A contaminação bacteriana por espécies dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc entre outras bactérias lácticas é um dos principais fatores que afetam o rendimento da fermentação alcoólica. A formação de biofilmes acaba protegendo as bactérias e é uma fonte permanente de contaminação. Objetivando caracterizar tais contaminações em (1) biofilmes de centrífuga, dorna, trocador de calor e tubulação de água e (2) melaço, mosto, levedo, levedo tratado (com H2SO4) e vinho, amostras foram coletadas em diferentes períodos de um sistema fermentativo de alto teor alcoólico (16%). As enzimas de restrição AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI e MspI utilizadas nas análises de T-RFLP foram definidas por análises in silico com sequências do gene 16S rRNA de contaminantes freqüentes. Essas enzimas geram uma maior quantidade de T-RFs únicos entre 30 e 650 pb. Os DNAs extraídos das amostras foram submetidos às análises de T-RFLP para obtenção do perfil molecular das comunidades microbianas dos pontos de coleta. Os índices de diversidade de Shannon foram calculados com base no número dos T-RFs. Foram realizadas as análises dos componentes principais (PCA) e a inferência filogenética dos contaminantes com base nos perfis dos T-RFs. A quantificação dos principais táxons contaminantes foi feita por qPCR utilizando primers específicos delineados neste estudo e considerando a média de cópias do gene 16S rRNA presentes no genoma de cada táxon bacteriano. Na primeira coleta o biofilme de água apresentou maior índice de diversidade microbiana e na segunda, melaço e mosto. PCA sugere que os biofilmes (e não as fontes externas) são os principais contaminantes desse processo fermentativo devido as suas semelhanças com a composição das outras comunidades analisadas. Espécies de Lactobacillus e Bacillus predominaram entre as amostras da primeira coleta. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus e Pseudomonas foram detectados em amostras de biofilme e em amostras líquidas, sendo os principais contaminantes provindos de biofilme no momento da primeira coleta. Na segunda coleta Bacillus foi o principal contaminante e novamente gêneros produtores de ácido lático como Streptococcus, Lactobacillus e Staphylococcus foram os mais freqüentes. Os resultados concordam com o reportado na literatura sobre sistemas fermentativos convencionais. Apenas os primers desenhados para amplificação do gene 16S rRNA de Burkholderia, Pseudomonas e Weissella apresentaram especificidade em testes com isolados. Halomonas sp. foi encontrada em biofilme de dorna através do sequenciamento utilizando primers para esse gênero. Halomonas pode produzir levânio podendo haver o consumo da sacarose disponível para fermentação. Biofilme da centrífuga teve a maior quantidade de micro-organismos nos dois momentos de coleta (1,93E+06 UFC.mg-1 e 2,14E+07 UFC.mg-1, respectivamente) assim como as amostra de levedo entre as amostras líquidas (1,03E+08 UFC.ml-1 e 2,96E+06 UFC.ml-1, na primeira e segunda coleta, respectivamente), indicando níveis consideráveis de contaminantes. Burkholderia e Pseudomonas foram os mais abundantes entre as amostras de biofilmes da primeira e segunda coleta. Nas amostras líquidas Burkholderia apresentou-se em maior quantidade na maioria das amostras da primeira coleta; enquanto Pseudomonas e Weissella em geral predominaram equivalentemente entre as amostras da segunda coleta / Bacterial contamination by Lactobacillus, Bacillus and Leuconostoc and other lactic acid bacteria is one of the main factors that affects the yield in alcoholic fermentation process. Biofilm formation protects the bacteria community and it is a permanent source of contamination. For characterization of these contaminations in (1) biofilms from centrifuge, tank fermentation, heat exchanger and water pipe and (2) molasses, must, yeast, yeast treated (with H2SO4) and wine, samples were taken at two different periods from fermentation system characterized by high alcohol yields (16%). Restriction enzymes AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI and MspI used in T-RFLP analysis were defined by 16S rRNA gene sequences analysis in silico from common contaminants. These enzymes generate high number of unique T-RFs between 30 and 650 bp. DNA from samples were used as template in T-RFLP reactions in order to obtain molecular profiles of microbial communities present at each sample. Shannon diversity index was calculated based on T-RFs numbers. Principal component analysis (PCA) and phylogenetic inference of contaminants were performed based on T-RFs profiles. The main contaminant bacterial taxa were quantified by qPCR using specific primers designed in this study and considering the average of 16S rRNA gene copies previously counted into the genome of each bacterial taxon. Water pipe biofilm showed the highest rate of bacterial diversity in the samples collected in the first sampling period. For the samples collected in the second sampling, the highest rate of bacterial diversity was revealed for molasses and must. PCA suggested that biofilms (but not external sources) are the main contaminants in the studied fermentation process. It is probably due their similarities with the composition of other analyzed communities. Lactobacillus and Bacillus species predominated in first sampling period. