Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants

As Terras Pretas de Índio (TPIs) na Amazônia Brasileira são altamente férteis e o seu conteúdo químico parece não exaurir mesmo em condições de floresta tropical. Por essa razão, são frequentemente procuradas pelas populações locais para o cultivo de subsistência. A importância das comunidades microbianas tem aumentado o interesse em compreender a relação entre o uso da terra, as comunidades de plantas, os micro-organismos e os processos do ecossistema. Portanto, o objetivo principal desta pesquisa foi investigar as comunidades bacterianas sob a influência da cobertura vegetal em sistemas de uso da terra (floresta secundária e plantio de mandioca) e na rizosfera de plantas leguminonas nativas em comunidades de bactéria das TPIs. Além disso, investigou-se também as bactérias desnitrificantes nesses solos. A área de estudo está localizada na Estação Experimental do Caldeirão, pertencente à Embrapa Amazônia Ocidental, no município de Iranduba-AM. A funcionalidade da comunidade bacteriana foi determinada pela Análise de Perfil Fisiológico da Comunidade Microbiana (CLPP), a estrutura da comunidade bacteriana foi acessada por Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição Terminal (T-RFLP), a composição e distribuição das comunidades bacterianas foram determinadas por sequenciamento em larga escala (pirosequenciamento), e para quantificar as bactérias desnitrificantes foi utilizada a técnica de PCR quantitativa (qPCR). Os estudos foram realizados no laboratório de Biologia Celular e Molecular (CENA / USP) e no departamento de Biogeoquímica (Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology). A análise de T-RFLP mostrou que o uso da terra e a sazonalidade afetaram as comunidades bacterianas na TPI, e mostrou também um claro efeito da rizosfera nas comunidades bacterianas. CLPP demonstrou que a atividade funcional da TPI não foi afetada pela sazonalidade. Além disso, a tecnologia de pirosequenciamento foi uma ferramenta importante para diferenciar filotipos raros. Diferenças distintas de alguns filos bacterianos da rizosfera foram observadas, indicando que a zona de raiz contribui para moldar essas comunidades. A abundância relativa do gene nirK não foi afetada pelo uso da terra nos dois tipos de solos. Alterações na estrutura das comunidades dos genes nirK e nosZ foram observadas em ambos os tipos de solos. As comunidades desnitrificantes na TPI pareceram ser mais influenciadas pelo uso da terra do que pela sazonalidade, e ACH foi mais influenciada pelas variações de sazonalidade. / Amazonian Dark Earths (ADEs) in the Brazilian Amazon are highly fertile and its chemical content seems not to get depleted even under tropical humid conditions. For this reason, these soils are frequently searched by local population for subsistence farming. The importance of microbial communities has grown the interest in understanding the relationship between land use, plant communities, microorganisms, and ecosystem processes. Therefore, the main objective of this research was to investigate the effect of vegetation cover in land use systems (secondary forest and cassava plantation) and rhizosphere of native leguminous plants on bacterial communities of ADEs. Furthermore, it was also aimed to investigate denitrifying bacteria in these soils. The study area is located at the Experimental Station of Caldeirão, belonging to Embrapa Amazônia Ocidental, Iranduba, AM. The bacterial community function was determined by Community Level Physiological Profile (CLPP), the bacterial community structure was assessed by Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP), the bacterial community composition and distribution by high-throughput sequencing (pyrosequencing), and the quantification of denitrifier bacteria by Quantitative PCR (qPCR). The studies were performed in the Laboratory of Cell and Molecular Biology (CENA/USP) and the Deparment of Biogeochemistry (Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology). T-RFLP analysis showed that land use and seasonality affected bacterial communities in ADE, and also showed a clear rhizosphere effect on bacterial communities. CLPP have shown that ADE functional activity was not affected by seasonality. Furthermore, pyrosequencing technology was an important tool to differentiate rare phylotypes. Distinct differences of some rhizosphere bacterial phyla were also observed, indicating that the root zone contributed to shape these communities. The relative abundance of nirK gene was not affected by land use in both studied soils. Alterations in the community structure of nirK and nosZ genes were observed for both soils. ADE denitrifying communities seemed to be more affected by land use than seasonality, and ACH was more influenced by seasonal variations.

