Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

AXL est un récepteur tyrosine kinase (RTK) impliqué dans de nombreux mécanismes cellulaires tels que la migration, l'invasion, l'angiogenèse et la prolifération des cellules. Sa surexpression a été observée dans de nombreux cancers et est souvent liée à un mauvais pronostic vital pour le patient. De plus, ce récepteur semble agir dans un mécanisme important dans la formation de métastases et la résistance aux thérapies anticancéreuses : la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Nous avons dans un premier temps généré des anticorps monoclonaux murins spécifiques du récepteur AXL. Deux de ces anticorps ont ensuite été sélectionnés pour leurs propriétés inhibitrices de l'expression d'AXL à la surface et de l'activation de ce récepteur par son ligand GAS6. En effet ces deux anticorps, le 20G7D9 et le 3E3E8, entraine l'internalisation et la dégradation lysosomale d'AXL.Nous avons dans un deuxième temps étudié l'expression et le rôle de ce récepteur dans le cancer du pancréas qui possède un manque cruel de solutions thérapeutiques aujourd'hui et dont le taux de survie reste très faible (moins 5% des patients survivent 5 ans après son diagnostic). Nous avons ainsi observé une expression d'AXL dans une majorité des tumeurs de patients (76%), notamment au niveau du front invasif de ces tumeurs. Le ciblage d'AXL par nos deux anticorps inhibe sa signalisation et permet une réduction in vitro et in vivo de la croissance tumorale.Enfin, l'importante expression d'AXL dans le front invasif des tumeurs nous a incité à étudier le rôle d'AXL au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse. Nous avons ainsi démontré que le couple AXL/GAS6 induit l'EMT dans des modèles invasifs de cancer du sein triple négatifs. De plus, l'expression du récepteur dans des tumeurs de cancer du sein de type basal-like est corrélée à celle de différents marqueurs importants dans l'EMT. L'application de nos anticorps anti-AXL dans ce type de cancer permet d'inhiber l'induction de l'EMT par le récepteur ainsi que l'invasion cellulaire in vitro et in vivo.Cette thèse a ainsi permis de démontrer l'importance du récepteur tyrosine kinase AXL dans des mécanismes oncogéniques clés et l'efficacité de son ciblage par des anticorps monoclonaux dans des modèles précliniques de cancer. / The Tyrosine Kinase Receptor (TKR) AXL is implicated in various cellular mechanisms (migration, invasion, angiogenesis and cell proliferation). Its overexpression has been observed in many cancers and is often correlated with poor prognosis. Moreover, this receptor seems to be important in Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT), a mechanism related to metastasis formation and resistance to anticancer therapies.We have generated several AXL specific murine monoclonal antibodies. Two of them, 20G7D9 and 3E3E8, have been selected for their inhibition properties in AXL expression and activation by its ligand GAS6. In fact, both antibodies induce internalization and lysosomal degradation of AXL.Then we decided to study AXL expression and role in pancreatic cancer, which is characterized by a dramatic overall survival (<5%, 5 years after diagnosis) and a lack of efficient therapeutic solutions. We observed an ectopic expression of AXL in a majority of patient' pancreatic tumors (76%), notably in the invasive front of the tumor. Targeting AXL with both 20G7D9 and 3E3E8 inhibits its signaling and decreases tumor growth in vitro and in vivo.As AXL is mainly expressed in the invasive front of tumors, we analyzed its role during EMT. We observed that AXL/GAS6 signaling induces EMT in triple negative breast cancer cell lines. Furthermore, its expression is correlated with well-defined EMT markers in basal-like breast cancer tumors. In vitro and in vivo application of our antibodies inhibits AXL-dependant EMT signaling and cellular migration and invasion.In conclusion, this thesis demonstrates the importance of AXL Tyrosine Kinase Receptor in oncogenic processes and the efficacy of targeting this receptor with monoclonal antibodies in cancer preclinical models.

