Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-25T20:49:24Z No. of bitstreams: 1 ELISANGELA BATISTA DA SILVA- DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015.pdf: 1682556 bytes, checksum: 441c1648554dce2563984e2135e7eae7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-25T20:49:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ELISANGELA BATISTA DA SILVA- DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015.pdf: 1682556 bytes, checksum: 441c1648554dce2563984e2135e7eae7 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / CNPq / Enzimas são proteínas biocatalisadoras, aumentam a velocidade de reação sem alterar o equilíbrio. Apresentam alta eficiência durante as reações bioquímicas no metabolismo dos seres vivos. O soro de queijo pode apresentar-se aplicado na dieta de alguns animais; como também serem descartado nos efluentes. O extrato seco do soro de leite corresponde à lactose, proteínas, sais minerais e gordura, dos quais a lactose é o material energético utilizado em processos biotecnológicos (indústria farmacêutica e alimentícia) e as proteínas destacam-se devido ao valor nutricional. A hidrólise é um método promissor para a indústria de alimentos, pois possibilita o desenvolvimento de novos produtos hidrolisados, aumentando assim a disponibilidade de nutrientes aos produtos lácteos e a nível mundial e atenuação por intolerantes a lactose. A imobilização de enzimas é uma técnica cada vez mais utilizada a fim de melhorar a aplicação industrial de enzimas permitindo um melhor controle da produção e redução de custos. Objetivou-se estudar coimobilização de lactase e neutrase em suporte de quitosana comparando metodologias visando à hidrólise da lactose e proteínas do soro de queijo, além de promover o reaproveitamento de produtos regionais mais baratos como suportes a base de quitosana e alginato de sódio. Inicialmente prepararam-se os suportes a serem aplicados no estudo com quitosana 4% (m/v) e alginato de sódio 2,5% (m/v) ativados com glutaraldeído 5% (v/v). Na primeira etapa, determinaram-se o rendimento e atividade de imobilização e coimobilização, atividade recuperada e atividade aparente dos melhores derivados obtidos. Para a segunda fase, os catalisadores imobilizados e coimobilizados foram estudados quanto à estabilidade térmica e operacional, tempo de meia vida, grau de hidrólise e concentração de glicose. Os resultados para os derivados formados a partir da quitosana foram satisfatórios obtendo um rendimento de coimobilização para a neutrase (76,53%) e para a lactase (91,30%). Suportes de alginato de sódio não apresentaram boa adequação para imobilização e coimobilização obtendo-se rendimentos nulos. Houve um aumento na estabilidade térmica e tempo de meia vida nos derivados de quitosana. Na comparação do grau de hidrólise entre a neutrase livre, imobilizada e coimobilizada obteve-se um melhor desempenho da enzima imobilizada (20%) em 80 minutos de reação. Quando se comparou a conversão de glicose com lactase livre, imobilizada e coimobilizada a melhor resultado foi a lactase livre (15g/L) em 30 minutos de reação. A estabilidade operacional da neutrase em cinco ciclos consecutivos ocorreu uma queda de (46%) no grau máximo de hidrólise, já a lactase em seu quinto ciclo de reutilização em bateladas foi obtido perda de (16,4%) na concentração de glicose. Dessa forma, obtiveram-se bons derivados de lactase e neutrase coimobilizada possibilitando a reutilização da enzima, reduzindo custos de processo. / Enzymes are proteins biocatalisadoras, increase reaction speed without changing the balance. They feature high efficiency during the biochemical reactions in the metabolism of living beings. The cheese whey may be present in the applied diet some animals; but also be disposed in the effluent. The dry extract of whey corresponds lactose, proteins, minerals and fat, of which lactose is the energetic material used in biotechnological processes (pharmaceutical and food industry) and proteins stand out due to their nutritional value. Hydrolysis is a promising method for the food industry, it allows the development of new hydrolysed products, thereby increasing the availability of nutrients for milk products and worldwide and mitigation for the lactose intolerant. The immobilizing enzymes is an increasingly used technique to improve the industrial application of enzymes allowing better control of production and cost reduction. The objective was to study coimobilização lactase and neutrase in chitosan support methodologies aimed at comparing hydrolysis of lactose and whey proteins, and promote the reuse of cheaper local products as supports the basis of chitosan and sodium alginate. Initially prepared brackets to be applied to the study of 4% chitosan (w/v) and sodium alginate (2.5% w/v) activated with glutaraldehyde (5% v/v). In the first stage, they were determined income and immobilization activity and coimobilizada, recovered activity and apparent activity of the best obtained derivatives. For the second phase, the immobilized catalysts and coimobilizada were studied for thermal and operational stability, half-life, degree of hydrolysis and the glucose concentration. The results for the derivatives formed from chitosan were obtained satisfactory yield coimobilizada for neutrase (76.53%) and lactase (91.30%). Sodium alginate holders did not show good fit for immobilization and coimobilizada obtaining zero income. There was an increase in the thermal stability and half-life in the chitosan derivatives. Comparing the degree of hydrolysis between free Neutrase, and immobilized coimobilizada obtained a better performance of the immobilized enzyme (20%) at 80 minutes of reaction. When comparing the conversion of glucose to free lactase, immobilized and coimobilizada the best result was the free lactase (15g/L) in 30 minutes of reaction. The operational stability of Neutrase in five consecutive cycles there was a fall (46%) maximum degree of hydrolysis, longer lactase in its fifth reuse cycle in batches loss was obtained (16.4%) in glucose concentration. Thus, there were obtained good derivatives lactase and coimobilizada neutrase enabling reuse of the enzyme, reducing processing costs.