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus and Pseudomonas were detected in biofilm and liquid samples. They were the main contaminants from biofilm at this time of sampling. In the second sampling period, Bacillus was the most common genera and other lactic acid bacteria such Streptococcus, Staphylococcus and Lactobacillus were also the most frequent contaminants. These results agree with other reported in the literature about conventional fermentation systems. Only the primers designed in this study to amplify the 16S rRNA gene of Burkholderia, Pseudomonas and Weissella showed specificity in tests with bacterial strains. Halomonas sp. was revealed in biofilms from tank fermentation by DNA sequencing using designed primers for genera. Halomonas can produce levan and may consume sucrose available for generation of alcohol. Centrifugal biofilm had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.93E+06 CFU.mg-1 and 2.14E+07 CFU.mg-1, respectively). In liquid samples, yeast had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.03E+08 CFU.ml-1 and 2.96E+06 CFU.ml-1, respectively); it shows significant levels of contaminants. Burkholderia and Pseudomonas were more abundant among biofilm samples of all samplings. Burkholderia was present in high quantities in the majority of liquid samples taken during the first sampling period; Pseudomonas and Weissella equivalently predominated among samples taken during the second sampling period

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-10-15T01:03:28Z No. of bitstreams: 1 tese_MarcieneAmorimRodrigues.pdf: 2638970 bytes, checksum: d5ff79afee71b478fcb964476ba3b346 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-15T01:03:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_MarcieneAmorimRodrigues.pdf: 2638970 bytes, checksum: d5ff79afee71b478fcb964476ba3b346 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The finger drop of banana is closely related to the maturation process and involves the softening and weakening of the pedicel. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of banana genotypes with contrasting levels of fruit finger drop by means of molecular markers and evaluate the susceptibility and resistance to finger drop from anatomical studies and analysis of gene expression via real-time quantitative PCR.The genotyping data generated by microsatellites was carried out based on the number of base pairs of each fragment and dendrogram cluster calculated by UPGMA method. Of the 30 microsatellite primer evaluated, 139 alleles were obtained, with the average of 4.66 alleles per locus. No relationship was found between the polymorphism detected by microsatellite markers and the degree of finger drop fruit. For the anatomical characterization, genotypes in the maturation stages 4, 5 and 6, and from different ploidy levels and finger drop resistance patterns, were used. In genotype 017041-01, susceptible, the presence of air parenchyma, was observed, a feature which was not evidenced in the resistant genotypes genotypes BB France, Khai Nai and BRS On Preciosa. Higher values of variable AF and increased deposition of lignin in the vascular bundles, were related to finger drop resistance. The values of Ct (cycle threshold) were used to determine the gene expression difference on cell wall modifier genes (PEL1, EXP1 and XTH4) between different stages of maturation in the finger drop zone (ZD) and in the middle of the fruit (control zone-ZC). To perform the analysis of relative expression, the 2? ?? CT method, was used. RT-qPCR analysis showed that there was a differential expression between the stages of maturation. Ploidy levels and resistance patterns, did not show correlation with the results of the expression. Genes XTH4 and PEL1 showed expression profiles related to finger drop in fruits in different genotypes being good candidates for functional studies in bananas, and may be useful in strategies of genetic improvement aiming the production of banana fruits with resistance to finger drop. / O despencamento natural dos frutos da bananeira est? estreitamente relacionado com o processo de matura??o e envolve o amolecimento e enfraquecimento do pedicelo. O objetivo deste trabalho foi estudar a diversidade gen?tica de gen?tipos de bananeira com n?veis contrastantes ao despencamento dos frutos por meio de marcadores moleculares e avaliar a suscetibilidade e resist?ncia ao despencamento a partir de estudos anat?micos e an?lise de express?o g?nica via PCR quantitativo em tempo real. A genotipagem dos dados gerados pelos microssat?lites foi realizada com base no n?mero de pares de base de cada fragmento e para o agrupamento no dendrograma, utilizou-se o m?todo UPGMA. Dos 30 iniciadores microssat?lites avaliados, obteve-se 139 alelos, com m?dia de 4,66 alelos por loco. N?o foi observada rela??o entre o polimorfismo detectado pelos marcadores microssat?lites e o grau de despencamento dos frutos Para a caracteriza??o anat?mica, foram utilizados gen?tipos nos est?dios de matura??o 4, 5 e 6, de diferentes ploidias e padr?es de resist?ncia ao despencamento. No gen?tipo suscet?vel 017041-01 foi observada presen?a marcante de par?nquima aer?fero, caracter?stica que n?o foi evidenciada nos gen?tipos resistentes BB Fran?a, Khai Nai On e BRS Preciosa. As mudan?as anat?micas, observadas durante o amadurecimento nos est?dios de matura??o, foram mais evidentes no gen?tipo suscet?vel 017041-01. Maiores valores da vari?vel AF e maior deposi??o de lignina nos feixes vasculares mostraram-se relacionados ? resist?ncia ao despencamento. Os valores dos Ct (cycle threshold) foram utilizados para determinar a diferen?a da express?o g?nica relativa dos genes modificadores da parede celular (PEL1, EXP1 e XTH4) entre diferentes est?dios de matura??o na zona de despencamento (ZD) e na regi?o mediana da casca (zona controle - ZC). Para realizar a an?lise de express?o relativa, foi utilizado o m?todo 2? ?? CT. Os resultados finais da an?lise por RT-qPCR mostraram que houve uma express?o diferencial entre os est?dios de matura??o nos gen?tipos estudados. Os genes PEL1 e XTH4 demonstraram perfis de express?o relacionados com o despencamento dos frutos em diferentes gen?tipos sendo bons candidatos para estudos funcionais em bananeira, podendo ser utilizado para direcionar o programa de melhoramento da cultura visando ? produ??o de frutos com resist?ncia para essa caracter?stica.

