Chez Bacillus subtilis nous avons identifié un complexe protéique membranaire impliquant une protéine inconnue, YteJ, et une autre protéine membranaire, SppA, une signal peptide peptidase également impliquée dans la résistance aux peptides antibactériens de la famille des lantibiotiques. Après délétion des gènes correspondant, nous avons montré que les deux protéines sont impliquées dans cette résistance. Dans la souche ΔsppA, la surexpression ectopique de SppA a non seulement restauré la résistance, mais elle a également induit la formation de cellules allongées, un phénotype supprimé par la surexpression simultanée de YteJ. L'expression de versions tronquées de YteJ a mis en évidence le rôle inhibiteur d'un domaine spécifique de YteJ. Enfin, des études biochimiques in vitro ont confirmé que l'activité de la protéase SppA était fortement réduite par la présence de YteJ, confirmant l'hypothèse d'une inhibition par YteJ. Nos études in vivo et in vitro ont montré que YteJ, via l'un de ses domaines, agit comme régulateur négatif de l'activité protéase de SppA dans ce complexe. En conclusion, nous avons montré que le complexe SppA/YteJ est impliqué dans la résistance aux lantibiotiques à travers l’activité protéase de SppA, elle-même régulée par YteJ. / We have identified a membrane protein complex of Bacillus subtilis involving an unknown protein, YteJ, and SppA, a membrane protein first described as a signal peptide peptidase and later shown to be also involved in the resistance to antibacterial peptides of the lantibiotic family. Using deletion mutant strains, we showed that both proteins are involved in this resistance. In the ΔsppA strain, the ectopic overexpression of SppA not only restored the resistance, it also induced the formation of elongated cells, a phenotype suppressed by the simultaneous overexpression of YteJ. Furthermore, the expression of truncated versions of YteJ pinpointed the inhibitory role of a specific domain of YteJ. Finally, in vitro biochemical studies showed that SppA protease activity was strongly reduced by the presence of YteJ, supporting the hypothesis of an inhibition by YteJ. Our in vivo and in vitro studies showed that YteJ, via one of its domain, acts as a negative regulator of the protease activity of SppA in this complex. In conclusion, we have shown that SppA/YteJ complex is involved in lantibiotic resistance through the protease activity of SppA, which is regulated by YteJ.

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Die Schwammskelette der Ordnung Verongida zeichnen sich durch das Fehlen mineralischer Komponenten aus. Stattdessen bestehen sie aus Spongin, einem kollagenartigen Protein, und Chitin. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die aus solch einem Chitin-Protein-Komplex bestehenden Skelette der Schwammspezies Aplysina cavernicola und Ianthella basta aus der Ordnung Verongida untersucht. Aufgrund ihrer morphologischen Unterschiede wurde für jede Schwammart eine eigene Methode zur Isolierung der Schwammskelette entwickelt. Die isolierten Skelette konnten anschließend mit verschiedenen Methoden wie REM, ATR-FTIR-Spektroskopie und NMR-Spektroskopie charakterisiert werden. Weiterhin wurde eine Methode zur Extraktion und Analyse der in den Skeletten befindlichen Aminosäuren mittels GC-MS entwickelt. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass es sich bei Spongin um ein kollagenartiges und halogeniertes Protein handelt, welches je nach Schwammart Unterschiede in der Aminosäurezusammensetzung aufweist. Darüber hinaus gelang es zum ersten Mal das Chitin aus dem Chitin-Protein-Komplex mittels Phosphorsäure zu entfernen. Aus den gewonnenen Erkenntnissen konnte abschließend ein Modell zum Aufbau des Chitin-Protein-Komplexes in der Schwammspezies Aplysina cavernicola entwickelt werden.

