Nas secreções glandulares de anfíbios, muitos dos compostos isolados apresentam ação antifúngica e/ou antibacteriana, cuja função é protegê-los contra infecções, uma vez que estes animais habitam ambientes inóspitos. Os peptídeos têm-se destacado dentre os compostos com atividade antimicrobiana isolados de venenos de diversos animais. Além disso, compostos de natureza não proteica presentes nestas secreções têm demonstrado ação antimicrobiana. O objetivo deste estudo foi, primeiramente, isolar e caracterizar, estruturalmente, compostos com atividade antifúngica relevante. Em um segundo momento, foi realizar um estudo comparativo, através de técnicas ômicas, dos compostos presentes nas secreções das glândulas mucosas e parotoides. Os ensaios antimicrobianos, in vitro, foram realizados com fungos, leveduras e bactérias. O material de baixa massa molecular da água de diálise das secreções das glândulas parotoides apresentou atividade antimicrobiana sobre, principalmente, os fungos filamentosos. Este mesmo material foi submetido a uma filtração em gel, resultando em 11 frações as quais foram testadas contra Microsporum canis no ensaio de diluição seriada. A fração 9 mostrou atividade antifúngica e foi submetida a uma cromatografia de fase reversa, resultando em 9 frações, as quais foram testados contra M. canis. Destas frações, as frações 1 e 9 demonstraram, respectivamente, atividade fungicida e fungistática contra M. canis. No segundo momento, as secreções de ambas as glândulas foram analisadas por nanocromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a um espectrômetro de massas de alta resolução. Desta análise, foram obtidos 11.034 compostos, distribuídos entre as secreções de ambas as glândulas. Todos os íons obtidos foram fragmentados (MS/MS) e submetidos à análise no programa PEAKS 6. Foram obtidas 511 sequências de peptídeos e/ou sequências parciais de proteínas das secreções das glândulas mucosas, enquanto que para as secreções das glândulas parotoides foram obtidas 110 sequências. Nas secreções das glândulas mucosas, a maior parte das sequências de aminoácidos são de compostos com massas moleculares entre 1 e 3 kDa, o que corresponde a 82% das sequências obtidas. Já para as secreções das glândulas parotoides, a maioria das sequências de aminoácidos são correspondentes aos peptídeos/proteínas com massas moleculares entre 1 e 2 kDa, o que representa 55% do total de sequências obtidas para esta secreção. As sequências foram analisadas pelo BLAST e revelou que um peptídeo presente nas secreções das glândulas parotoides apresenta 66,7% de identidade com o peptídeo antimicrobiano conhecido como ponericin-G2. Entre as sequências encontradas para as secreções das glândulas mucosas, o destaque foi para o precursor do peptídeo brevinin-1, com identidade de 31,2%. Todas as frações obtidas da filtração em gel das secreções das glândulas mucosas e parotoides foram direcionadas à análise por espectrometria de massas MALDI-TOF, o que resultou em maiores informações sobre a natureza dos compostos presentes nestas frações. A fração 8 das secreções das glândulas mucosas foi fracionada por cromatografia de fase reversa, resultando em 7 frações denominadas Pep1-Pep7. O composto denominado Pep7 teve sua massa molecular (6,012 kDa) determinada através da espectrometria de ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier com ionização por electrospray. Os peptídeos Pep4, Pep6 e Pep7 foram sequenciados pelo método de degradação de Edman. Estes peptídeos mostraram identidades com peptídeos antimicrobianos das famílias das tigerinin, shepherin e microcin e brevinins, respectivamente. Este estudo demonstrou que há compostos com atividade antimicrobiana significativa nestas secreções, principalmente para fungos filamentosos. Além disso, foi o primeiro a fazer uma análise comparativa dos compostos presentes nas secreções das glândulas mucosas e parotoides de R. schneideri, destacando a presença de peptídeos antimicrobianos / In amphibian glandular secretions, many of the isolated compounds have antifungal and/or antibacterial action, whose function is to protect the animal against infections, since they usually inhabit inhospitable environments. Peptides have been highlighted among antimicrobial compounds isolated from several venomous animals. In addition, non-proteic compounds present in these secretions have demonstrated antimicrobial action. The aim of this study was to isolate and structurally characterize antifungal compounds from Rhinella schneideri parotoid and mucous secretions. Moreover, in this study it was also performed a comparative study of the composition of mucous and parotid gland secretion by omics techniques. The low molecular weight material from parotoid gland secretion showed antimicrobial activity against filamentous fungi and bacteria. The low molecular weight material that showed antimicrobial activity was subjected to gel filtration, resulting in 11 fractions that were tested against Microsporum canis in serial dilution assay. The fraction 9 showed antifungal activity and it was subjected to a reversed phase chromatography, resulting in 9 fractions, which were tested against M. canis. Among them, fraction 1 and 9 showed fungicidal and fungistatic activity against M. canis, respectively. Gland secretion and the respective low molecular weight material were subjected to gel filtration and, each obtained fraction was analyzed by SDSTricine- PAGE. Secretion of the both glands were also quantitatively analyzed by nano ultraperformance liquid chromatography hyphenated to a high-resolution mass spectrometer. It was obtained 6,460 compounds distributed among secretions of both glands. All obtained ions were fragmented (MS/MS) and analyzed by PEAKS 6 program. 511 sequences were obtained from mucous gland secretion, against 110 sequences from parotoid gland secretion. In mucous gland secretion, most of the amino acid sequences (82%) are compounds with molecular masses between 1 and 3 kDa, while for parotoid gland secretion, most of sequences (55%) correspond to peptides/proteins with molecular masses between 1 and 2 kDa. Sequences were analyzed by BLAST, reveling a peptide in parotoid gland secretion that presents 66.7% of identify with an antimicrobial peptide known as ponericin-G2. Among sequences found in mucous gland secretion, the highlight was to one presenting 31.2% of identify with brevinin-1 precursor. All fractions obtained from gel filtration of the mucous and parotoid gland secretions were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry, which resulted in more informations about the nature of the compounds present in these secretions. Fraction 8 from mucous gland secretion was fractionated by reversed phase chromatography on C18 column, resulting in seven fractions denominated Pep1-Pep7. Pep7 presented a molecular mass of 6.012 kDa when analyzed by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. In this analysis, six precursor ions were identified, but no sequence was obtained. Pep4, Pep6 and Pep7 were sequenced by Edman degradation method. These peptides showed identity with tigerinin, shepherin and microcin and brevinins, respectively. This study revealed compounds with significant antimicrobial activity in the analyzed secretions, especially to filamentous fungi. In addition, it was the first to perform a comparative analysis of compounds present in mucous and parotoid gland secretion from R. schneideri toad, highlighting the presence of antimicrobial peptides