Existe uma preocupação mundial com as mudanças climáticas causadas pelo aumento da concentração de gases do efeito estufa (GEE) e consequente acréscimo na temperatura média da superfície terrestre. A queima de combustíveis fósseis é a maior causadora do aquecimento global e responsável por danos à saúde humana. É notável o esforço global em diversificar a matriz mundial de combustíveis líquidos, priorizando a substituição de fontes fósseis por renováveis. Tal substituição reforça a necessidade de avaliações de todas as emissões de GEE na cadeia produtiva da cana-de-açúcar. O Brasil é o maior produtor de etanol proveniente de cana-de-açúcar. Um importante co-produto deste processo produtivo é a vinhaça, sendo produzida em elevadas quantidades e constituída por uma expressiva carga orgânica. Esta é comumente aplicada ao solo por fertirrigação. Apesar de atuar beneficamente no solo, pouco se sabe sobre a capacidade deste co-produto de aumentar as emissões de GEE no solo. Assim, o objetivo foi avaliar o efeito da aplicação da vinhaça nas emissões de N2O e CH4 e na comunidade de bactérias desnitrificantes e metanogênicas do solo. As amostragens de GEE e solo foram em áreas de cana sem queima a partir da aplicação de doses vinhaça (0, 150, 300 e 450 m3 ha-1). O delineamento experimental realizado foi em cinco blocos casualizados, totalizando 25 câmaras de coleta de gases do efeito estufa. Amostras de solo foram coletadas em quatro períodos de amostragem após aplicação de vinhaça (0, 7, 15 e 30 dias), em dois anos consecutivos. Foram analisados os GEE, N2O e CH4, além da abundancia de genes por meio da técnica de qPCR. A fertirrigação via aplicação de vinhaça no solo, nos dois anos, proporcionou aumento nas emissões de N-N2O, principalmente nos primeiros dias após a aplicação. Contudo os fluxos de C-CH4 oscilaram indicando a capacidade do solo de servir ora como fonte ora como sumidouro deste GEE. Os fatores de emissão obtidos para aplicação de N na forma de vinhaça, dose de 300 m3 ha-1, foram de 0,08% para o primeiro ano e 0,07% para o segundo ano. A partir da técnica de qPCR, a abundância dos genes indicou que a introdução deste resíduo ao solo pode aumentar significativamente o total de bactérias no solo e a atividade do gene nosZ, contudo o mesmo não ocorre com o potencial de desnitrificação biológica (gene nirK) e nem com o gene mcrA (redução de CH4). Os resultados demonstram que a aplicação da vinhaça no solo influencia as emissões de GEE, assim como a comunidade microbiana do solo / There is a global concern with climate change caused by increased concentration of greenhouse gases (GHG) and consequent increase in the average temperature of the Earth surface. Fossil fuels burning is the major cause of global warming and it is responsible for damages to human health. Remarkable global efforts in diversifying liquid fuels have been attempted, giving priority to the replacement of fossil fuels to renewables. Such substitution reinforces the need of an evaluation of all GHG emissions in the production chain of sugarcane. Brazil is the largest producer of ethanol with source from sugarcane. An important co-product of the production process is vinasse, which is being produced in large quantities comprising a significant organic load. This is commonly applied over the ground by fertigation. Despite being good for the soil, little is known about the ability of this co-product of increasing GHG emissions. This work aimed to evaluate the effect of the application of vinasse in the emissions of N2O and CH4 and in the soil community of denitrifying and methanogenic bacteria. Sampling of GHG and soil were performed in areas of sugarcane without burning with the application of different vinasse doses (0, 150, 300 and 450 m3 ha-1). The experiment was conducted in five blocks, totaling 25 collection chambers of greenhouse gases. Soil samples were collected in four sampling periods after application of vinasse (0, 7, 15 and 30 days), in two consecutive years. We analyzed the GHG, N2O and CH4, and the abundance of genes by qPCR technique. The fertigation via vinasse application on the ground in two years provided an increase in emissions of N-N2O, especially in the first couple of days after application. However the flow of C-CH4 was variable indicating the ability of the soil to serve either as source or as sink of this GHG. The emission factor obtained for N application in the form of vinasse dose of 300 m3 ha-1 was 0.08% for the first year and 0.07% for the second year. By qPCR technique, the abundance of the genes indicated that the use of this residue to the soil can significantly increase the amount of bacteria in the soil and nosZ gene activity. However it does not occur with the potential for biological denitrification (nirK gene) or with the gene mcrA (reduction of CH4). These results demonstrate that the application of vinasse in the soil influences GHG emissions as well as the soil microbial community

Circoviren sind kleine, unbehüllte Viren mit einem einzelsträngigen zirkulären DNA Genom mit eine Größe von 1,7 bis 2,4 kb. Das Porcine Circovirus Typ 2 (PCV2), welches zum Genus Circovirus gehört, ist mit einer Anzahl von Krankheitsmanifestationen verbunden worden, die heute als Porcine Circovirus Assoziierte Krankheiten (PCVAD) zusammengefasst sind. Die PCV2-Infektion bei Rindern ist bis zum jetzigen Zeitpunkt marginal erforscht worden. Serologische Untersuchungen auf Circovirus spezifische Antikörperführten zu widersprüchlichen Ergebnissen. Im Jahr 2007 wurde von der Bovinen Neonatalen Panzytopenie (BNP) in Europa mit unklarer Genese berichtet. Das klinisch - pathologische Bild der Hämorrhagien ähnelte dem Krankheitsbild der Infektiösen Anämie, welche durch ein Circovirus bei Hühnern verursacht wird. Deshalb wurde in dieser Studie eine Breitspektrum PCR zum Nachweis von Cirocvirus-Genomen durchgeführt. In 5 von 25 BNP betroffenen Kälbern konnte circovirale DNA nachgewiesen werden. Das komplette Genom wurde nachfolgend amplifiziert, kloniert und