Le lymphocyte B (LB) joue un rôle important dans la polyarthrite rhumatoïde (PR), en produisant des auto-anticorps qui ont un rôle pathogène, en activant les lymphocytes T, en sécrétant des cytokines pro-inflammatoires et en permettant la formation de centres germinatifs. Plus récemment, il a été montré que le LB pouvait également produire de l'interleukine (IL) 10, une cytokine anti-inflammatoire qui lui procure des fonctions régulatrices. Ces B régulateurs ont notamment la capacité de différencier les lymphocytes T en T régulateurs. De nombreux traitements sont actuellement disponibles dans la PR, notamment les anti-TNF alpha et les inhibiteurs du récepteur de l'IL-6 (tocilizumab). Dans la première partie de cette thèse, nous avons comparé les LB circulants de patients atteints de PR et de contrôles. Nous avons étudié l'influence de l'activité de la maladie et des traitements sur les LB. Nous avons montré qu'il existait une lymphopénie B globale chez les patients atteints de PR avec une répartition des différents sous-types de LB superposable à celle des contrôles. Les patients ayant une maladie active avaient significativement plus de LB mémoires totaux, pré- et post-switch, CD24hiCD27+ et double négatifs que les patients ayant une maladie peu active. Les traitements anti-TNF et le tocilizumab ne modifiaient pas la répartition des sous-types de LB. Nous avons également montré qu'un taux de plus de 26% de LB mémoires CD27+ avant l'instauration d'un traitement par anti-TNF était associé à la réponse clinique à 3 mois. Les LB mémoires semblent produire plus de TNF que les LB naïfs et par ce biais pourraient induire une réponse Th1. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons tout d'abord cherché à mieux définir les LB régulateurs. Nous avons ensuite étudié leur présence et leur rôle dans la PR. Chez les sujets sains, les LB CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi semblent produire plus d'IL-10 que les autres LB, qui peuvent néanmoins en sécréter. Il semble donc plus adapter de définir les B régulateurs comme B producteurs d'IL-10 ou B10. Les patients atteints de PR avaient significativement moins de B10 que les contrôles en pourcentage et en valeur absolue. Chez les patients ayant un facteur rhumatoïde (FR) positif, il y avait une corrélation inverse entre le pourcentage de B10 et le taux de FR. Il y avait une corrélation inverse entre l'activité de la maladie (DAS28) et le pourcentage de B10, qui était particulièrement marquée pour les PR évoluant depuis moins de 5 ans. Chez ces patients, il y avait également une corrélation inverse entre les B10 et l'inflammation biologique (protéine C réactive). L'instauration d'anti-TNF ou de tocilizumab ne modifiait pas le taux de B10. Les CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi induisaient plus de lymphocytes T régulateurs chez les contrôles que les autres LB (CD24lo/-) alors que ça n'était plus le cas chez les patients atteints de PR, montrant que ces sous-types ont perdu cette fonction régulatrice dans la PR. En conclusion, bien qu'il existe une lymphopénie B, la répartition des sous-types de LB ne semble pas différente entre les patients atteints de PR et les contrôles. Néanmoins, il existe des anomalies fonctionnelles avec notamment une perte de la capacité à produire de l'IL-10 et à induire des T régulateurs chez les patients atteints de PR. / B cells play an important role in rheumatoid arthritis (RA), producing autoantibodies which have a pathogenic role, activating T cells, secreting pro-inflammatory cytokines and allowing the formation of germinal centers. More recently, it was shown that the B cells could also produce interleukin (IL)-10, an anti-inflammatory cytokine which provides their regulatory functions. Those regulatory B cells have the ability to differentiate T cell into regulatory T cells. Many treatments are currently available in RA, including TNF-alpha inhibitors and IL-6 receptor inhibitor (tocilizumab). In the first part, we compared circulating B cells in RA patients and in controls, and we studied the influence of disease activity and treatment on B cells. We have shown that there is a global B cell lymphopenia in RA patients with a similar B cell subtype distribution as controls. Patients with active disease had significantly more pre- and post-switch, CD24hiCD27+ and double negative memory B cells than patients with low disease activity. Anti -TNF treatment and tocilizumab did not change the distribution of B cell subsets. We also showed than patient with more than 26% of CD27+ memory B cells prior TNF inhibitor initiation was associated with clinical response at 3 months. Memory B cells produced more TNF alpha than naive B cells and can potentially induce a Th1 response. B cell subtypes were not associated with response to tocilizumab. In the second part, we first sought to better define regulatory B cells. We then studied their presence and role in RA. In healthy subjects, CD24hiCD27+ and CD24hiCD38hi B cells seem to produce more IL-10 than the other B cells that can nevertheless rarely produce some. It seemed more acurate to define regulatory B cells as IL-10 producing B cells also called B10 cells. Patients with RA had significantly less B10 cells than controls in percentage and absolute values. In rheumatoid factor (RF) positive patients, there was an inverse correlation between the percentage of B10 and the rate of RF. There was an inverse correlation between disease activity (DAS28) and the percentage of B10, which was particularly significant for patients with a disease duration of less than 5 years. In these patients, there was also an inverse correlation between B10 and biological inflammation (C-Reactive Protein). TNF inhibitors or tocilizumab did not change B10 cell rate. The CD24hiCD27 + and CD24hiCD38hi induce more regulatory T cells in controls than other LB (CD24lo/-) while it was not the case in patients with RA, indicating that these subtypes have lost this regulatory function in RA. In conclusion, although there are B cell lymphopenia, the distribution of B cell subsets does not seem to differ between RA patients and controls. Nevertheless, there are functional abnormalities including a loss of the ability to produce IL -10 and induce regulatory T in patients with RA.