L’objectif de cette thèse porte sur l’étude de la compartimentalisation cellulaire et de la prise en charge de l’uranium (U) par les protéines cytosoliques des cellules branchiales du poisson zèbre (Danio rerio, espèce modèle en toxicologie aquatique) après exposition contrastées (chronique vs. aiguë, 20 et 250 µg.L-1) par voie directe. Cette étude a nécessité le développement, l’utilisation et le couplage d’outils analytiques de pointe (SEC, IEF hors-gel, RP-UHPLC pour la séparation, ICP-SFMS, ESI-FTMS/MS pour la détection) avec comme défis majeurs la conservation des interactions non-covalentes U biomolécule et une sensibilité maximale pour travailler à des niveaux d’exposition proches de ceux rencontrés dans l’environnement. Après extraction, 24 à 32% de la charge branchiale totale en U est contenue dans le cytosol dans lequel la distribution de l’U sur les biomolécules (en fonction de leur PM mais aussi de leur pI) diffère selon le niveau d’exposition. Enfin, une cartographie des biomolécules cibles de l’U a permis (i) de mettre en évidence une affinité particulière de l’U pour les protéines à caractère acide et/ou contenant du phosphore et (ii) d’identifier 24 protéines candidates pour lier U. / The objective of this thesis is to study the cellular compartmentalization and the chelation of uranium (U) by cytosolic proteins of gill cells of the zebrafish (Danio rerio, model species in aquatic toxicology) under different direct exposure conditions (chronic vs. acute, 20 and 250 µg.L 1). This study required the development of hyphenated techniques (SEC, IEF off-gel, RP-UHPLC for the separation, ICP-SFMS, ESI-FTMS/MS for the detection) with the main challenges of maintaining the non-covalent U-biomolecule interactions and enhancing sensitivity for the analysis of environmentally relevant samples. After extraction, 24% to 32% of the total U detected in the gills were present in the cytosolic fraction, in which the U distribution on the biomolecules (as a function of their MW and pI) varied depending on the exposure level. Finally, U target biomolecules mapping allowed us (i) to highlight a particular affinity of U for acidic and/or P-containing proteins and (ii) to identify 24 protein candidates for U binding.

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Genomic DNA is the template of life - the entity which is characterized by a self-sustaining anatomical development, regulated signaling processes, the ability to reproduce and to respond to stimuli. Through what is classically known as the central dogma, the genome is transcribed into mRNA, which in turn is translated into proteins. The proteins take part in most, if not all, cellular processes, and it is by unraveling these processes that we can begin to understand life and disease-causing mechanisms. In vitro and in vivo assays are two levels at which protein communication may be studied, and which permit manipulation and control over the proteins under investigation. But in order to retrieve a representation of the processes as close to reality as possible, in situ analysis may instead be applied as a complement to the other two levels of study. In situ PLA offers the ability to survey protein activity in tissue samples and primary cell lines, at a single cell level, detecting single targets in their natural unperturbed environment.   In this thesis new developments of the in situ PLA are described, along with a new technique offering in situ enzyme-free detection of proximity between biomolecules. The dynamic range of in situ PLA has now been increased by several orders of magnitude to cover analogous ranges of protein expression; the output signals have been modified to offer a greater signal-to-noise ratio and to limit false-positive-rates while also extending the dynamic range further; simultaneous detection of multiple protein complexes is now possible; proximity-HCR is presented as a robust and inexpensive enzyme-free assay for protein complex detection. The thesis also covers descriptions on how the techniques may be simultaneously applied, also together with other techniques, for the multiple data-point acquisition required by the emerging realm of systems biology. A future perspective is presented for how much more information may be simultaneously acquired from tissue samples to describe biomolecular interactions in a new manner. This will allow new types of biomarkers and drugs to be discovered, and a new holistic understanding of life.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs à domaines transmembranaires et sont impliqués dans divers processus biologiques, ce qui en fait une cible privilégiée pour le développement de médicaments. Parmi les protéines qui régulent la signalisation des RCPG, les β-arrestines sont impliquées dans plusieurs fonctions canoniques telles que la désensibilisation, l'internalisation et le trafic des récepteurs. En outre, la β-arrestine accomplit aussi des fonctions non-canoniques en agissant comme un échafaudage pour des complexes de signalisation notamment pour la voie MAPK et ainsi favorise certaines voies de signalisation intracellulaire. La présente thèse visait à explorer des fonctions non-canoniques et de nouveaux mécanismes possibles de régulation de la β-arrestine induite par l'activation des RCPG. Le premier projet visait à mettre en évidence le mécanisme de trafic des protéines G de la membrane plasmique vers les endosomes et le rôle que joue la β-arrestine dans ce processus. Nous avons montré que la sous-unité Gαs se dissocie de la membrane plasmique indépendamment de la β-arrestine après l'activation des récepteurs, alors que le dimère Gβγ nécessite la présence de la β-arrestine. Nous avons également mis en évidence la formation d'un complexe composé du récepteur V2 de la