sequenziert. Das nachgewiesene Genom (PCV2-Ha08) hat eine Länge von 1768 Nukleotiden und zeigte eine hohe Homologie (bis zu 99%) mit PCV2-Genotyp b (siehe Publikation 1). Als Ursache der BNP ist vor kurzen die Übertragung von Alloantikörpern über das Kolostrum beschrieben wurden, welche die Zerstörungen von Leukozyten und Thrombozyten sowie deren Vorläuferzellen bewirken. Ungeachtet dessen war es wichtig, die Empfänglichkeit und Immunantwort von Kälbern nach experimenteller Infektion mit PCV2 zu studieren. Für diesen Zweck wurden weitere 181 Proben von BNP-Kälbern aus Deutschland mit Hilfe einer Breitspektrum-PCR getestet. In zwei von 181 Proben wurde PCV2 DNA nachgewiesen. Die vollständigen Sequenzen konnten amplifiziert werden. Während das erste Genom aus einer Blutprobe eines Kalbs in Bayern stammte (PCV2-Ha09), stammte das zweite nachgewiesene Genom aus Lunge und Gehirn von einem Kalb in Sachsen (PCV2-Ha10). Das Genom (PCV2-Ha09) besteht aus 1768 nt, währenddessen das Genom (PCV2-Ha10) aus 1767 nt aufgebaut ist (siehe Publikation 2). Weiterhin wurden die PCV2 Empfänglichkeit und die Immunantwort von Kälbern durch experimentellen PCV2 Inokulation sowie die Möglichkeit, eine Serokonversion nach Impfung mit einer kommerziellen PCV2 Vakzin zu entwickeln, untersucht. PCV2-spezifische Antikörper wurden in den PCV2-infizierten Tieren und in den PCV2-immunisierten Tieren im Tag 11 und 7 nach Inokulation (p.i.) nachgewiesen. PCV2-Genome wurden durch quantitative Realtime-PCR zwischen Tag 4 und Tag 46 p.i. nur in den Blutproben sowie in verschiedenen Geweben (z.B. Milz, Lymphknoten, Thymus) der PCV2-infizierten Tiere nachgewiesen. Das Genom, welches von den Lymphknoten der PCV2-infizierten Kälber erneut isoliert wurde, zeigt eine Identität von 99,9% gegenüber dem Inokulum. Dies weist möglicherweise auf adaptierte Mutationen im PCV2 Genom hin. Die Mutationen C1708T und G365C sind während der Infektionen aufgetreten. Die Sequenzanalyse zeigt eine mögliche adaptierte Mutation an der Aminosäure Nr. 105 in Replikationsgen (Met zu Ile) (siehe Publikation 3). Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass der Nachweis der PCV2 Genomen und eine experimentell induzierte Serokonversion möglich war. Es konnte gezeigt werden, dass die Empfänglichkeit von PCV2 nicht allein auf Schweine begrenzt ist und eine Übertragung von PCV2 auf Rinder möglich ist.

Existe uma preocupação mundial com as mudanças climáticas causadas pelo aumento da concentração de gases do efeito estufa (GEE) e consequente acréscimo na temperatura média da superfície terrestre. A queima de combustíveis fósseis é a maior causadora do aquecimento global e responsável por danos à saúde humana. É notável o esforço global em diversificar a matriz mundial de combustíveis líquidos, priorizando a substituição de fontes fósseis por renováveis. Tal substituição reforça a necessidade de avaliações de todas as emissões de GEE na cadeia produtiva da cana-de-açúcar. O Brasil é o maior produtor de etanol proveniente de cana-de-açúcar. Um importante co-produto deste processo produtivo é a vinhaça, sendo produzida em elevadas quantidades e constituída por uma expressiva carga orgânica. Esta é comumente aplicada ao solo por fertirrigação. Apesar de atuar beneficamente no solo, pouco se sabe sobre a capacidade deste co-produto de aumentar as emissões de GEE no solo. Assim, o objetivo foi avaliar o efeito da aplicação da vinhaça nas emissões de N2O e CH4 e na comunidade de bactérias desnitrificantes e metanogênicas do solo. As amostragens de GEE e solo foram em áreas de cana sem queima a partir da aplicação de doses vinhaça (0, 150, 300 e 450 m3 ha-1). O delineamento experimental realizado foi em cinco blocos casualizados, totalizando 25 câmaras de coleta de gases do efeito estufa. Amostras de solo foram coletadas em quatro períodos de amostragem após aplicação de vinhaça (0, 7, 15 e 30 dias), em dois anos consecutivos. Foram analisados os GEE, N2O e CH4, além da abundancia de genes por meio da técnica de qPCR. A fertirrigação via aplicação de vinhaça no solo, nos dois anos, proporcionou aumento nas emissões de N-N2O, principalmente nos primeiros dias após a aplicação. Contudo os fluxos de C-CH4 oscilaram indicando a capacidade do solo de servir ora como fonte ora como sumidouro deste GEE. Os fatores de emissão obtidos para aplicação de N na forma de vinhaça, dose de 300 m3 ha-1, foram de 0,08% para o primeiro ano e 0,07% para o segundo ano. A partir da técnica de qPCR, a abundância dos genes indicou que a introdução deste resíduo ao solo pode aumentar significativamente o total de bactérias no solo e a atividade do gene nosZ, contudo o mesmo não ocorre com o potencial de desnitrificação biológica (gene nirK) e nem com o gene mcrA (redução de CH4). Os resultados demonstram que a aplicação da vinhaça no solo influencia as emissões de GEE, assim como a comunidade microbiana do solo / There is a global concern with climate change caused by increased concentration of greenhouse gases (GHG) and consequent increase in the average temperature of the Earth surface. Fossil fuels burning is the major cause of global warming and it is responsible for damages to human health. Remarkable global efforts in diversifying liquid fuels have been attempted, giving priority to the replacement of fossil fuels to renewables. Such substitution reinforces the need of an evaluation of all GHG emissions in the production chain of sugarcane. Brazil is the largest producer of ethanol with source from sugarcane. An important co-product of the production process is vinasse, which is being produced in large quantities comprising a significant organic load. This is commonly applied over the ground by fertigation. Despite being good for the soil, little is known about the ability of this co-product of increasing GHG emissions. This work aimed to evaluate the effect of the application of vinasse in the emissions of N2O and CH4 and in the soil community of denitrifying and methanogenic bacteria. Sampling of GHG and soil were performed in areas