Submitted by Natalia de Souza Gonçalves (natalia.goncalves@ufpe.br) on 2016-09-23T13:38:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese - Paulo Geovani Silva Martins - 2016.pdf: 11199647 bytes, checksum: e9d2a3a59d3656debcafdd36c106889f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-23T13:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese - Paulo Geovani Silva Martins - 2016.pdf: 11199647 bytes, checksum: e9d2a3a59d3656debcafdd36c106889f (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / CAPES / A cultura da cana-de-açúcar possui importância econômica para o Brasil pela produção de açúcar e etanol. No entanto, parte da produção é ameaçada pelo ataque de insetos-praga, destacando-se a broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), que causa graves perdas econômicas. O controle biológico é alternativo ao controle químico e consiste no emprego de inimigos naturais como patógenos, que regulam a população de insetos-praga em níveis nãoprejudiciais. Dentre os patógenos destaca-se a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) que produz toxinas, codificadas pelos genes cry, no formato de cristais proteicos com atividade entomotóxica para diversas ordens de insetos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterização de novas estirpes de Bt com potencial entomotóxico para controle biológico da D. saccharalis em cana-de-açúcar. Amostras de solo coletadas possibilitaram o isolamento de 97 colônias bacterianas com características fenotípicas compatíveis para Bt. O DNA extraído foi amplificado com primers para os genes cry1, cry2 e cry9, ativos contra dípteros e lepidópteros. Em 11,4% e 12,4% dos isolados foram constatados os genes cry2 e cry9, respectivamente, e 10 destes patogenicidade variando entre 3,47% a 20,05% para D.saccharalis. Após comparação dos perfis proteômicos dos isolados Bt.Pri 4.7, Bt.Pri 4.29, Bt.CDi 1.3 e Bt.CDi 1.11, de maior e menor potencial patogênico de cada classe gênica, foram identificadas proteínas como a shikimato quinase, envolvida na produção de toxinas em Bt, e que auxiliam o entendimento da patogênese deste microorganismo. / Sugarcane production has economical importance to Brazil, especially due to production of sugar and ethanol. However, a proportion of the production is lost owing to damage of pest insects, including sugarcane borer (Diatraea saccharalis), which cause severe economical lost in the sugar/ethanol industry. Biological control, alternatively to chemical control, which cause damage to human health and environment, is based on use of natural enemies such as pathogens that regulated pest insects population to a non-prejudicial level. Among pathogens, especially bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) that produce toxins, encoding by cry genes, which are protein crystal with entomotoxicity activity for diverse insect orders. The present work aims to isolate and characterize new strains of Bt with potential entomotoxicity to biological control of D. saccharalis in sugarcane. Soil samples collected allowed the isolation of 97 bacterial colonies phenotypically compatible to Bt. DNA extracted was used in PCR reaction using primers to amplify cry1, cry2 and cry9 genes, with activity against Lepidoptera and Diptera. In 11.4 and 12.4% of the strains was observed fragments with pattern expected for cry2 and cry9 genes, respectively, and ten isolated shown pathogenicity ranging from 3.47% to 15.62% for D.saccharalis. After comparing the proteomic profiles of the isolates Bt.Pri 4.7 Bt.Pri 4.29, Bt.CDi 1.3 and Bt.CDi 1.11 of major and minor pathogenic potential of every gene class proteins were identified as shikimate kinase, involved in the production of Bt toxins, and assist the understanding of the pathogenesis of this microorganism.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-21T17:21:31Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2067440 bytes, checksum: 75097497dd06813e72e11d6ebe952eb5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-21T17:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2067440 bytes, checksum: 75097497dd06813e72e11d6ebe952eb5 (MD5) Previous issue date: 2017-10-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Estresses abióticos, como seca e salinidade, influenciam a sobrevivência das plantas. A germinação de sementes é um dos pontos críticos durante o ciclo de vida das plantas. Mecanismos de resposta a nível fisiológico e molecular são escassos para sementes de espécies arbóreas como Melanoxylon brauna. O presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos estresses hídrico e salino durante a germinação de sementes de braúna. Avaliou-se as curvas de embebição e a germinação nos potenciais de 0, -0,2, - 0,4, -0,6 e -0,8 Mpa (PEG e NaCl). Para as demais análises utilizou-se o potencial de 0,0 e -0,4 MPa, no qual foram avaliados peso fresco e comprimento do eixo embrionário, fitohormônios, peroxidação de lipídios (MDA), produção de ânion superóxido (O 2.