vasopressine, de la β-arrestine et de l'hétérodimère Gβγ et que ce complexe est crucial pour la translocation des protéines G vers les endosomes. Cette étude met en évidence le rôle de la β-arrestine dans le trafic endosomal des protéines G et établit les bases pour expliquer sa contribution dans la médiation de la signalisation soutenue des protéines G dans les endosomes. Le second projet avait pour objectif d'explorer le rôle de l'ubiquitination du récepteur du glucagon (GCGR) sur sa signalisation et les fonctions de la β-arrestine. Nous avons montré que l'état d'ubiquitination de ce récepteur cause un biais de signalisation, car le GCGR déubiquitiné présente une diminution du couplage et de l'activité des protéines G alors que la liaison à la β-arrestine est augmentée. Ceci contribue à l’activation de la voie de signalisation MAPK p38 de manière dépendante de la β-arrestine 1. Nous avons également montré que le biais en faveur de la β-arrestine ne réduit pas la sécrétion d'insuline médiée par le GCGR dans les cellules β pancréatiques. Cette étude suggère que la sécrétion d’insuline dépendante du GCGR implique à la fois une signalisation dépendante des protéines G, mais aussi de la β-arrestine. Le statut d'ubiquitination du GCGR oriente la signalisation du récepteur par différents effecteurs pour réguler la sécrétion d'insuline et l'homéostasie du glucose. Le troisième projet visait à identifier de nouveaux interacteurs des β-arrestines 1/2 et à caractériser le rôle de ces interactions dans le contexte de la signalisation des RCPG. Nous avons identifié plus de 100 nouveaux interacteurs potentiels des β-arrestines 1/2 en utilisant l'approche protéomique BioID. Nous avons confirmé l'interaction de l'enzyme atypique de conjugaison de l'ubiquitine UBE2O avec les β-arrestines. Nous avons également montré que UBE2O module le trafic des β-arrestines entre la membrane plasmique et les endosomes. Cette étude ouvre de nouvelles voies pour explorer des fonctions potentielles des β-arrestines médiées par leurs liaisons à des interacteurs jusqu'alors non identifiés. Les résultats compilés dans cette thèse permettent de dresser un tableau plus étendu des mécanismes régulant les fonctions de la β-arrestine ainsi que de nouveaux rôles potentiels que cette protéine joue dans la signalisation des RCPG. La caractérisation des fonctions non-canoniques et des mécanismes de régulation de la β-arrestine est une avenue prometteuse qui pourrait mener au développement de thérapies ciblant les RCPG. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of transmembrane receptors and are involved in various biological processes, making them an interesting target for drug discovery. GPCR signaling is regulated by various proteins, including the β-arrestin family that mediate various canonical functions such as receptor desensitization, internalization, and trafficking. β-arrestin also fulfills certain non-canonical roles and has been shown to trigger intracellular signaling by acting as a scaffold for signaling complexes such as for the MAPK pathway. The present thesis aimed to explore non-canonical functions and possible novel mechanism of regulation of β-arrestin following GPCR activation. The objective of the first project was to uncover G protein trafficking mechanism from the plasma membrane to the endosomes and the role that β-arrestin plays in this process. We showed that the Gαs subunit dissociates from the plasma membrane independently of β-arrestin after receptor activation while the Gβγ dimer requires β-arrestin for its trafficking. We also revealed the formation of a complex composed of the vasopressin V2 receptor, β-arrestin, and the Gβγ heterodimer and that this complex is critical for G protein translocation to the endosomes. This study highlights the role of β-arrestin in Gβγ trafficking and lays the basis for explaining the role of β-arrestin in mediating sustained endosomal G protein signaling. The aim of the second project was to explore the role of the glucagon receptor (GCGR) ubiquitination on signaling and β-arrestin functions. We showed that the ubiquitination state of the receptor controls signaling bias as a deubiquitinated GCGR exhibits decreased G protein coupling and activity while β-arrestin binding is enhanced. Deubiquitinated GCGR signaling is also redirected to a β-arrestin 1-dependent p38 MAPK pathway. We also revealed that this β-arrestin bias does not reduce GCGR-mediated insulin secretion in pancreatic β-cells. This study suggests that GCGR-dependent insulin secretion involves both G-protein and β-arrestin-dependent signaling. The ubiquitination status of GCGR directs signaling through different effectors to regulate insulin secretion and glucose homeostasis. The third project aimed to identify novel interactors of β-arrestin 1/2 and characterize the role of these interactions in the context of GPCR signaling. We identified over 100 new β-arrestin 1/2 potential interactions using the BioID proteomic approach. We confirmed the interaction of the atypical ubiquitin conjugating enzyme UBE2O with β-arrestin by co-immunoprecipitation and by BRET. We also showed that UBE2O modulates β-arrestin trafficking between the plasma membrane and early endosomes. The results of this study open new avenues to explore novel functions and regulation mechanisms of β-arrestin mediated by their interactions with previously unidentified interactors. The findings compiled in this thesis shed light on a broader picture of the mechanisms regulating β-arrestin functions, as well as the potential novel roles this protein plays in GPCR signaling. The characterization of non-canonical functions and regulatory mechanisms of β-arrestin is an exciting avenue that could be important in the development of future therapies targeting GPCRs.