A restrição calórica (RC) é uma intervenção dietética capaz de estender a longevidade de vários organismos. O modelo para RC em Saccharomyces cerevisiae consiste da diminuição da concentração de glicose no meio de cultura e mostra um aumentado tanto do tempo de vida cronológico quanto replicativo. Nosso objetivo foi investigar experimentalmente a ação da RC, focando principalmente nas causas e consequências das modificações de geração de EROs mitocondriais e como estas estão associadas ao processo de envelhecimento. Em um primeiro período de estudos, verificamos quais as fontes mitocondriais de EROs, e comprovamos que uma quantidade significativa se origina de proteínas da matriz mitocondrial, e não da cadeia de transporte de elétrons. Nós estudamos a participação de glicose e de outras fontes de carbono sobre o tempo de vida cronológico em leveduras e mostramos que o aumento da longevidade promovida pela RC está associado à uma mudança de metabolismo fermentativo para respiratório, com participação da via de sinalização de glicose. No estágio realizado no laboratório do Professor Francis Sluse na Université de Liegè, Bélgica, estudamos a ação da RC em leveduras focando nas consequências das modificações no proteoma mitocondrial. Em nosso estudo proteômico, encontramos grandes modificações em proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos. Monitoramos a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e o tempo de vida cronológico de S. cerevisiae e as mutantes nulas bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ e gdh3Δ, que codificam a aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada citosólica, NADP glutamato desidrogenase citosólica, a NAD glutamato desidrogenase mitocondrial, e a NADP glutamato desidrogenase mitocondrial, respectivamente. A atividade da NAD glutamato desidrogenase é aumentada em RC, mas a de NADP glutamato desidrogenase decresce em células controle. Aumentos do tempo de vida cronológico foram observados nas mutantes bat2Δ e gdh1Δ devido a RC, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nas mutantes nulas para Gdh2p e Gdh3p em fase estacionária, indicando que essas proteínas são essenciais para os efeitos benéficos da RC. Nessas células WT crescidas em condições normais e as mutantes nulas apresentam iguais longevidades. Juntos, nossos resultados indicam que o aumento da longevidade em S. cerevisiae promovida pela RC depende da interação entre o sinal de glicose e o metabolismo de aminoácidos. / Calorie restriction (CR) is a dietary intervention capable of extending lifespans in a wide range of organisms. A yeast model of CR has been developed in which limiting the concentration of glucose in growth media of Saccharomyces cerevisiae leads to enhanced chronological and replicative life spans. Our aim was to experimentally investigate the effects of CR, focusing mainly on the causes and consequences of changes in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation and how these are associated with the aging process. Initially, we looked for sources of mitochondrial ROS, and found that a significant amount of ROS comes from mitochondrial matrix enzymes and not from the electron transport chain. We studied the participation of glucose and other carbon sources in chronological lifespan and show that increased longevity promoted by CR is associated with a metabolism change from fermentation to respiration, with participation of glucose repression pathway. During studies performed in the laboratory of Professor Francis Sluse at the Université de Liège, Belgium, we studied the effect of CR in yeast with focus on the consequences of changes in the mitochondrial proteome. We found large proteomic changes in proteins involved in amino acid metabolism. We monitored the activity of enzymes related to amino acid metabolism and chronological life span of S. cerevisiae null mutants bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ, and gdh3Δ, which encode for the cytosolic branched-chain amino acid aminotransferase, cytosolic NADP glutamate dehydrogenase, mitochondrial NAD glutamate dehydrogenase and mitochondrial NADP glutamate dehydrogenase, respectively. The activity of NAD glutamate dehydrogenase is increased in CR, but NADP glutamate dehydrogenase decreases in control cells. Increases in chronological life span due to RC were observed in bat2Δ and gdh1Δ mutants, but no significant difference was found in Gdh2p and Gdh3p null mutants in the stationary phase, indicating that these proteins are essential for the beneficial effects of CR. In rich medium, WT cells and null mutants have similar life spans. Together, our results indicate that longevity enhancement by CR in S. cerevisiae depends on the interaction between glucose signals and amino acid metabolism

As leucemias cromossomo Ph-positivas estão intimamente associadas à expressão da tirosina-quinase Bcr-Abl. Esta oncoproteína promove independência de fatores de crescimento, alterações na adesão e inibição da apoptose por mecanismos ainda não totalmente elucidados. O objetivo desse estudo foi avaliar a contribuição da atividade quinase de Bcr-Abl para seu potencial anti-apoptótico e identificar alterações moleculares envolvidas na transformação celular induzida por essa proteína. Nossos resultados sugerem que a resistência à apoptose não depende da manutenção constante da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, tampouco da presença de proteínas fosforiladas em tirosina. A comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl revelou que a presença de Bcr-Abl causa alterações profundas no padrão de expressão protéica. As proteínas afetadas estão associadas a diversos processos celulares, como adesão, transdução de sinais, proliferação e morte celular. Esses achados devem contribuir para a identificação de novos marcadores de prognóstico e alvos terapêuticos. / Ph chromosome-positive leukemias are closely associated with the expression of Bcr-Abl tyrosine kinase. This oncoprotein promotes growth factor independence, alters cell adhesion and confers resistance to apoptosis by mechanisms that are not fully understood. The aim of this study was to evaluate the contribution of Bcr-Abl kinase activity for its antiapoptotic potential and identify molecular alterations involved in Bcr-Abl-induced cell malignant transformation. Our results suggest that Bcr-Abl is not required to be constantly active to maintain the resistance to apoptosis and pY-containing proteins may not be responsible for the antiapoptotic effect of Bcr-Abl. The comparison between the proteome of HL-60.vector and HL-60.Bcr-Abl cells revealed that the presence of Bcr-Abl alters the expression of a great variety of proteins. The affected molecules are associated with several cellular processes, including cell adhesion, signal transduction, proliferation and cell death. Our findings might help the identification of new prognostic markers and therapeutic targets.