- ) e peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), ação do sistema antioxidante, pela atividade das enzimas dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidase do ascorbato (APX) e peroxidase (POX) e análise proteômica para elucidar os mecanismos de resposta sob estresse. Para sementes do grupo controle foi possível observar padrão trifásico de embebição, maiores porcentagens de germinação e taxas de crescimento do eixo embrionário em relação aos tratamentos sob estresse hídrico e salino. Em condições salinas houve atraso do ganho de peso de sementes, reduções da germinação e do crescimento do eixo embrionário, sendo classificada como halófita. Sob estresse hídrico ocorre redução mais drástica do ganho de peso de sementes, a germinação é inibida, bem como o crescimento do eixo embrionário. Sementes de M. brauna são mais sensíveis ao estresse hídrico do que ao estresse salino. Níveis endógenos de ACC foram superiores após a germinação de sementes. Níveis endógenos de ABA, AIA e AS foram superiores em resposta ao estresse hídrico. ABA e AIA induzem um estado de quiescência sob condições de estresse hídrico. Não houve danos oxidativos pelos dados de MDA. Ocorreram reduções dos níveis de H 2 O 2 e MDA durante o tempo. Proteínas como PGK, α-L-arabinofuranosidase e conglutina são temporariamente inibidas sob estresses hídrico e salino. Anexina pode estar relacionada ao controle dos estresses hídrico e salino. Mecanismos fisiológicos e moleculares atuam de forma integrada em sementes de braúna, sendo fundamentais para explicar a germinação e as diferentes respostas sob condições de estresse. / Abiotic stresses, such as drought and salinity, affect the survival of plants. Seed germination is one of the critical points during the plant life cycle. Mechanisms of response at physiological and molecular levels are scarce for seeds of forest species such as Melanoxylon brauna. The objective of this study was to investigate the effects of water and saline stress during a germination of Brauna seeds. The imbibition curves and germination were evaluated in the potentials of 0,0; -0.2; -0.4; -0.6 and -0.8 MPa (PEG and NaCl). For the subsequente analyses the potential of 0.0 and -0.4 Mpa were used, in wich were evaluated fresh weight and embryo axis lenght, phytohormones, lipid peroxidation (MDA), superoxide anion (O 2.- ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) production, antioxidant system by enzymatic activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and peroxidase (POX), and proteomic analysis to elucidate the mechanisms of stress response. For seeds of control group was possible to show the phases of imbibition, germination increases and higher growth rates of the embryonic axis in relation to the treatments under water and saline stress. Under saline stress, there was delay of seed weight gain, germination reductions and lower growth rates of the embryonic axis, classified as halophyte. Under water stress a drastic reduction of seed weight gain occurs, germination was inhibited, as well as embryonic axis growth. Seeds of Brauna are more sensitive to water stress than to saline stress. Later levels of ACC were higher after seed germination. Endogenous levels of ABA, AIA and AS were higher in response to water stress. ABA and AIA induce a state of quiescence under water stress. There was no oxidative damage from MDA data. H 2 O 2 and MDA levels decreases over the time. Proteins such as PGK, α-L- arabinofuranosidase and conglutin are temporarily inhibited under water and saline stress. Annexin may be related to the control of water and saline stresses. Physiological and molecular mechanisms act in an integrated way in Brauna seeds, being fundamental to explain the germination and the different responses under stress conditions.

Orientadores: Francisco Carlos Groppo, Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-12T19:00:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cogo_Karina_D.pdf: 3355648 bytes, checksum: d8afd799c6d162cda6cbb9bad9d225a5 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O uso do cigarro tem sido associado com a progressão da periodontite bem como com a redução da resposta à terapia aplicada a essa doença. Porphyromonas gingivalis é um importante colonizador do biofilme subgengival além de ser um dos principais patógenos envolvidos no estabelecimento e progressão da doença periodontal. No entanto, os possíveis efeitos dos principais derivados do cigarro sobre P. gingivalis ainda não foram totalmente investigados. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos da nicotina e cotinina sobre a expressão de proteínas e sobre a capacidade de adesão e invasão celular de P. gingivalis. A fim de avaliar a expressão de proteínas, culturas de P. gingivalis W83 foram expostas à nicotina e cotinina nas concentrações de 6 e 600µg/mL, as proteínas foram extraídas, separadas por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (12.5% SDS-PAGE) e identificadas por LC-MS/MS. Os géis e suas corridas eletroforéticas foram feitas em triplicatas e a detecção de proteínas nos mesmos foi feita através de coloração com corante Coomassie. Proteínas diferentemente expressas foram digeridas com tripsina e as amostras de peptídeos sequenciadas utilizando um sistema Q-TOF API LC-MS/MS. A busca MS/MS foi realizada utilizando os bancos de dados MSDB e NCBI através do programa Mascot. Para examinar a capacidade de adesão e invasão de P. gingivalis, monocamadas de células KB e culturas de P. gingivalis ATCC 33277 foram expostas às concentrações de 0.1, 10 e 100 µg/mL de nicotina e cotinina. As células epiteliais foram incubadas por 24 h enquanto P. gingivalis foi exposta a essas substâncias até atingir a fase logarítmica. Após o período de incubação, P. gingivalis foi submetida aos ensaios de adesão e invasão às células KB. O número de bactérias associadas às células foi obtido através de contagem de unidades formadoras de colônia. Os resultados obtidos da análise expressão de proteínas mostraram que a adição de nicotina e cotinina promoveram alterações no proteoma de P. gingivalis. Entre os ± 430 spots de proteínas reproduzíveis detectados em cada gel, 20 proteínas foram menos expressas e 42 foram mais expressas em pelo menos um dos tratamentos (p<0.05; ANOVA - Tukey). Entre as proteínas identificadas, muitas estavam envolvidas em processos como produção de energia celular, síntese de proteínas, estresse