38 PIVs carried through in two laboratories of the Uberaba MGBRASIL had been used in this work with the objective to evaluate the relationship between condensation chromatin and head morphometry of spermatozoa and cleavages and blastocyst formation rates using semen of zebu bulls with normal routine tests of fertility. Smears of semen stained with of Toluidine Blue and computer image analysis had been used to evaluate the morphometry and chromatin condensation. Area (A), perimeter (P), width (L), length (C), width:length ratio (L/C), ellipticity (E), shape factor (FF), side symmetry (SL), anterior-posterior symmetry (SAP) and the three first Fourier values (F0, F1, F2) had been evaluated in the morphometric analysis. The chromatin was evaluated in relation to intensity of condensation and homogeneity. The results allowed concluding that the influence of light variations in the sperm head morphometry and the chromatin condensation on the cleavage and number of normal morfologic blastocyst in the PIV is small. / Foram utilizados os dados de 38 programações de produção in vitro de embriões (PIV), realizadas em dois laboratórios da cidade de Uberaba-MG-Brasil, com o objetivo de se avaliar a correlação entre compactação da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozóides com a taxa de clivagem e formação de blastocisto utilizando sêmen de touros zebuínos com testes de rotina normais para fertilidade. Foram utilizados esfregaços de sêmen corados com Azul de Toluidina e análise de imagem por computador para avaliar a morfometria e a compactação de cromatina. Na análise morfométrica foram avaliados: área (A), perímetro (P), largura (L), comprimento (C), razão largura:comprimento (L/C), elipsidade (E), fator forma (FF), simetria lateral (SL), simetria ântero-posterior (SAP) e descritores Fourier com amplitude de 0 a 2 (F0, F1, F2). A cromatina foi avaliada quanto à intensidade de compactação e homogeneidade. Os resultados permitiram concluir que é discreta a influência de pequenas variações observadas na morfometria da cabeça e na compactação da cromatina espermática sobre a clivagem e número de blastocistos morfologicamente normais na PIV. / Mestre em Ciências Veterinárias

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pre textuais aline franca.pdf: 261338 bytes, checksum: 26489ba3dd2eb948a58b73b531aee0b2 (MD5) Previous issue date: 2010-10-05 / The evaluation of the reproductive capacity of stallions and semen cooled and / or frozen is of fundamental importance in practical breeding of horses. Whereas predicting the fertility of a stallion is still a subjective decision, the present study was conducted to evaluate different staining techniques, as well as tests that assess the viability of semen in horses, studying the effects of the addition of cysteine and glutathione in plasma membrane integrity of sperm DNA, and to evaluate the effects of the addition of these antioxidants in preserving the viability of sperm undergoing incubation and refrigerated for short periods. We used semen from six stallions, wich were split into seven samples, one kept as control (Control Group) and other antioxidants cysteine was added at a ratio of 1.0 mM (Group C1, 0), 1.5 mM (Group C1, 5), 2.5 mM (Group C 2.5) and glutathione also at 1.0 mM (Group G1, 0), 1.5 mM (Group G1, 5) and 2.5 mM (Group G 2.5 ). All tests were performed every six hours. The three treatments were: Treatment I cooled to 12 &#8304;C for 12 hours (zero hour; 6h resf.; 12h resf.) Chilled in boxes; Treatment II incubated in a water bath at 37 &#8304;C for 12 hours (6h 37 ° C, 12h 37 ° C) and Treatment III - cooled and subsequently incubated, according to the treatments I and II. The evaluation of plasma membrane integrity was performed by staining eosine-nigrosin; acrosomal membrane by FITC-PSA and DNA by acridine orange. For each analysis were numbered 200 to 500 cells. The evaluation of the viability of sperm was performed by MTT assay according to Mosmann (1983). The results showed that antioxidants were effective (p <0.05) in keeping the DNA intact chromatin, especially glutathione. In the acrosome of antioxidants were protective, at times 18 and 24 hours, and in other treatments, no significant difference (p> 0.05) between control and treated groups. The MTT test showed that groups treated with