Introdução: O trauma é um fenômeno que cursa com lesão tecidual, sendo que o trauma cirúrgico (TC) apresenta a referida lesão como consequência de um ato cirúrgico. A isquemia seguida de reperfusão (IR) é um evento comum em várias condições patológicas, bem como em diversos procedimentos cirúrgicos, principalmente transplantes. É frequente o desenvolvimento de lesões teciduais locais e remotas após trauma e após a I/R, parte de um fenômeno conhecido como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS), frequentemente seguida pela falência de múltiplos órgãos (FMO). Estudos provaram o envolvimento do neutrófilo em tais síndromes como resultado da ação de enzimas proteolíticas secretadas a partir de grânulos citoplasmáticos, radicais livres produzidos por explosão respiratória e citocinas liberadas após a infiltração nos tecidos. Nesse contexto, foi provado que o pré-condicionamento isquêmico (PCI), definido como curtos episódios de isquemia precedendo a IR, protege contra essas lesões, com menor ativação de neutrófilos. No entanto, o conhecimento a respeito dos mecanismos operantes nos neutrófilos após o trauma cirúrgico, a isquemia seguida de reperfusão ou o pré-condicionamento isquêmico, ainda são preliminares. Objetivo: Analisar com maior profundidade o impacto dessas condições (TC, IR e PCI) no proteoma e fosfoproteoma do neutrófilo. Métodos: Foi realizada a análise de parâmetros hematológicos juntamente com a análise proteômica e fosfoproteômica de neutrófilos de ratos submetidos a TC, IR e PCI, comparados ao grupo controle. A análise proteômica foi realizada em sistema de nLC-MS/MS orbitrap de alto desempenho, usando marcação com iTRAQ, enriquecimento de fosfopeptídios e pré-fracionamento por HILIC. A análise estatística baseada em clusters utilizando scripts em R mostrou proteínas com abundância relativa diferencial em todas as condições. Resultados: A avaliação dos parâmetros hematológicos antes e depois de TC, IR e IPC demonstrou alterações no número, forma e tamanho de linfócitos, hemácias, plaquetas e, principalmente, neutrófilos (granulócitos). Observou-se um claro aumento na contagem de neutrófilos após TC e IR, sendo que tal aumento foi prevenido pelo PCI. Um total de 393 proteínas foram determinadas como reguladas para abundância relativa entre o grupo controle e o grupo TC. A maioria das proteínas encontradas como reguladas em comum nos grupos TC e IR estão relacionadas à apoptose (caspase-3), motilidade celular (PAK2), transdução de sinal (IL-5, IL-6 e TNF) e degradação pelo sistema proteassoma no neutrófilo. Maior produção de espécies reativas de oxigênio e disfunção da migração direcional de neutrófilos (PKC-delta) com aumento do tempo de vida dos neutrófilos são eventos iniciais importantes que podem resultar em mais dano tecidual e em infecção. A análise proteômica de neutrófilos de ratos após PCI levou à identificação de 2437 grupos de proteínas atribuídos a 5 clusters diferentes, contendo proteínas de abundância relativa significativamente aumentada ou diminuída em IR e PCI. O estudo de vias desses clusters baseado no KEGG revelou aumento nas vias de fagocitose mediada por Fc-gama R, sinalização por quimiocinas, adesão focal e migração transendotelial, citoesqueleto de actina, metabolismo e diminuição nas vias ribossomais, de transporte de RNA, de processamento de proteínas. A regulação da fosforilação de proteínas após IR e PCI mostrou algumas vias como quimiocinas, Fc-gama, GPCR, migração celular e vias pró e antiapoptóticas, sendo que a via de splicing alternativo foi a que apresentou regulação mais evidente (p < 0.0001). A regulação da abundância, bem como da fosforilação, presença de motivos e de domínios levou à identificação de fosfatases, como Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 e ptprc reguladas por IR, bem como stk38, pkn1, syk e inpp5d reguladas por PCI. A interação mais marcante entre proteínas foi demonstrada como sendo entre os receptores de Fgr e Ptp. Conclusão: Concluímos que as alterações causadas por TC, IR e PCI levaram a intenss alterações na abundância de algumas proteínas e em eventos de fosforilação em neutrófilos, levando ao efeito destrutivo observado após a IR e ao efeito protetor consequente ao PCI / Introduction: Trauma is a phenomenon that involves tissue injury, whereas the surgical trauma (ST) has such injury as a consequence of a surgery. Ischemia reperfusion is common event in many surgical procedures, especially in transplants, as well as in many pathological conditions. Local and remote tissue injuries usually develop after trauma and ischemic reperfusion, part of a phenomenon known as systemic inflammatory response syndrome, frequently followed by multiple organ failure (MOF). Studies have proven the involvement of the neutrophil in all these injuries as a result of proteolytic enzymes secreted from cytoplasmic granules, free radicals produced by respiratory burst, cytokines released after tissue infiltration. In that context, ischemic preconditioning (IPC), that are short episodes of ischemia before ischemia reperfusion, was proved to be protective against these injuries with less activation of neutrophils. However the knowledge about the underlying mechanism operating in the neutrophil after surgical trauma, ischemia reperfusion and preconditioning is preliminary. Objective: To deeply analyze the impact of these conditions (ST, IR and IPC) on the neutrophil proteome and phosphoproteome. Methodology: We did hematological analysis along proteomics and phospho proteomics through high throughput nLC-MS/MS analysis by orbitrap using iTRAQ labeling, phospho peptide enrichments, and