oxidativo, virulência, transporte, etc. Em relação aos resultados obtidos nos ensaios de adesão e invasão, foi evidenciado que, quando as células epiteliais foram inoculadas com nicotina e cotinina, nenhuma diferença significativa na colonização de P. gingivalis foi encontrada. Quando P. gingivalis foi exposta à maior concentração de cotinina, sua capacidade de adesão e invasão às células epiteliais aumentou de forma expressiva (p<0.05; ANOVA - Tukey). No entanto, a nicotina e as outras concentrações de cotinina testadas não alteraram a capacidade de colonização. Esses achados indicam que a nicotina e a cotinina podem afetar a expressão de proteínas de P. gingivalis. Ainda, a cotinina pode alterar positivamente a eficiência de adesão e invasão de P. gingivalis. / Abstract: Cigarette smoking is associated with the development of periodontitis and the decreased response to periodontal therapy. P. gingivalis is an important colonizer of the subgingival biofilm and is one of the major pathogens involved in the initiation and progression of periodontal disease. However, the possible effects of major cigarette's derivatives on P. gingivalis were not fully investigated. Thus, the purpose of the present study was to evaluate the effects of nicotine and cotinine on the protein expression and cellular adhesion and invasion abilities of P. gingivalis. To evaluate protein expression, P. gingivalis W83 cultures were exposed to nicotine and cotinine 6 and 600µg/mL concentrations, the proteins were extracted, separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (12.5% PAGE) and identified with LC-MS/MS. The gels were run in triplicates and detection of proteins was obtained by staining the gels with Coomassie blue. Proteins differentially expressed were digested with trypsin, and the peptide samples sequenced using a Q-TOF API LC-MS/MS system. The MS/MS was searched against the MSDB and NCBI databank using Mascot program. In order to assess P. gingivalis adhesion and invasion abilities, KB cells monolayers and P. gingivalis ATCC 33277 cultures were exposed to 0.1, 10 and 100 µg/mL nicotine and cotinine concentrations. The epithelial cells were incubated for 24 h while P. gingivalis was exposed to these substances until early logarithmic phase. After incubation period, P. gingivalis were submitted to assays to evaluate adhesion to and invasion of KB cells. The number of bacteria associated with these cells was assessed by counting the colony-forming unities. The results from protein expression analyses showed that addition of nicotine and cotinine promoted alterations in proteome profile of P. gingivalis. Among ± 430 protein spots reproducibly detected on each gel, 20 protein spots were downregulated, and 42 were upregulated at least in one treatment (p<0.05; ANOVA - Tukey test). The identified proteins are involved in several processes, i.e. energy production, protein synthesis, oxidative stress, virulence, transport and binding activities. Data obtained from adhesion and invasion assays evidenced that epithelial cells inoculated with nicotine and cotinine did not show any significant differences in P. gingivalis colonization. When P. gingivalis was exposed to the higher concentration of cotinine, adherence and invasion of this bacterium to the epithelial cells markedly increased (p<0.05; ANOVA - Tukey test). However, nicotine and the other concentrations of cotinine did not alter the colonization ability. These findings indicate that nicotine and cotinine may affect P. gingivalis protein expression. In addition, cotinine may alter positively P. gingivalis adhesion and invasion efficiencies. / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

Orientador: Maria Julia Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T07:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matsumura_CintiaYuri_D.pdf: 2096053 bytes, checksum: 36802787c48fa671b02e82fdc5d9de40 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Na Distrofia Muscular de Duchene (DMD) e em seu modelo experimental, camundongos mdx, a ausência ou disfunção da proteína distrofina leva a degeneração muscular. Acredita-se que a patogênese da DMD esteja relacionada à fragilidade do sarcolema, ao estresse mecânico e ao maior influxo de íons cálcio na fibra muscular resultante do funcionamento anormal de canais iônicos, como os canais de cálcio ativados por estiramento. O conhecimento das proteínas envolvidas na degeneração/regeneração muscular e na proteção a mionecrose da fibra muscular distrófica é essencial para a caracterização das distrofias musculares, bem como para o estabelecimento de métodos diagnósticos e de tratamentos preventivos ou terapêuticos. No presente trabalho estudamos os mecanismos de proteção a degeneração muscular, sendo dois os objetivos. No primeiro, identificamos proteínas envolvidas na proteção a mionecrose e nos processos de degeneração/regeneração muscular através do estudo proteômico dos músculos afetados ou não pela distrofia muscular em camundongos mdx e em animais controle. No segundo, verificamos a participação dos canais de cálcio ativados por estiramento na degeneração da fibra muscular através do seu bloqueio pela estreptomicina nos diferentes músculos distróficos de mdx. Adicionalmente, verificamos os potenciais efeitos secundários da estreptomicina na estabilidade do sarcolema e no tamponamento e sinalização de cálcio. Quanto ao estudo proteômico, nossos resultados sugerem que a diferença constitutiva dentre músculos afetados e não afetados pela degeneração são fundamentais para proteção a mionecrose, permitindo a manutenção da homeostase de cálcio e melhor resposta ao estresse mecânico e oxidativo. As proteínas galectina-1, anexina A1 e proteína 1 de