As metalotioneínas (MTs) constituem uma superfamília de proteínas de baixo peso molecular (5-10 kDa), ricas em cisteinas. As MTs de plantas são classificadas em quatro tipos de acordo com o arranjo de cisteinas na cadeia polipeptídica. A função das metalotioneínas em plantas é ainda desconhecida, mas as evidências sugerem que teriam um papel na regulação da homeostasia de metais essenciais, detoxificação de metais pesados e proteção contra espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho foram identificados e caracterizados seis genes de metalotioneína a partir das seqüências codificantes para MTs depositadas em banco de dados de cana-de-açúcar, mediante análise filogenética e comparações por alinhamento com os membros da família gênica de metalotioneínas de arroz (Oryza sativa) e Arabidospsis. Os seis genes MTs de cana de açúcar foram classificados como sendo dois do tipo 1 (SoMT1a e SoMT1b); dois do tipo 2 (SoMT2a e SoMT2b); um do tipo 3 (SoMT3); e um tipo 4 SoMT4 (Ec). A região promotora presumível de quatro genes (SoMT1a, SoMT1b, SoMT2b e SoMT3) foi caracterizada e os motivos cis-regulatórios identificados. A distribuição de éxons e íntrons foi estabelecida, e dois éxons separados por único íntron foram identificados na estrutura dos genes SoMT1a e SoMT2b. Um segundo íntron parece estar presente na estrutura dos genes SoMT2a e SoMT3, mas os resultados não foram conclusivos. O gene SoMT1b não foi caracterizado para composição éxons/íntrons. Foi avaliada a expressão constitutiva de SoMT1a, SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b e SoMT3 em diferentes tecidos/órgão (colmo, inflorescência, limbo foliar, meristema e raiz). SoMT1a e SoMT1b foram mais abundantemente expressos em todos os tecidos, seguidos de SoMT2b e SoMT3. SoMT2a apresentou a menor expressão. A expressão dos cinco genes SoMTs foi também avaliada em parte aérea e raízes de plântulas de cana-de-açúcar em resposta a 100 e 500 µM de cobre, crescidas in vitro. Não houve modulação da expressão dos genes SoMTs nos tecidos examinados para as doses de cobre utilizadas, as 6, 24, 48 e 96 h após imposição dos tratamentos. A resposta dos genes SoMTs também foi avaliada para o tratamento com 200g L-1 ha-1 de paraquat, aos 15 min, 6 e 24 h após aplicação do herbicida em folhas de plantas deSP80-3280. Houve uma tendência a repressão da expressão dos genes SoMTs, significativa as 6 e 24 h somente para SoMT1a. A expressão de SoMT1b, SoMT2a e SoMT3 foi significativamente reprimida as 24 h após a imposição do tratamento, enquanto que não houve efeito significativo sobre a expressão de SoMT2b. Em relação a expressão dos cinco genes SoMTs em resposta a inoculação com patógenos, plântulas de \'SP70-1143\' e \'RB72-454\', consideradas suscetíveis e resistentes, respectivamente ao fungo da ferrugem, foram inoculadas e não inoculadas com Puccinia melanocephala, enquanto que plântulas de \'SP78-4467\' e \'SP82-1176\', consideradas suscetíveis e resistentes, respectivamente a bactéria da escaldadura, foram inoculadas ou não com Xanthomonas albilineans. As coletas de parte aérea das plântulas foram realizadas aos 15 min, 4, 8, 24, 48, 96 e 240 h após inoculação. Foi observado aproximadamente 4 vezes mais transcritos de SoMT1a em plantas de \'SP70-1143\', suscetível a Puccinia melanocephala, em relação a cultivar resistente \'RB72-454\'. Entretanto, houve uma tendência a repressão de SoMT1a nas plantas suscetíveis inoculadas com o fungo, significativamente as 8 e 24 h após tratamento, não havendo diferenças para as plantas da cultivar resistente após inoculação. A expressão constitutiva dos genes SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b e SoMT3 foi similar entre ambas as cultivares e manteve-se inalterada após inoculação com o fungo. Não houve diferenças significativa entre as cultivares suscetíveis e resistentes em relação a expressão basal dos genes SoMTs, nem foi observado efeito significativo sobre a expressão dos genes SoMTs após inoculação das plântulas com X. albilineans. Por fim, transcritos dos cinco genes SoMTs foram clonados em vetor de expressão para expressão heteróloga em Escherichia coli e proteína presumível pode ser observada em géis de poliacrilamida SDS-PAGE. Entretanto, não foi caracterizada uma modulação importante dos cinco genes SoMT em resposta a condições de estresse bióticos (patógenos) e abióticos (Paraquat e metais), que permitisse a associação direta desses genes com a resposta a estresse oxidativo / Metallothioneins (MTs) are part of a low molecular weight (5-10 kDa) cysteine-rich protein super-family. Plant MTs are classified into four types according to cysteine location in the protein sequence. MTs function is largely unknown, but evidences suggested their role in metal homeostasis, heavy metal detoxification, and protection against reactive oxygen species. This work identified and characterized six sugarcane MT genes from expressed sequences available in databases, by alignment and phylogenetic analyses using members from the MT gene family from rice (Oryza sativa) and Arabidopsis. The six sugarcane MT genes were classified as two of type 1 (SoMT1a and SoMT1b); two of type 2 (SoMT2a and SoMT2b); one of type 3 (SoMT3); and one SoMT4 (Ec). The gene putative promoter region of four genes (SoMT1a, SoMT1b, SoMT2b and SoMT3) were characterized, with the cis-regulatory motifs identified. Exon