Les récepteurs AMPA (rAMPA) sont les récepteurs ionotropiques du glutamate responsables de la majeure partie des courants excitateurs rapides dans la transmission synaptique rapide. Lors de la libération de glutamate, le rAMPA passe par 3 états conformationnels majoritaires : pore fermé/agoniste non lié, pore ouvert/agoniste lié et pore fermé/agoniste lié. Le contrôle du nombre et de l’organisation dans la synapse des rAMPA, via une combinaison de diffusion latérale et d’endo/exocytose, est essentiel à la régulation de l’intensité de la transmission synaptique. Les interactions existant entre les protéines de la densité post-synaptique et les protéines partenaires des récepteurs régulent la diffusion des récepteurs, contrôlant leur nombre et leur organisation à la post-synapse. Mon travail de thèse a consisté à étudier l’impact de l’activation des rAMPA sur leur mobilité et leur organisation à la post-synapse. En effet, la fixation de glutamate sur les récepteurs ainsi que leur désensibilisation entraînent des modifications structurales majeures affectant leurs interactions avec les protéines d’échafaudage et les protéines accessoires. L’impact de telles modifications sur les propriétés de diffusion et sur l’organisation sub-synaptique de ces rAMPA était jusqu’à présent inconnu. Mes travaux démontrent une mobilisation des rAMPA synaptiques consécutivement à leur activation par le glutamate. A l’échelle moléculaire, je propose que le passage de l’état activé à l’état désensibilisé des rAMPA entraîne un changement d’affinité de ces derniers pour une de leur protéine partenaire : la Stargazin. Cette régulation glutamate dépendante de la diffusion des rAMPA participe au maintien de la fidélité de la transmission synaptique rapide. / AMPA receptors (AMPAR) are ionotropic glutamate receptors which are responsible for the vast majority of fast excitatory synaptic currents in fast transmission. Upon release of glutamate, AMPAR undergo three main conformational states: pore closed/agonist unbound, pore open/agonist bound and pore closed/agonist bound. Controlling the number of AMPAR and their organization in the synapse, through a combination of lateral diffusion and endo/exocytosis, is essential to regulate the intensity of synaptic transmission. The interactions between proteins of the post-synaptic density and accessory receptor proteins regulate the distribution of receptors, controlling their number and organization in the post-synapse. During my PhD, I studied the impact of AMPAR activation on their mobility and organization in the post-synapse. Indeed, the binding of glutamate to AMPAR and their following desensitization lead to major structural changes on the receptor which impacts on their interactions with scaffolding proteins and accessory proteins. The impact of such modifications on the lateral diffusion and sub-synaptic organization of AMPAR was not known yet. My findings show a mobilization of synaptic AMPAR following their activation by glutamate. At the molecular level, I suggest that the transition from the activated state to the desensitized state of AMPAR leads to a change in affinity of the receptor for their partner protein: Stargazin. This glutamate dependent regulation of AMPAR diffusion participates in maintaining the fidelity of fast synaptic transmission.