Die Muscle-RING-finger (MuRF) Proteine sind E3-Ubiquitin-Ligasen, die im Muskelgewebe den Ubiquitin-Proteasom-System abhängigen Abbau von Proteinen vermitteln. MuRF1 wird in der Muskelatrophie verstärkt synthetisiert, was zu einem gesteigerten Proteinabbau und damit zum Verlust von Muskelmasse führt. Zudem sind Mäuse, denen MuRF1 fehlt vor Muskelatrophie geschützt. E3-Ubiquitin-Ligasen fungieren oftmals in Multiproteinkomplexen. Dies wurde für MuRF-Proteine bisher nicht gezeigt. Aufgrund dessen sollten neue MuRF-Multiproteinkomplex assoziierte Faktoren mittels Hefe-Zwei-Hybrid-System und SILAC AP-MS identifiziert und deren Einfluss auf die MuRF-Funktion charakterisiert werden. Es wurden sowohl neue als auch publizierte MuRF-Interaktionspartner (Iap) gefunden. Von den neu entdeckten MuRF-Iap wurde der Fokus auf WDR42A gelegt, da das Protein mit beiden Methoden identifiziert wurde und zudem funktionell hoch interessant ist. WDR42A homologe Proteine bilden zirkuläre β-Propeller Strukturen die Multiproteinkomplexe koordinieren. Die Interaktion zwischen MuRF-Proteinen und WDR42A wurde mittels Ko-IP Experimenten und Kolokalisationsstudien bestätigt. Cycloheximid-Abbau-Experimente deuten darauf hin, dass WDR42A kein MuRF1 Substrat-Protein ist. Da die MuRF-Proteine spezifisch im Muskel hergestellt werden, sollte überprüft werden ob WDR42A ebenfalls im Muskelgewebe synthetisiert wird. Es wurde gezeigt, dass WDR42A ubiquitär sowie im Muskelgewebe und in immortalisierten Muskelzellen hergestellt wird. Analog zu MuRF1 wird WDR42A in der Denervations-induzierten Skelettmuskelatrophie und der Muskelentwicklung verstärkt synthetisiert. Die Herunterregulation von WDR42A mittels siRNA in C2C12 Myotuben schützte diese Zellen vor dem Auftreten von Atrophie. Diese Ergebnisse zeigen, dass WDR42A wie MuRF1 an der Entstehung von Muskelatrophie beteiligt ist. Aufgrund der WDR42A Domänenstruktur wird vermutet, dass WDR42A als Scaffolding-Protein MuRF1-Multiproteinkomplexe reguliert. / The muscle-RING-finger (MuRF) proteins are E3 ubiquitin ligases which coordinate the ubiquitin-proteasome system dependent protein degradation in muscle tissue. MuRF1 is up-regulated under muscle atrophy conditions. This leads to enhanced proteolysis and thereby to loss of muscle mass and strength. Furthermore are MuRF1 knockout mice resistant to muscle atrophy. E3 ubiquitin ligases often operate in multi-protein complexes. This has not been shown for MuRF proteins. Therefore we used yeast-two-hybrid and SILAC-AP-MS to identify and subsequently characterize new MuRF multi-protein complex associated proteins. We found new and also published MuRF interaction partners (Iap) with both methods. Amongst the new Iap, we focused on WDR42A, because it was found with both techniques and his interesting functional potential. WDR42A exhibits seven consecutive arranged WD40-repeat domains. This domain arrangement leads in homologues proteins to the formation of seven-bladed β-propeller structures, which act as protein interaction platforms that coordinate multi-protein complexes. The protein interaction between the MuRFs and WDR42A was confirmed with Co-IP and co-localization experiments. Cycloheximide decay experiments indicated that WDR42A is not a MuRF1 substrate protein. The MuRF proteins are muscle specific, therefore we tested if WDR42A is also synthetized in muscle tissue. We could show that WDR42A is ubiquitously, but also in muscle tissue as well as in immortalized muscle cells produced. WDR42A is similar to MuRF1 up-regulated under denervation-induced skeletal muscle atrophy as well as in muscle development. Furthermore are C2C12 myotubes resistant to muscle atrophy after siRNA down-regulation of WDR42A. These results demonstrate that WDR42A is like MuRF1 important for the development of muscle atrophy. Due to the domain structure of WDR42A, we hypothesize that WDR42A regulates MuRF1 multi protein complexes as scaffolding protein.