and intron location were established, with two exons and one intron identified for SoMT1a and SoMT2b, A second intron appeared to be present on SoMT2a and SoMT3, but results were inconclusive. SoMT1b could not be characterized for exons and introns. Gene expression analyses was conducted for SoMT1a, SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b and SoMT3 in various tissues/organs (stem; inflorescence; leaf; meristem; and root). SoMT1a and SoMT1b were the most expressed genes in all tissues, followed by SoMT2b and SoMT3; SoMT2a was the least expressed. Expression of the five SoMTs genes were evaluated in shoots and roots from in vitro plant grown on 100 or 500 µM copper. There was no modulation of expression in the evaluated tissues at 6, 24, 48 and 96 h after treatment. Gene expression was also evaluated at 15 min, 6 and 24 h after tretament with 200g L-1 ha-1 Paraquat. There was a trend to repress expression of the SoMT genes, being significan only for SoMT1a at 6 and 24 h. Expression of SoMT1b, SoMT2a and SoMT3 were significantly repressed at 24 h after treatment, while there was no significant effect on SoMT2b expression. In relation to the expression of the five SoMTs in response to biotic stress, plants from cultivars \'SP70-1143\' and \'RB72-454\', considered susceptible or resistant respectively, to the rust fungus, were inculated or not with Puccinia melanocephala, whereas plants of \'SP78-4467\' e \'SP82-1176\', considered susceptible or resistant respectively, to the sugarcane leaf scald, were inoculated or not with Xanthomonas albilineans. Shoots were sampled at 15 min, 4, 8, 24, 48, 96 and 240 h after inoculation. Plants of the susceptible \'SP70-1143\' contained 4 times SoMT1a transcripts than the resistant \'RB72-454\'. However, there was a trend to decrease SoMT1a transcripts in susceptible plants, significantly 8 and 24 h after P. melanocephala inoculation, while no difference was observed for expression in resistant plants. The constitutive expression of the other genes (SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b and SoMT3) were similar between cultivars, and remained unchanged after inoculation. There was no significant differences for constitutive SoMTs expression between the X. albilineans susceptible and resistant cultivars, nor an inoculation effect of gene expression. Transcripts from the five SoMTs genes were cloned into vetor for heterologous expression in Escherichia coli , and putative proteins were seen in polyacrylamide gels. Therefore, the modulation of the five SoMT genes in response to various abiotic (Paraquat or metals) or biotic (pathogen) stress condition was not characterized to allow definite conclusions about the direct role of metallothioneins in response to oxidative stress

Camundongos AIRmax e AIRmin homozigotos para os alelos R e S do gene Slc11a1 foram avaliados para susceptibilidade à artrite induzida por pristane (PIA). A presença do alelo S aumentou a incidência e a gravidade nos AIRmax, sugerindo que o gene Slc11a1, ou outro próximo, esteja interagindo com os loci de resposta inflamatória na modulação de PIA. Para identificar estes loci foram realizados estudos de associação genótipo-fenótipo e de expressão gênica global. Os RNAs das patas dos animais foram isolados após 180 dias da indução por pristane. As análises de expressão gênica global foram realizadas usando a plataforma Codelink (36k genes), cujos resultados foram validados por PCR em tempo real. Os estudos de associação foram realizados através da análise de polimorfismo de microssatélites pelo programa MapManager. Foram identificadas duas regiões nos cromossomos 1 e 11. Um número grande de genes diferencialmente expressos foi verificado nos animais AIRmax SS cujos temas biológicos significativamente sobre-representados foram a resposta inflamatória e quimiotaxia. Os camundongos AIRmax SS também possuem uma ativação maior dos genes Ccl3, Ccl7, C3ar1, Il10, Stat3, Tirap, Trem 1, Trem 3, Mefv, Ptx3, Chi3l3 e Kras. Alguns desses genes co-localizam com regiões previamente mapeadas nos cromossomos 1 e 11. / AIRmax and AIRmin mice homozygous for Slc11a1 R and S allele were evaluated for pristane-induced arthritis (PIA) susceptibility. The presence of S allele increased the incidence and the arthritis severity in ARmax mice, suggesting that Slc11a1 or other closed-linked gene interacts with inflammatory loci to modulate PIA. In order to identify inflammatory modifier loci modulating experimental arthritis development, genotype-phenotype association studies and global gene expression analyses were performed. Mice received i.p. injections of pristane and the paw RNAs were isolated at day 180. Global gene expression analysis was performed on Codelink bioarrays (36k genes) and validated by real time PCR. The microsatellite polymorphism analyses were performed using MapManager program. Two regions on chromosomes 1 and 11 were identified. Higher number of differentially-expressed genes were detected in AIRmax SS subline, which significant over-represented biological themes were related to inflammatory response and chemotaxis. Susceptible AIRmax SS mice also display high up-regulation of Ccl3, Ccl7, C3ar1, Il10, Stat3, Tirap, Trem 1, Trem 3, Mefv, Ptx3, Chi3l3 e Kras genes. Some of them co-localize with previously identified regions mapped on chromosomes 1 and 11.

A cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) se destaca como fonte protéica e mineral para as populações humanas, principalmente, para populações de baixa renda. Dentre os agentes patogênicos, o fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. Scrib., causador da antracnose, é considerado o de maior importância devido aos seus efeitos destrutivos para o feijoeiro. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão de genes candidatos a atuarem na defesa da planta durante a interação incompatível do feijoeiro SEL 1308 e raça 73 do C. lindemuthianum, considerando diferentes tecidos (folhas, epicótilo e hipocótilo) e períodos de interação (24, 48, 72 e 96 horas). Além disso, o trabalho visou a validação de bibliotecas de ESTs (Expressed Sequence Tags) de feijoeiro (MELOTTO et al., 2005) e a análise da estabilidade de possíveis genes de referência para as análises de expressão por RT-qPCR. Foram utilizados 20 genes no estudo: 12 possivelmente responsivos ao patógeno e oito candidatos a genes de referência. A eficiência média das curvas de amplificação e valores dos ciclos e de quantificação (Cq) foram definidos no programa LinRegPCR. A estabilidade dos genes de referência foi avaliada nos programas geNorm e NormFinder. A expressão relativa dos genes alvos e normalizadores e as análises estatísticas foram determinadas no programa REST. As combinações de genes de referência Act2/Ukn2 e InsDeg/Act2 foram utilizadas para normalização dos genes-alvo por RT-qPCR. Os dados de expressão relativa dos transcritos entre as bibliotecas de ESTs foram validados pelo RT-qPCR. Os genes-alvo analisados foram todos responsivos ao sistema fitopatogênico avaliado, revelando perfil transcricional específico nos tecidos e período de interação com o patógeno. Os dados permitiram a disponibilização de genes de referência importantes para análise de expressão por RTqPCR em feijoeiro sob estresse biótico; e indícios para melhor entendimento dos processos envolvidos nos mecanismos de defesa do feijoeiro ao patógeno da antracnose / Common bean crop (Phaseolus vulgaris L.) highlight as protein and mineral source to the human population, especially, for low-income populations. Among the pathogens, Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. - Scrib., which causes anthracnose, is considered the most important due to its destructive effects to common bean. This study aimed to evaluate the expression of candidate genes to act in defense of the plant during the incompatible interaction between common bean SEL 1308 and race 73 of C. lindemuthianum, considering different tissues (leaves, epicotyl and hypocotyl) and periods of interaction (24, 48, 72 and 96 hours). Also, this study attempted the validation of ESTs (Expressed Sequence Tags) libraries of common bean (MELOTTO et al., 2005) and the evaluation of candidate reference genes stability for expression analysis in RT-qPCR. Twenty genes were used: 12 candidate genes responsive to the pathogen and eight candidate reference genes. The average efficiency of amplification curves and the values of quantification cycles (Cq) were defined in LinRegPCR software. The stability of reference genes was evaluated using geNorm and NormFinder softwares. Relative expression of target and normalizer genes and statistical analysis were determined by REST software. The Act2/Ukn2 and InsDeg/Act2 reference genes combinations were used for normalization of target genes by RT-qPCR. The data of relative expression of transcripts between the libraries of ESTs were validated by RT-qPCR. All target genes analyzed were responsive to the pathogenic system evaluated, revealing specific transcriptional profiles in tissues and periods of interaction with the pathogen. The data provided the availability of normalizers important for expression analysis by RTqPCR in beans under biotic stress; and evidences to understand the processes involved in defense mechanisms of common bean against the anthracnose pathogen

Estresses abióticos como seca, alta salinidade e baixas temperaturas, afetam o crescimento e a produtividade em culturas de interesse comercial como o feijoeiro comum. Proteínas DREB (Dehydration Responsive Element Binding) são fatores de transcrição que regulam genes específicos envolvidos na tolerância ao estresse abiótico. Para determinar como as plantas toleram condições ambientais adversas, variedades tolerantes, biologia molecular e bioinformática podem ser aplicadas para identificar e caracterizar genes que controlam mecanismos de adaptação a estresses. Baseado nas informações disponíveis nos bancos de dados públicos, a sequência da Orf completa do gene Phvul.009G029600.1| PACid:27146455 contendo 1062 pb foi encontrada e usada para o desenho dos primers e para o sequenciamento. A nova sequência é muito similar ao AtRAP2.4 e foi nomeada como PvDREB6A, segundo a análise filogenética. Ferramentas de predição mostraram que a sequência apresenta 354 aminoácidos e possui uma cópia do domínio AP2, que se dobra em uma estrutura com três ?-folhas e uma ?