Les ondes acoustiques subissent peu de dispersion dans le milieu marin, comparé au milieu aérien. Certaines espèces de cétacés communiquent ainsi à grande distance, d'autres utilisent leurs émissions sonores pour s'orienter. La bioacoustique consiste à étudier ces espèces à partir de l'analyse de leurs sons, c'est-à-dire à les détecter, classer, localiser. Cela peut se faire via un réseau d'hydrophones au déploiement fastidieux. Afin de contribuer au passage à l'échelle de la bioacoustique, cette thèse propose des modèles originaux mono-hydrophone pour l'analyse de ces signaux stationnaires ou transitoires. Premièrement, nous dérivons un nouveau modèle d'estimation de la distance entre une source impulsive (ex. biosonar) et un hydrophone. Notre modèle théorique, l'Intra Spectral ATténuation(ISAT), dérive des lois acoustiques de déformation spectrale du signal transitoire induite par l'atténuation durant sa propagation. Ce modèle relie les rapports énergétiques des bandes de fréquences pondérés par un modèle de perte par atténuation fréquentielle (Thorp ou Leroy) à la distance de propagation. Nous approximons aussi ISAT par un modèle neuromimétique. Ces deux modèles sont validés sur le sonar du cachalot (Physeter macrocephalus) enregistré avec notre bouée acoustique autonome BOMBYX et notre système d'acquisition DECAV en collaboration avec le Parc National de Port-Cros et le sanctuaire Pelagos pour la protection des mammifères marins en Méditerranée. Les mesures d'erreur (RMSE) d'environ 500 mètres sur nos références du centre d'essai OTAN aux Bahamas présentent un intérêt opérationnel. Deuxièmement, nous proposons une analyse originale de l'évolution des voisements de cétacé par codage parcimonieux. Notre encodage des cepstres par apprentissage non supervisé d'un dictionnaire met en évidence l'évolution temporelle des bigrammes des chants que les baleines à bosse mâles émettent durant la période de reproduction. Nous validons ce modèle sur nos enregistrements du canal de Sainte-Marie à Madagascar entre 2008 et 2014, via notre réseau d'hydrophones BAOBAB qui constitue une première dans l'Océan Indien. Nos modèles s'inscrivent dans le projet Scaled Bioacoustics (SABIOD, MI CNRS) et ouvrent de nouvelles perspectives pour les passages à l'échelle temporelle et spatiale de la bioacoustique. / Acoustic waves show low dispersion due to the underwater propagation, compared to the propagation in the air. Some species of cetaceans communicate at long distance, others use their sound production for orientation. The goal of the scientic area called bioacoustics is to study animal species based on the analysis of their emitted sound. Their sounds can be used to detect, to classify and to locate the cetaceans. Recordings can be done with an passive acoustic array of multiple hydrophones, but this method is expensive and difficult to deploy. Thus, in order to scale this approach, we propose in this Phd thesis several original single hydrophone models to analyze these stationary or transient signals.Firstly, we provide a new theoretical model to estimate the distance between the impulsive source (ex. biosonar of the cetacean) and the hydrophone. Our model, the Intra Spectral ATtenuation (ISAT), is based on the spectral signal alteration due to the underwater acoustic propagation, especially the differences in different frequency bands. We also approximated ISAT by an artificial neural network. Both models are validated on clicks emitted by sperm whales (Physeter macrocephalus) recorded by our sonobuoy BOMBYX and our data-acquisition system DECAV developed incollaboration with the National Park of Port-Cros (France) and the Pelagos sanctuary for the protection of marine mammals in the Mediterranean sea (France). The error (RMSE) measures on the recordings of the NATO test center in the Bahamas are about500 meters, promising further real applications. Secondly, we worked on the variations of the cetacean vocalizations using the sparse coding method. The encoding of thecepstrums by unsupervised learning of a dictionary shows bigrammic time changes of the songs of humpback whales (Megaptera novaeangliae). We validate this model on signals recorded in the Ste Marie Channel (Madagascar) between 2008 and 2014, through our network of hydrophones BAOBAB which is the first passive acoustic array deployed in the Indian Ocean.Our models are part of the Saled Bioacoustics project (SABIOD, MI CNRS) and open perspectives for temporal and spatial scaling of bioacoustics.