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVRS.pdf: 5281242 bytes, checksum: 8ae3e0f5731bedd5705926ff0020de41 (MD5) Previous issue date: 2007-08-16 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an important enzyme for industry, used to produce aminopenicillanic acid, a key intermediate in the synthesis of ampicillin, among other betalatam antibiotics. The production of this enzyme by Bacillus megaterium has been studied by the research group for several years. This work advances this research, aiming not only at the enhancement of the enzyme production, but also at a better understanding of B. megaterium regulatory expression mechanisms for PGA. A systematic study of the inoculum, including conservation strategies for the microorganism, was performed. Different cultivation media and operational conditions for the production of PGA were investigated, especially temperature and dissolved oxygen concentration. Enzyme recovery was also studied, including methodologies for minimizing protein contents in whey. Cheese whey is an important nutrient for enzyme production, but its use implies the presence of contaminant proteins in the culture broth. Finally, the enzyme was kinetically characterized. During the inoculum study, PGA yields of microorganisms conserved using different techniques were compared: endospores in 20%-glycerol, -50oC (cryotubes), endospores in solid medium, in refrigerator ( slants ) and vegetative cells in 5%-glycerol, -50oC ( eppendorffs ). It was observed that cryotubes (frozen spores) preserve the enzyme production levels for 12 months, 521 IU/L ±20 IU/L with great reproducibility. Conservation in slants shows a marked fall of production after one month, with a low reproducibility along months. Freezing vegetative cells leads to the highest patterns of enzyme production, up to 900 IU/L, but preservation is sustained for only five months. Maximum specific growth rates changed according to the conservation method, with µmax eppendofor > cryotube > slant . A study of the effect of the inoculum growth period on enzyme yield has shown that, for the three conservation methods, harvesting between 8 and 12 h leaded to similar cell mass and enzyme concentrations after 24 h of cultivation. The procedure of harvesting the inoculum after 12 h, with 10%-bioreactor inoculum volume, showed to be a good method for inoculum standardization. The effect of temperature on the cultivation of B. megaterium for production of PGA was assessed in the range 24-40oC. Maximum cell concentration and maximum enzyme yield were achieved at 30oC. The effect of the concentration of dissolved oxygen on the production of PGA was studied, using air to feed the bioreactor (culture medium volume: 1.2-2.0 L). A second B. megaterium strain showed a lower growth rate than the original one, demanding 24 h for germination/propagation, while the original one requires 12 h. Thus, different oxygen (air) feeding strategies were tested for both strains. Along the years, enzyme yields in agitated flasks have been higher than in bioreactor, for almost all assays. For the second strain, sustaining the dissolved oxygen at 10% of saturation leaded to the highest enzyme productivity among all tested conditions, with a bioreactor productivity similar to the agitated flasks. For the original strain a similar production was only achieved with an increasing stirring profile, implying a very low dissolved oxygen concentration, equal to zero during long periods of the cultivation. The two strains presented different dissolved oxygen requirements. Changes in the cultivation medium also implied different dissolved oxygen requirements for a maximum enzyme yield. Cheese whey has a still no-identified substance that is an essential nutrient for enzyme production. The use of enzymatically hydrolyzed cheese whey improves the downstream process. Assays in agitated flasks, with the original strain, using hydrolyzed whey, leaded to PGA levels similar to the ones obtained using integral whey. However, in bioreactor the yield of enzyme was always lower than in agitated flasks, no matter the aeration strategy that was used. Three possible explanations for this fact were investigated: 1) microorganism preservation method; 2) changes in the time necessary for attaining and sustaining the metabolic state where enzyme expression occurs, what could be related to the ratio between vegetative cells and spores along time, in flasks and in the bioreactor; 3) increase in the production of proteases in the bioreactor, compared to the flasks. The lower yield using hydrolyzed whey does not seem to be related to none of these hypotheses, and up to now it was not possible to generalize the study of the effect of this variable on the PGA production by B. megaterium. Enzyme purification and concentration, via ultra-diafiltration, in the presence of integral and hydrolyzed whey was another subject for research. The effect of pH and of the number of washing cycles on enzyme recovery was assessed. Results showed that this technique is efficient, provided it is run at low temperatures. Hydrolyzed whey indeed eases the purification of the enzyme using membranes, and great part of the contaminant whey proteins can be removed. However, an expressive loss of PGA occurs during the diafiltration stages, which must be minimized. pH did not influence enzyme recovery. The kinetic characterization of the produced enzyme, using the hydrolysis of penicillin G as standard reaction, has showed that maximum PGA activity is at pH 8 and 37oC. Estimated Michelis-Menten parameters were Vmax= 0.0344 mMPenG/min and Km=1.83 mM, with activation energy equal to 27.12 KJ/mol. / Penicilina G acilase (PGA) é uma importante enzima industrial usada para produção do ácido 6-aminopenicilânico, intermediário chave na produção de ampicilina e outros antibióticos β- lactâmicos semi-sintéticos. A produção dessa enzima por Bacillus megaterium vem sendo estudada no grupo há muitos anos. Esta tese dá continuidade a esse estudo visando não só aumento da produção da enzima, mas também um melhor entendimento dos mecanismos regulatórios da expressão de PGA por B. megaterium. Neste trabalho foi realizado um estudo sistemático do inóculo, incluindo estratégias para conservação do microrganismo. Foram investigados diferentes meios de cultura e condições operacionais de cultivo na produção de PGA, em especial temperatura e concentração de oxigênio dissolvido. A recuperação da enzima foi também estudada, incluindo metodologias para minimização do conteúdo de proteínas presentes no soro de queijo, um nutriente importante na produção da enzima, mas cujo uso implica também a presença de proteínas contaminantes no meio de cultivo. Finalmente, a enzima foi caracterizada cineticamente. No estudo do inóculo foram comparados, ao longo do tempo, os desempenhos na produção de PGA de microrganismos conservados como endósporos em glicerol 20% v/v, a -70°C (criotubos), como endósporos conservados em meio sólido a 4ºC ( slants ) e como células vegetativas em glicerol 8% v/v, a -70°C ( eppendorfs ). Verificou-se que sob