HILIC pre-fractionation. Neutrophils from control, ST, IR and IPC conditions after extraction were processed for proteomic analysis. Statistical package using R based on cluster analysis led to the detection of differentially regulated proteins in all conditions. Results: The evaluation of the hematological parameters before and after ST, IR or IPC on blood cells stated alteration in size, number and shape of lymphocytes, RBCs, platelets and specially neutrophils (granulocytes). In the analysis, a clear increase in neutrophil count after ST and IR with such increase prevented by IPC. A total of 393 proteins were found differentially regulated between control and trauma groups. Most of the common proteins found regulated in trauma and IR seem to be related to apoptosis (caspase-3), cell motility (PAK2) and signal transduction in IL5, IL6 and TNF and proteasomal degradation in neutrophil. Higher oxygen species production and dysfunction of directional neutrophil migration (PKC delta) with increase in the life span of neutrophils are early important events that can finally result into more tissue damage and infection. The total proteomic analysis of rat neutrophils after IPC led to the identification of 2437 protein groups assigned to five different clusters with significantly up and downregulated proteins in IR and IPC. Cluster based KEGG pathways analysis revealed up-regulation of chemokine signaling, focal adhesion, leukocyte transendothelial migration, actin cytoskeleton, metabolism and Fc gamma R mediated phagocytosis, whereas downregulation in ribosome, spliceosome, RNA transport, protein processing in endoplasmic reticulum and proteasome, after intestinal ischemic preconditioning. The phosphoregulated proteins containing domains and motifs in the regulated peptides after IR and IPC led to the identification of some of important players such as chemokine, Fc gamma, GPCR, migration and pro/anti-apoptotic pathways. The phosphoproteins from alternative splicing was the pathway presenting the most remarkable regulation with a p-value of 0.0001. The regulation in expression as well as in phosphorylation, the presence of motifs and domains led to the identification of kinases and phosphatases including Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 and ptprc in neutrophils after IR whereas stk38, pkn1, syk, and inpp5d in neutrophil due to IPC. The highest protein-protein interaction was shown by Fgr and Ptp receptors. Conclusion: We concluded that the changed stimulus produced after ST, IR and IPC led to the huge alteration in proteins expression and phosphorylation events in the neutrophil proteome as mentioned in our work, that leads to final destructive and protective phenotype of neutrophils respectively

Controlar a proliferação celular de tumores é um objetivo que vem sendo perseguido há décadas, com moderado sucesso na maioria dos casos. Dentre os diversos tipos de tumores que atingem a humanidade, alguns gliomas são considerados os mais fatais, por haver pouca ou nenhuma alternativa de tratamento efetivo. Agentes que apresentam propriedades anti-tumorais, como glicocorticóides (GC) e a forma all-trans do ácido retinóico (ATRA) são utilizados como adjuvantes no tratamento de alguns tipos de glioma. Entretanto, apesar de serem moléculas bastante conhecidas, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação como anti-tumoral. Para endereçar este problema, nosso laboratório se propôs a isolar e caracterizar genes regulados por estes agentes, utilizando modelos celulares, como as linhagens C6 e ST1 de glioma de rato, e as linhagens T98G e A172 de glioma humano. A linhagem C6 apresenta características de células transformadas e tumorais em cultura, e responde a GC, ou ATRA, com inibição de crescimento e achatamento celular. A linhagem ST1, variante derivado da C6, é hiper-responsiva ao tratamento com GC e, aparentemente, mais responsiva ao tratamento com ATRA, passando por um processo de completa reversão fenotípica tumoral-normal, devido ao expressivo aumento do tempo de dobramento, diminuição da densidade de saturação, recuperação da dependência de fatores de crescimento presentes no soro fetal bovino e da dependência de ancoragem para proliferação e perda do potencial tumorigênico, além de sofrer alterações morfológicas, como um maior achatamento celular e reorganização em feixes paralelos, que a aproximam do fenótipo normal. No presente trabalho buscou-se alterações moleculares induzidas por ATRA em células ST1, para melhor compreender a cascata de eventos desencadeada por ação deste fármaco. Em paralelo foram realizados estudos da ação de ATRA sobre as células T98G, buscando-se correlacionar os dados obtidos em modelo celular murino com modelos humanos. Para tanto, duas metodologias de estudo foram aplicadas: a) análise proteômica através de eletroforese bidimensional de proteínas (2D-PAGE), acoplada à espectrometria de massa (MALDI-TOF), para gerar perfis de expressão protéica na ausência e na presença de ATRA, permitindo comparação e identificação de proteínas moduladas no processo; b) construção de vetores plasmideais e retrovirais para super-expressar ou bloquear a expressão de um inibidor de serina protease de rato (serpinb6), descrito previamente no laboratório como estando potencialmente envolvido no processo de reversão fenotípica de ST1 induzido por ATRA. A abordagem proteômica permitiu a identificação de sete proteínas potencialmente reguladas por ATRA no modelo celular ST1, como as proteínas envolvidas em proliferação celular (c-Fos e SCGF), as proteínas de citoesqueleto (actina e tubulina), as proteínas envolvidas em estresse