Les antagonistes du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA) comme la kétamine, le dextrométhorphane et la mémantine sont utilisés pour la prise en charge de la douleur neuropathique. La kétamine est très efficace contre les douleurs neuropathiques réfractaires aux traitements conventionnels. Cependant, son utilisation est limitée du fait de nombreux effets indésirables. Un relais antalgique est alors proposé. Ce travail de thèse s’insère dans un programme de recherche dédié aux antagonistes du récepteur NMDA dans la prise en charge de la douleur neuropathique. Le premier objectif était d’évaluer dans une étude clinique randomisée, en simple insu, en groupes parallèles, contrôlée versus placebo, les effets antalgiques du dextrométhorphane et de la mémantine, administrés en relais de la kétamine chez 60 patients souffrant de douleurs neuropathiques d’origine périphérique. L’impact de ces traitements sur le statut cognitivo-émotionnel des patients et leur qualité de vie a également été examiné, ainsi que la modulation des effets de ces médicaments par le polymorphisme génétique impliqué dans le métabolisme (CYP2D6, CYP3A4,5), la biodisponibilité et l’élimination (NR1I2) de ces deux molécules. En parallèle une étude mécanistique centrée sur le dextrométhorphane a été réalisée chez vingt volontaires sains (étude randomisée, en double aveugle, en groupes croisés). L’objectif était d’étudier dans un modèle d’hyperalgie induite par le froid « Freeze injury » les caractéristiques pharmacologiques et mécanistiques déterminant les effets anti-nociceptifs, centraux et cognitifs du dextrométhorphane ainsi que le polymorphisme génétique impliqué dans leur modulation. Chez les patients, les effets antalgiques immédiats de la kétamine ont été confirmés et s’accompagnaient de l’amélioration des scores d’anxiété et de dépression, des aspects cognitifs et affectifs et du sommeil. Toutefois, par rapport au placebo, la mémantine et le dextrométhorphane n’ont pas permis de renforcer significativement l’antalgie induite par la kétamine. Chez les volontaires sains, le dextrométhorphane a révélé des effets anti-hyperalgiques suite à une sensibilisation périphérique et centrale. Cependant, aucun effet analgésique sur la douleur thermique aiguë n’a été observé. Ces deux approches clinique et mécanistique concernant l’effet curatif des antagonistes du récepteur NMDA ont permis d’une part de montrer : 1 - chez le patient, l’effet curatif prolongé de la kétamine et l’intérêt du dextrométhorphane et de la mémantine dans la prise en charge du retentissement négatif de la douleur neuropathique sur le statut cognitivo-émotionnel et la qualité de vie des patients; 2 - chez le volontaire sain, l’efficacité anti-hyperalgique du dextrométhorphane sur les phénomènes de sensibilisation périphérique et centrale ainsi que ses répercussions sédatives et cognitives. En complément de ces deux études et dans le but de confirmer en clinique les effets curatifs du dextrométhorphane sur le triptyque douleur-cognition-émotion, une étude clinique randomisée, en double aveugle, en groupes parallèles, contrôlée versus placebo est en cours de réalisation chez 40 patientes souffrant de douleur neuropathique chimio-induite subséquente au traitement du cancer du sein. En conclusion de ce travail de thèse, l’étude des effets du dextrométhorphane dans deux populations différentes souligne l’intérêt de la recherche translationnelle. Chez le sujet volontaire sain, le dextrométhorphane exerce un effet anti-hyperalgique marqué et provoque des effets centraux délétères. Chez le patient présentant une douleur neuropathique d’origine périphérique et étant répondeur à la kétamine, seule une tendance est observée en faveur de l’effet anti-nociceptif du dextrométhorphane donné en relais de la kétamine. En revanche l’administration de dextrométhorphane s’accompagne d’un certain bénéfice au niveau cognitif et sur la qualité de vie des patients. / N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonists such as ketamine, dextromethorphan and memantine have gained an increasing interest in the management of neuropathic pain. In Pain Clinics, ketamine is widely used in the relief of neuropathic pain. However, its use in clinical practice is limited due to its numerous side effects. It is therefore necessary to propose to patients a drug relay with other NMDA receptor antagonists. This work is part of an academic program research dedicated to NMDA receptor antagonists in the management of neuropathic pain. Its first objective was to evaluate the antalgic effects of dextromethorphan and memantine. This randomized, single-blind, parallel-group, placebo-controlled study in 60 ketamine responder patients aimed also to assess the cognitive-emotional status of patients and their quality life. In parallel, a mechanistic study focusing on dextromethorphan was performed in 20 healthy volunteers in a randomized, double-blind, cross-over, placebo-controlled study. The objective was to investigate in a freeze-injury model the pharmacokinetic and mechanistic characteristics of the anti-nociceptive, central and cognitive effects of dextromethorphan as well as the genetic polymorphism involved in its response variability.In patients, the immediate analgesic effects of ketamine were confirmed with improved anxiety and