Hole-Burning (HB) und Fluorescence Line-Narrowing (FLN) bei 4.2 K sowie Experimente zur Temperaturabhängigkeit werden angewendet, um Energieniveaustruktur und Elektron-Phonon- Wechselwirkung im Antennenkomplex LHC II grüner Pflanzen zu untersuchen. Besondere Aufmerksamkeit gilt dabei der Vermeidung systematischer Meßfehler durch Reabsorption von Fluoreszenz oder durch Lichtstreuung und unerwünschtes Lochbrennen bei FLN-Experimenten. Durch die Auswertung von Lochspektren können erstmals drei niederenergetische elektronische Zustände bei 677.1, 678.4 und 679.8 nm nachgewiesen werden. Die inhomogene Breite der zugehörigen Absorptionsbanden beträgt etwa 4 nm. Wahrscheinlich stellt jeder dieser Zustände das tiefste Energieniveau einer Untereinheit des LHC II-Trimers dar und ist weitgehend an jeweils einem Chl a-Molekül lokalisiert. Die energetische Differenz zwischen den drei Zuständen kann durch strukturelle Heterogenität erklärt werden. Es kann nachgewiesen werden, daß die Meßergebnisse praktisch frei von Effekten durch unerwünschte Aggregation sind. Die homogene Linienbreite des energetisch tiefsten Zustandes bei 4.7 K wird vorwiegend durch phasenzerstörende Prozesse (pure dephasing) bestimmt. Die Lochbreiten innerhalb der 650 nm Absorptionsbande entsprechen Chl b-Chl a Energietransferzeiten von 1 ps und etwa 240 fs bei 4.2 K, während Lochbreiten innerhalb der 676 nm Absorptionsbande Chl a-Chl a Energietransferzeiten in der Größenordnung von 6-10 ps ergeben. In einer theoretischen Betrachtung werden die Beiträge zu Phonon-Seitenbanden bei HB und FLN separat analysiert. Auf dieser Grundlage können Ergebnisse von HB und FLN Experimenten an LHC II erstmals in einem konsistenten Modell durch schwache Elektron-Phonon-Wechselwirkung mit einem Huang-Rhys-Faktor von 0.9 und ein breites, stark asymmetrisches Ein-Phonon-Profil erklärt werden. / Spectral hole-burning (HB) is combined with fluorescence line-narrowing (FLN) experiments at 4.2 K and studies of temperature-dependent fluorescence spectra in order to investigate low-energy level structure as well as electron-phonon coupling of the LHC II antenna complex of green plants. Special attention has been paid to eliminate effects owing to reabsorption of fluorescence and to assure that the FLN spectra are virtually unaffected by hole-burning or scattering artifacts. For the first time, analysis of the 4.2 K hole spectra reveals three low-energy electronic states at 677.1, 678.4 and 679.8 nm, respectively. The inhomogeneous width of their absorption bands is approximately 4 nm. It is likely that each of these states is associated with the lowest energy state of one trimer subunit with the energetic separations being due to structural heterogeneity. It is likely that each of the low-energy states is highly localized on a single Chl a molecule of the corresponding trimer subunit. The results are shown to be virtually free from aggregation effects. The homogeneous width for the lowest state at 4.7 K is predominantly due to pure dephasing. Widths of holes burned into the 650 nm absorption band correspond to Chl b-Chl a energy transfer times of 1 ps and about 240 fs at 4.2 K while holewidths for the 676 nm absorption band lead to Chl a-Chl a energy transfer times in the 6-10 ps range. The complexities associated with the interpretation of the phonon structure in HB and FLN spectra are discussed by theoretically analyzing the different phonon sideband contributions. On this basis, 4.2 K HB and FLN data can be consistently interpreted for the first time by weak electron-phonon coupling with a Huang-Rhys factor of about 0.9 to protein phonons with a broad and strongly asymmetric one- phonon profile.