interação com Reticulon-4 são possíveis biomarcadores para a distrofia muscular, uma vez que participam de diferentes processos celulares. Quanto a terapia farmacológica verificamos que os músculos distróficos mais afetados, como o diafragma, possuem maior quantidade de canais de cálcio ativados por estiramento e a estreptomicina atenuou a degeneração dos músculos distróficos. Diferente do efeito secundário de outros bloqueadores de canais de cálcio, a estreptomicina não alterou as proteínas do complexo distrofina-glicoproteína (beta-distroglicana e alfa-sintrofina), bem como as relacionadas ao cálcio (calsequestrina e calmodulina). Nossos resultados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias farmacológicas relacionadas a proteínas envolvidas na degeneração muscular e na proteção a mionecrose, assim como para o desenvolvimento de métodos diagnóstico e de acompanhamento das distrofinopatias pelos marcadores moleculares / Abstract: In Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and in the mdx mice model of DMD, the lack of dystrophin leads to muscle degeneration. The pathogenesis of DMD is related to sarcolemmal fragility, mechanical stress and increased influx of calcium in muscle fibers, due to dysfunction of ion channels, such as the stretch-activated calcium channels. The knowledge of the proteins related to muscle degeneration/regeneration and to the protection against myonecrosis is essential to better characterize the muscular dystrophy and to establish new diagnostic tools, in addition to new preventive or therapeutic treatments. In the present study, we addressed new mechanisms of muscle protection by focusing on two main objectives. First, to identify proteins related to the protection agaisnt myonecrosis and to muscle degeneration/regeneration by performing a comparative proteomic study of spared and affected muscles of mdx and control mice. Second, to verify the involvement of stretch-activated calcium channels in dystrophic muscle degeneration by performing a drug therapy with a stretch-activated calcium channels blocker, streptomycin, in muscles that are differently affected by the lack of dystrophin, in the exercised-mdx mice. Furthermore, we were interested to see whether the stretch-activated calcium channels blocker would have additional effects on sarcolemal stability and on calcium buffering and signaling, as previously reported for other calcium channels blockers. The proteomic study suggests that constitutive differences among spared and affected dystrophic muscles are essential for muscle protection agaisnt myonecrosis, allowing a better calcium homeostasis and response to oxidative and mechanical stress. Galectin-1, annexin A1 and the protein interacting with Reticulon-4 are potencial biomarkers for muscular dystrophy, due to their involvement in different cellular processes. The drug therapy study shows that stretch-activated calcium channels participates in dystrophic muscle degeneration, showing higher levels in the mostly affected muscle, the diaphragm. Streptomycin protects the dystrophic muscles against myonecrosis, but has no further effects on other mechanisms of dystrophic muscle protection, i.e., did not improve the dystrophin-glycoprotein complex (assayed by beta-dystroglycan and alpha-syntrofin levels), nor calcium binding protein (assayed by calsequestrin and calmodulin levels). Overall, the present study opens new perspectives for the development of drug therapies to dystrophinopathies by suggesting potential new molecular markers of dystrophy (proteomic study) and by suggesting new mechanistic views to explain the differences in the response of dystrophic muscles to the lack of dystrophin (drug therapy) / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_ErichdeCastro_M.pdf: 2721434 bytes, checksum: 5649b1cd35c4a6d4ef9aef257d027b24 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neurotraumas periféricos, situação recorrente atualmente na humanidade, resultam em reorganizações e modificações tanto do sistema nervoso periférico que foi lesado quanto do sistema nervoso central, mais especificamente da medula espinhal na tentativa de reparar o dano gerado. O período pós-natal apresenta intensa plasticidade neuronal medular já que é o intervalo no qual a medula espinhal apresenta a maior capacidade de sofrer alterações e rearranjos dependentes de estímulos internos e externos, sendo assim, podem ocorrer modificações em seu desenvolvimento. Logo, este período é considerado ideal para estudos dos mecanismos envolvidos na degeneração e em possíveis reparos do tecido nervoso após um neurotrauma periférico. Visando contribuir para a elucidação dos mecanismos de neurodegeneração, este trabalho propôs um enfoque proteômico, área que na era pós-genômica tornou-se essencial tanto para a compreensão dos mecanismos que regem um organismo quanto para a análise comparativa entre duas condições contrastantes no mesmo organismo. Utilizando-se uma combinação entre as duas técnicas mais clássicas e usuais em estudos de proteoma, a eletroforese de duas dimensões e a espectrometria de massas, estudou-se o perfil proteômico da medula espinhal de ratos com sete dias de vida em duas situações distintas, uma que sofreu axotomia do nervo ciático com dois dias de vida, e a outra que não sofreu tal lesão, com a finalidade de conhecer as proteínas diferencialmente expressas nas duas classes e sugerir suas prováveis funções biológicas. Dentre essas, foram identificadas proteínas responsáveis diretamente e indiretamente pela desintoxicação celular e combate as espécies reativas de oxigênio como a catalase, a glutationa S-trasnferase Mu1 e a glicose 6-fosfato 1-desidrogenase, além da proteína dissulfeto