a forma de esporos congelados (criotubos) há preservação dos níveis de produção da enzima até 12 meses, 521 UI/L ± 20 UI/L, com grande reprodutibilidade. Conservação como slants além de mostrar variabilidade ao longo dos meses, apresenta queda acentuada desde o primeiro mês de conservação. Congelamento de células vegetativas conduz a níveis mais altos de produção da enzima, 900 UI/L, mas preserva atividade apenas durante cinco meses. Velocidades específicas máximas de crescimento dos microrganismos variaram com a forma de conservação, com µmáx eppendorf > criotubo > slant . Estudo do efeito do tempo de crescimento do inóculo na produção da enzima mostrou que, para as três formas de conservação estudada, a colheita do microrganismo entre 8 e 12 horas de cultivo conduzia a produções de enzima e concentração do microrganismo similares após 24 horas de produção. O procedimento de colheita após 12 horas de cultivo, com inoculação de 10% do volume de biorreator, mostrou-se, assim, um bom critério para padronização do inóculo. Foi estudada a influência da temperatura no cultivo de B. megaterium para produção de PGA na faixa entre 25-40°C. Os resultados mostraram que a máxima concentração celular e a máxima produção da enzima ocorrem no cultivo a 30°C. O efeito da concentração de oxigênio dissolvido na produção de PGA foi extensamente estudado, sendo o biorreator (volume de meio: 1,2-2,0 L) alimentado com ar. Uma segunda linhagem de B. megaterium mostrou crescimento mais lento que a original, requerendo 24 horas para a fase de germinação/propagação, enquanto que a original requer 12 horas. Foi, assim, efetuado estudo em biorreator com diferentes estratégias de fornecimento de oxigênio (ar) para as duas linhagens. Ao longo dos anos, a produção de enzima em frascos agitados vem se mostrando maior que a obtida em biorreator em quase todos os ensaios realizados. A segunda linhagem mostrou de forma clara que a manutenção da concentração de oxigênio dissolvido em 10% da saturação conduzia à maior produção da enzima dentre todas as condições testadas, com produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 450 UI/L. Entretanto, produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 550-600UI/L, só foi obtida com a linhagem original usando-se um perfil crescente de agitação, que implicava concentração de oxigênio dissolvido muito baixa, permanecendo em zero por vários períodos ao longo do cultivo. As duas linhagens apresentaram, portanto, requerimentos diferenciados para o oxigênio dissolvido. Alterações no meio de cultivo também alteram o requerimento de oxigênio dissolvido para obtenção da máxima produção da enzima. Soro de queijo possui um fator que ainda não foi possível identificar que é nutriente essencial para a produção da enzima. O uso de soro hidrolisado permite melhor recuperação da enzima. Ensaios em frascos agitados, com a linhagem original, na presença de soro hidrolisado, conduziram a níveis de PGA similares aos obtidos com soro integral. Contudo, em biorreator, para todas as condições de oxigênio dissolvido testadas a produção da enzima era inferior à obtida em frascos agitados, qualquer que fosse a estratégia de aeração usada. Foram investigadas três possíveis explicações para esse fato: 1) forma de preservação do microrganismo; 2) alteração no tempo para se atingir e/ou manter o estágio metabólico onde ocorre expressão da enzima, o que poderia estar relacionado com a proporção entre células vegetativas/esporos ao longo do tempo em frascos agitados e biorreator; 3) aumento na produção de proteases no ensaio em biorreator em relação ao ensaio em frasco agitado. A menor produção com soro hidrolisado não parece estar relacionada com nenhuma dessas hipóteses, não tendo sido possível, portanto, até o momento, generalizar o estudo do efeito dessa variável na produção de PGA por B. megaterium. Foi efetuado estudo da concentração e purificação da enzima produzida na presença de soro integral e hidrolisado, através de ultra-diafiltração. Foi estudado o efeito do pH e do número de lavagens na recuperação da enzima. Resultados obtidos mostraram eficiência da técnica para concentração da enzima, se realizada a baixa temperatura. Mostraram também que soro hidrolisado realmente facilita a purificação da enzima através da filtração em membrana, permitindo remoção de grande parte das proteínas contaminantes introduzidas no meio com o soro de queijo. Contudo, ocorre expressiva perda de PGA durante as etapas de diafiltração, que devem ser minimizadas. O pH não influenciou na recuperação da enzima. Caracterização cinética da enzima produzida para a hidrólise de penicilina G mostrou que a máxima atividade de PGA ocorre a pH 8 e temperatura de 37°C. Os valores estimados para os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten foram de Vmáx e Km de 0,0344 mMPenG/min e 1,83 mM, respectivamente, com energia de ativação de 27,12 KJ/mol.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1651.pdf: 3101567 bytes, checksum: 399a65fa1b493a7477de38b37956b87e (MD5) Previous issue date: 2007-12-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / Enzymatic hydrolyzed proteins present some advantages over the pool of amino acids obtained after a chemical hydrolysis: lower osmolality (easier absorption by the organism) and better sensorial characteristics. The removal of phenylalanine (Phe) from these hydrolysates allows their use in the diet of phenylktonuria (PKU) patients. This Thesis studies the sequential hydrolysis of cheese whey proteins. This process aims at producing a protein hydrolysate with low contents of Phe, after two reaction stages: in the first one, concentrated cheese whey proteins are hydrolyzed by the endoprotease chymotrypsin, immobilized on agarose gel. The substrate of the second stage is the product of the first one. This reaction is the central focus of this Thesis, and consists in a hydrolysis using the exoprotease carboxipeptidase A (CPA), immobilized on the same matrix. Since the scope of this work was a process for obtaining a protein hydrolysate with low contents of Phe for phenylketonurics, another stage had to be incorporated: ultrafiltration, to separate the amino acids released by the action of CPA, mainly Phe (and other amino acids that inhibit the reaction). With this purpose, an enzymatic membrane reactor (EMR) is proposed. It should be noticed that, to the best of our knowledge, the reactor design presented here has not been published yet. The EMR had spherical agarose particles within the reaction space, retained by a stainless steel mesh (400 Tyler). Hence, the ultrafiltration membrane was in charge only of the separation of the