No presente trabalho estudou-se o perfil bioquímico do plasma seminal bem como o perfil metabólico de touros Nelore com degeneração testicular. O estudo está apresentado em dois artigos. No Artigo 1, o objetivo foi investigar alguns metabólitos do plasma seminal de touros da raça Nelore para caracterizar valores e avaliar sua relação com as características espermáticas. Foram realizadas 14 colheitas seminais, com intervalos semanais, de 11 touros (n=154). O sêmen foi avaliado para motilidade, vigor, concentração, integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial, morfologia e pH. O plasma seminal foi submetido às avaliações metabólicas de proteína total, albumina, gama glutamil transferase (GGT), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA). Os dados foram analisados no programa do Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), sendo realizadas estatística descritiva e análise de correlação de Pearson, o nível de significância considerado foi de 5%. Os valores dos metabólitos encontrados no plasma seminal foram descritos e podem ser utilizados como referência para touros Nelore. Também se pode concluir que há relação entre o perfil metabólico do plasma seminal e as características espermáticas. No Artigo 2, o objetivo foi investigar a bioquímica séria e do plasma seminal de touros Nelore com degeneração testicular. Para isso, foram utilizados 22 touros, que foram distribuídos em dois grupos: Grupo Controle (CON; n=11) e Grupo Degeneração (DEG; n=11). Foram realizadas 14 colheitas de sêmen, e 21 colheitas de sangue com intervalos semanais. As avaliações seminais e do plasma seminal foram as mesmas realizadas no estudo do artigo 1 e o sangue foi avaliado quanto às concentrações de proteína total, albumina, fibrinogênio, GGT, AST, creatina-quinase (CK), glicose, lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol, triglicérides, beta-hidroxibutirato (BHB) e ácidos graxos não esterificados (NEFA). Os dados foram submetidos à Análise de Variância, sendo adicionado o fator medidas repetidas no tempo, utilizando-se o comando REPEATED gerado pelo PROC MIXED do SAS, com nível de significância de 5%. Pode-se afirmar que a degeneração testicular em touros Nelore causa elevação de pH do sêmen, bem como elevação da concentração de ALT e diminuição nas concentrações de GGT e FA no plasma seminal. Em relação às proteínas de fase aguda, a degeneração testicular causa diminuição na concentração de albumina. Em adição, este insulto local não altera os metabólitos séricos em touros Nelore. / In the present work the biochemical profile of the seminal plasma and the metabolic profile of Nelore bulls with testicular degeneration were studied. The study was presented in two articles. First in article 1, the objective was to investigate some seminal plasma metabolites of Nellore bulls to characterize values and evaluate their relation with sperm characteristics. Fourteen seed samples were taken, with weekly intervals, of 11 bulls (n = 154). Semen was evaluated for motility, vigor, concentration, plasmatic and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, morphology and pH. Seminal plasma was submitted to metabolic assessments of total protein, albumin, gamma glutamyl transferase (GGT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (AP). Data were analyzed by the Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), with descriptive statistics and Pearson\'s correlation analysis performed, the level of significance considered was 5%. The values of the seminal plasma metabolites found have been described and can be used as reference for Nellore bulls. It can also be concluded that there is a relation between the metabolic profile of seminal plasma and sperm characteristics. In Article 2, the objective was to investigate the seric biochemistry and seminal plasma of Nellore bulls with testicular degeneration. For this, 22 bulls were used, which were distributed in two groups: Control Group (CON; n = 11) and Degeneration Group (DEG; n = 11). There were 14 semen crops and 21 weekly blood sampling. Seminal and seminal plasma evaluations were the same as those performed in the study of article 1 and blood was evaluated for total protein, albumin, fibrinogen, GGT, AST, creatine-kinase (CK), glucose, high density lipoprotein (HDL), cholesterol, triglycerides, beta-hydroxybutyrate (BHB) and non-esterified fatty acids (NEFA). The data were submitted to Variance Analysis, adding the factor measures repeated in time, using the REPEATED command generated by PROC MIXED of the SAS, with significance level of 5%. It can be affirmed that testicular degeneration in Nellore bulls causes elevation of semen pH, as well as elevation of ALT concentration and decrease in GGT and AF concentrations in seminal plasma. In relation to acute phase proteins, testicular degeneration causes a decrease in albumin concentration. In addition, this local insult does not alter serum metabolites in Nellore bulls.