celular (GRP78 e Hsc70) e a proteína TCTP, classicamente reprimida em processos de reversão do fenótipo tumoral. O uso de construções plasmideais e retrovirais permitiu a obtenção de populações celulares que super-expressam serpinb6 e a análise de fenótipo destas células indicou que serpinb6 também pode ter função citoprotetora em células ST1, o que a coloca junto com as proteínas GRP78 e Hsc70 identificadas, evidenciando a importância desta classe de proteínas no processo estudado. / Control of tumor cell proliferation is an objective that has been pursued for decades, with modest or no success in the majority of the cases. Among the several kinds of tumors that develop in humans, some gliomas are considered the most fatal, due to the lack of alternatives for effective treatment. Anti-tumor agents, such as glucocorticoids (GC) or all-trans retinoic acid (ATRA) are used in combination with other drugs in some glioma cases. However, besides being very known molecules, their anti-tumor mechanism is not completely understood. In order to address this problem, our laboratory decided to isolate and characterize genes regulated by these agents, using cellular models, such as the C6 and ST1 rat glioma cell lines and the T98G and A172 human glioma models. The C6 cell line is fully transformed and tumoral in culture and responds to GC or ATRA treatment, showing growth inhibition and cell flattening. The ST1 variant is hyper-responsive to the treatment with GC and, apparently, more responsive to the treatment with ATRA, when compared to C6. Upon treatment with these agents, it undergoes a complete tumoral to normal phenotypic reversion, characterized by an increase in doubling time, decrease of saturation density in culture, recovery of dependence of serum factors for proliferation and anchorage for colony formation, besides inhability to form tumors in nude mice and morphological changes. Here we present the efforts undertaken towards better understanding of the molecular changes induced by ATRA in ST1 cells. Aiming at the correlation of the data obtained from a rat model with human models, all the studies were performed in parallel with the T98G human glioma cell model. To this end, two study methodologies were applied: a) proteomic analysis through bidimensional electrophoresis coupled to MALDI-TOF identification, to generate protein expression profiles in the presence and absence of ATRA, allowing comparison and identification of proteins modulated in the process; b) construction of plasmid and retroviral vectors to overexpress or block the expression of a serine protease inhibitor (serpinb6), previously described in the laboratory as being potentially involved in the process of tumoral to normal phenotypic reversion promoted by ATRA in ST1. The proteomics approach allowed the identification of seven proteins potentially regulated by ATRA in ST1, such as the proteins involved in cell proliferation (c-Fos and SCGF), cytoskeleton organization (actin and tubulin), cellular stress (GRP78 and Hsc70) and the tumor related protein TCTP, classically repressed in tumoral to normal reversions, and related to the three groups of proteins mentioned above. By using plasmid and retroviral vectors it was possible to obtain recombinant cell populations over-expressing serpinb6. The phenotype analysis of these populations indicated that serpinb6 can also have cell protection effects in ST1, which would classify it together with GRP78 and Hsc70 as an anti-stress protein highlighting the importance of this protein class in the process studied.

O complexo salivar da sanguessuga H. depressa é composto pelas glândulas salivares e probóscide. Análises bidimensionais (2D) mostraram que a maioria das proteínas apresentam pI entre 3.5 à 9.5 e MM entre 10 à 105 kDa. O mapa 2D do complexo salivar apresentou 352 spots totais, sendo 249 exclusivos da saliva (corado por nitrato de prata) e 219 spots totais (corado por Coomassie Blue). As proteínas foram identificadas após sequenciamento tandem MS (proteoma) pela complementariedade às sequências traduzidas do cDNA (transcriptoma). As proteínas mais abundantes foram: antiagregante plaquetário; miohemeritrina e anidrase carbônica. Estas proteínas devem exercer um papel na digestão ou anticoagulação do sangue durante a alimentação. A zimografia também identificou uma protease gelatinolítica (45 kDa). Porém, lefaxin (inibidor de FXa) e hementerina (fibrinogenolítico e inibidor de agregação plaquetária) não foram identificados por estas técnicas biotecnológicas, o que mostra a necessidade de técnicas adicionais para a completa elucidação da constituição desta amostra. / The salivary complex from H. depressa leech is composed of salivary gland and proboscis. Two-dimensional (2D) analysis showed that majority of proteins have pI from 3.5 to 9.5 and MW from 10 to 105 kDa. The 2D gel of salivary complex showed 352 total spots, 249 of them were from saliva (silver stained) and 219 total spots (Coomassie Blue stained). Proteins were identified after tandem MS sequencing (proteome) and complementar analysis of translated sequences from cDNA (transcriptome). The most abundant proteins were: antiplatelet protein; myohemerytrin; carbonic anhydrase. These proteins may have a role in digestion or antihemostatic system during blood feeding. The zymographic assay identified a gelatinolytic protein (45 kDa). But, lefaxin (inhibitor of Fxa) and hementerin (fibrinogenolytic and antiplatelet function) were not identified by these biotechonolgical techniques, showing that additional techniques are necessary for complete knowledge about the composition of this sample.