-hélice apresentando resíduos importantes e motivos específicos de reconhecimento e de ligação ao DNA. Além disso, um peptídeo trânsito foi detectado na porção N-terminal com um sítio de clivagem no resíduo 52. A interação deste fator de transcrição com seu domínio de ligação ao DNA foi validada por Electro Mobility Shift Assay (EMSA). A localização subcelular da proteína foi realizada e expressão da Green Fluorescent Proteín (GFP) foi detectada no núcleo. A transformação genética para a superexpressão do gene PvDREB6A em plantas de Arabidopsis thaliana Columbia-0 e mutantes nocaute para o gene AtRAP2.4 (Salk_020767C) foi realizada. Quatro eventos com cópia única e melhor expressão do gene PvDREB6A denominados Col-0/pFEC2.1 #1, Salk_020767C/pFEC2.1 #13.1, Salk_020767C/ pFEC2.1 #19.7 e Salk_020767C/ pFEC2.1 #23.7, foram selecionados. O evento Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 mostrou melhor expressão do gene PvDREB6A e foi visualizado sob luz UV. A análise funcional revelou que as plantas transgênicas submetidas ao déficit hídrico, à alta salinidade e ao frio, apresentaram maior taxa de sobrevivência. Plantas transgênicas superexpressando o gene PvDREB6A apresentaram menor taxa de desidratação e de vazamento de eletrólitos quando submetidas a estresses abióticos. Uma análise da expressão de genes relacionados à tolerância foi conduzida. A quantificação revelou que a expressão de 18 genes: AtDC1.2, AtUSP, AtKIN1, AtERF69, AtGolS3, AtMT2A, AtCAP160, AtNTR1.7, AtGPR7, AtPDC2, AtLTI78, AtCOR15a, AtCOR15b, AtCOR47, AtCOR413, AtLEA6, AtLEA9 e AtLEA14, relacionados a tolerância a seca, sal e frio foram up-regulated devido à superexpressão do gene PvDREB6A de feijoeiro nas plantas transgênicas / Abiotic stresses like drought, high salinity and low temperatures affect growth and productivity in crops of economic interest such as common bean. DREB (Dehydration Responsive Element Binding) proteins are transcription factors that activate specific genes involved in tolerance to abiotic stress. To generate new information on the research for drought and other abiotic stresses, tolerant varieties, molecular biology and bioinformatics can be applied to identify and characterize genes that control plant defense and adaptation mechanisms to water deprivation, to excessive salt and to high/low temperature. Based on public databases, a common bean DREB sequence was found and an in silico study was carried out. A complete Orf sequence Phvul.009G029600.1 |PACid:27146455 containing 1062 bp was found and used for primer design and sequencing. The new sequence was very similar to AtRAP2.4 and named as PvDREB6A, according to phylogenetic analysis. Prediction tools showed that the deduced 354 aa sequence has one copy of the AP2 domain, folding in a three ?-sheets and one ?-helix structure, and presenting important residues and motifs for DNA contacting and binding specificity. In addition, a chloroplast transit peptide was detected at the N-terminal region with cleavage site in the 52 residue. Binding activity of this transcription factor was validated by Electro Mobility Shift Assay (EMSA). Subcellular localization was verified by transient expression of PvDREB6A::GFP in Nicotiana benthamiana and the expression of GFP was detected at the nucleus. Genetic transformation for overexpression of PvDREB6A gene in Arabidopsis thaliana wild type and knockout mutant for AtRAP2.4 gene was conducted. Four single copy events with better expression of the PvDREB6A named Col-0/pFEC2.1 #1, Salk_020767C/pFEC2.1 #13.1, Salk_020767C/pFEC2.1 #19.7 and Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 were selected. The event Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 showed the best expression of PvDREB6A and was visualized under UV light. Functional analysis, revealed that transgenic plants under water deficit, high salt, and cold showed higher survival rate. Transgenic plants overexpressing the PvDREB6A exhibited lower water loss rate and electrolyte leakage rate under abiotic stress. A gene expression analysis with tolerant-related genes was conduted. The quantification revealed that 18 genes, AtDC1.2, AtUSP, AtKIN1, AtERF69, AtGolS3, AtMT2A, AtCAP160, AtNTR1.7, AtGPR7, AtPDC2, AtLTI78, AtCOR15a, AtCOR15b, AtCOR47, AtCOR413, AtLEA6, AtLEA9 e AtLEA14, related to drought, salt and cold tolerance, were up-regulated due to the overexpression of PvDREB6A from common bean in the transgenic plants

A diversidade microbiana é geralmente considerada por seu papel nos principais processos do ecossistema, tais como a decomposição da matéria orgânica e ciclos biogeoquímicos. No entanto, informações sobre o impacto da diversidade em funções menores, como degradação de xenobióticos são escassas. Nós estudamos a partir da abordagem da \'diluição para extinção\', o papel da diversidade sobre a capacidade da comunidade microbiana em degradar o fungicida clorotalonil (organoclorado). Também estudamos o comportamento da comunidade bacteriana após aplicação do pesticida no solo com e sem biochar. A diversidade microbiana do solo natural foi alterada artificialmente por diluição, constituindo um gradiente de diversidade (SN > 10-1 > 10-3 > 10-6), seguido pela inoculação em amostras de solo estéril e posterior reestruturação (15 dias). Após a reestruturação da comunidade, as amostras foram manejadas com biochar (1% m/m) e tratadas com a dose de campo do CHT. O comportamento da comunidade