A predição do desempenho de touros na produção in vitro de embriões (PIVE), pela avaliação seminal, não está plenamente estabelecida. Com este estudo, objetivou-se caracterizar as diferenças nos atributos espermáticos de touros com baixo e alto desempenho, baseado nas taxas de clivagem e de blastocisto, visando estabelecer métodos preditivos de maior eficiência na PIVE. A partir do histórico de três anos da empresa In Vitro Brasil®, foram selecionados touros que haviam resultado nas menores e maiores taxas de clivagem e de blastocisto, estabelecendo-se 4 grupos experimentais: baixa taxa de clivagem (BC, n=5), alta taxa de clivagem (AC, n=5), baixa taxa de blastocisto (BB, n=5) e alta taxa de blastocisto (AB, n=5). Foram adquiridas palhetas de sêmen congelado dos touros de cada grupo, nas quais foram avaliados, antes (Pré-Percoll®) e após centrifugação em gradiente de Percoll® (Pós-Percoll®), os atributos espermáticos: cinética, em sistema CASA; integridade de membranas plasmática e acrossomal (FITC-PSA/PI), potencial de membrana mitocondrial (JC-1), status oxidativo (DHE, CellROXTM green/PI, MitoSox red), apoptose (FITC-FMK-VAD/PI) e DNA (SCSA), por citometria de fluxo; morfologia; atividade mitocondrial (DAB); capacitação (CTC); teste funcional e TBARS induzido. Diferenças entre grupos (BC vs. AC e BB vs. AB) foram estimadas pelo teste t. Para todas as análises estatísticas foi considerado nível de significância de 5%. Na ausência de interações significativas, o efeito dos grupos foi analisado ao fundir os momentos Pré e Pós-Percoll®. Os grupos AC e AB apresentaram valores superiores de VAP, VCL, ALH e DNC e valores inferiores de BCF, STR, LIN e WOB, cinética indicativa de hiperativação. Adicionalmente, estes grupos apresentaram indícios de menor ocorrência de estresse oxidativo, evidenciados pelo percentual de espermatozoides com membrana lesada e estresse oxidativo (CellROXTM green/PI) no grupo AC e nível de DHE no grupo AB. Para os demais atributos estudados, não se obteve diferença entre os grupos. Por meio de análise de regressão logística multivariada, constatou-se que a taxa de clivagem sofre efeito de: VCL, BCF e percentual de espermatozoides com integridade de membrana e sem estresse oxidativo; já a taxa de blastocisto, sofre efeito de: defeitos menores, VSL, DABIII e DHE, os quais foram inclusos nos respectivos modelos preditivos. As taxas obtidas com o modelo preditivo foram comparadas às taxas reais por análise de correlação de Pearson, que resultaram em intensidade moderada tanto para clivagem (r=0,56) quanto para blastocisto (r=0,44). Subpopulações espermáticas com diferentes perfis de cinética em CASA, foram determinadas em três etapas estatísticas segundo Núñez-Martínez et al. (2006). Foram detectadas 4 subpopulações: 1-Rápidos e progressivos; 2- Hiperativados; 3- Lentos e sinuosos; 4- Lentos e progressivos. Touros com alto desempenho (AC e AB) apresentaram maior percentual de subpopulação 2, Pré-Percoll®, e das subpopulações 1 e 2, Pós-Percoll®. Com isto, demonstra-se ser possível diferenciar touros de baixo e alto desempenho na PIVE, pela avaliação dos atributos espermáticos, com o estabelecimento de modelos preditivos para as taxas de clivagem e de blastocisto. Ademais, o estudo das subpopulações espermáticas constitui-se no método mais efetivo para a predição do desempenho in vitro. / The prediction of bull performance on the in vitro production (IVP) of bovine embryos, by the seminal evaluation, is not fully established. Thus, the aim of this study was to characterize the differences in the sperm features of bulls with low and high performance, based on cleavage and blastocyst rates, in order to establish predictive methods for a greater efficiency in the IVP. Based on the results obtained in three years from the company In Vitro Brasil®, bulls were selected by the lowest and highest cleavage and blastocyst rates, establishing 4 experimental groups: low cleavage rate (BC, n=5), high cleavage rate (AC, n=5), low blastocyst rate (BB, n=5) and high blastocyst rate (AB, n=5). Frozen semen were obtained from the bulls of each group, in which were evaluated, before (Pre-Percoll®) and after Percoll® gradient centrifugation (Post-Percoll®), the sperm features: kinetics, in CASA; integrity of plasma and acrosomal membranes (FITC-PSA/PI), mitochondrial membrane potential (JC-1), oxidative status (DHE, CellROXTM green/PI, MitoSox red), apoptosis (FITC-FMK-VAD/PI) and DNA (SCSA), by flow cytometry; morphology; mitochondrial activity (DAB); capacitation (CTC); functional test and induced TBARS. Differences between groups (BC vs. AC and BB vs. AB) were estimated by t test. A significance level of 5% was considered for all statistical analysis. In the absence of significant interactions, the effect of the groups was analyzed by merging the moments Pre and Post-Percoll®. The AC and AB groups presented higher values of VAP, VCL, ALH and DNC and lower values of BCF, STR, LIN and WOB, kinetics indicative of hyperactivation. In addition, these groups showed less evidence of oxidative stress, observed by the percentage of spermatozoa with damaged membrane and oxidative stress (CellROXTM green/PI) in the AC group and level of DHE in the AB group. For the others sperm features, there was no difference between groups. By multivariate logistic regression analysis, it was verified that the cleavage rate is affected by: VSL, BCF and percentage of spermatozoa with membrane integrity and without oxidative stress; and the blastocyst rate, is affected by: minor defects, VSL, DABIII and DHE, which were included in the respective predictive models. The rates obtained with the predictive model were compared to the real rates by Pearson correlation analysis, which resulted in moderate intensity for both cleavage (r=0.56) and blastocyst (r=0.44). Spermatic subpopulations with different kinetic profiles at CASA were determined in three statistical steps according to Núñez-Martínez et al. (2006). Four subpopulations were detected: 1-Fast and progressive; 2- Hyperactivated; 3- Slow and sinuous; 4- Slow and progressive. Bulls with high performance (AC and AB) presented higher percentage of subpopulation 2, Pre-Percoll®, and subpopulations 1 and 2, Post-Percoll®. In summary, it is possible to differentiate low and high-performance bulls at IVP by evaluating the sperm features, with the establishment of predictive models for the cleavage and blastocyst rates. Furthermore, the study of sperm subpopulations is the most effective method for predicting in vitro performance.