of sugarcane without burning with the application of different vinasse doses (0, 150, 300 and 450 m3 ha-1). The experiment was conducted in five blocks, totaling 25 collection chambers of greenhouse gases. Soil samples were collected in four sampling periods after application of vinasse (0, 7, 15 and 30 days), in two consecutive years. We analyzed the GHG, N2O and CH4, and the abundance of genes by qPCR technique. The fertigation via vinasse application on the ground in two years provided an increase in emissions of N-N2O, especially in the first couple of days after application. However the flow of C-CH4 was variable indicating the ability of the soil to serve either as source or as sink of this GHG. The emission factor obtained for N application in the form of vinasse dose of 300 m3 ha-1 was 0.08% for the first year and 0.07% for the second year. By qPCR technique, the abundance of the genes indicated that the use of this residue to the soil can significantly increase the amount of bacteria in the soil and nosZ gene activity. However it does not occur with the potential for biological denitrification (nirK gene) or with the gene mcrA (reduction of CH4). These results demonstrate that the application of vinasse in the soil influences GHG emissions as well as the soil microbial community

A glutationa S-transferase (GST) tem a capacidade de conferir resistência do tipo não-alvo aos efeitos danosos de certos herbicidas em várias culturas, principalmente gramíneas. Entretanto, o papel das GSTs em relação aos herbicidas em cana-de-açúcar é desconhecido, e tal elucidação poderia auxiliar na redução de perdas de produtividade e/ou aumento na eficiência de produção. O objetivo desse trabalho foi caracterizar as diversas classes de GST de cana-de-açúcar por análise filogenética e padrão de expressão por amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR). Foi realizada no banco de dados de Saccharum Gene Index a busca completa das seqüências codificadoras de GST referentes às classes Phi, Tau, Theta e Zeta, baseando-se nos 61 genes de GST de arroz; estas foram traduzidas e empregadas em análise filogenética. Foram identificados 18 agrupamentos de ESTs codificando GSTs, totalizando 355 transcritos das 255.635 seqüências disponíveis no banco de dados. A análise filogenética identificou 7 agrupamentos como pertencentes à classe Phi (denominados ScGSTF), 7 como Tau (ScGSTU), 1 como Theta (ScGSTT), e 3 como Zeta (ScGSTZ); respectivamente. As classes Phi e Tau, consideradas planta-específica, foram as mais representativas em termos de número de agrupamentos de ESTs em relação à Theta e Zeta (mamífero-específica). Os 18 agrupamentos de cana-de-açúcar equivalem aos genes mais expressos em termos de número de ESTs individuais em arroz. Foram extraídos RNA de diversos tecidos/órgãos, e de tecido foliar das cultivares \'SP87-365\' e \'SP80-3280\' coletados a 0 e 48 h após tratamento com herbicidas, seguida da síntese de cDNA e RT-qPCR. O gene da proteína ribossômica rpl35-4 foi determinado como referência nas análises de expressão. A expressão nos tecidos/órgãos mostraram que os genes ScGSTF3, ScGSTU8 e ScGSTU13 foram menos expressos no colmo, inflorescência, meristema e raiz em relação ao limbo foliar; ScGSTF4, ScGSTF6, ScGSTF14 e ScGSTF15 foram mais expressos no colmo; ScGSTF5, ScGSTU1, ScGSTU17, ScGSTU31, ScGSTU39 e ScGSTT1 na inflorescência; e ScGSTZ1 foi único mais expresso no meristema. De forma geral, todas as classes tiveram expressão detectada nos tecidos, mas os genes da Phi e Tau foram os mais expressos. Os genes da classe Phi foram mais expressos no colmo em relação aos demais; os da classe Tau e Theta na inflorescência; e os da Zeta no meristema. A validação a 0 h determinou que os genes ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU8, ScGSTU13 e ScGSTU17 foram os mais expressos na cultivar \'SP80-3280\' em relação à \'SP87-365\'. As evidentes diferenças na expressão basal entre as cultivares foram dos genes das classes Phi e Tau. Com relação à expressão das GSTs 48 h após aplicação dos herbicidas, foi observado que a aplicação de Ametryn ou Diuron, os genes de GST foram induzidos, enquanto foram reprimidos com Imazapic ou Isoxaflutole. Os genes ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU13 e ScGSTU17 foram os mais expressos nas cultivares tratadas com os herbicidas; e foram considerados possíveis candidatos a associação em resposta a desintoxicação desses herbicidas. O Southern blot determinou que o maior número de cópias de GST em cana-de-açúcar foi os pertencentes às classes Phi e Tau, sendo nas classes Zeta e Theta, menos freqüentes / Glutathione S-transferase (GST) has the ability to confer non-target tolerance to damaging effects of certain herbicides in various crops, especially grasses. However, the role of GSTs in relation to herbicide tolerance in sugarcane s is unknown, and its elucidation could help in reducing yield losses and/or increase in production efficiency. The objective of this work was to characterize the various classes of sugarcane GSTs by phylogenetic analyses and expression profile using RTqPCR. A complete search at the Saccharum Gene Index database was conducted for sequences encoding GSTs from the classes Phi, Tau, Theta and Zeta, based on 61 rice GST genes; the conceptually translated sequences were used in the phylogenetic analyses. Eighteen EST clusters encoding GSTs were identified, in a total of 355 transcripts out of the 255,635 available sequences at the database. Phylogenetic analysis identified 7 groups as belonging to Phi class (denominated ScGSTF), 7 as Tau (ScGSTU), one as Theta (ScGSTT), and 3 as Zeta (ScGSTZ); respectively. The Phi and Tau classes, considered plant-specific, were the most frequent in terms of number of EST clusters in comparison to Theta and Zeta (mammal-specific). The 18 groups of sugarcane ESTs were equivalent to the mostly expressed ortologues in rice. Total RNA from various tissues and organs, and from leaves from cultivars \'SP87-365\' and \'SP80-3280\', collected