depression scores, cognitive and affective aspects of pain, and different sleep parameters. However, memantine and dextromethorphan, compared to placebo, did not significantly increase the ketamine-induced analgesia. The analysis of the genetic polymorphism did not reveal any variability in the analgesic efficacy of these treatments. In healthy volunteers, dextromethorphan revealed anti-hyperalgesic effects following peripheral and central sensitization but no analgesic effect on acute heat pain. Moreover, the variability of the anti-nociceptive activity of dextromethorphan described in the literature seems to be more related to the genetic polymorphism of the CYP2D6 gene than to that of the CYP3A4,5 and ABCB1 genes. Finally, dextrorphan, the main active metabolite of dextromethorphan, appears to be responsible for the deleterious sedative and cognitive effects of the drug. These two clinical and mechanistic approaches concerning the curative effect of the NMDA receptor antagonists showed : 1 - in patients, the prolonged curative effect of ketamine and the interest of dextromethorphan and memantine in the management of the neuropathic pain-related cognitive-emotional and quality of life impairment; 2 - in healthy volunteers, the anti-hyperalgesic efficacy of dextromethorphan on peripheral and central sensitization and its sedative and cognitive side effects. In addition to these two studies, a randomized, double-blind, parallel-group, placebo-controlled clinical study is ongoing in 40 patients with chemotherapy-induced peripheral neuropathic pain subsequently to the treatment of breast cancer. In conclusion the assessment of the effects of dextromethorphan in two different populations led to discordant results. In the healthy volunteer, dextromethorphan exerts a marked anti-hyperalgesic effect and causes deleterious central effects. In the patient with peripheral neuropathic pain, only a trend is observed in favor of the anti-nociceptive effect of dextromethorphan given in ketamine responder patients. More studies with larger population are needed to determine the importance of the CYP2D6, CYP3A4,5 and ABCB1 genetic polymorphisms on the anti-nociceptive activity of dextromethorphan. The translational approach of this thesis does not allow a firm conclusion on the clinical use of dextromethorphan in the curative treatment of chronic peripheral neuropathic pain. The use of dextromethorphan as a preventive agent via other administration routes (i.e. local) or in combination with other drugs, all require further exploration in order to improve the benefit/risk ratio of this molecule.

Les travaux épidémiologiques et expérimentaux effectués à ce jour sur le cancer du sein ont montré que les oestrogènes - comme l’eostradiole (E2) - et leur récépteur (ER) - un facteur de transcription les liants - sont fortement impliqués dans au moins 70% des cas de cancer du sein. Cette implication est d’autant plus visible que les patients, suite à une thérapie anti-oestrogénique, ont tendance à développer une résistance endocrinienne au traitement. Pendant longtemps, l’ER a été étudié en tant que facteur indépendant liant directement une séquence ADN spécifique sur le génome. Aujourd’hui le paradigme a profondément changé. Il est bien connu que ER s’associe avec de nombreux autres facteurs de transcription et protéines régulant la chromatine afin de réguler l’expression des gènes. Cependant, nos connaissances concernant la fonction de modifications épigénétiques suite à l’activation de ER - notamment la méthylation de l’ADN et l’acétylation des histones - sont encore limitées. Dans cette étude, j’ai mis en place un protocole de culture cellulaire adapté à l’étude de la privation et à la re-stimulation d’E2 stricto sensu. Dans un premier temps, ce protocole a été évalué à l’aide de la toute dernière technologie de puce permettant la lecture du méthylome et couvrant la liste complète des éléments amplificateurs. Dans un deuxième temps, j’ai mesuré le transcriptome et les profiles d’acétylation de l’histone H3 (H3K27ac) afin de déterminer la capacité de ER à réguler l’expression des gènes J’ai découvert que, suite à la privation de E2, les niveaux de méthylation de l’ADN et de H3K27ac changent et que ces changements s’accentuent avec le temps, en particulier au niveau des éléments amplificateurs. Une analyse d’enrichissement des facteurs de transcription et des séquences de liaison spécifiques a révélé que les facteurs de transcriptions des familles AP-1 et FOX sont des intermédiaires favorisants la liaison de ER aux éléments amplificateurs. Finalement, la re-stimulation des cellules par de l’E2 a montré que la majorité des changements épigénétiques observé sont réversibles mais que certains éléments amplificateurs restent hyperméthylés et déacétylés. Ceci pourrait indiquer que les traitements anti-oestrogéniques sont efficaces mais pourrait également indiquer un marqueur de résistance endocrinienne. Cette étude apporte des informations nouvelles quant aux effets de l’inhibition et l’activation de ER sur la méthylation de l’ADN et l’acétylation de l’histone H3 à l’échelle du génome et renforce l’importance du rôle d’autres facteurs au niveau des amplificateurs / Previous epidemiological and experimental studies have strongly implicated estrogens in breast cancer risk and Estrogen