amino acids in the hydrolysate, which was continuously recycled to the flask containing the immobilized enzyme. Assays to characterize the membranes were performed. These membranes were then used in the integrated process (reaction with immobilized enzyme coupled to the ultrafiltration), for different experimental conditions. The substrates where Prato and Minas Frescal cheese whey. Two set-ups of the ultrafiltration unit were tested: flat plate and hollow fiber, both with 1 kDa cut-off. The reactor volume/membrane area ratios were 7.5×10-2 cm and 76.9×10-2 cm, respectively. Finally, the performance of three systems was compared: EMR with flat plane and hollow fiber and a batch reactor, followed by diafiltration. The hollow fiber EMR showed the best performance (85% conversion, productivity of 275.2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-PHE/h and only 1% retention of Phe in the membrane, after assays of 10 h). The resulting product was appropriate for phenylketonurics, with high protein contents (53.4 g/L), mainly constituted by small peptides (≤ 5.8 kDa) and with 19.9 mgPhe/gProteína, within the admissible range for PKU / Os hidrolisados protéicos via enzimática apresentam algumas vantagens, em relação à mistura de aminoácidos livres obtida pela hidrólise química: menor osmolalidade (e, portanto, maior facilidade de absorção pelo organismo) e características sensoriais mais agradáveis. Por sua vez, a remoção da fenilalanina (Phe) desses hidrolisados permite a utilização dos hidrolisados na dieta de fenilcetonúricos. Nesta Tese foi estudada a hidrólise enzimática seqüencial de proteínas de soro de queijo, processo proposto para obtenção de um hidrolisado protéico, com reduzido teor de Phe, e constituído de duas etapas reacionais: na primeira, as proteínas do soro de queijo concentrado são hidrolisadas pela endoprotease quimotripsina, imobilizada em gel de agarose. A segunda etapa, cujo substrato é o produto da primeira proteólise, é o foco central desta Tese, e consiste na hidrólise do substrato prehidrolisado utilizando-se a exoprotease carboxipeptidase A (CPA), imobilizada na mesma matriz. Como o escopo do trabalho era o processo para obtenção de um hidrolisado protéico com baixo teor de Phe para pacientes fenilcetonúricos foi necessário incorporar outra etapa: ultrafiltração, para separar os aminoácidos liberados por ação da CPA, principalmente Phe (além de outros aminoácidos inibidores da reação). Para isso, propõe-se trabalhar com reator enzimático de membrana (REM). Destaque-se que a concepção de reator aqui apresentada é, até onde vai nosso conhecimento, inédita. Estudou-se um reator de membrana com a enzima imobilizada em partículas esféricas de gel de agarose, retidas no volume reacional propriamente dito por meio de um filtro de aço (400 Tyler). Assim, a membrana de ultrafiltração ficou a cargo apenas da separação dos aminoácidos presentes no hidrolisado, que era reciclado continuamente para o frasco contendo a enzima imobilizada. Foram realizados ensaios para caracterização das membranas utilizadas, para posteriormente serem realizados ensaios em diferentes condições experimentais no processo integrado (reação com enzima imobilizada acoplada à ultrafiltração), utilizando como substratos soro de queijo tipo Prato e Minas Frescal. Foram testadas duas configurações de unidades de ultrafiltração: placa plana e fibra oca, ambas com corte de 1 kDa As razões volume de reator/área de membrana testadas foram de 7,5×10-2 e 76,9×10-2 cm, rescpectivamente. Foi desenvolvido um modelo matemático do REM, e suas predições foram comparados com dados experimentais de hidrólise com CPA para ambos os sistemas. Finalmente, foi comparado o desempenho de três sistemas: reator com membrana de placa plana, reator com membrana de fibra oca e reator em batelada, seguido por diafiltração com membrana de fibra oca. O REM tipo fibra oca apresentou o melhor desempenho (85% de conversão, uma produtividade de 275,2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-Phe/h e apenas 1% de retenção de Phe na membrana, em ensaios de 10 h. O produto resultante desse sistema apresentou características próprias para ser utilizado como complemento protéico para pacientes fenilcetonúricos, com um alto conteúdo protéico (53,4 g/L) constituído majoritariamente por pequenos peptídeos (≤ 5,8 kDa) e com 19,9 mgPhe/gProteína valor que se encontra dentro da faixa tolerada para pacientes de fenilcetonúria

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2138.pdf: 4301493 bytes, checksum: b5c60c6030083935e6ef824229ef53ac (MD5) Previous issue date: 2008-10-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The continuous advances in process computing have provided in recent years several sophisticated tools for process analysis and simulation. The effective use of these tools demands the capability to interface with a pre-existent process system hierarchy. Within this perspective, an important issue is to provide meaningful and useful simulation and optimization applications for complex systems that require integration with data-intensive experimentation. This study proposes an integrated environment, using Internet as development platform, for simulation, monitoring, control and optimization of a cheese whey refinery, employing immobilized and stabilized enzymes as catalysts. The multipurpose process described here, the cheese whey biorefinery, provides, besides lactose, whey protein concentrates and hydrolysates that can be applied in food and pharmaceutical formulae. In these circumstances, it is possible to add value to this significant by-product of the dairy industry, avoiding its disposal in natura (what is mostly done by small cheese manufacturers). In parallel, relevant aspects of the enzymatic reactions within the cheese whey biorefinery were investigated. The lumping of substrate molecules in pseudo-components, using a hybrid phenomenological-neural approach for description of the enzymatic depolymerization kinetics, is the suggestion to follow the complex reaction dynamics in biorefinery. During the estimative of model parameters, global search algorithms and different post-fitting statistical strategies were implemented and evaluated. The work, thus, is concerned with two of the main dilemmas/challenges of the present millennium: reduction of environmental problems related to the disposal of agro-industrial residues (i.e., cheese whey) and development of processes for food production from alternative sources (whey refinery). The integrated web application here presented may allow small companies to access a remote engineering centre , with know-how on plant