bacteriana foi estudo por PCR-DGGE e qPCR do gene 16S rDNA através de um experimento com molécula fria (não radiomarcada). Enquanto a capacidade de degradação do CHT foi estudada por radiorespirometria (14C-CHT). Inicialmente, a comunidade de bactérias foi influenciada pelo gradiente de diversidade obtido por diluição. A separação dos grupos bacterianos se mostrou bastante similar nos três primeiros períodos pré-aplicação do CHT (SN > 10-1 - 10-3 > 10-6), enquanto que no período de 15 dias, a dinâmica de grupos foi alterada (SN > 10-1 > 10-3 - 10-6). O fungicida e o biochar não exerceram efeitos na comunidade bacteriana no tempo zero (imediatamente após a aplicação), a modificação no perfil da comunidade foi atribuído à diluição. Nos períodos de 21 e 42 dias, o perfil comunidade bacteriana apresentou forte modificação. Os grupos bacterianos se mostraram mais dispersos quando considerado somente o CHT. Embora, a análise de ANOSIM indicou não haver diferença nas amostras com e sem biochar, sugerindo que o clorotalonil foi quem mais contribuiu na dispersão dos grupos bacterianos. No período de 42 d, a comunidade apresentou resposta positiva, sendo observado aumentos no número de bandas e no índice de Shannon em todos tratamentos. Isto possivelmente, devido a menor concentração do fungicida disponível na solução do solo, diminuindo assim, os efeitos deletérios sobre a comunidade. Os dados de qPCR não apresentaram alteração no número de copias do gene 16S rDNA em todos os tratamentos. A remoção da diversidade impactou fortemente a capacidade da comunidade bacteriana de degradar o clorotalonil. Apesar da capacidade de degradar não ter sido perdida, a mínima alteração na diversidade promoveu elevada redução na taxa de mineralização do CHT. A dissipação do CHT se mostrou rápida (D50 < 1 dia) em todos os tratamentos, além disso, a formação de 14C-resíduos não extraíveis foi constituiu um dos principais mecanismos de dissipação do CHT. A partir da degradação do fungicida, foram detectados três metabólitos. Conclui-se que a modificação por diluição da diversidade bacteriana promoveu impacto negativo na mineralização do clorotalonil. E que a formação de resíduos não extraíveis consistiu no principal mecanismo de dissipação do CHT em ambos solos. / Microbial diversity is generally considered for his role in key ecosystem processes, such as decomposition of organic matter and biogeochemical cycles. However, information about the impact of diversity on minor functions, such as degradation of xenobiotics is scant. We study from the approach of \'dilution to extinction\', the role of diversity on the capacity of microbial community to degrade the chlorothalonil (organochlorine). We also studied the behavior of bacterial community after applying the pesticide in the soil with and without biochar. Microbial diversity of the soil natural (control) was artificially altered by dilution, forming a gradient of diversity (SN > 10-1 > 10-3 > 10-6), followed by inoculation in sterile soil samples and subsequent restructuring (15 days). After of the community restructuring, the samples were handled with biochar (1% w/w) and treated with the chlorothalonil field dose. The behavior of the bacterial community was studied by PCR-DGGE and qPCR of the 16S rDNA gene through an experiment with cold molecule (no radiolabeled). While the CHT degradation capacity was studied by radiorespirometry (14C-CHT). Initially, the community of bacteria was influenced by the diversity gradient obtained by dilution. The separation of bacterial groups showed very similar in the first three pre-application periods of the CHT (SN > 10-1 - 10-3 > 10-6). While in the period of 15 days, the group dynamic has changed (SN > 10-1 > 10-3 e 10-6). During periods of 21 and 42 days, the profile bacterial community showed strong modification. The bacterial groups were more dispersed when only considered the CHT. Although, the ANOSIM analysis indicated no difference in samples with and without biochar, suggesting that chlorothalonil who has contributed the most in the dispersion of bacterial groups. In the period of 42 days, the community presented a positive response, being observed increases in the number of bands and Shannon-Weiner index in all treatments. This possibly due to less concentration of fungicide available in soil solution, thus reducing, the deleterious effects on the community. The qPCR dates showed no change in the number of copies of the 16S rDNA gene in all treatments. The removal of microbial strongly impacted the ability of the bacterial community to degrading chlorothalonil. Despite the ability to degrade not having been lost, the minimum change in diversity promoted high reduction in the rate of mineralization CHT. The dissipation of the CHT showed quick (D50 < 1 d) in all treatments, in addition, the formation of non-extractable 14C-residues was one of the main mechanisms of dissipation of the CHT. From the degradation of chlorothalonil, three metabolites were detected. We conclude that modification by dilution of the bacterial diversity had a negative impact on the mineralization of chlorothalonil. And the formation of non-extractable residues consisted in the main CHT dissipation mechanism in both soils.

A cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) se destaca como fonte protéica e mineral para as populações humanas, principalmente, para populações de baixa renda. Dentre os agentes patogênicos, o fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. Scrib., causador da antracnose, é considerado o de maior importância devido aos seus efeitos destrutivos para o feijoeiro. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão de genes candidatos a atuarem na defesa da planta durante a interação incompatível do feijoeiro SEL 1308 e raça 73 do C. lindemuthianum, considerando diferentes tecidos (folhas, epicótilo e hipocótilo) e períodos de interação (24, 48, 72 e 96 horas). Além disso, o trabalho visou a validação de bibliotecas de ESTs (Expressed Sequence Tags) de feijoeiro (MELOTTO et al., 2005) e a análise da estabilidade de possíveis genes de referência para as análises de expressão por RT-qPCR. Foram utilizados 20 genes no estudo: 12 possivelmente responsivos ao patógeno e oito candidatos a genes de referência. A eficiência média das curvas de amplificação e valores dos ciclos e de quantificação (Cq) foram definidos no programa LinRegPCR. A estabilidade dos genes de referência foi avaliada nos programas geNorm e NormFinder. A expressão relativa dos genes alvos e normalizadores e as análises estatísticas foram determinadas no programa REST. As combinações de genes de referência Act2/Ukn2 e InsDeg/Act2 foram utilizadas para normalização dos genes-alvo por RT-qPCR. Os dados de expressão relativa dos transcritos entre as bibliotecas de ESTs foram validados pelo RT-qPCR. Os genes-alvo analisados foram todos responsivos ao sistema fitopatogênico avaliado, revelando perfil transcricional específico nos tecidos e período de interação com o patógeno. Os dados permitiram a disponibilização de genes de referência importantes para análise de expressão por RTqPCR em feijoeiro sob estresse biótico; e indícios para melhor entendimento dos processos envolvidos nos mecanismos de defesa do feijoeiro ao patógeno da antracnose / Common bean crop (Phaseolus vulgaris L.) highlight as protein and mineral source to the human population, especially, for low-income populations. Among the pathogens, Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Lams. - Scrib., which causes anthracnose, is considered the most important due to its destructive effects to common bean. This study aimed to evaluate the expression of candidate genes to act in defense of the plant during the incompatible interaction between common bean SEL 1308 and race 73 of C. lindemuthianum, considering different tissues (leaves, epicotyl and hypocotyl) and periods of interaction (24, 48, 72 and 96 hours). Also, this study attempted the validation of ESTs (Expressed Sequence Tags) libraries of common bean (MELOTTO et al., 2005) and the evaluation of candidate reference genes stability for expression analysis in RT-qPCR. Twenty genes were used: 12 candidate genes responsive to the pathogen and eight candidate reference genes. The average efficiency of amplification curves and the values of quantification cycles (Cq) were defined in LinRegPCR software. The stability of reference genes was evaluated using geNorm and NormFinder softwares. Relative expression of target and normalizer genes and statistical analysis were determined by REST software. The Act2/Ukn2 and InsDeg/Act2 reference genes combinations were used for normalization of target genes by RT-qPCR. The data of relative expression of transcripts between the libraries of ESTs were validated by RT-qPCR. All target genes analyzed were responsive to the pathogenic system evaluated, revealing specific transcriptional profiles in tissues and periods of interaction with the pathogen. The data provided the availability of normalizers important for expression analysis by RTqPCR in beans under biotic stress; and evidences to understand the processes involved in defense mechanisms of common bean against the anthracnose pathogen

La réplication de l’ADN est une fonction cellulaire responsable de la duplication du matériel génétique. Elle est assurée par un complexe protéique appelé réplisome. Ce processus est hautement régulé en fonction des conditions de croissance cellulaire. Durant cette thèse je me suis intéressé principalement au contrôle de la réplication par le Métabolisme Central Carboné (MCC) et, dans une moindre mesure, au fonctionnement du réplisome chez la bactérie modèle Bacillus subtilis. J’ai analysé la réplication de l’ADN dans des mutants métaboliques, par deux techniques ; la QPCR et la cytométrie en flux. Mes analyses révèlent que la réplication de l’ADN est dérégulée dans des cellules mutées dans les cinq dernières réactions de la glycolyse et dans celles affectées dans des réactions connectant cette petite région du métabolisme aux autres réactions du MCC (haut de la glycolyse, voie des pentoses phosphate et cycle de Krebs) et au milieu extérieur (voies overflow qui éliminent les métabolites du MCC produits en excès). J’ai constaté que dans ces mutants la réplication commence plutôt et dure plus longtemps que dans une souche sauvage. L’ensemble de ces résultats montre que les réactions situées au cœur du MCC sont importantes pour assurer un bon contrôle temporel de la réplication. J’ai aussi établi que le ppGpp, une petite molécule fonctionnant comme une alarmone de l’état nutritionnelle des cellules, ne joue pas un rôle déterminant dans le contrôle de la réplication par le métabolisme dans des cellules à l’état d’équilibre. L’ensemble de nos connaissances actuelles sur les réplisomes repose essentiellement sur les données accumulées à partir de la dissection du réplisome de la bactérie modèle Escherichia coli et des phages T4 et T7. Chez Bacillus subtilis, deuxième modèle bactérien le mieux connu et représentant des Gram+ à faible GC%, il existe deux ADN polymérases essentielles à la réplication : PolC et DnaE. Nous avons montré que DnaE, comme PolC, fait partie du réplisome. Nos études fournissent une explication moléculaire à la spécialisation de DnaE dans la synthèse du brin d’ADN discontinu. En conclusion, nos résultats montrent que les réplisomes bactériens ont beaucoup plus évolué qu’attendu tant dans leur composition protéique que dans leur organisation et leur fonctionnement. Ils montrent également, et pour la première fois, que le contrôle temporel de la réplication dépend de réactions situées au cœur du MCC chez B. subtilis. Ces données et d’autres de la littérature suggèrent que cette propriété pourrait être universelle et pourrait jouer un rôle important dans la carcinogenèse. / DNA replication is a central cellular function for the duplication of the genetic material. A protein complex that is called replisome carries out this function. The process of replication is highly regulated with respect to cell growth conditions. During my thesis I was primarily interested in the control of replication by the central carbon metabolism (CCM) and to a lesser extent, to the functioning of the replisome in the bacterium Bacillus subtilis. The thesis studied the DNA replication in metabolic mutants by employing two techniques; QPCR and flow cytometry. The analyses showed that DNA replication is deregulated in cells that carry the following mutations: First, cells with mutations in the last 5 reactions of glycolysis. Second, cells with mutations in the reactions that connect the last part of glycolysis to the other parts of CCM (upper part of glycolysis pathway, pentose phosphate and Krebs cycle). Third, cells mutated in the overflow genes (channels that eliminate overflow metabolites produced in excess in CCM). The results demonstrate that in these mutants the replication begins and lasts longer than in the wild strain. All of these results show that the reactions that are centrally located to the CCM are important to ensure a correct control of replication timing. I also found that the ppGpp, a small molecule that functions as an alarmone of nutritional state in the cells, does not play a decisive role in the control of replication by metabolism in cells in steady state. The current knowledge of replisomes is mainly based on accumulated data from the dissection of the replisome of the model bacterium Escherichia coli and the phages T4 and T7. Bacillus subtilis is the second well studied bacterial model, a representative of Gram+ low GC%, it carries –unlike E. coli- two essential DNA polymerases for replication: PolC and DnaE. The thesis showed that DnaE as PolC form a part of the replisome in B. subtilis and provide a molecular explanation to the specialization of DnaE in the synthesis of the DNA lagging strand. In conclusion, the results show that there is much more diversity in the protein composition, organization and functioning of replisomes in bacteria than it is expected. In addition, the thesis concluded for the first time that the temporal control of replication depends on reactions located in the heart of CCM in B. subtilis. This property, in combination with other data from the literature, suggests that it could be universal and play an important role in carcinogenesis.