Receptor (ER), the transcription factor to which estrogen binds, is considered as the major molecular driver of around 70% breast cancers. The importance of the deregulated estrogen signalling is further highlighted by increasing evidence that current chemopreventive and therapeutic strategies that target hormonally responsive breast cancers frequently result in the development of resistance to anti-estrogens and metastatic progression, highlighting the need for understanding the molecular underlying mechanisms. While until recently, ER was believed to act as a stand-alone transcription factor, which can directly bind its motifs in DNA, it is now accepted that ER activity is a complex and dynamic process that requires highly concerted actions of a dozen transcriptional cofactors and various chromatin regulators at DNA. Recent studies focused on characterising ER-associated cofactors and their role in opening the chromatin provided a remarkable insight into transcriptional regulation mediated by ER. However DNA methylation and histone acetylation are poorly understood in the context of ER’s dynamic binding. In this thesis, I combined a cell culture protocol adapted for studying estradiol (E2) deprivation and re-stimulation in stricto sensu in ER-positive breast cancer cells with the latest methylation array, that allowed a genome-wide interrogation of DNA methylation (including a comprehensive panel of enhancers). I further investigated histone acetylation (ChIP-seq) and transcriptome (RNA-seq) after E2 deprivation and re-stimulation to better characterise the ability of ER to coordinate gene regulation. I found that E2 deprivation and re-stimulation result in time-dependent DNA methylation changes and in histone acetylation across diverse genomic regions, many of which overlap with enhancers. Further enrichment analysis of transcription factor (TF) binding and motif occurrence highlights the importance of ER tethering mainly through two partner TF families, AP-1 and FOX, in the proximity of enhancers that are differentially methylated and acetylated. This is the first study that comprehensively characterized DNA methylation at enhancers in response to inhibition and activation of ER signalling. The transcriptome and genome occupancy data further reinforced the notion that ER activity may orchestrate a broad transcriptional programme through regulating a limited panel of critical enhancers. Finally, the E2 re-stimulation experiments revealed that although the majority of the observed epigenetic changes induced by E2 deprivation could be largely reversed when the cells were re-stimulated we show that DNA hypermethylation and H3K27 acetylation at enhancers as well as several gene expression changes are selectively retained. The partial reversibility can be interpreted as a sign of treatment efficiency but also as a mechanism by which ER activity may contribute to endocrine resistance. This study provides entirely new information that constitutes a major advance in our understanding of the events by which ER and its cofactors mediate changes in DNA methylation and chromatin states at enhancers. These findings should open new avenues for studying role of the deregulated estrogen signalling in the mechanism underlying the “roots” of endocrine resistance that commonly develops in response to anti-estrogen therapy

Une cellule reçoit en permanence des signaux de son environnement. Cette stimulation induit une cascade de signalisation activant un programme génique et protéomique dynamique aboutissant à une réponse cellulaire adaptée. Dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC), la stimulation du récepteur à l’antigène induit un programme et une réponse anormale à l’origine de la prolifération leucémique. Notre objectif est de caractériser ce programme cellulaire pathologique. Pour cela, nous avons mis en place un modèle de stimulation afin de reproduire ex vivo cette stimulation du récepteur à l’antigène de cellules primaires issues de patients porteurs de LLC et d’activer ce programme cellulaire. Nous avons alors analysé la dynamique transcriptionnelle et protéomique activée dans ces cellules afin de caractériser les anomalies de ce programme. Cette étude nous a permis de mettre en évidence la spécificité de ce programme prolifératif et de caractériser les gènes clés de ce programme tumoral. Ces gènes constituent de potentielles cibles thérapeutiques innovantes. / A cell constantly receives signals from its environment. This stimulation induces a signalling cascade activating a dynamic genic and proteomic program, leading to an adapted cellular response. In chronic lymphocytic leukemia (CLL), an antigen receptor stimulation induces a program and an abnormal response behind leukemic proliferation. Our aim was to characterize the pathological cell program. To achieve this, we have implemented a stimulation model to reproduce ex vivo antigen receptor stimulation of primary cells from CLL patients and activate this cellular program. We then analyzed the transcriptional and proteomic dynamics activated in these cells in order to characterize the abnormalities of this program. This study allows us to highlight the specificity of this proliferative program and to identify key genes of tumor program. These genes constitute potential new therapeutic targets.