isomeraseA3 que participa do processo oxidativo. Proteínas estruturais como a tubulina ß-5 e a anexina A6 também foram identificadas. Infere-se, dessa forma, que essas e outras proteínas podem representar alvos moleculares importantes para futuros tratamentos visando à diminuição da degeneração e o reparo de uma lesão nervosa periférica. / Abstract: Peripheral neurotraumas are a common situation nowadays in humanity. These nerve damages results in reorganizations and modifications over the own injured peripheral nerve system and over the central nerve system, more specifically over the spinal cord due the attempt to repair the damage. The post-natal period shows intense neuronal plasticity on spinal cord because the spinal cord ability to suffer alterations and rearrangements due internal and external stimuli, therefore maybe occur modifications in your development. Therefore, this period is ideal for study the involved mechanisms in nerve degeneration and nerve tissue repair after a neurotrauma. Trying to contribute with the degeneration mechanisms elucidation, this study proposed a proteomic approach, field which in the post-genomic era has become essential for both, to understanding all the pathways which controls an organism as to comparative analysis between two different conditions of the same organism. Using the two most useful and classical techniques combination for proteomics labor, which are two dimension electrophoresis and mass spectrometry, was studied a seven days of life rat's spinal cord proteomic profile in two different situations: in the first, the rats had suffered sciatic nerve section with two days of life and other that the rats had not suffered any trauma in sciatic nerve. The purpose is to know the differentially expressed proteins in the two classes and suggest their probable biological functions. Among these, proteins directly responsible for the cell detoxification and combat the reactive oxygen species were identified, like a catalase, a Glutathione S-transferase Mu 1 and a Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase. Structural proteins like a ß-5 Tubulin and Protein disulfide isomerase A3 were indentified too. Thus it, these and other proteins could represent important molecular targets to future treatments aiming the post trauma degeneration decrease and the peripheral nerve injury repair. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O splicing alternativo é um processo no qual moléculas idênticas de pré-mRNA são processadas de diferentes formas. Ele é fundamental em organismos complexos, pois é responsável por criar uma ampla diversidade de proteínas a partir de um número relativamente pequeno de genes. Contudo, poucas proteínas advindas do splicing alternativo já foram identificadas, visto que a maioria dos espectros de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) não encontra sequências correspondentes nos diversos bancos de dados de proteínas disponíveis. Entre diversos fatores, isso ocorre porque um número reduzido de eventos de splicing alternativo (ASEs) são conhecidos e devidamente estudados. Nesse trabalho, o espectro de eventos observáveis foi ampliado por meio da análise de eventos complexos de splicing alternativo (CASEs), que consideram múltiplos ASEs em um ou diferentes transcritos. Foi desenvolvido um novo método de análise utilizando expressões regulares (regexes) associada a uma sintaxe baseada em caracteres intuitivos. O método de análise e a sintaxe foram implementados em uma ferramenta web denominada de SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) que também apresenta ferramentas extras de análise. Adicionalmente, os subestimados eventos do tipo retenção de íntron (IR) foram explorados em busca de evidências funcionais por meio de análises de MS/MS. Como resultado, eventos bastante incomuns foram observados no proteoma humano, sugerindo que muito pouco ainda é conhecido sobre a complexidade transcriptômica e proteômica humana. Portanto, com base nesses dados, esse trabalho representa um grande avanço no estudo de fenômenos de splicing alternativo ainda pouco explorados. / Alternative splicing is defined, basically, as a process in which identical pre-mRNA molecules are processed in different ways in terms of usage of exon/introns borders. It is a fundamental process in complex organisms, and is responsible for creating a large diversity of proteins from a relatively small number of genes. However, just a few proteins resulted from alternative splicing were already identified, since only a small part of \\emph mass spectrometry (MS/MS) spetras match proteins in sequence databases. Among different factors, it occurs because a reduced number of alternative splicing events (ASEs) are known and properly studied. In this work, the landscape of observable events was amplified through the analysis of complex alternative splicing events (CASEs), which consider different ASEs within the same or different transcripts. A method of analysis was developed using regular expressions (regexes) associated with a syntax composed of intuitive characters. Those features were implemented in a web tool called SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) that also has extra analysis tools.Furthermore, the understudied events known as intron retention (IR) were explored using MS/MS analyses as a strategy to identify functional roles. As result, very uncommon events were observed in human proteome, suggesting that little is currently known about the complexity of the human proteome and transcriptome. Based on those data, it can be concluded that this work represents a significant advance in the study of uncommon and understudied alternative splicing events.