at 0 and e 48 h after treatment with herbicides were obtained and converted into cDNA, and analyzed by RT-qPCR. The transcript of the ribosomal protein rpl35-4 was established as gene reference for the RT-qPCR analyses. The analyses of expression in tissues/organs demonstrated that the genes ScGSTF3, ScGSTU8 and ScGSTU13 were less expressed in stem, inflorescence, meristem and roots in relation to leaf blades; ScGSTF4, ScGSTF6, ScGSTF14 and ScGSTF15 were more expressed in stems; ScGSTF5, ScGSTU1, ScGSTU17, ScGSTU31, ScGSTU39 and ScGSTT1 in the inflorescence; and ScGSTZ1 was the only more expressed in the meristem. In general, all classes had gene member expression detected in the tissues, but the genes from Phi and Tau were the most expressed. The genes from class Phi were more expressed in the stem in comparison to the others; genes from classes Tau and Theta were more expressed in the inflorescence; and the ones from Zeta in meristem. Gene expression validation at 0 or 48 h after treatment with herbicides determined that ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU8, ScGSTU13 and ScGSTU17 were more expressed in cultivar \'SP80-3280\' than \'SP87-365\'. The more evident differences in basal expression between cultivars were for genes from classes Phi and Tau. In response to herbicides treatment, GSTs expression was higher in response to Ametryn or Diuron in comparison to Imazapic or Isoxaflutole. Genes ScGSTF3, ScGSTF4, ScGSTU13 and ScGSTU17 displayed more difference in expression at 48 h between cultivars, and might be associated with differences in herbicide detoxification. Southern blot analyses determined that a larger number of GST gene copies in sugarcane from classes Phi and Tau, with less copies from classes Zeta and Theta

Orientador: Célia Regina Nogueira / Resumo: A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença malígna, clonal, da célula tronco hematopoética. A descoberta do cromossomo filadélfia e subsequente identificação do gene BCR-ABL, levaram a compreensão da biologia da doença que culminou com o desenvolvimento de drogas alvo-específicas, assim como o de métodos moleculares para o monitoramento da doença. O foco atual das pesquisas em LMC está voltado para o maior entendimento dos mecanismos moleculares e epigenéticos que levam a resistência terapêutica e progressão da doença. Estudos recentes demonstram que a expressão de micro-RNAs específicos modula oncogenes e genes supressores envolvidos no desenvolvimento de neoplasias. Ao encontro a esta tendência, propomos um estudo que procurou identificar o perfil de micro-RNAs dos pacientes bons respondedores aos tratamentos de primeira linha para LMC. Avaliamos o perfil de micro-RNAs, de 41 pacientes com LMC que atingiram resposta citogenética completa (ausência do cromossomo Filadélfia) após o tratamento com inibidor de tirosinaquinase e transplante alogênico de células progenitoras hematopoéticas, por meio do sistema de micro-RNA PCR arrays (TaqMan® Human Micro-RNA Array A e B). Identificamos uma assinatura de micro-RNA distinta entre os grupos tratados, apesar de se encontrarem no mesmo patamar de resposta clínica e citogenética. Palavras-chave: Leucemia Mielóide Crônica, micro-RNA, imatinibe, transplante, qPCR array. / Abstract: Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a malignant clonal hematopoietic stem cell disease. The discovery of the Philadelphia chromosome and subsequent identification of the gene BCR-ABL have led to understanding the biology of the disease and the development of target-specific drugs, as well as molecular methods for monitoring the disease. The current focus of research in the CML is facing the greatest understanding of the molecular and epigenetic mechanisms that lead to therapy resistance and disease progression. Recent studies show that the expression of specific micro-RNAs modulates oncogenes and tumor suppressor genes involved in cancer development.We are proposing a new study in the literature that aims to identify the profile of micro-RNAs of patients good responders to first-line treatments for CML.Evaluated the profile of micro-RNAs in 41 CML patients who achieved a complete cytogenetic response (absence of Philadelphia chromosome) after treatment with tyrosine kinase inhibitor and allogeneic bone marrow transplantation, through the micro-RNA- PCR arrays (TaqMan® Human Micro-RNA Array A e B). We identified a distinct micro-RNA signature between the treated groups, despite being on the same level of cytogenetic and clinical response.Key Words: Chronic Myeloid LeuKemia, micro-RNA, imatinib, bone marrow transplantation, qPCR array. / Mestre

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-04-05T19:37:55Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Raquel Martins Abreu - 2014.pdf: 2480777 bytes, checksum: f8c50ff359945dffab56d7874ad25086 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-06T11:34:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Raquel Martins Abreu - 2014.pdf: 2480777 bytes, checksum: f8c50ff359945dffab56d7874ad25086 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-06T11:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Raquel Martins Abreu - 2014.pdf: 2480777 bytes, checksum: f8c50ff359945dffab56d7874ad25086 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-04-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Drought, a major problem concerning a sustainable rice production in Brazil and worldwide, is responsible for a series of plant responses, including modification in gene expression, accumulation of metabolites and protein synthesis. In order to verify the correspondence between five Arabidopsis genes (PLDα1, LEW2, GluR2, Lsi1 e EIN2), previously related to drought tolerance, and their respective orthologs in rice, the present study analyzed two contrasting rice genotypes for drought, Douradão, the tolerant genotype, and Primavera, the susceptible one. The genotypes were submitted to drought stress and subsequently evaluated for gene expression by