design, economic evaluation and advanced control/optimization techniques. The idea can also be extended to large dairy companies, providing the remote control of sites of production geographically sparse. All implemented algorithms for remote process monitoring and control were validated with data from laboratory-scale assays. The validation of the hydrolytic kinetic models followed the same procedure. According to the achieved results, is possible to conclude that the robustness of the integrated computational environment was demonstrated. The prediction capability of the approaches employed for description of the proteolytic enzymatic reactions was verified, as well. / O contínuo avanço no processamento computacional vem proporcionando nos últimos anos o desenvolvimento e aplicação de ferramentas cada vez mais elaboradas de análise e simulação de processos. O uso consistente dessas ferramentas demanda, entre outras competências, a capacidade de interação com uma hierarquia de sistemas pré-definida pela engenharia de processos. Por outro lado, é imprescindível, nesse contexto, validar os cálculos matemáticos com dados reais de processo. Esta tese propõe um ambiente integrado, utilizando a Internet como plataforma de desenvolvimento, para simulação, monitoramento, controle e otimização do processo de refino do soro de queijo, utilizando enzimas imobilizadas em suporte inerte como catalisadores. O processo de refino aqui apresentado, dentro do escopo de uma planta multipropósito denominada biorefinaria de soro de queijo, disponibiliza como produtos, além da lactose, concentrados e hidrolisados protéicos com aplicação vasta em formulações alimentícias e farmacêuticas. Assim, agrega-se valor a um importante resíduo da indústria queijeira, altamente poluente se descartado in natura no meio ambiente. Paralelamente, aspectos relevantes das reações enzimáticas envolvidas na biorefinaria do soro de queijo foram aprofundados. O agrupamento de moléculas de substrato em pseudocomponentes, utilizando-se um enfoque híbrido fenomenológico-neuronal para descrição da complexa cinética de despolimerização enzimática, é a proposta para o acompanhamento dinâmico dos processos ocorrendo na biorefinaria. Durante o procedimento de estimativa paramétrica desses modelos cinéticos, algoritmos globais de busca e diferentes ferramentas de análise estatística pós-ajuste foram implementadas e avaliadas. O trabalho, assim, se insere em dois dos principais dilemas/desafios do presente milênio: redução do impacto ambiental provocado por resíduos agroindustriais (soro de queijo) e desenvolvimento de processos para produção de alimentos a partir de fontes alternativas (refino do soro). Nesse contexto, com o aplicativo aqui desenvolvido, pequenas e médias empresas interessadas em implementar o processo de beneficiamento do soro de queijo têm acesso a dados para dimensionamento dos equipamentos, estimativa do custo de produção e do retorno de investimento, com base em atualizações em tempo real de preços, custos e taxas de juros pela própria Internet. Com rotinas avançadas de monitoramento e controle agregadas, o ambiente integrado também pode se tornar atrativo para grandes indústrias de laticínios que tenham várias unidades fisicamente descentralizadas. Nesse caso, cada unidade poderia ser monitorada à distância, por exemplo, por um núcleo central de engenharia (conceito este que pode ser ampliado até níveis globais, com plantas de produção em diferentes países). Todos os algoritmos de monitoração e controle remotos implementados nesta tese foram validados em ensaios experimentais em escala de laboratório. Da mesma forma, os modelos cinéticos das reações enzimáticas também foram testados, em ensaios independentes de validação. Com base no conjunto de resultados apresentados, pode-se afirmar que ficou demonstrada tanto a robustez do ambiente computacional integrado, como a propriedade dos enfoques utilizados para descrição das reações de proteólise enzimática.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCMAG.pdf: 44716096 bytes, checksum: e3e312b192d857e9515643f716291ed1 (MD5) Previous issue date: 2004-11-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin (on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of these proteins with immobilized chymotrypsin. Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained. Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads- IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin- (Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than the trypsin-glyoxyl-agarose one. Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol. Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100% of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At 40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9 (40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative (coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH) of 12%). Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives. These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5). Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4% (3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/ gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than 1046Da. The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account competitive inhibition by the substrate ( app max V , app m K and app S K ) were calculated by initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic (V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No (V=f(P/No)). / Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com quimotripsina imobilizada sobre agarose. Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente 100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+) a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose. Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10) ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de 20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7, independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N), resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a 40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13 vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de hidrólise (GH) de 12%). Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH 10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte. Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH 10,5 para quimotripsina). Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina, atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de 3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10 horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com massa molecular (MM) inferior a 1046Da. O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os parâmetros cinéticos aparentes ap máx V , ap m K e ap S K do modelo de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5 minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema em questão.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 822133 bytes, checksum: e079e0bf0b7042a8b0741f41174d4120 (MD5) Previous issue date: 2006-05-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The physiological and technological parameters important to the development of Direct Vat Set culture of Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 cultivated in Minas Frescal cheese whey were studied. Greater fermentative activity on cheese whey was observed at 40ºC and therefore all bacterial growth experiments were performed at this temperature. Heat shock, 50ºC for 30 minutes, or acid stress, cheese whey with pH 3.5 for 30 minutes, did not affect growth of L. delbrueckii UFV H2b20 on cheese whey. The survival of heat or acid pre-treated cells was assessed after dehydration by lyophilization and spray-drying. Cell survival to either dehydration processes was not affected by acid pre-treatment, whereas heat shock had a deleterious effect on survival. The addition of protective substances (6% mannitol, 1,25% sorbitol, 1,25% monosodium glutamate and mixture of 6% sucrose and 4% trehalose) to cheese whey in which the cells were submitted to lyophilization did not improve cell survival to dehydratation and storage at -80ºC for two months. Cell survival was greater when lyophilization was performed on cheese whey alone. Acid pre-treated cells on cheese whey, pH 3.5 adjusted with HCl, without any further addition, retained higher viable counts after lyophilization and subsequent -80ºC storage. Cell activity recovery in 10% reconstituted skimmed milk was not affected by either heat shock or acid pre-treatment when cells were lyophilized in cheese whey with no additional substances. Spray-dried cultures submitted to acid stress demonstrate recovery comparable to active cells which were not subjected to any condition that could result in cell injury. Those cultures exhibit a high activity even after two months storage at - 20ºC. The hereby presented results demonstrate that the probiotic culture produced in stabilized Minas Frescal cheese whey, pre-treated at pH 3.5, and spray-dried have desirable viability and activity characteristics, and its use can be recommended for the elaboration of milk fermented products containing L. delbrueckii UFV H2b20 cells. / Os parâmetros fisiológicos e tecnológicos de importância para o desenvolvimento de sistema DVS para Lactobacillus delbrueckii UFVH2b20 em soro de queijo Minas Frescal estabilizado foram estudados. A maior atividade fermentativa das células do L. delbrueckii UFV H2b20 em soro de queijo ocorreu a 40ºC. Por essa razão, essa temperatura de incubação foi adotada para a condução dos experimentos. Foi observado que a aplicação de choque térmico, 50ºC por 30 minutos, ou choque ácido, pH 3,5 por 30 minutos, a 40ºC, às células de L. delbrueckii UFV H2b20 não afetaram seu crescimento. Foi avaliado ainda se a aplicação de tais pré-tratamentos afetava a sobrevivência aos processos de desidratação das células por liofilização e spray-drying. Foi observado que o choque ácido não afetou a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 aos dois processos de desidratação avaliados. Por outro lado, o choque térmico teve efeito deletério sobre a sobrevivência das células submetidas aos mesmos processos de desidratação. Para as culturas liofilizadas, foi avaliado se a adição de diferentes soluções protetoras (manitol 6%, sorbitol 1,25%, glutamato monossódico 1,25% e mistura das soluções de sacarose 6% e trealose 4%) exercia efeito sobre a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 à liofilização, bem como durante o período de estocagem das células desidratadas a -80ºC por 2 meses. A sobrevivência das células ao processo de liofilização foi maior quando não se adicionaram substâncias crioprotetoras ao soro de queijo. Maior viabilidade durante o armazenamento a -80ºC foi observada quando as células foram pré-tratadas em soro de queijo pH 3,5, ajustado com HCl e sem a adição de outras substâncias antes da liofilização. Observou-se que os choques térmico ou ácido não afetaram a recuperação imediata em leite desnatado reconstituído a 10% das culturas liofilizadas que não sofreram adição de substâncias protetoras. Nas culturas desidratadas por spray-drying, observou-se que as células de L. delbrueckii UFV H2b20, previamente submetidas ao choque ácido, lograram crescimento comparável ao obtido pelas células ativas que não foram submetidas a qualquer condição que possa causar injúria. Essas culturas permaneceram com elevado número de células, mesmo após 2 meses de estocagem a -20°C. Os resultados obtidos levam à conclusão de que a cultura starter probiótica produzida em soro de queijo Minas Frescal estabilizado, desidratada por spray-drying e previamente submetida ao choque ácido, demonstrou características de viabilidade e atividade mais promissoras, e seu uso pode ser recomendado para a elaboração de produtos lácteos fermentados contendo células do L. delbrueckii UFV H2b20.

Submitted by SIMONE QUINTÃO SILVA null (simoneufv@yahoo.com.br) on 2016-10-30T01:55:31Z No. of bitstreams: 1 TeseDoutSimone. formatada.pdf: 2246390 bytes, checksum: b288a3f3113eb32b94654ad3a16d2bf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-11-04T16:06:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_sq_dr_sjrp.pdf: 1772331 bytes, checksum: a34c0157ef2af5f8408f13fd3ce9368c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-04T16:06:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_sq_dr_sjrp.pdf: 1772331 bytes, checksum: a34c0157ef2af5f8408f13fd3ce9368c (MD5) Previous issue date: 2016-10-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A resistência bacteriana aos antimicrobianos é um importante problema de saúde pública. Nos últimos anos tem sido frequente o isolamento de bactérias resistentes a partir de animais de produção e alimentos de origem animal. O objetivo desse estudo é identificar em Enterococcus spp. isolados de carnes (suína, bovina e frango) e de queijo Minas Frescal, o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos e a diversidade de genes de resistência aos antimicrobianos e de genes de virulência. Os resultados são comparados ao perfil observado em Enterococcus spp. isolados de pacientes internados em um hospital terciário no estado de São Paulo. Foram avaliados 102 Enterococcus spp. isolados de alimentos e 46 isolados clínicos. Entre os