and/or temporal expression of the introduced genes has been a limited factor for the success of products derived from transgeny. Metallothionein promoters, for instance, can represent an alternative to the use of constitutive promoters, particularly those from metallothionein type 1 (MT1) because they present high expression levels in different tissues / organs and are responsive to biotic and abiotic stress. Another alternative is the use of synthetic promoters which contain only cis elements, as GCG-like, W-box and JERE, which induces local gene expression in response to pathogen attack. In this work, we aimed to make the functional characterization of sugarcane metallothionein promoters and synthetic regulatory elements, in parallel, we evaluated the use of synthetic promoters in the control of gene expression in sugarcane. After transient expression analyzis, it was found that SoMT1b promoter was able to control the expression of the reporter genes to GUS and GFP in onion epithelium and GUS in sugarcane embryogenic calli. Additionally, synthetic promoters 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE and 4xW 4xS-box were able to direct the expression of the gene uidA (GUS) in embryogenic calli of sugarcane. In stable transformation analysis, SoMT1b promoter was capable of directing uidA expression in fruits and seeds of tomato cv. \'Micro-Tom\', but it was not responsive to herbivory, cadmium and copper stress. It was also carried out the transformation of sugarcane plants with the construction containing the SoMT1b promoter, but these are still being analyzed. The results demonstrate the functionality of the SoMT1b promoter in sugarcane and tomato

O emprego de novas tecnologias, como a transgenia, associadas ao melhoramento convencional de cana-de-açúcar apresenta grande potencial no combate a pragas e desenvolvimento de novas variedades. Entretanto, a falta de especificidade na expressão temporal e/ou local dos genes introduzidos tem se mostrado um fator limitante para o sucesso de produtos derivados da transgenia. Os promotores das metalotioneínas, por exemplo, podem representar uma alternativa ao uso de promotores constitutivos, particularmente, aqueles de metalotioneínas do tipo 1 (MT1) por apresentarem níveis elevados de expressão, em diferentes tecidos/órgãos e serem responsivos a estresses bióticos e abióticos. O uso de promotores sintéticos, contendo apenas elementos-cis, como GCG-like, W boxes e JERE, tem sido relevante por induzirem a expressão gênica local em resposta ao ataque de agentes bióticos. Este trabalho teve por objetivo a caracterização funcional de promotores de genes de metalotioneínas de cana-de-açúcar e o uso de elementos regulatórios sintéticos e, em paralelo, avaliou-se o uso de promotores sintéticos no controle da expressão gênica em cana-de-açúcar. Após as análises de expressão transiente, verificou-se que o promotor SoMT1b apresentou atividade GUS e GFP em epitélios de cebola e os promotores sintéticos, 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE e 4xW 4xS-box, e o promotor SoMT1b foram capazes de dirigir a expressão do gene repórter uidA (GUS) em calos embriogênicos de cana-de-açúcar. Em análise de expressão estável, o promotor SoMT1b foi capaz de dirigir a expressão do gene GUS para os frutos e sementes de tomate \'Micro-Tom\', mas não foi responsivo a estresse por herbivoria, cádmio e cobre. Também foi realizada a transformação de plantas de cana-de-açúcar, as quais ainda estão sendo analisadas. Os resultados obtidos demonstram a funcionalidade do promotor SoMT1b / New technologies, like genetic transformation, associated with conventional breeding of sugarcane have a large potential in developing new varieties tolerant to biotic and abiotic stress. However, the lack of specificity in the spatial and/or temporal expression of the introduced genes has been a limited factor for the success of products derived from transgeny. Metallothionein promoters, for instance, can represent an alternative to the use of constitutive promoters, particularly those from metallothionein type 1 (MT1) because they present high expression levels in different tissues / organs and are responsive to biotic and abiotic stress. Another alternative is the use of synthetic promoters which contain only cis elements, as GCG-like, W-box and JERE, which induces local gene expression in response to pathogen attack. In this work, we aimed to make the functional characterization of sugarcane metallothionein promoters and synthetic regulatory elements, in parallel, we evaluated the use of synthetic promoters in the control of gene expression in sugarcane. After transient expression analyzis, it was found that SoMT1b promoter was able to control the expression of the reporter genes to GUS and GFP in onion epithelium and GUS in sugarcane embryogenic calli. Additionally, synthetic promoters 4X Wbox, 4X GCC-like, 4X JERE and 4xW 4xS-box were able to direct the expression of the gene uidA (GUS) in embryogenic calli of sugarcane. In stable transformation analysis, SoMT1b promoter was capable of directing uidA expression in fruits and seeds of tomato cv. \'Micro-Tom\', but it was not responsive to herbivory, cadmium and copper stress. It was also carried out the transformation of sugarcane plants with the construction containing the SoMT1b promoter, but these are still being analyzed. The results demonstrate the functionality of the SoMT1b promoter in sugarcane and tomato