quantitative real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR). The comparison of gene expression, between leaf and root tissues, showed a greater expression in roots, within their vegetative stage, and leaves, within their reproductive stage. Differential expression were observed mainly among the genes whose orthologs in Arabidopsis encode phospholipase Dα1 (PLDα1) and ethylene-insensitive protein (EIN2); these proteins are directly related to abscisic acid (ABA), a phytohormone that when identified in higher concentration in cells triggers the expression of drought stress-responsive genes, besides it is also responsible for the regulating the water loss (by transpiration) by controlling of stomatal movement. The results suggested that orthologs genes were in fact drought stress-responsive genes in rice, and emphasized the feasibility of PLDα1 and EIN2 overexpression in rice plants, supporting plant breeding programs in the development of drought tolerant genotypes. / A seca, um dos principais problemas para a sustentabilidade do cultivo de arroz no Brasil e no mundo, é responsável por uma série de respostas em plantas, incluindo mudanças na expressão gênica, acúmulo de metabólitos e síntese de proteínas. No intuito de verificar a correspondência entre cinco genes de Arabidopsis (PLDα1, LEW2, GluR2, Lsi1 e EIN2), previamente relacionados com a tolerância à seca, e seus respectivos genes ortólogos em arroz, o presente estudo analisou dois genótipos de arroz contrastantes no nível de tolerância à seca, Douradão, genótipo tolerante, e Primavera, genótipo susceptível. Os genótipos foram submetidos a experimento de seca e posterior avaliação de expressão gênica via PCR quantitativa em tempo real, qPCR (real time quantitative-Polimerase Chain Reaction). Ao se comparar os níveis de expressão entre os tecidos foliar e radicular, desses genótipos, foi observado, de uma forma geral, que houve maior expressão em raízes no estádio vegetativo e em folhas no estádio reprodutivo. Níveis diferenciais de expressão entre os genótipos foram observados principalmente para os genes ortólogos responsáveis por produzir fosfolipase Dα1 (PLDα1) e proteína etileno insensitiva (EIN2); estes produtos estão diretamente relacionados ao ácido abscísico (ABA), um fito hormônio induzido por estresse de seca que, quando em alta concentração nas células, além de acionar a expressão de muitos genes, desempenha um papel vital na regulação da perda de água por transpiração ao controlar os movimentos estomáticos. Os resultados apresentados nesta pesquisa sugeriram que os genes ortólogos estariam de fato atuando em resposta à tolerância à seca em arroz, e reforçaram a hipótese de que a superexpressão desses genes, em especial, PLDα1 e EIN2, pode auxiliar programas de melhoramento genético de arroz no desenvolvimento de cultivares mais tolerantes à seca.

O objetivo do presente estudo foi: a) comparar dois métodos de detecção e contagem de S. agalactiae, (cultura microbiológica e qPCR) em leite de vacas e de tanques; b) determinar a sensibilidade analítica e a repetibilidade do diagnóstico por qPCR em relação à cultura microbiológica para detecção de S. agalactiae em amostras compostas de leite de vaca e de tanque. Foram utilizadas amostras de leite de vaca (n=31) e de tanque (n=150), as quais foram submetidas à cultura microbiológica e contagem de S. agalactiae por cultura de microbiologia convencional e qPCR. Para avaliar a sensibilidade analítica, foi construída uma curva padrão com amostras de leite desnatado reconstituído estéril contaminado artificialmente com S. agalactiae (ATCC 13813). Em apenas duas amostras não foi possível amplificação de DNA, o que indica que a qPCR foi capaz de detectar S. agalactiae, em 96% e 97%, do leite de vaca e de tanque, respectivamente. Embora a técnica qPCR tenha apresentado alta sensibilidade analítica, não houve equivalência de resultados de contagem S. agalactiae entre os dois métodos propostos. Os coeficientes de variação interensaio utilizados para avaliar a técnica qPCR foram < 5%, o que demonstra que a técnica possui repetibilidade adequada. Portanto, não houve equivalência entre a contagem de S. agalactiae por cultura microbiológica padrão e a técnica de qPCR, provavelmente pela alta sensibilidade da técnica qPCR em quantificar DNA de células inviáveis. No entanto, a qPCR apresentou-se como uma técnica sensível para identificação de S. agalactiae em amostras de leite de vaca e de taque. / The aim of this study was to: a) to compare two methods of detection and enumeration of S. agalactiae (microbiological culture and qPCR) in cow`s milk and bulk tank milks, b) to determine the analytical sensitivity and repeatability of the diagnosis by qPCR in relation to microbiological culture for detection of S. agalactiae on composite samples of cow\'s milk and bulk tank milk. Samples of cow\'s milk (n = 31) and bulk tank milk (n = 150), which were submitted to microbiological culture and enumeration of S. agalactiae by conventional microbiology culture and qPCR. To evaluate the analytical sensitivity, a standard curve was made with samples of sterile reconstituted skim milk artificially contaminated with S. agalactiae (ATCC - 13813). In two samples was not possible the amplification of DNA, indicating that qPCR was able to detect S. agalactiae, 96% and 97% cow\'s milk and bulk tank milk, respectively. Although the technique has presented qPCR high analytical sensitivity, there was no equivalent result of counting S. agalactiae between the two proposed methods. The interassay coefficients of variation technique used to evaluate the qPCR were <5%, which demonstrate that the technique has adequate repeatability. So there was no equivalence between the counts of S. agalactiae by standard microbiological culture and qPCR technique, probably due to the high sensitivity of qPCR technique to quantify DNA of unviable cells. However, the qPCR presented as a sensitive technique for identifying S. agalactiae in samples of cow\'s milk and bulk tank milk.