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Fabio Morato Monteiro / Banca: César Roberto Esper / Banca: Marcelo Roncoletta / Resumo: O plasma seminal já foi descrito como benéfico e ao mesmo tempo prejudicial aos espermatozoides e isto está relacionado com o tempo de contato entre eles. A criopreservação do sêmen em touros pode ser prejudicada por exposição contínua dos espermatozoides ao plasma seminal (PS) e a aplicação de métodos para sua remoção pode aumentar a qualidade dos espermatozoides recuperados pós-descongelação, melhorando os resultados de biotécnicas que utilizam sêmen criopreservado. Pelo fato da centrifugação causar muitos danos aos espermatozoides, a filtragem com Sperm Filter® apresenta-se como um novo método de remoção do PS que almeja melhores resultados, porém não foi encontrado relato da sua aplicação em bovinos até o momento. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos métodos de centrifugação e filtragem com Sperm Filter® sobre a criopreservação do sêmen bovino. Para isso, o sêmen de 38 touros Nelore foi colhido por eletroejaculação. Após a colheita, o sêmen foi fracionado em três alíquotas iguais para divisão em três grupos: controle (N), em que o sêmen foi diluído com PS; centrifugação (C), em que o PS foi removido por centrifugação a 600 X g por 10 minutos; e filtragem (F), em que o PS foi removido por filtragem com Sperm Filter®. As amostras foram criopreservadas, e pós-descongelação foram avaliados a cinética espermática, a integridade das membranas plasmática e acrossomal, o potencial mitocondrial, o estresse oxidativo e a capacidade fecundante através da produção in vitr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Seminal plasma has been described as beneficial and harmful to the spermatozoa and this is related to the contact time between them. Cryopreservation of semen from bulls can be undermined by continuous exposure of sperm to the seminal plasma (SP) and the application of methods for removal can increase the quality of post-thaw sperm recovered, improving fertilization. Centrifugation cause a lot of damage to sperm and filtering with Sperm Filter® is a new SP removal method that aims to better results, but has not yet been applied in bull. The aim of this study was to evaluate the effect of the methods of centrifugation and filtering with Sperm Filter® on cryopreservation of bovine semen. For this, semen of 38 Nelore bulls was collected by electroejaculation. Semen was fractioned into three equal aliquots for division into three groups: control (N), wherein the semen was diluted with SP; centrifugation (C), in which the SP was removed by centrifugation at 600 X g for 10 minutes; and filtration (F), in which the SP was removed by filtration with Sperm Filter®. Samples were cryopreserved and was evaluated after thawing sperm kinetics, the integrity of plasma and acrosomal membranes, mitochondrial potential, oxidative stress and the fertilizing capacity by in vitro embryo production (IVP). The kinetics, higher values of the path velocity (P = 0.0005) and progressive speed (P = <0.0001) were observed in the groups C and F and the beat frequency parameters, straightness and linearity... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

No presente trabalho estudou-se o perfil bioquímico do plasma seminal bem como o perfil metabólico de touros Nelore com degeneração testicular. O estudo está apresentado em dois artigos. No Artigo 1, o objetivo foi investigar alguns metabólitos do plasma seminal de touros da raça Nelore para caracterizar valores e avaliar sua relação com as características espermáticas. Foram realizadas 14 colheitas seminais, com intervalos semanais, de 11 touros (n=154). O sêmen foi avaliado para motilidade, vigor, concentração, integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial, morfologia e pH. O plasma seminal foi submetido às avaliações metabólicas de proteína total, albumina, gama glutamil transferase (GGT), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA). Os dados foram analisados no programa do Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), sendo realizadas estatística descritiva e análise de correlação de Pearson, o nível de significância considerado foi de 5%. Os valores dos metabólitos encontrados no plasma seminal foram descritos e podem ser utilizados como referência para touros Nelore. Também se pode concluir que há relação entre o perfil metabólico do plasma seminal e as características espermáticas. No Artigo 2, o objetivo foi investigar a bioquímica séria e do plasma seminal de touros Nelore com degeneração testicular. Para isso, foram utilizados 22 touros, que foram distribuídos em dois grupos: Grupo Controle (CON; n=11) e Grupo Degeneração (DEG; n=11). Foram realizadas 14 colheitas de sêmen, e 21 colheitas de sangue com intervalos semanais. As avaliações seminais e do plasma seminal foram as mesmas realizadas no estudo do artigo 1 e o sangue foi avaliado quanto às concentrações de proteína total, albumina, fibrinogênio, GGT, AST, creatina-quinase (CK), glicose, lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol, triglicérides, beta-hidroxibutirato (BHB) e ácidos graxos não esterificados (NEFA). Os dados foram submetidos à Análise de Variância, sendo adicionado o fator medidas repetidas no tempo, utilizando-se o comando REPEATED gerado pelo PROC MIXED do SAS, com nível de significância de 5%. Pode-se afirmar que a degeneração testicular em touros Nelore causa elevação de pH do sêmen, bem como elevação da concentração de ALT e diminuição nas concentrações de GGT e FA no plasma seminal. Em relação às proteínas de fase aguda, a degeneração testicular causa diminuição na concentração de albumina. Em adição, este insulto local não altera os metabólitos séricos em touros Nelore. / In the present work the biochemical profile of the seminal plasma and the metabolic profile of Nelore bulls with testicular degeneration were studied. The study was presented in two articles. First in article 1, the objective was to investigate some seminal plasma metabolites of Nellore bulls to characterize values and evaluate their relation with sperm characteristics. Fourteen seed samples were taken, with weekly intervals, of 11 bulls (n = 154). Semen was evaluated for motility, vigor, concentration, plasmatic and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, morphology and pH. Seminal plasma was submitted to metabolic assessments of total protein, albumin, gamma glutamyl transferase (GGT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (AP). Data were analyzed by the Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), with descriptive statistics and Pearson\'s correlation analysis performed, the level of significance considered was 5%. The values of the seminal plasma metabolites found have been described and can be used as reference for Nellore bulls. It can also be concluded that there is a relation between the metabolic profile of seminal plasma and sperm characteristics. In Article 2, the objective was to investigate the seric biochemistry and seminal plasma of Nellore bulls with testicular degeneration. For this, 22 bulls were used, which were distributed in two groups: Control Group (CON; n = 11) and Degeneration Group (DEG; n = 11). There were 14 semen crops and 21 weekly blood sampling. Seminal and seminal plasma evaluations were the same as those performed in the study of article 1 and blood was evaluated for total protein, albumin, fibrinogen, GGT, AST, creatine-kinase (CK), glucose, high density lipoprotein (HDL), cholesterol, triglycerides, beta-hydroxybutyrate (BHB) and non-esterified fatty acids (NEFA). The data were submitted to Variance Analysis, adding the factor measures repeated in time, using the REPEATED command generated by PROC MIXED of the SAS, with significance level of 5%. It can be affirmed that testicular degeneration in Nellore bulls causes elevation of semen pH, as well as elevation of ALT concentration and decrease in GGT and AF concentrations in seminal plasma. In relation to acute phase proteins, testicular degeneration causes a decrease in albumin concentration. In addition, this local insult does not alter serum metabolites in Nellore bulls.