A revascularização cardíaca utilizando a ponte de safena é um procedimento bastante utilizado para restabelecer o fluxo coronariano. Apesar do sucesso deste procedimento, a patência deste enxerto pode chegar a menos de 50% em 10 anos. Atribui-se parte deste insucesso a variações no processo adaptativo à nova condição hemodinâmica, onde o shear stress e o estiramento aumentados podem estar interferindo na função endotelial e vascular. Este processo envolve a participação de diversas proteínas e o estudo de como elas participam conjuntamente é uma importante abordagem para entender as alterações fisiológicas e patológicas que ocorrem no enxerto vascular. Neste trabalho, tecnologias proteômicas, gel 2-D e ICAT, foram utilizadas para identificar as proteínas que são modificadas nas fases precoces da arterialização do enxerto venoso. Foi utilizado um sistema ex vivo de perfusão controlada, desenvolvido em nosso laboratório, onde a veia safena humana foi cultivada tanto em regime hemodinâmico venoso (5 mL/min) e arterial (50 mL/min, 80 mmHg) por 24 horas. Dentre as proteínas identificadas, a maioria apresenta funções estruturais como, por exemplo, -actina de músculo liso, CRP1, colágeno VI, tropomiosina, miosina, desmina e vimentina. Para avaliação funcional foram selecionadas a -SMA e a CRP. A -SMA mostrou-se diminuída nas fases mais precoces da arterialização venosa, com quase desaparecimento após 3 dias da cirurgia, seguido de um aumento nos períodos subseqüentes. A CRP3 mostrou-se com expressão predominantemente arterial tanto em amostra humana como de rato. A arterialização de segmentos venosos induziu a expressão da CRP3, sendo dependente do aumento do estiramento (stretch) nas células musculares lisas e não do aumento do shear stress na superfície endotelial. Coletivamente, neste trabalho caracterizamos duas proteínas que foram modificadas durante o processo de arterialização e/ou adaptação da veia à condição hemodinâmica arterial. As proteínas identificadas contribuirão para o melhor entendimento do processo de arterialização venosa e poderão ser testadas como novos alvos terapêuticos para melhorar a patência destes enxertos / Coronary artery bypass surgery by saphenous vein graft is still widely used to revascularization of ischemic heart. Despite the success of this procedure, about 50% occlude after 5-10 years. The vein graft is subjected to increased tensile stress and the adaptive vein response to the arterial hemodynamic condition may predispose to bypass occlusion. Several proteins are modulated during arterialization, the understanding of the molecular changes of this process may be useful to new therapeutics approaches development attempting to increase vein graft patency. In this work, proteomics plataform, gel 2-D and ICAT, were used to identify the proteins that are modified in the early stages of vein graft rterialization. Human saphenous vein were cultured in an ex vivo flow through system in both venous (5 ml / min) and arterial (50 ml / min, 80 mm Hg) hemodymanic conditions for 24 hours. The identified proteins were related to cell structural function, such as -SMA, CRP1, collagen VI, tropomyosin, myosin, desmin and vimentin. To functional characterization, -SMA and CRP were selected. In rat vein arterialization model, - SMA showed to be decreased during the early stages of arterialization and almost disappeared after 3 days of surgery. Later on, -SMA-positive cells increase reaching similar expression levels of normal jugular vein. The expressiom of CRP3 showed to be predominantly to arterial beds both in human and rat. When vein segment were submitted to arterial hemodynamic condition, it was observed a significant induction of CRP3 expression. Interestingly, the increase of CRP3 is dependent of stretch stimulus in smooth muscle cells while shear stress did not modify its expression in endothelial cells. Collectively, we successfully identified proteins differentially expressed during the vein arterialization by using proteomic technique. -SMA and CRP3 were modified in vein segments exposed to arterial hemodynamic condition and efficiently discriminate smooth muscle cell phenotype. The identified proteins will contribute to the better understanding of the venous arterialization process and may be tested as new therapeutic targets for improving the patency these grafts

Orientador: Antonio Carlos Cicogna / Resumo: A obesidade é uma doença metabólica complexa considerada uma pandemia global e associada à alta incidência de doença cardiovascular. O excesso de tecido adiposo pode promover mal adaptação que resulta em alterações na estrutura e função do coração; no entanto, os mecanismos não estão totalmente elucidados. A proteômica pode fornecer uma compreensão mais profunda do processo fisiopatológico e contribuir para a identificação de novos potenciais alvos terapêuticos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão proteica miocárdica em ratos saudáveis e obesos por dieta Ocidental, empregando duas abordagens proteômicas, para melhor compreender a rede de mecanismos inerentes à disfunção cardíaca na obesidade. Ratos Wistar foram distribuídos em dois grupos: controle (C, n = 13; dieta controle) e obeso (Ob, n = 13; dieta Ocidental) alimentados por 41 semanas. A obesidade foi determinada pelo índice de adiposidade. A função cardíaca foi avaliada pelo ecocardiograma e análise do músculo papilar isolado. A proteômica foi baseada em eletroforese em gel bidimensional (2-DE) juntamente com espectrometria de massa (LC-MS/MS) e cromatografia-líquida em nanofluxo com espectrometria de massa em tandem (nanoLC-MS/MS) seguida de quantificação label-free. Ratos obesos apresentaram aumento do índice de adiposidade e disfunção cardíaca sistólica e diastólica comparados aos controles. Um total de 82 proteínas miocárdicas foram identificadas como diferencialmente expressas entre os grupos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Obesity is a complex metabolic disease considered a global pandemic and associated with high incidence of cardiovascular disease. The excess of adipose tissue may promotes maladaptation that result in alterations in structure and function of the heart; however, the mechanisms are not fully elucidated. Proteomics may provide a deeper understanding into the pathophysiological process and contribute to the identification of new potential therapeutic targets. Thus, the aim of this was evaluate the myocardial protein expression in healthy and obese rats, employing two proteomic approaches to better comprehend the network of mechanisms inherent to cardiac dysfunction in obesity. Male Wistar rats were