isolados de alimentos, 39% apresentaram resistência à tetraciclina, 32% à eritromicina, 17,5% à estreptomicina, 13% à norfloxacina, 10% ao cloranfenicol, 8% à ciprofloxacina e à fosfomicina, 6% à levofloxacina, 5,5% à quinupristina-dalfopristina, 4% à linezolida e à penicilina, 3,5% à moxifloxacina, 3% à ampicilina e 2% à gentamicina. Todos os Enterococcus spp. isolados de alimentos foram sensíveis à teicoplanina e à tigeciclina. Entre os isolados clínicos, 67,5% apresentaram resistência à ciprofloxacina, 56,5% à penicilina, 43,5% à ampicilina, 37% à estreptomicina, 24% à vancomicina e à teicoplanina, e 11% à gentamicina. Cepas multirrestentes foram detectadas entre os isolados de alimentos e de amostras clínicas. Nos Enterococcus isolados de alimentos resistentes à tetraciclina foram detectados os genes tet M, tet L, tet K e tet C. Os genes ant6-Ia e aac(6’)-Ie/aph(2”)-Ia foram detectados em cepas de alimentos e de origem clínica. Com relação aos genes de virulência, entre os Enterococcus isolados de alimentos, 48% apresentaram o gene efaA, 42% o gelE, 37,5% o ace, 15% o as, 13% o esp e 11% o cyl. Entre os isolados clínicos, 61% apresentaram o gene ace, 56,5% o efaA, 43,5% o gelE, 11% o cyl e o esp e 6,5% o as. O gene hyl não foi detectado nesse estudo. Fenotipicamente, 63,5% foram positivos para gelatinase e 45% para citolisina entre os isolados de alimentos e 55% e 44,55% para gelatinase e citolisina, respectivamente, entre os clínicos. Entre os 102 isolados de alimentos, 62 foram identificados quanto à espécie, 59,5% foram identificados como E. faecalis, 22,5% como E. faecium e 18% como E. durans. Após análise do perfil de restrição de DNA de Enterococcus por PFGE, não foi observado similaridade entre as cepas de alimentos e clínicas. Esses alimentos podem representar um risco para a saúde dos consumidores, pois podem veicular Enterococcus spp. multirresistentes via cadeia alimentar, que além de causar infecções de difícil tratamento podem atuar como reservatórios para genes de resistência e de virulência. / Bacterial resistance to antibiotics is a major public health. In recent years there has often been the isolation of resistant bacteria from production and animal food animals. The aim of this study is to identify in Enterococcus spp. isolated from meat (pork, beef and chicken) and Frescal Minas cheese, susceptibility profile to antimicrobials and the diversity of antimicrobial resistance genes and virulence genes. The results are compared to the profile observed in Enterococcus spp. isolated from patients admitted to a tertiary hospital in São Paulo. One hundread two Enterococcus spp. were isolated from food and 46 were from clinical isolates. Resistances to different classes of antimicrobials has been observed, and among the isolates of food were resistant to tetracycline (39%), erythromycin (32%), Streptomycin (17.5%), norfloxacin (13%), chloramphenicol (10%), ciprofloxacin and fosfomycin (8%), levofloxacin (6%), quinupristin-dalfopristin (5.5%), penicillin and linezolid (4%), moxifloxacin (3.5%), ampicillin (3%) and gentamicin (2%). All Enterococcus spp. isolates from foods were sensitive to teicoplanin and tigecycline. Among clinical isolates, were resistant to ciprofloxacin (67.5%), penicillin (56.5%), ampicillin (43.5%), streptomycin (37%), vancomycin and teicoplanin (24%) and gentamicin (11%). Multidrug-resistant strains were detected among isolates from food and clinical samples. In Enterococcus spp. tetracycline resistant, the genes tet M, tet L, tet K and tet C were detected. The genes ant6-la and aac(6')-Ie/aph(2")-Ia were detected in strains of food and clinical origin. Regarding the virulence genes among Enterococcus isolates from food, 48% had the gene efaA, 42% the gelE, 37.5% the ace, 15% the as, 13% the esp and 11% the cyl. Among the clinical isolates, 61% had the ace, 56.5% the efaA, 43.5% the gelE, 11% the cyl and esp, and 6,5% the as. The hyl gene was not detected in this study. Phenotypically, 63.5% were positive for gelatinase and 45% for cytolysin A isolated from food and 55% and 44.55% for gelatinase and cytolysin, respectively, among clinicals. Among the 102 isolated from foods, 62 were identified as the species, 59.5% were identified as E. faecalis, E. faecium (22.5%) and E. durans (18%). After analysis of DNA restriction profile by PFGE, similarity between the strains of food and clinical was not observed. These foods may pose a risk to the health of consumers because they may serve of source of Enterococcus spp. multiresistant, which in addition to a cause infections difficult to treat can act as reservoirs for resistance genes and virulence.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-29Bitstream added on 2014-06-13T18:39:09Z : No. of bitstreams: 1 alcolea_vc_me_botfmvz.pdf: 243769 bytes, checksum: d874245efa9c2cd6a07e3650f2f0e06e (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O consumo de queijos produzidos artesanalmente, especialmente de queijos frescos, é muito comum no Brasil, principalmente em cidades do interior. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a presença de Brucella spp. em queijos produzidos artesanalmente na região centro oeste do Estado de São Paulo. Um total de 52 amostras foi adquirido de produtores rurais, feiras livres, padarias e outros estabelecimentos comerciais. As amostras foram analisadas por isolamento microbiológico direto, isolamento microbiológico após enriquecimento em caldo suplementado com confirmação das colônias suspeitas pela PCR e também por PCR direta. Brucella spp. não foi detectada no isolamento direto. Porém, 9,61% das amostras foram positivas no isolamento com enriquecimento em caldo suplementado. Já a PCR direta detectou 12 amostras positivas para o agente. A porcentagem significativa de amostras positivas nos queijos avaliados revela um risco para os consumidores e serve de alerta para os serviços públicos responsáveis pela sanidade animal e inspeção de produtos de origem animal / The consumption of homemade cheeses, especially fresh cheese, is very common in Brazil, mainly in the small cities. The aim of this study was to evaluate the presence of Brucella spp. in homemade cheeses in the central west of São Paulo State. A total of 52 samples was acquired from farmers, street fairs, bakeries and other shops. Samples were analyzed by direct microbiological isolation, microbiological isolation after enrichment in broth supplemented allowed by PCR for conferenction and direct PCR. Brucella spp. was not detected in the direct isolation. However, 9.61% of samples were positive by isolation with enrichment broth supplemented. The direct PCR detected 12 positive samples to the agent. A significant percentage of positive samples evaluated in the cheeses reveals a risk to consumers and serves to warn the public services responsible for the inspection of animal and animal products

Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luis Manuel Medina Canalejo / Banca: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Luciano Menezes Ferreira / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Lisiane de Almeida Martins / Resumo: Foi realizado o estudo epidemiológico molecular de estirpes de Staphylococcus aureus potencialmente toxigênicas isoladas no processo de produção do Queijo Tipo Minas Frescal em uma micro-usina no Estado de São Paulo. Para tanto, foram realizadas seis amostragens durante o período de junho de 2008 a julho de 2009, de modo a perfazer um total de 140 amostras, as quais foram colhidas do leite cru e pasteurizado, mãos do manipulador, queijo embalado para consumo e diversos pontos do fluxograma de seu processamento. A confirmação molecular da espécie dos isolados e a presença de genes codificadores das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e da toxina TSST-1, foram realizadas a partir da amplificação dos fragmentos de DNA genômico específico. Entre as 41 (29,3,4%) das estirpes confirmadas como sendo S. aureus, 25 (61%) mostraram-se positivas na pesquisa de genes codificadores de toxinas estafilocócicas. Os pontos de maior frequência de estirpes de S. aureus toxigênico foram as mãos do manipulador (16,0%), o leite cru do tanque de recepção (12,0%), o leite pasteurizado (12,0%) e o Queijo Tipo Minas Frescal pronto para consumo (12,0%). O gene codificador de enterotoxina de maior frequência identificada foi o sea. Na determinação do potencial toxigênico das estirpes com genes codificadores de enterotoxinas por imunodifusão, apenas uma estirpe isolada da superfície interna do tanque de estocagem do leite cru foi produtora da enterotoxina SEC. Houve variabilidade genética entre as 41 estirpes de S. aureus isoladas, uma vez que foram identificados 22 pulsotipos diferentes pelo PFGE. Os resultados obtidos permitem a adoção de medidas para a melhoria do processamento do Queijo Tipo Minas Frescal de modo a reduzir o risco potencial que estas toxinas podem representar para a saúde da população consumidora deste produto / Abstract: We performed molecular epidemiological study of strains of Staphylococcus aureus isolated toxigenic potential in the process of producing the Frescal Minas Type Cheese in a micro-mill in State of São Paulo. For this, six samples were taken during the period June 2008 to July 2009 in order to make a total of 140 samples, which were collected raw and pasteurized milk, the handler's hands, cheese packaged for consumption and different points flowchart of processing. Confirmation of the molecular species of the isolates and the presence of genes encoding enterotoxins SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 toxin, were made from the amplification of specific fragments of genomic DNA. Among the 41 (29.3%) of strains confirmed as S. aureus, 25 (61%) were positive in the research of genes encoding staphylococcal toxins. Points higher frequency of toxigenic strains of S. aureus were the hands of the handler (16.0%), raw milk receiving tank (12.0%), pasteurized milk (12.0%) and Frescal Minas Type Cheese ready for consumption (12.0%). The gene encoding enterotoxin most frequently identified was the sea. In determining the potential toxigenic strains with genes encoding enterotoxins by immunodiffusion, only one strain isolated from the inside surface of the storage tank of raw milk was the producer of enterotoxin SEC. There was genetic variability among the 41 strains of S. aureus isolated, since they were identified by 22 different PFGE pulsotypes. The results obtained allow the adoption of measures to improve the processing of Frescal Minas Type Cheese to reduce the potential risk that these toxins can pose to the health of consumers of this product / Doutor

Orientador: Oswaldo Durival Rossi Júnior / Banca: Germano Francisco Biondi / Banca: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Angela Cleusa de Fátima Banzato de Carvalho / Banca: Antonio Nader Filho / Resumo: Com o objetivo de estabelecer, durante o processamento do queijo Minas Frescal e Colonial os possíveis pontos de contaminação e a forma de disseminação de bactérias do gênero Aeromonas, foram analisados, quanto à presença do microrganismo, diferentes produtos e pontos do fluxograma de produção. Para o Queijo Minas Frescal, aeromonas foram isoladas no leite cru, leite pasteurizado, ambiente e nas mãos dos manipuladores. A. caviae foi a espécie mais frequentemente identificada, sendo também isoladas A. sobria e A. schubertii. Durante o processamento do queijo Colonial, as espécies A. hydrophila, A. caviae, A. sobria, A. veronii e A. jandaei foram isoladas a partir da água, mãos dos manipuladores, utensílios, leite cru e após tratamento térmico e de massa coagulada. Os resultados demonstram que o gênero Aeromonas encontra-se disseminado nas diferentes etapas do processamento de queijos, destacando-se o leite cru como principal fonte de contaminação para o processamento industrial e artesanal. Ressalta-se o perfil de resistência dos isolados de Aeromonas sp. que revelaram resistência múltipla aos antimicrobianos de uso na medicina humana e animal, caracterizando assim, risco à saúde pública. / Abstract: With the purpose to establish the possible points of contamination and the form of disseminating of Aeromonas bacteria genus during Minas Frescal cheese processing and Colonial cheese, different products and points of the production process were analyzed, as for the presence of the microorganism. In Minas Frescal cheese, Aeromonas were isolated in raw milk, pasteurized milk, in the ambient and in the manipulators' hands. A. caviae was the most frequently identified species, being also isolated A. sobria and A. schubertii. During the processing of Colonial cheese, the species A. hydrophila, A. caviae, A. sobria, A. veronii and A. jandaei were isolated from the water, the manipulators' hands, utensils, raw milk and after thermal treatment and coagulated mass. The results showed that the genus Aeromonas is disseminated in the different stages of cheeses processing, standing out the raw milk as main source of contamination for the industrial and handmade processing. The profile of resistance of the isolated of Aeromonas sp. is pointed out that they revealed multiple resistance to the antibiotics used in human and animal medicine, characterizing, therefore, risk for public health. / Doutor