Objetivou-se com o presente estudo caracterizar as mudanças na população bacteriana ruminal, ocasionadas pelo aumento de concentrado na dieta, utilização de diferentes fontes de CNF e volumosos com diferentes digestibilidades da fibra. Para tanto, foram coletadas amostras de líquido ruminal, para posterior quantificação relativa de bactérias ruminais, oriundas de quatro projetos de pesquisa conduzidos no Laboratório de Pesquisa em Gado de Corte, pela FMVZ/USP - Pirassununga-SP. Em todos os experimentos, foram utilizados animais da raça Nelore, castrados e canulados no rúmen, em delineamento experimental de quadrado latino. Foi realizada uma quantificação relativa através da técnica de qPCR de três bactérias celulolíticas (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus e Ruminococcus flavefaciens), duas amilolíticas (Streptococcus bovis e Ruminobacter amylophilus), e uma consumidora de lactato (Megasphaera elsdenii), para determinação do efeito da dieta sobre a população de microrganismos ruminais. No Experimento 1, as dietas experimentais foram formuladas com dois níveis de concentrado: 60% ou 80%, sendo que o volumoso utilizado foi silagem de cana-de-açúcar (variedade IACSP 93-3046). Dentro de cada nível de inclusão de concentrado, foram utilizados três fontes de CNF: milho floculado a vapor (MFV), polpa cítrica peletizada (PCP), ou milho moído (MM). MFV e PCP foram incluídas na dieta em substituição parcial de 70% do MM. No Experimento 2, as dietas experimentais foram formuladas com 60% de concentrado, sendo que o volumoso utilizado foi a cana-de-açúcar fresca ou ensilada, com alta ou baixa digestibilidade da fibra (DFDN). No Experimento 3, as dietas experimentais foram formuladas com dois níveis de concentrado: 60% ou 80%, sendo que o volumoso utilizado foi a cana-de-açúcar fresca, com alta ou baixa DFDN. No Experimento 1, o aumento de concentrado resultou em queda da população de F. succinogenes (P<0,01) e S. bovis (P<0,01), e aumentou R. flavefaciens (P=0,05). A substituição parcial do MM por PCP resultou em aumento de S. bovis (P=0,01) e redução de R. flavefaciens (P<0,01). Já a substituição do MM por MFV reduziu R. albus (P<0,01). Houve uma interação Dieta*CNF apenas para a M. elsdenii (P=0,02), onde o MFV aumentou M. elsdenii apenas na dieta com 80% de concentrado. No Experimento 2, o fornecimento de cana fresca resultou em um aumento da população de S. bovis (P<0,01), e M. elsdenii (P=0,06). Houve interação entre DFDN e modo de conservação da cana sobre a população de F. succinogenes (P=0,01), onde a cana de alta DFDN aumentou a população de F. succinogenes apenas com o fornecimento de cana fresca. No Experimento 3, o aumento de concentrado resultou em queda de S. bovis (P<0,01), e aumento de R. amylophilus (P=0,07). Houve interação entre DFDN e nível de concentrado para a F. succinogenes (P=0,06) e R. albus (P<0,01), onde a cana de alta DFDN aumentou a população destes microrganismos apenas na dieta com 60% de concentrado. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que o desempenho animal pode ser explicado pela modulação da população de microrganismos ruminais por meio da composição da dieta. / The aim of this study was to characterize the population change of cellulolytic and amylolytic rumen bacteria, caused by the increase of concentrate, and by the use of different sources of NFC in diets with sugarcane silage. Samples of rumen contents were collected for subsequent analysis of the relative quantification of rumen microorganisms, from four research projects conducted at the Research Laboratory in Beef Cattle at FMVZ / USP - Pirassununga-SP. In all experiments, Nellore beef cattle, castrated, and ruminal cannulated, were used in a Latin square design. Three cellulolytic bacteria (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus and Ruminococcus flavefaciens); two amylolytic (Streptococcus bovis and Ruminobacter amylophilus); and a lactate fermenting microorganism (Megasphaera elsdenii), were quantified by the technique of qPCR, to determine the effect of diet on the population of rumen microorganisms. Experiment 1, the experimental diets were formulated with two levels of concentrate: 60% or 80%, and the roughage used was sugarcane silage (IACSP 93-3046). Within each level of concentrate inclusion, three different sources of NFC were used: steam flaked corn (SFC), pelleted citrus pulp (PCP), or ground corn (GC). SFC and PCP were included in the diet in partial replacement of 70% of GC. Experiment 2, the experimental diets were formulated with 60% of concentrate level, and two sugarcane genotypes divergent for stalk NDFD, with high or low NDFD, either freshly cut or as silage. Experiment 3, the experimental diets were formulated with two levels of concentrate: 60% or 80%, and the roughage used was fresh sugarcane, with high or low NDFD. In the Experiment 1, increasing concentrate in the diet decreased the population of F. succinogenes (P<0.01) and S. bovis (P<0.01), and increased R. flavefaciens population (P=0.05). The partial replacement of GC by PCP increased S. bovis population (P=0.01) and decreased R. flavefaciens population (P<0.01). The replacement of GC by SFC decreased the population of R. albus (P<0.01). There was a significant Diet*NFC interaction only for M. elsdenii (P=0.02), where SFC increased the relative population only at the 80% concentrate diet. Experiment 2, Diets with fresh sugarcane increased the population of S. bovis (P <0.01), and M. elsdenii (P=0.06). There was a significant interaction between NDFD and conservation mode of sugarcane for F. succinogenes (P = 0.01), where sugarcane with high NDFD increased F. succinogenes population only when sugarcane was offered as freshly cut. In Experiment 3, the increase concentrate in the diet decreased S. bovis population (P<0.01), and increased R. amylophilus (P=0.07). There was a significant interaction between NDFD and concentrate level for F. succinogenes (P=0.06) and R. albus (P<0.01), where sugarcane with high NDFD increased the population of these microorganisms only at the 60% concentrate diet. The animal performance can be explained by modulation of the population of the rumen microorganisms through diet composition.