O mamão papaia (Carica papaya L.) é uma fruta tropical de grande relevância comercial uma vez que o Brasil é o maior produtor mundial e terceiro maior exportador da fruta. Contudo, por ser uma fruta climatérica, tem uma vida pós-colheita limitada, devido ao rápido Amaciamento da polpa. Neste trabalho foi realizada uma investigação proteômica comparativa de polpa do mamão verde e maduro. Várias centenas de componentes protéicos (spots) foram resolvidos em géis 2-DE (faixa de pH 4-7) utilizando a eletroforese diferencial em gel (DIGE) e posteriormente as imagens geradas foram analisadas pelo programa PDQuest. Os spots diferencialmente expressos foram retirados do gel, digeridos e sequenciados (ESI-Q-TOF-MS/MS). Em geral, as proteínas diferencialmente expressas foram associadas ao metabolismo do etileno, resposta ao estresse, metabolismo de carbono e outros importantes processos fisiológicos. Os papéis de algumas das proteínas identificadas foram discutidos em relação à qualidade dos frutos do mamão. Este estudo fornece a primeira caracterização das mudanças no proteoma da polpa do mamão durante o amadurecimento. Deste modo a identificação de proteínas envolvidas na instalação ou desenvolvimento do amadurecimento pode contribuir para o entendimento deste processo e, também, gerar subsídios para avanços tecnológicos visando à qualidade e diminuição das perdas pós-colheita. / Papaya (Carica papaya L.) fruit is a relevant tropical crop since Brazil is the world\'s largest producer and third largest exporter of fruit. However being a climacteric fruit, has a limited green life due to the rapid pulp softening. We report here a comparative proteomic investigation of fruit pulp from unripe and ripe papayas. Several hundreds of protein components were resolved on 2-DE gels (pH range 4-7) using the differential gel electrophoresis (DIGE) approach, and images were analyzed by PDQuest. The variable components were excised, in-gel digested and were analyzed by ESI-Q-TOF-MS/MS. In general, the differentially expressed proteins were associated to ethylene metabolism, stress response, carbon metabolism and other important physiological processes. The roles of some of the identified proteins were discussed in relation to papaya fruit quality. To the best of our knowledge, this investigation provides the first characterization of the changes in papaya fruit pulp proteome during ripening. Thus the identification of proteins involved in the installation or development of the ripening may contribute to the understanding of this process and also provide subsidies for technological advances aimed at quality and reduction of post harvest losses.