distributed into two groups: control (C, n=13; standard diet) and obese (Ob, n=13; Western diet) fed for 41 weeks. The obesity was determined by adipose index. Cardiac function was evaluated by echocardiogram and isolated papillary muscle analysis. The proteomics was based on two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) along with mass spectrometry identification (LC-MS/MS) and nano-liquid chromatography with tandem mass spectrometry (nanoLC-MS/MS) followed by label-free quantification. Obese rats showed increased adiposity index and systolic and diastolic cardiac dysfunction. A total of 82 myocardial proteins was identified as differentially expressed between C and Ob groups using two proteomic strategies, being 43 up- and 39 down-regulated by obesity. These proteins are involved in imp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tesis por compendio / [ES] Para evaluar los efectos del proceso de selección en una línea paterna de conejos, se compararon los rasgos de crecimiento y rendimiento reproductivo de la descendencia actual (generación R36) en similar ambiente con una población control rederivada de embriones de una generación anterior (R18). Para reducir/evitar el efecto del proceso de criopreservación sobre los rasgos fenotípicos se rederivaron embriones de la generación actual (R36) y obtener una 3ra población (R37V). Capítulo 1, se compara la R37V y la descendencia de la R36 nacida por inseminación artificial (R37). Hubo diferencias en rasgos de crecimiento postnatal en las 3 generaciones evaluadas, pero no en el crecimiento fetal, componentes del tamaño de la camada y rasgos reproductivos. Así, los procesos de criopreservación y transferencia de embriones causan cambios en rasgos de crecimiento de poblaciones reconstituidas que influyen en las siguientes generaciones, sin producir cambios en los reproductivos. En los siguientes capítulos, para reducir/evitar los efectos del proceso de rederivación, la deriva genética y factores ambientales sobre los rasgos fenotípicos, se usó sólo poblaciones rederivadas para comparar los rendimientos reproductivos y de crecimiento. Capítulo 2, al ser los machos usados para producir dosis seminales en centros de inseminación y granjas, se evaluó si el programa de selección modificaba los rasgos seminales, el proteoma del plasma seminal y de espermatozoides, y la fertilidad del semen al usarla en inseminación artificial. Se analizó el proteoma del plasma seminal y espermatozoides de machos maduros de c/grupo y se prepararon dosis seminales para inseminación. Sólo el porcentaje de espermatozoides anormales mostró diferencias, presentando los R21 menos espermatozoides anormales que los R39. El análisis discriminante (DA-PLS) mostró efecto de la generación para el proteoma plasmático y espermático. En plasma seminal, se reportaron 64 proteínas diferencialmente expresadas y 56 sobreexpresadas en R39 (87,5%). Del proteoma de espermatozoides 132 diferencialmente abundantes y 89 sobreexpresadas en R39 (67,4%). A pesar de las diferencias en importantes proteínas relacionadas con la capacitación, la motilidad, la inmunoprotección de espermatozoides y la fecundación, no hubo diferencias en fertilidad y prolificidad con las dosis seminales para inseminación. Capítulo 3, se analizó el efecto de la selección por ganancia media diaria de peso (GMD) post-destete después de 37 generaciones. Tras 2 generaciones post rederivación (R21 vs. R39), todos los caracteres evaluados mostraron progreso resultado de la selección, y no afecta a los parámetros estimados de la curva de crecimiento de Gompertz. Los resultados demuestran que el programa de selección mejoró la GMD sin variar el peso corporal adulto, pero tras 37 generaciones de selección, este carácter parece agotado. Capítulo 4, comparamos los parámetros reproductivos de conejas entre las poblaciones rederivadas y control. Los rasgos de desarrollo prenatal y los componentes del tamaño de camada se midieron en la 2da generación post rederivación (R20 y R38). Así la selección por GMD no tiene efectos adversos sobre los componentes del tamaño de la camada, y el área del saco fetal al día 12 de gestación, área de la placenta fetal y la longitud cráneo-rabadilla del feto al 19 de gestación fueron mayores en R38. Resultados muestran que la selección por GMD no afecta negativamente el rendimiento reproductivo. Conclusión, el estudio demuestra que los efectos de la criopreservación sobre los rasgos de crecimiento persisten dos generaciones post rederivación. Además, la línea muestra signos de agotamiento del progreso genético quizás por el bajo rendimiento reproductivo y elevada mortalidad postnatal. La selección por GMD influyó en cambios del crecimiento fetal y del proteoma del eyaculado, sin afectar al rendimiento reproductivo de hembras ni la fertilidad y prolificidad de las dosis seminales de machos. / [CA] Per avaluar els efectes del procés de selección en una línia paterna de conills, es van comparar els trets de creixement i el rendiment reproductiu de la descendència de la generació actual (R36) sota el mateix entorn amb una població control derivada dels embrions emmagatzemats d'una generació anterior (R18). Per reduir/evitar l'efecte del procés de criopreservació embrions de la generació actual (R36) es van criopreservar i transferir (rederivar) per obtenir una 3a població (R37V). Capítol 1, es compara la generació R37V i la descendència de la 36a generació nascuda per inseminació artificial (R37). Hi ha diferències en els trets de creixement postnatal a les tres generacions avaluades. Tot i que el creixement fetal, els components de la mida de la ventrada i els trets reproductius no van mostrar diferències. La rederivació provoquen canvis en els trets de creixement de les poblacions reconstituïdes que influeixen en les generacions següents, sense canvis en els trets reproductius. En els capítols següents, per reduir/evitar els efectes del procés de rederivació, la deriva genètica i els factors ambientals sobre els trets fenotípics, es van utilitzar les poblacions rederivades per comparar els rendiments reproductius i de creixement. Capítol 2, ja que els mascles s'utilitzaven per produir dosis de semen en centres d'inseminació i granges, es va estudiar si un programa de selecció per guany mitja de pes diari pot canviar els trets seminals, el proteoma del plasma i dels espermatozoides i la fertilitat del semen en la inseminació artificial. Només el percentatge d'espermatozoides anormals mostra diferències significatives, R21 presentant menys espermatozoides anormals que R39. L'anàlisi discriminant (DA-PLS) mostra efecte de la generació