A leprose dos citros, principal doença viral que afeta a citricultura no Brasil, é causada pelo Citrus leprosis virus C (CiLV-C, gênero Cilevirus). CiLV-C possui um genoma bipartido de RNA de fita simples, polaridade positiva, que codifica para seis proteínas. O vírus é transmitido de planta a planta por ácaros Brevipalpus phoenicis e pode infectar mais de 40 espécies vegetais, produzindo lesões localizadas cloróticas ou necróticas ao redor do sítio de inoculação pelo ácaro. Invariavelmente, o patógeno não realiza movimento sistêmico em nenhuma de suas hospedeiras conhecidas. Para se revelar os mecanismos moleculares que determinam a atípica interação vírus/ácaro/planta, as atividades das principais vias de defesa foram avaliadas durante a infestação de A. thaliana com ácaros avirulíferos e virulíferos para o CiLV-C. A expressão de 19 genes marcadores associados às respostas de defesa do hospedeiro foi verificada mediante PCR quantitativo (RT-qPCR) em um experimento de time course (6, 12 e 24 horas após a infestação, e no momento do aparecimento dos sintomas de leprose). As análises demostraram que os genes envolvidos na via do ácido salicílico (SA) foram induzidos durante a interação com o ácaro e com o vírus. O perfil de expressão dos genes desta via durante a infestação com ácaros virulíferos foi similar ao observado com ácaros avirulíferos, porém a resposta da planta a ambos os estímulos foi mais intensa. Ademais, ambas as vias do ácido jasmônico e etileno foram ativadas durante a interação com o ácaro e reprimidas ao longo da infecção com o vírus, sugerindo uma interferência antagonística mediada pela via do SA. O mecanismo de silenciamento de RNA foi regulado de maneira diferencial em resposta à interação com ácaros avirulíferos e virulíferos. Diante da infecção viral, em tempos iniciais da infecção, as plantas responderam com a ativação de uma primeira linha de defesa mediada por AGO1, e depois alternaram para uma segunda linha de defesa mediada por AGO2. Os resultados indicam a ativação de um processo multifatorial em resposta ao CiLV-C e ao ácaro B. phoenicis em A. thaliana. / Citrus leprosis, the main viral disease affecting citrus orchards in Brazil, is caused by Citrus leprosis virus C (CiLV-C, genus Cilevirus). CiLV-C has a bipartite genome of singled stranded positive RNA, which encodes six proteins. CiLV-C is plant-to-plant transmitted by Brevipalpus phoenicis mites and can infect more than 40 plant species, invariably producing localized chlorotic or necrotic lesions around the site of feeding of the viruliferous mites. Viral long distance movement in its hosts is not accomplished. To unveil the mechanisms determining the unique characteristic of the virus/mite/plant interaction, activities of main plant defense pathways were evaluated during aviruliferous and CiLV-C viruliferous mite infestation in Arabidopsis thaliana. The expression of 19 marker genes involved in defense responses along a time course experiment (6, 12 and 24 hours after infestation, and after appearance of leprosis symptoms) was assessed by RT-qPCR. Analyses showed that genes involved in the salicylic acid (SA) pathway were up-regulated during plant interaction with mite and virus. The SA pathway expression profile observed at the infestation by viruliferous mites resembled those observed for the aviruliferous mites, but plant response to both stimuli was stronger. Both the jasmonic acid and ethylene pathways were activated during mite/plant interaction and were repressed at the course of infection with CiLV-C, suggesting an antagonistic effect mediated by the activated SA pathway. Gene silencing mechanism was differentially regulated in response to both aviruliferous and viruliferous mites. Upon viral infection, plants responded with the activation of an AGO1-mediated first defense line, in early times of infection; and then switched to an AGO2-mediated defense. Results indicate the activation of a multifactorial process in response to CiLV-C and B. phoenicis mites in A. thaliana.