Os objetivos do estudo foram: (a) avaliar a influência da suplementação de vitamina A na dieta de cachaços nos parâmetros seminais: volume, motilidade, vigor espermático, pH, concentração espermática, número total de espermatozóides, percentual de espermatozóides vivos e anormalidades morfológicas ao longo do ano; (b) averiguar a variabilidade das características, em animais suplementados com vitamina A na dieta, frente às variações da temperatura nas estações do ano. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Suínos, da FMVZ-USP, utilizando-se 10 machos de linhagem híbrida e distribuídos em dois tratamentos, controle (nível de 25.000 UI de vitamina A/animal/dia) e suplementado com a vitamina A (nível de 40.000 UI de vitamina A/animal/dia). O delineamento foi inteiramente casualizado, com medidas repetidas no tempo, sendo os dados analisados utilizando o programa estatístico Statistical Analysis System (SAS). As probabilidades de interações com o tempo foram determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser Epsilon, considerando o nível de significância de 5%. Em relação aos efeitos da vitamina A durante o período de 1 ano, verificou-se que não houve diferença entre os tratamentos para os parâmetros seminais, não encontrando-se efeito de interação tempo e tratamento. Detectou-se efeito de tempo para os parâmetros pH, concentração espermática, número total de espermatozóides, percentual de espermatozóides vivos e anormalidades morfológicas. Já na averiguação da variabilidade também não foi constatado efeito de tratamento, porém houve efeito de estação do ano para todos os parâmetros e de temperatura para o percentual de espermatozóides vivos, pH e anormalidades morfológicas, não sendo verificado efeito para os demais parâmetros. Inferiuse com o estudo que, dada à condição metabólica diferencial dos animais híbridas, novas averiguações devem ser perseguidas para a relação nutrição e reprodução, uma vez que, os efeitos positivos da suplementação da vitamina A na espermatogênese foram evidenciados, principalmente nas características que mais se relacionam com a formação da célula espermática, as anormalidades morfológicas, percentual de espermatozóides vivos e número total de espermatozóides no ejaculado. / The objectives of the study were: (a) to evaluate the effect of vitamin A supplementation on boars? diet considering the parameters: volume, motility, spermatic vigor, seminal pH, spermatic concentration, total number of spermatozoa, percentage of living sperm cells and morphologic abnormalities during one year; (b) to investigate the variability founded against the temperature and seasons of the year on vitamin A supplemented animals seminal parameters. The research was developed in the Laboratory of Research in Swines, the FMVZUSP, using 10 boars of hybrid lineages. Two treatments were used having the control (level of 25.000 UI of vitamin A/animal/day) and vitamin A supplemented group (level of 40.000 UI of vitamin A/animal/day). The statistical design was random, with repeated measured in time. The analyzed data used was the statistical program Statistical Analysis System (SAS). The probabilities of the interactions in time were determined by Greenhouse-Geisser Epsilon test, considering the significant level 5%. None of the evaluated parameters was significantly different and no detected interaction in time was found treatment. In relation to the effects of the vitamin A on supplementation in one year period it wasn?t have differences among treatments on seminal parameters, and also there wasn?t interaction in time and at treatment, however for pH, spermatic concentration, total number of spermatozoa, percentage of living sperm cells and morphologic abnormalities it was detected effect on time. In relation to the variability there wasn?t treatment effect, however there was for all the parameters studied effect of the season. The effect of temperature was only for the percentage of living sperm cells, pH and morphologic abnormalities. It was concluded that at a given metabolic condition of the hybrid animals, new ascertainments must be inquired for the relation nutrition and reproduction, a time that, the positive effect of the suplementation of the vitamin in spermatogenesis had been evidenced, mainly in the characteristics that more become related with the formation of the espermática cell.