al proteoma del plasma i dels espermatozoides. En plasma seminal, 64 proteïnes es van expressar de manera diferent, 56 sobre-expressades en R39 (87,5%). El proteoma de l'esperma 132 proteïnes diferencialment abundants, 89 sobre-expressades en R39 (67,4%). Tot i observar diferències en proteïnes importants relacionades amb la capacitat, la motilitat o la immunoprotecció dels espermatozoides i la fecundació, La fertilitat i la prolificitat es van detectar quan es van utilitzar dosis seminals comercials per a la inseminació. Capítol 3, vam avaluar l'efecte d'una selecció a llarg termini per a l'augment de pes mitjà diari (ADG). Després de dues generacions d'ambdues poblacions rederivades (R21 vs. R39), tots els trets avaluats mostra algun progrés. Aquesta resposta no sembla afectar els paràmetres estimats de la corba de creixement de Gompertz. Resultats demostra que el programa de selecció havia millorat l'ADG sense variacions en pes corporal adult, però després de 37 generacions de selecció, aquest tret sembla esgotat. Capítol 4, compara els trets reproductius entre poblacions femenins entre ambdues poblacions (rederivades i control). El desenvolupament fetal i els components de la mida de la ventrada es mesura els trets a la segona generació després de la rederivació (R20 i R38). Resultats suggereix que la selecció per ADG no té cap efecte advers sobre els components de la mida de la ventrada i la zona del sac fetal el dia 12 de gestació i la zona de la placenta fetal i la longitud de la corona-gropa del fetus el dia 19 de gestació eren més grans a la R38. La selecció per ADG no afecta negativament els components de la mida de la ventrada, el creixement fetal i el rendiment reproductiu. Nostre estudi proporciona més proves dels efectes de la criopreservació sobre els trets de creixement que persisteixen dues generacions després de la rederivació. La línia va mostrar signes d'esgotament del progrés genètic per baix rendiment reproductiu i l'alta mortalitat postnatal. La selecció per ADG va influir en els canvis en el creixement fetal i en el proteoma ejaculat, però no va afectar el rendiment reproductiu de les femelles ni la fertilitat i la prolificitat de les dosis seminals dels mascles. / [EN] To evaluate the effects of the selection process in a paternal line of rabbits, growth traits and reproductive performance from the offspring of the current generation (R36) were compared under the same environment with a control population rederived from embryos stored of a previous generation (R18). To reduce or avoid the effect of the cryopreservation process on phenotypic traits embryos of current generation (R36) were cryopreserved and transferred to obtain a third population (R37V). In chapter 1, R37V generation and offspring of 36th generation born by artificial insemination (generation R37) were compared. Differences in postnatal growth traits were observed in the three generations assessed. Although foetal growth, litter size components and reproductive traits did not show significant differences. In conclusion, cryopreservation and embryo transfer processes cause changes in growth traits of reconstituted populations that influence the following generations, without changes in reproductive traits. In the following chapters, to reduce or avoid the effects of the rederivation process, genetic drift and environmental factors on phenotypic traits, only the rederived populations were used to compare reproductive and growth performances. In chapter 2, considering that males were used to produce semen doses at insemination centres and farms, we studied whether a programme of selection by daily gain changed the seminal traits, plasma and sperm proteome and the fertility of semen when used in artificial insemination. Seminal plasma and sperm proteome from mature males of each group were analysed and semen doses were used to inseminate females. Only the percentage of abnormal sperm showed significant differences, R21 presented fewer abnormal sperm than R39. The discriminant analysis (DA-PLS) showed an effect of the generation for plasma and sperm proteome. In seminal plasma, 64 proteins were differentially expressed, 56 were overexpressed in R39 (87.5%). Sperm proteome reported 132 differentially abundant proteins, 89 were overexpressed in R39 (67.4%). Despite differences in important proteins related to capacitation, sperm motility or immunoprotection and to the fertilization process, no differences in fertility and prolificacy were detected when commercial seminal doses were used for insemination. In chapter 3, we evaluated the effect of a long-term selection for post-weaning average daily weight gain (ADG) over 37 generations. After two generations of both rederived populations (R21 vs. R39 generations), all evaluated traits showed some progress as a result of the selection. This response does not seem to affect the estimated Gompertz growth curve parameters. Results demonstrated that the selection programme had improved ADG without variations in adult body weight but, after 37 generations of selection, this trait seems exhausted. In chapter 4, we compared female reproductive traits between both rabbit populations (rederived and control). Foetal growth and litter size traits were measured in the second generation after rederivation (R20 and R38 generations). Our study suggests that selection for growth rate has no adverse effect on litter size components and the foetal sac area at day 12 of gestation, and foetal placenta area and crown-rump length of the foetus at day 19 of gestation were higher in the R38 generation. These results show that selection for growth rate does not adversely affect on reproductive performance. In conclusion, our study provides further evidence of the effects of cryopreservation on growth traits persisting two generations after rederivation. Moreover, the paternal line showed signs of genetic progress exhaustion due to low reproductive performance and high postnatal mortality. Selection by daily weight gain influenced changes in foetal growth and ejaculate proteome, but did not affect the reproductive performance of females or the fertility of seminal doses of males. / This research was supported by AGL2017-85162-C2-1-R research project funded by Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (MICINN, Spain). Funding for open access charge: CRUE- Universitat Politècnica de València. / Juárez Moreno, JD. (2022). Embryo cryopreservation and transfer to rederive a paternal rabbit line after 18 generations. Evaluation of growth and reproductive traits [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185071 / Compendio