Le récepteur des androgènes (RA) est la principale cible thérapeutique du cancer de la prostate (CaP) métastatique. Bien que cette thérapie soit initialement efficace, les effets sont transitoires. De nombreux mécanismes peuvent expliquer la progression du CaP vers un stade de résistance à la castration, telles les modifications du RA. Des données récentes ont montré que les variants constitutifs RA-Q641X et RA-V7, caractérisés par la perte du domaine de liaison au ligand, étaient associés à l’expression de marqueurs mésenchymateux. L’étude de la régulation de la N-cadhérine a mis en évidence que si le RA sauvage et les variants constitutifs se liaient tous deux aux éléments de réponse du gène codant, seuls les derniers étaient associés à une augmentation de l’acétylation de l’histone H4, marque positive de la transcription. Le RNA-seq a révélé que leur expression était aussi corrélée à la régulation de sets de gènes spécifiques incluant des facteurs de transcription dont certains ont déjà été caractérisés en cancérologie.En ce qui concerne le RA-T576A, porteur d’une mutation faux-sens, les données ont révélé une séquence consensus de liaison à l’ADN moins conservée pour le RA sauvage que pour ce mutant et l’importance du 11ème nucléotide des éléments de réponse. De plus, cette mutation a semblé impacter le transcriptome du RA. Ce travail met en évidence le comportement distinct des variants du RA et aide à mieux comprendre leurs modes d’action en décrivant leurs activités transcriptionnelles. / The androgen receptor (AR) is the main therapeutic target in metastatic prostate cancer (PCa). Although this therapy is initially effective, the effects are transient. Many mechanisms can explain PCa progression toward castration resistance including abnormalities in the AR. Recent data have shown that constitutive AR (e.g AR-Q641X and AR-V7), which have lost the ligand binding domain, were associated with the induction of mesenchymal marker expression. The study of N-cadherin regulation highlighted that while both constitutive AR and wild type AR bound to response elements located in the encoding gene, only the AR variants were associated with an increase of H4 acetylation, a positive transcription mark. RNA-seq revealed that their expression was also correlated to specific sets of genes regulation, including transcription factors and genes involved in migration, AR regulation, and therapeutic resistance.Concerning AR-T576A, which hold a missense mutation, data revealed a less conserved consensus sequence for the wild type AR than for this mutant and highlighted the importance of the 11th nucleotide of the response element for AR recruitment to DNA. Plus, this mutation seemed to impair AR transcriptome. This work highlights the distinct AR variants’ behavior and helps to understand their mode of action by depicting their transcriptional landscapes.

Les récepteurs nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcriptions se liant à des séquences spécifiques d'ADN et activant la transcription de gènes en réponse à la fixation de ligands spécifiques. Parmi tous les RNs impliquées dans l'étiologie des cancers, les récepteurs liés aux œstrogènes ERR jouent un rôle important dans les cancers du sein, de l'ovaire, du colon, de l’endomètre et la prostate. Ce RN est dit orphelin car il ne possède pas de ligand naturel connu à ce jour. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant cryo-microscopie électronique, bioinformatique et évolution, mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude structurale de ERR et sur l'origine et l'évolution des RNs. Dans ce contexte, 3 outils informatiques ont été développés. Les résultats obtenus ont permis d'une part la révision des connaissances fondamentales sur l'origine des récepteurs nucléaires et leur évolution. D'autre part, l'étude structurale de ERR a permis d'acquérir de nouvelles données sur la topologie des récepteurs nucléaires stéroidiens fixés sur un élément de réponse ERRE/ERE ainsi que sur le mécanisme allostérique de la liaison du coactivateur PGC-1α sur le dimère de ERR. La résolution du complexe à l'échelle atomique par cryo-microscopie électronique permettra d'ouvrir la voie vers la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. / Nuclear receptors (NRs) are transcription factors which bind to specific DNA sequences and activate gene transcription in response to the binding of specific ligands. Among all of the RNs involved in the etiology of cancers, ERR estrogen receptors play an important role in breast, ovarian, colon, endometrial and prostate cancers. This NR is said to be orphan because it does not have a natural ligand known to date. Using an integrative structural biology approach combining cryo-electron microscopy, bioinformatics and evolution, my PhD work focused on the structural study of ERR and the origin and evolution of RNs. In this context, three informatic tools have been developed. The results obtained allowed, on the one hand, the revision of fundamental knowledge on the origin of nuclear receptors and their evolution. On the other hand, structural study of ERR allow us to acquire new data on topology of steroid nuclear receptors fixed on an element of ERRE / ERE response as well as on the allosteric mechanism of the binding of the coactivator PGC-1α on the dimer of ERR. The resolution of the complex at the atomic scale by cryo-electron microscopy will open the way towards the design of new therapeutic molecules.