Os répteis compõem hoje uma classe com mais de 8.000 espécies e em razão das restrições na importação desses animais, o risco na introdução de doenças exóticas, o crescente número de espécies ameaçadas no mundo, entre outros, a reprodução e a manutenção em cativeiro desses animais é muito importante. No Sul da Califórnia, que é considerado um Hotspot para a biodiversidade, a Zoological Society of San Diego mantém uma reserva ecológica com aproximadamente 400 hectares e formada por vegetação tipo Chaparral, Coastal Sage Scrub e áreas cobertas por cactos (Opuntia sp.). Durante o período de junho de 2005 a julho de 2006 foram capturadas 96 cascavéis das espécies Crotalus ruber ruber, C. oreganus helleri e C. mitchellii phyrrus, durante os trabalhos de campo pela procura visual limitada por tempo. Foram realizadas avaliações morfológicas e reprodutivas em todas essas serpentes capturadas. Nos machos realizou-se a colheita e avaliação de sêmen, incluindo duas colorações específicas para avaliar integridade de membrana espermática e do acrossoma. Nas fêmeas foi realizada a avaliação ultra-sonográfica dos ovários, com mensuração e contagem de folículos, além do diagnóstico de gestação. Para a C. ruber ruber, a serpente mais abundante neste estudo, foram observadas fêmeas prenhes no verão e vitelogênicas na primavera, outono e inverno. Apenas as fêmeas desta espécie com condição corporal boa ou muito boa apresentaram-se vitelogênicas ou prenhes. Nos machos dentre as características seminais avaliadas, não foi observada a diferença estatisticamente significante ao longo das estações do ano. Em paralelo a este estudo, também foram testados protocolos para a congelação de sêmen de serpentes, com a obtenção de resultados promissores, discutidos em capítulo específico. As informações obtidas neste estudo visam contribuir para a compreensão da biologia reprodutiva e conservação das serpentes, em cativeiro ou vida-livre. / There are more than 8,000 reptile species in world. Today´s restrictions to importation of these species around world, the risk of introduction of exotic diseases, the growing number of endangered reptiles, among other reasons, emphasize the importance of reproduction in captivity and ex-situ conservation. South California is a Hotspot for biodiversity and the Zoological Society of San Diego maintains a nature preserve in Escondido City. In an area of about 400 hectares, composed by vegetation types like Chaparral and Coastal Sage Scrub, it has been found the greatest diversity of snake in region. Between May 2005 and July 2006, 96 rattlesnakes of species Crotalus ruber ruber, C. oreganus helleri and C. mitchellii phyrrus were captured by active searching during field work. In the Laboratory of Reproductive Physiology the snakes were measured, weighted, and marked the captured snakes. We evaluated their body condition, collected and evaluated semen from males and performed ultrasound exams in females. Snakes were released up to 24 hours after capture. The Crotalus ruber ruber studied initiated vitellogenesis in fall, courtship and mating occurred in spring and gravid snake were observed in spring and summer. Only females with a good or very good body condition were in secondary vitellogenesis or gravid. There were no statistical differences in seminal parameters among season in males of the Crotalus ruber ruber. Protocols to freeze snake´s semen were tested in this study, with positive results that are discussed in specific chapter. This study results contribute to understand of snake´s biology of reproduction and in or ex-situ conservation.

Foi conduzida uma série de experimentos onde se buscou definir: 1) o limite de tolerância do espermatozóide caprino a soluções hiperosmóticas de sacarose; 2) um diluente para criopreservação de sêmen que minimizasse as flutuações de volume celular. O limite de tolerância da membrana, avaliado pelo corante eosina-nigrosina, foi de 930 mOsm em soluções de sacarose em Ringer-lactato a 38oC. Os danos à integridade de membrana (IM), em osmolalidades acima deste valor, se estabeleceram no primeiro minuto de exposição e não se agravaram até 10 minutos depois. A motilidade (MOT) foi mais afetada que a IM. A rediluição abrupta em meio isosmótico causou dano extenso e proporcional ao grau de desidratação prévia. Nos experimentos seguintes, adição de 375 mM de sacarose ao diluidor TRIS-gema com 6,8% de glicerol (TGG), 5 minutos antes da congelação, resultou em MOT e IM similares ao controle TGG sem sacarose. Descongelação e rediluição a 4oC favoreceram a MOT e, a 38oC, favoreceram a IM. O diluente TRIS-gema com 375 mM de sacarose e concentração de glicerol reduzida para 1,7% apresentou melhor MOT e IM que o controle (65% e 187% vs 52% e 100%, respectivamente). A MOT após 2 h e o vigor após 6 h foram maiores quando a rediluição pós-descongelação foi em 5 passos se comparado a 3 passos (28% e 9% vs 19% e 2%, respectivamente). Na fase seguinte do trabalho, diluentes elaborados com 300 mM após 6 h a 38oC, melhor MOT e vigor que o controle (33% e 26% vs 15% e 10%, respectivamente). A descongelação a 20oC favoreceu a MOT e o vigor nos tempos zero, 2 h e 6 h pós-descongelação em todos os grupos contendo sacarose. O etilenoglicol não diferiu do glicerol na concentração de 3,4% quando adicionado a diluente contendo 300 mM de sacarose. Nestes diluentes, a rediluição em 5 passos a 20oC não diferiu em MOT e IM da feita em 1 passo a 38oC. No último experimento, sêmen congelado em