L’uranium (U) est naturellement présent à l’état de trace dans l’eau (µg.L-1), sa concentration pouvant atteindre localement quelques mg.L-1 du fait des activités anthropiques. Plusieurs études écotoxicologiques sur Danio rerio ont mis en évidence la toxicité, e.g. le stress oxydant, la génotoxicité mais aussi la reprotoxicité (i.e. moins de pontes et d’œufs pondus chez les poissons contaminés) de l’U dont les mécanismes ne sont pas connus.L’objectif de cette étude est de contribuer à la compréhension de la reprotoxicité de l’U par l’élucidation de mécanismes moléculaires perturbés après contamination. Pour cela, des investigations ont été menées sur les ovaires de poissons zèbre Danio rerio, reproduits (R) ou non (NR), après exposition par voie directe en condition de laboratoire à des concentrations représentatives d’environnements contaminés.Ce travail de thèse a été divisé en deux volets. Un premier volet analytique avait pour but la poursuite des développements de méthodes pour l’identification des complexes U-protéines en condition non dénaturante, autour du couplage de techniques de séparation (chromatographie d’exclusion stérique SEC, électrophorèse hors gel OGE) et de détection sensible par spectrométrie de masse élémentaire (ICP MS) et moléculaire (ESI MS). Le second volet a été dédié à l’étude de la reprotoxicité de l’U à l’échelle moléculaire, avec i) l’étude des complexes natifs U-protéines (approche métallomique), et ii) l’analyse différentielle de l’expression des protéines (approche protéomique).Les développements analytiques ont permis de garder le tampon physiologique et non dénaturant d’extraction pour l’étape de séparation OGE, améliorant le taux de recouvrement en U. En écotoxicologie, les principaux résultats montrent que l’ovaire est un organe accumulateur de l’U et que le statut de reproduction a une influence sur le niveau d’accumulation (R<NR). En revanche, cet état a peu d’influence sur sa distribution protéique pour laquelle 4 fractions (dont 1 principale) ont été identifiées, toutes contenant aussi du phosphore. L’identification des cibles potentielles de l’U et des protéines exprimées différentiellement (vtg, GST, GAPDH,…) a montré que les processus biologiques perturbés suite à la contamination sont de deux niveaux : 1/ générique (stress oxydant) et 2/ plus spécifique de la gonade (développement et maturation des ovocytes). En conclusion, ces deux approches complémentaires ont permis de mettre en évidence un effet direct (complexation) et indirect (expression protéique modulée) de l’U, et de proposer l’hypothèse d’un défaut de maturation des ovocytes après contamination. Ce défaut pourrait impacter le développement embryonnaire et in fine expliquer la reprotoxicité observée lors d’études écotoxicologiques précédentes. / Uranium (U) is naturally presents at trace level (µg.L-1) in aquatic environment; its concentration can increase up to a few mg.L-1 due to human activities. Several ecotoxicological studies have shown uranium toxicity in contaminated zebrafishes Danio rerio, e.g. oxidative stress, genotoxicity and reprotoxicity (i.e. lower number of spawn and eggs laid) but mechanisms are not well known.The objective of this study is to contribute to the understanding of uranium reprotoxicity by elucidating the disrupted molecular mechanisms after contamination. Therefore, investigations have been carried out on ovaries from reproduced (R) and non-reproduced (NR) zebrafishes after waterborne exposure in laboratory conditions at environmentally relevant concentrations.This project was divided into two parts. Firstly, analytical investigations were carried out to continue the development of non-denaturing methods for U-protein identification by coupling separative techniques (size exclusion chromatography SEC, off gel electrophoresis OGE) with elemental (ICP MS) and molecular (ESI MS) sensitive mass spectrometry detection. Secondly, studies of U reprotoxicity were investigated by studying i) native U-protein complexes (metallomics approach) and ii) differential analysis of protein expression (proteomics approach)Analytical developments allowed keeping the physiological and non-denaturing extraction buffer for OGE separation step, improving U recovery. In ecotoxicology, the major results showed that ovary is an U accumulating organ and that the reproduction status modifies the accumulation level (R<NR). However, this status is of little influence on its distribution on proteins with 4 fractions (including a major one) determined, all of them coeluting with phosphorus. The identification of U potential targets and of protein expression differences (vtg, GST, GAPDH…) showed that biological processes disrupted after contamination are at two levels: 1/ generic (oxidative stress) and 2/ more specific to gonad (oocyte development and maturation).As a conclusion, these two complementary approaches showed a direct (complexation) and indirect (modification of protein expression) effects of U, and enabled to hypothesize a lack of oocyte maturation after contamination. This defect could impact embryo development and in fine explain the reprotoxicity observed in previous ecotoxicological studies.