O estudo de venenos de artrópodes é de grande interesse para melhorar os tratamentos contra envenenamentos e oferece uma ótima ferramenta para melhor compreensão dos sistemas nervoso e imunológico, coagulação sanguínea e respostas inflamatórias. As abelhas são um dos animais venenosos mais estudados e a elucidação do seu proteoma é de interesse na elucidação de reações tóxicas e alérgicas a ferroadas. O número de acidentes envolvendo estes insetos é crescente, tendo ultrapassado 20.000 notificações entre 2001 e 2006 em todo o país e, apesar disso, não há um tratamento específico para estas vítimas, nem mesmo uma identificação completa dos antígenos presentes nesse veneno. O perfil protéico descrito até então apresenta cerca de 40 proteínas. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil protéico do veneno de abelhas utilizando a união da abordagem proteômica e da cromatografia de afinidade. Identificar também as proteínas alergênicas deste veneno e algumas modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação. Além disso, um soro antiveneno específico foi produzido e sua ação neutralizadora testada. O veneno de abelhas foi separado por cromatografia de afinidade utilizando o soro antiveneno imobilizado em coluna de Sepharose 4B. Para identificação das proteínas foram utilizadas técnicas de 2D-SDS-PAGE, MALDI TOF/TOF e nanoESI-LC/MS-MS. Ensaios de Western Blotting foram realizados para identificar as proteínas alergênicas e fosforiladas. A utilização da cromatografia de afinidade permitiu a identificação 2 de proteínas pouco abundantes. Foram identificadas 54 proteínas, dentre as quais 9 nunca haviam sido descritas neste veneno, como MRJP-2, alfaglicosidase, transferinas, proteases, quinases e um inibidor de protease. Após a identificação destas proteínas foi possível propor um provável mecanismo de ação deste veneno. Dentre as proteínas identificadas como alergênicas, a MRJP-8 foi identificada pela primeira vez, juntamente com fatores relacionados ao PDGF e VEGF. Os resultados dos ensaios de neutralização de atividades citotóxicas, hemolíticas e miotóxicas mostraram a eficiência do soro antiveneno produzido. Chegou-se a um volume de 5,7 mL de soro antiveneno necessários para neutralizar a ação tóxica provocada por 100 ferroadas de abelhas. Este valor está na mesma faixa de eficiência dos melhores antivenenos (ofídicos, aracnídicos e escorpionídicos) produzidos no Brasil e no mundo. O lote de soro antiveneno produzido mostrou resultados satisfatórios para ser utilizado nos testes clínicos / The aim of this work was to identify the protein profile of honeybee venom, and detect allergenic proteins and post-translational modifications. Furthermore specific antivenom was produced and potency tests were performed in order to check its power of neutralization of toxic activities of venom. They were identified 54 proteins, 9 that have never been reported before in this venom. After identification of these proteins it was possible to outline a feasible mechanism of action of venom. For the first time MRJP-8, transferrin, PDGF and VEGF factors were identified as allergenic. Results of neutralization of citotoxic, hemolytic and myotoxic activities showed the efficacy of antivenom that had satisfactory results to be tested in clinical assay

Introdução: O trauma é um fenômeno que cursa com lesão tecidual, sendo que o trauma cirúrgico (TC) apresenta a referida lesão como consequência de um ato cirúrgico. A isquemia seguida de reperfusão (IR) é um evento comum em várias condições patológicas, bem como em diversos procedimentos cirúrgicos, principalmente transplantes. É frequente o desenvolvimento de lesões teciduais locais e remotas após trauma e após a I/R, parte de um fenômeno conhecido como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS), frequentemente seguida pela falência de múltiplos órgãos (FMO). Estudos provaram o envolvimento do neutrófilo em tais síndromes como resultado da ação de enzimas proteolíticas secretadas a partir de grânulos citoplasmáticos, radicais livres produzidos por explosão respiratória e citocinas liberadas após a infiltração nos tecidos. Nesse contexto, foi provado que o pré-condicionamento isquêmico (PCI), definido como curtos episódios de isquemia precedendo a IR, protege contra essas lesões, com menor ativação de neutrófilos. No entanto, o conhecimento a respeito dos mecanismos operantes nos neutrófilos após o trauma cirúrgico, a isquemia seguida de reperfusão ou o pré-condicionamento isquêmico, ainda são preliminares. Objetivo: Analisar com maior profundidade o impacto dessas condições (TC, IR e PCI) no proteoma e fosfoproteoma do neutrófilo. Métodos: Foi realizada a análise de parâmetros hematológicos juntamente com a análise proteômica e fosfoproteômica de neutrófilos de ratos submetidos a TC, IR e PCI, comparados ao grupo controle. A análise proteômica foi realizada em sistema de nLC-MS/MS orbitrap de alto desempenho, usando marcação com iTRAQ, enriquecimento de fosfopeptídios e pré-fracionamento por HILIC. A análise estatística baseada em clusters utilizando scripts em R mostrou proteínas com abundância relativa diferencial em todas as condições. Resultados: A avaliação dos parâmetros hematológicos antes e depois de TC, IR e IPC demonstrou alterações no número, forma e tamanho de linfócitos, hemácias, plaquetas e, principalmente, neutrófilos (granulócitos). Observou-se um claro aumento na contagem de neutrófilos após TC e IR, sendo que tal aumento foi prevenido pelo PCI. Um total de 393 proteínas foram determinadas como reguladas para abundância relativa entre o grupo controle e o grupo TC. A maioria das proteínas encontradas como reguladas em comum nos grupos TC e IR estão relacionadas à apoptose (caspase-3), motilidade celular (PAK2), transdução de sinal (IL-5, IL-6 e TNF) e degradação pelo sistema proteassoma