diluente contendo 300 mM de trealose e zero% de glicerol mostrou melhor IM após descongelação em um passo a 38oC (320% vs 100% no controle) e maior MOT às 6 h após descongelação e rediluição em 5 passos a 20oC (56% vs 26% no controle). Conclui-se que o sêmen caprino tolera soluções de sacarose até o limite de 930 mOsm, mas a rediluição deve ser progressiva. A desidratação parcial, causada por soluções concentradas de sacarose ou trealose, permite a congelação de sêmen sem adição de crioprotetores permeantes. Os melhores resultados foram obtidos em diluente TRIS-gema sem glicerol e adicionado de 300 mM de trealose. / The objective of this study was to: 1) define the tolerance limits of goat sperm to hyperosmotic sucrose solutions; 2) establish an extender that minimizes cell volume variations during the processes of freezing and thawing. Boer goat semen was diluted with Ringer-lactate-Sucrose solutions at 38oC. The hyperosmotic tolerance limit was 930 mOsm evaluated with eosin-nigrosin stain. At osmolalities above this value, damage was evident after 1 min and was not affected by further exposure. Redilution in a single step resulted in massive membrane damage that was nearly proportional to the dehydration intensity previously undergone. Motility (MOT) was more distinctly impaired than membrane integrity (MI). In the next experiments, addition of 375 mM sucrose (Suc) 5 min previous to freezing to TRIS-egg yolk extender containing 6.8% glycerin (TYG) resulted in sperm motility (MOT) and MI similar to control extender TYG without sucrose. Thawing and redilution at 4oC affected favorably the MOT, and at 38oC, was favorable to MI. When freezing in TRIS-egg yolk-Suc extenders with low glycerin concentration (1.7%) MOT and MI were significantly higher than in the control TYG (65% and 187% vs 52% and 100%, respectively). MOT 2 h after thawing and intensity of motility (INTMOT) after 6 h after thawing were better preserved after a redilution of 5 increasing volume-steps than after redilution of 3 steps (28% and 9% vs 19% and 2%, respectively). In sequence, extenders containing 300 mM sucrose and thawed-rediluted 5 steps at 20oC improved MOT and INTMOT after 6 h (33% and 26% vs 15% and 10% in the control Group). The thawing-redilution at 20oC improved the results in all groups containing sucrose. At a concentration of 3.4% added to TRIS-yolk extender with 300 mM sucrose, the cryoprotectant ethylene glycol gave similar results as glycerin. MOT and INTMOT in the different time intervals were not influenced by redilution in 5 steps at 20oC or in one step at 38<SUPoC. In the last experiment made, semen frozen in a TRIS-yolk extender with 300 mM trehalose and devoid of glycerin showed the best MI after thawing-redilution in 1 step at 38oC (320% vs 100% in the control Group). The highest MOT after 6 h incubation was observed when this group was thawed-rediluted at 20oC in 5 steps (56% vs 26% in the control). From the results obtained it may be concluded that the upper tolerance limit of goat spermatozoa to hyperosmotic sucrose solutions is 930 mOsm. The redilution and return to isosmolality should be stepwise made. Goat semen can be frozen in extenders devoid of permeant cryoprotectants like glycerin when, previous to freezing, the cells are partially dehydrated by concentrated sucrose or trehalose solutions. The best survival rate was obtained when freezing goat spermatozoa in a glycerin-free TRIS-yolk-extender containing 300 mM of trehalose.

A resposta inflamatória uterina pós-cobertura ocorre para remoção de espermatozoides e contaminantes; todavia, o atraso em debelar este processo têm sido identificado, em equinos, como a principal causa de endometrite persistente pós-cobertura. A pentoxifilina atua como um inibidor da fosfodiesterase e aumenta as características de motilidade espermática, ainda tem sido relatada sua participação como agente reológico, aumentando o fluxo sanguíneo de tecidos comprometidos, e como agente imunomodulador. O propósito deste estudo foi examinar os efeitos da pentoxifilina adicionada ao diluidor seminal pós-descongelação, sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e integridade de cromatina, bem como sobre a resposta inflamatória uterina após a inseminação artificial de éguas. Dez partidas de sêmen de um único garanhão foram criopreservadas (100x106 espermatozoides/palheta 0,5 mL) em sistema automatizado (TK 3000) e mantidas em botijão criogênico, sendo posteriormente utilizadas para análises laboratoriais e inseminação artificial. Para análise laboratorial duas palhetas de sêmen de cada partida foram descongeladas (37ºC/30 segundos) e diluídas em diluidor à base de leite desnatado (controle) e diluidor à base de leite desnatado contendo pentoxifilina (7,18 mM). As alíquotas de cada tratamento foram mantidas em banho-Maria seco (37°C) e analisadas em quatro momentos: 5 (T0), 30 (T30), 60 (T60) e 120 minutos (T120) pós-diluição e incubação. As amostras foram analisadas quanto às características de movimento espermático, por sistema computadorizado de análise espermática (CASA), membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial por associação de sondas fluorescentes (PI, H342, FITC-PSA e JC-1), morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e integridade da cromatina pelo Azul de Toluidina. Para avaliar os efeitos do diluidor contendo ou não pentoxifilina na resposta inflamatória uterina, foram utilizadas 15 éguas distribuídas em cinco grupos: Grupo Control (controle): sem deposição de sêmen, nem diluidor, mimetizando-se o procedimento da IA; Grupo SM Extender: deposição de diluidor sem pentoxifilina (Botusemen®, Botupharma); Grupo SM Extender + PTX: deposição de diluidor contendo pentoxifilina; Grupo Sêmen: deposição de sêmen diluído com diluidor sem pentoxifilina; Grupo Sêmen + PTX: deposição de sêmen diluído com diluidor contendo pentoxifilina (7,18 mM). A hemodinâmica uterina foi avaliada por ultrassonografia nos modo color e espectral realizadas nos períodos: imediatamente antes da indução da ovulação (aproximadamente 30 horas antes da IA, T-30), imediatamente antes da inseminação artificial (TIA) e 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) e 48 (T48) horas após a inseminação artificial. Uma amostra para citologia endometrial foi coletada, por escova ginecológica no momento T6. A análise estatística foi realizada utilizando-se análise de variância (ANOVA), sendo as médias comparadas pelo LSD test, SAS versão 9.3 (2010). A adição de pentoxifilina não exerceu efeito sobre a motilidade progressiva, porém, a pentoxifilina aumentou velocidade de trajeto, velocidade progressiva e velocidade curvilinear quando comparada ao controle. Não houve diferença significativa na porcentagem de células apresentando membrana plasmática intacta, acrossoma intacto e alto potencial mitocondrial (PIAIC). Nenhuma diferença estatística foi encontrada no fluxo sanguíneo uterino de éguas após os tratamentos. Porém, a citologia endometrial demonstrou maior resposta inflamatória em grupos contendo pentoxifilina quando comparado aos controles. Concluiu-se que a pentoxifilina exerce efeito positivo sobre parâmetros de velocidade, mas não influencia as membranas celulares e a cromatina. No entanto, quando as éguas são inseminadas com sêmen contendo pentoxifilina, uma resposta inflamatória mais intensa é observada. / The post breeding uterine inflammatory response occurs due to remove spermatozoa and contaminants; however, delayed uterine clearance has been identified, in equines, as the underlying cause of persistent post breeding endometritis. Pentoxifylline acts as a phosphodiesterase inhibitor and increases sperm motion characteristics, and it has been reported to participate as a rheologic agent, improving blood flow to compromised tissues, and as an immunomodulatory agent. The purpose of this study was to examine the effects of pentoxifylline added to the seminal extender after thawing, on sperm motion, plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes and chromatin integrities, as well as the uterine inflammatory response on mares after artificial insemination. Ten batches of a unique stallion were cryopreserved (100x106 spermatozoa/0.5 mL straws), in an automated system (TK 3000) and storaged in cryogenic cylinder for posterior use for laboratory analysis and artificial insemination. For laboratory analysis two semen straws of each batch were thawed (37°C/30 seconds) and diluted in skim milk based extender (control) or diluted in skim milk extender containing pentoxifylline (7.18 mM). Aliquots of each treatment were maintained in dry water bath (37°C) and analyzed at four moments: 5 (T0), 30 (T30), 60 (T60) and 120 minutes (T120) post dilution and incubation. Samples were analyzed for sperm motion characteristics, through Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes through fluorescent probes association (PI, H342, FITC-PSA and JC-1), spermatic morphology through differential interference contrast and chromatin integrity through Toluidine blue. To examine the effect of extender containing or not pentoxifylline on uterine inflammatory response 15 mares were divided into 5 groups: Group Ccontrol (control): no uterine deposition of semen, or extender, just mimicking the AI procedure; Group SM Extender: deposition of skim milk based extender (Botusemen®, Botupharma); Group SM Extender + PTX: deposition of skim milk based extender containing Pentoxifylline; Group Semen: deposition of semen diluted with extender only; Group Semen + PTX: deposition of semen diluted with extender containing Pentoxifylline (7,18 mM). Uterine hemodynamics were examined through color and spectral mode ultrasonography on moments: immediately before ovulation induction (approximately 30 hours before AI, T-30), immediately before artificial insemination (TAI) and 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) and 48 (T48) hours after artificial insemination. Samples for endometrial cytology were collected, through cytobrush at T6 moment. Statistical analysis was performed using the analysis of variance (ANOVA), and the range was compared by LSD test, SAS 9.3 version (2010). Pentoxifylline addition did not exert effect on progressive motility, however, pentoxifylline increased path velocity, progressive velocity and curvilinear velocity when compared to controls. There were no significant differences on the percentage of cells presenting intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). No statistical difference was found on uterine blood flow of mares after treatments. However, endometrial cytology showed a major inflammatory response on groups containing Pentoxifylline when compared to controls. In conclusion, pentoxifylline exerted a positive effect on velocity parameters, but do not influence cellular membranes and chromatin. Furthermore, when mares were inseminated with semen containing pentoxifylline, an intense inflammatory response was observed.

No presente experimento os efeitos de adicionar-se enxofre, nas formas inorgânica e orgânica (quelatada) em rações ricas em uréia (nitrogênio não protéico), nos tecidos reprodutivos de ovinos e as conseqüências advindas desta suplementação sobre as características seminais destes animais foram estudados num delineamento em blocos incompletos equilibrados. Doze carneiros machos adultos de mesma idade, mestiços Santa Inês e de porte semelhante foram empregados em dois períodos experimentais de 60 dias cada para avaliar três tratamentos: A. 100% das exigências em proteína degradável no rúmen (controle); B. 100% das exigências em proteína degradável no rúmen + 3% de uréia + enxofre (99% S) e C. 100% das exigências em proteína degradável no rúmen + 3% de uréia + enxofre quelatado (21,5% S). Colheitas semanais de sêmen foram realizadas em vagina artificial durante ambos períodos experimentais, cada um correspondente a um ciclo espermático, totalizando nove colheitas por animal em cada período experimental. Colheitas de sangue foram realizadas semanalmente para determinação da concentração de nitrogênio (N) uréico. Peso vivo e circunferência escrotal também foram aferidos semanalmente. No sêmen foram analisados: volume, turbilhonamento, vigor espermático, motilidade espermática, concentração espermática, total de espermatozóides no ejaculado, total de espermatozóides viáveis no ejaculado, integridade de membrana espermática, integridade de acrossoma e concentração de nitrogênio uréico no plasma seminal. Os tratamentos com suplementação de uréia apresentaram níveis de N-uréico no plasma sanguíneo e seminal significativamente maiores que os níveis encontrados no tratamento controle (p&lt;0,05). Não houve diferença significativa entre as fontes de enxofre utilizadas. Os tratamentos avaliados não diferiram (p&gt;0,05) quanto às características do sêmen estudadas. O aumento dos níveis de Nuréico no sangue e sêmen não provocou prejuízos nas características seminais de carneiros mestiços Santa Inês, nas condições deste experimento. / In this research the addiction of inorganic and organic sulphur to diets with urea over the reproductive tissues of rams and its consequences on seminal characteristics were studied in a balanced incomplete block design. Twelve adult Santa Inês crossbred rams with similar weight and age were employed in two 60 days periods to evaluate three treatments: A. 100% of degradable protein requirement (control); B. 100% of degradable protein requirement + 3% urea + inorganic sulphur (99% S) and C. 100 % of degradable protein requirement + 3% urea + organic sulphur (21,5% S). Seminal collections were made weekly through artificial vagina over both experimental periods, corresponding each one to spermatic cycle, getting at an amount of nine collections by animal by period. Blood collections were made weekly to analyze plasma Nureic levels. Live weight and scrotal circumference were measured also weekly. In semen samples were studied volume, microscopic waves, vigor, motility, concentration, total sperm per ejaculate, total feasible sperm per ejaculate, membrane sperm integrity, acrosomal integrity and N-ureic level in seminal plasma. Treatments with urea presented blood and seminal plasma Nureic levels higher than the ones of control treatment (p&lt; 0,05). There was no significant difference between organic and inorganic sources of sulphur. The treatments did not affect semen characteristics (p&gt;0,05). Increased blood and semen N-ureic levels did not evoke damages on seminal characteristics of Santa Inês crossbred rams, under the conditions studied during this experiment.

No presente experimento os efeitos de adicionar-se enxofre, nas formas inorgânica e orgânica (quelatada) em rações ricas em uréia (nitrogênio não protéico), nos tecidos reprodutivos de ovinos e as conseqüências advindas desta suplementação sobre as características seminais destes animais foram estudados num delineamento em blocos incompletos equilibrados. Doze carneiros machos adultos de mesma idade, mestiços Santa Inês e de porte semelhante foram empregados em dois períodos experimentais de 60 dias cada para avaliar três tratamentos: A. 100% das exigências em proteína degradável no rúmen (controle); B. 100% das exigências em proteína degradável no rúmen + 3% de uréia + enxofre (99% S) e C. 100% das exigências em proteína degradável no rúmen + 3% de uréia + enxofre quelatado (21,5% S). Colheitas semanais de sêmen foram realizadas em vagina artificial durante ambos períodos experimentais, cada um correspondente a um ciclo espermático, totalizando nove colheitas por animal em cada período experimental. Colheitas de sangue foram realizadas semanalmente para determinação da concentração de nitrogênio (N) uréico. Peso vivo e circunferência escrotal também foram aferidos semanalmente. No sêmen foram analisados: volume, turbilhonamento, vigor espermático, motilidade espermática, concentração espermática, total de espermatozóides no ejaculado, total de espermatozóides viáveis no ejaculado, integridade de membrana espermática, integridade de acrossoma e concentração de nitrogênio uréico no plasma seminal. Os tratamentos com suplementação de uréia apresentaram níveis de N-uréico no plasma sanguíneo e seminal significativamente maiores que os níveis encontrados no tratamento controle (p&lt;0,05). Não houve diferença significativa entre as fontes de enxofre utilizadas. Os tratamentos avaliados não diferiram (p&gt;0,05) quanto às características do sêmen estudadas. O aumento dos níveis de Nuréico no sangue e sêmen não provocou prejuízos nas características seminais de carneiros mestiços Santa Inês, nas condições deste experimento. / In this research the addiction of inorganic and organic sulphur to diets with urea over the reproductive tissues of rams and its consequences on seminal characteristics were studied in a balanced incomplete block design. Twelve adult Santa Inês crossbred rams with similar weight and age were employed in two 60 days periods to evaluate three treatments: A. 100% of degradable protein requirement (control); B. 100% of degradable protein requirement + 3% urea + inorganic sulphur (99% S) and C. 100 % of degradable protein requirement + 3% urea + organic sulphur (21,5% S). Seminal collections were made weekly through artificial vagina over both experimental periods, corresponding each one to spermatic cycle, getting at an amount of nine collections by animal by period. Blood collections were made weekly to analyze plasma Nureic levels. Live weight and scrotal circumference were measured also weekly. In semen samples were studied volume, microscopic waves, vigor, motility, concentration, total sperm per ejaculate, total feasible sperm per ejaculate, membrane sperm integrity, acrosomal integrity and N-ureic level in seminal plasma. Treatments with urea presented blood and seminal plasma Nureic levels higher than the ones of control treatment (p&lt; 0,05). There was no significant difference between organic and inorganic sources of sulphur. The treatments did not affect semen characteristics (p&gt;0,05). Increased blood and semen N-ureic levels did not evoke damages on seminal characteristics of Santa Inês crossbred rams, under the conditions studied during this experiment.