no neutrófilo. Maior produção de espécies reativas de oxigênio e disfunção da migração direcional de neutrófilos (PKC-delta) com aumento do tempo de vida dos neutrófilos são eventos iniciais importantes que podem resultar em mais dano tecidual e em infecção. A análise proteômica de neutrófilos de ratos após PCI levou à identificação de 2437 grupos de proteínas atribuídos a 5 clusters diferentes, contendo proteínas de abundância relativa significativamente aumentada ou diminuída em IR e PCI. O estudo de vias desses clusters baseado no KEGG revelou aumento nas vias de fagocitose mediada por Fc-gama R, sinalização por quimiocinas, adesão focal e migração transendotelial, citoesqueleto de actina, metabolismo e diminuição nas vias ribossomais, de transporte de RNA, de processamento de proteínas. A regulação da fosforilação de proteínas após IR e PCI mostrou algumas vias como quimiocinas, Fc-gama, GPCR, migração celular e vias pró e antiapoptóticas, sendo que a via de splicing alternativo foi a que apresentou regulação mais evidente (p < 0.0001). A regulação da abundância, bem como da fosforilação, presença de motivos e de domínios levou à identificação de fosfatases, como Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 e ptprc reguladas por IR, bem como stk38, pkn1, syk e inpp5d reguladas por PCI. A interação mais marcante entre proteínas foi demonstrada como sendo entre os receptores de Fgr e Ptp. Conclusão: Concluímos que as alterações causadas por TC, IR e PCI levaram a intenss alterações na abundância de algumas proteínas e em eventos de fosforilação em neutrófilos, levando ao efeito destrutivo observado após a IR e ao efeito protetor consequente ao PCI / Introduction: Trauma is a phenomenon that involves tissue injury, whereas the surgical trauma (ST) has such injury as a consequence of a surgery. Ischemia reperfusion is common event in many surgical procedures, especially in transplants, as well as in many pathological conditions. Local and remote tissue injuries usually develop after trauma and ischemic reperfusion, part of a phenomenon known as systemic inflammatory response syndrome, frequently followed by multiple organ failure (MOF). Studies have proven the involvement of the neutrophil in all these injuries as a result of proteolytic enzymes secreted from cytoplasmic granules, free radicals produced by respiratory burst, cytokines released after tissue infiltration. In that context, ischemic preconditioning (IPC), that are short episodes of ischemia before ischemia reperfusion, was proved to be protective against these injuries with less activation of neutrophils. However the knowledge about the underlying mechanism operating in the neutrophil after surgical trauma, ischemia reperfusion and preconditioning is preliminary. Objective: To deeply analyze the impact of these conditions (ST, IR and IPC) on the neutrophil proteome and phosphoproteome. Methodology: We did hematological analysis along proteomics and phospho proteomics through high throughput nLC-MS/MS analysis by orbitrap using iTRAQ labeling, phospho peptide enrichments, and HILIC pre-fractionation. Neutrophils from control, ST, IR and IPC conditions after extraction were processed for proteomic analysis. Statistical package using R based on cluster analysis led to the detection of differentially regulated proteins in all conditions. Results: The evaluation of the hematological parameters before and after ST, IR or IPC on blood cells stated alteration in size, number and shape of lymphocytes, RBCs, platelets and specially neutrophils (granulocytes). In the analysis, a clear increase in neutrophil count after ST and IR with such increase prevented by IPC. A total of 393 proteins were found differentially regulated between control and trauma groups. Most of the common proteins found regulated in trauma and IR seem to be related to apoptosis (caspase-3), cell motility (PAK2) and signal transduction in IL5, IL6 and TNF and proteasomal degradation in neutrophil. Higher oxygen species production and dysfunction of directional neutrophil migration (PKC delta) with increase in the life span of neutrophils are early important events that can finally result into more tissue damage and infection. The total proteomic analysis of rat neutrophils after IPC led to the identification of 2437 protein groups assigned to five different clusters with significantly up and downregulated proteins in IR and IPC. Cluster based KEGG pathways analysis revealed up-regulation of chemokine signaling, focal adhesion, leukocyte transendothelial migration, actin cytoskeleton, metabolism and Fc gamma R mediated phagocytosis, whereas downregulation in ribosome, spliceosome, RNA transport, protein processing in endoplasmic reticulum and proteasome, after intestinal ischemic preconditioning. The phosphoregulated proteins containing domains and motifs in the regulated peptides after IR and IPC led to the identification of some of important players such as chemokine, Fc gamma, GPCR, migration and pro/anti-apoptotic pathways. The phosphoproteins from alternative splicing was the pathway presenting the most remarkable regulation with a p-value of 0.0001. The regulation in expression as well as in phosphorylation, the presence of motifs and domains led to the identification of kinases and phosphatases including Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 and ptprc in neutrophils after IR whereas stk38, pkn1, syk, and inpp5d in neutrophil due to IPC. The highest protein-protein interaction was shown by Fgr and Ptp receptors. Conclusion: We concluded that the changed stimulus produced after ST, IR and IPC led to the huge alteration in proteins expression and phosphorylation events in the neutrophil proteome as mentioned in our work, that leads to final destructive and protective phenotype of neutrophils respectively