antioxidants had absorbance values similar to those of control, showing positive effect (p <0.05) only when cooled by six o'clock in the cysteine group 2.5. In relation to the plasma membrane of spermatozoa stained with eosin-nigrosin, no protective effect of antioxidants in the samples. The values of their averages were close to the control group (p> 0.05). One factor was estimated that cooling per se, independent of the addition of antioxidants used, has been effective in protecting the sperm. And the incubation at 37 &#8304; C causes these cells, and the addition of cysteine and glutathione were efficient, if not protect, but to maintain the integrity of the factors evaluated, not causing more damage to sperm. / A avaliação da eficácia reprodutiva do garanhão e do sêmen resfriado e&#8260;ou congelado é de fundamental importância na prática reprodutiva dos eqüinos. Predizer a fertilidade de um garanhão constitui uma decisão subjetiva. O presente estudo foi realizado com o objetivo de testar diferentes técnicas de coloração, assim como testes que avaliem a viabilidade do sêmen de eqüinos, estudando os efeitos da adição de cisteína e glutationa na integridade da membrana plasmática, do DNA espermático, além de avaliar os efeitos da adição desses antioxidantes na preservação da viabilidade dos espermatozóides submetidos à incubação e refrigeração por curtos períodos. Foi utilizado sêmen de seis garanhões, que foram fracionados em sete amostras, sendo uma mantida como controle (Grupo Controle) e às outras foi adicionado os antioxidantes cisteína, na proporção de 1,0mM (Grupo C1,0); 1,5mM (Grupo C1,5); 2,5mM (Grupo C 2,5) e glutationa também na proporção de 1,0mM (Grupo G1,0); 1,5mM (Grupo G1,5) e 2,5mM (Grupo G 2,5). Todas as análises foram realizadas a cada seis horas. Os três tratamentos foram: Tratamento I resfriado a 12 °C, por 12 horas (zero hora; 6h resf.; 12h resf.), em caixas refrigeradas; Tratamento II incubado em banho-maria a 37 °C, por 12 horas (6h 37° C; 12h 37° C) e Tratamento III resfriado e posteriormente incubado, conforme os Tratamentos I e II. A avaliação da integridade da membrana plasmática foi feita pela coloração eosina-nigrosina; da membrana acrossomal pelo FITC-PSA e do DNA pela laranja de acridina. A avaliação da viabilidade do sêmen foi realizada pelo ensaio do MTT, de acordo com Mosmann(1983). Os resultados obtidos mostraram que os antioxidantes foram eficientes (p<0,05) em manter a cromatina do DNA intacta, especialmente a glutationa. Na membrana acrossomal houve proteção dos antioxidantes, nos momentos 18 e 24 horas, sendo que nos demais tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os grupos tratados e o grupo controle. O teste do MTT mostrou que os grupos tratados com antioxidantes tiveram valores de absorbância próximos aos do controle, mostrando efeito positivo (p<0,05) apenas quando resfriados por seis horas, no grupo cisteína 2,5. Em relação à membrana plasmática dos espermatozóides, corados por eosina-nigrosina, não houve efeito protetor dos antioxidantes nas amostras avaliadas. Um fator avaliado foi que o resfriamento, por si só, independente da adição dos antioxidantes utilizados, já foi eficaz em proteger os espermatozóides. E a incubação a 37&#8304; C causa danos a essas células, e a adição de cisteína e glutationa foi eficiente em, senão proteger, mas manter a integridade dos fatores avaliados, não causando mais danos aos espermatozóides.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ronan Maciel Marcos.pdf: 4015895 bytes, checksum: 8eccb9bdeae1bd75f757e535ee696dd1 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Fundação Araucária / The aim of this work were: evaluate sperm and seminal parameters of surubim-do-Iguaçu males and evaluate the effect of dilution, temperature and storage time of semen on them, besides determine the viability and describe the kinetics of activation of sperm cells of S. melanodermatum cryopreserved in different extenders. For the realization this work was divided into two sections: a) Spermatic and seminal parameters of surubim do Iguaçu, and short-term semen storage. It was collected semen from nine males hormonally induced. The spermatic parameters evaluated were: sperm motility (MOT), curvilinear velocity (VCL), straight-line velocity (VSL), average path velocity (VAP), sperm velocity (SV), time total of sperm activation (TEMP), sperm concentration (CONC), normal sperm morphology index (NORM), seminal plasma osmolality (OSM) and pH of semen (pH). Samples of semen were stored in microtubes to evaluate the effect of dilution (aqueous solution containing 5% fructose and 5% milk powder), temperature (10 and 25°C) and storage time (0, 5, 9, 18 , 27, 36, 45, 54 hours) on the MOT, VCL, VSL, VAP and TEMP. Males released on average 10.57 ± 6.28 mL and the sperm showed 99,86±0,31% of MOT, 185,58±14,11&#956;m.s-1 of VCL, 49,15 ±4,66&#956;m.s-1 of VSL, 87,02±4,13 &#956;m.s-1 of VAP, 106,52 ±4,45&#956;m.s-1 of VE, 79,31±5,62s of TEMP, 1,03x1010±3,65x109 células.mL-1 of CONC, 75,81±5,71% of NORM, 258,78±29,36mOsm of OSM and 7,11±0,31 of pH. b) Motility and kinetics activation of sperm cells cryopreserved in different extenders. Were collected semen samples from five males, hormonally induced, these submitted to the protocol of cryopreservation with the use of twelve extenders, formulated with the use of glucose, fructose, milk powder, DMSO, propylene glycol and methanol. The cryopreserved semen was thawed and evaluated for the parameters: sperm motility (in 10 seconds after activation), theoretical initial motility, sperm velocity, index of normality and the elapsed times for 75%, 50% and 25% of the sperm stay mobile. The fresh semen was evaluated for the same parameters. The solution containing 2.5% fructose, 5% milk powder and 10% methanol had higher (P <0.05) rate of normality (71.13 ± 4.79%) and higher initial motility (85.56 ± 15.31%). By using the solution containing 5% fructose, 5% milk powder and 10% methanol was found highest averages for the parameters: sperm motility in 10s after activation (78.99 ± 27.20%), sperm velocity (75.62 ± 18.76 &#956;m.s-¹) and this solution prolonged the sperm activation. The semen samples stored undiluted and maintained at 10 or 25°C showed higher averages for MOT. Is indicated storage of semen S. melanodermatum un diluted until 27 hours and cryopreservation using the extender solution containing 5% fructose, 5% milk powder and 10% methanol in aqueous solution. / Os objetivos deste estudo foram: avaliar os parâmetros seminais e espermáticos de Steindachneridion melanodermatum, bem com o efeito da diluição, da temperatura e tempo de estocagem do sêmen, além de avaliar a motilidade e descrever a cinética da ativação de células espermáticas de S. melanodermatum criopreservadas em diferentes soluções diluidoras. Para a realização do trabalho este foi dividido em duas seções: a) Parâmetros seminais e espermáticos do surubim do Iguaçu e estocagem do sêmen por curto prazo e b) Motilidade e cinética da ativação de células espermáticas criopreservadas em diferentes diluidores. No primeiro ensaio foi coletado o sêmen de nove machos, induzidos hormonalmente. Avaliou-se os parâmetros: motilidade espermática (MOT), velocidade curvilinear (VCL), velocidade em linha reta (VLR), velocidade média de deslocamento (VMD), velocidade espermática (VE), tempo total de ativação espermática (TEMP), concentração espermática (CONC), índice de normalidade morfológica dos espermatozoides (NORM), osmolaridade do plasma seminal (OSM) e pH do sêmen (pH). Amostras do sêmen foram estocadas em microtubos para a avaliação do efeito da diluição (solução aquosa contendo 5% de frutose e 5% de leite em pó), temperatura (10 e 25ºC) e tempo de estocagem (0, 5, 9, 18, 27, 36, 45, 54 horas) do sêmen sobre a MOT, VCL, VLR, VMD, TEMP. Os machos liberaram em média 10,57±6,28 mL e os espermatozoides apresentaram 99,86±0,31% de MOT, 185,58±14,11&#956;m.s-1 de VCL, 49,15 ±4,66&#956;m.s-1 de VLR, 87,02±4,13 &#956;m.s-1 de VMD, 106,52 ±4,45&#956;m.s-1 de VE, 79,31±5,62s de TEMP, 1,03x1010±3,65x109 células.mL-1 de CONC, 75,81±5,71% de NORM, 258,78±29,36mOsm de OSM e 7,11±0,31 de pH. No segundo ensaio foram coletadas amostras de sêmen de cinco machos, induzidos hormonalmente, que foram submetidas protocolo de criopreservação com a utilização de doze soluções diluidoras, formuladas com a utilização de glicose, frutose, leite em pó, DMSO, propileno glicol e metanol. O sêmen criopreservado foi descongelado e avaliado quanto aos parâmetros: motilidade espermática (10s após a ativação), motilidade inicial teórica, velocidade espermática, índice de normalidade, e os tempos decorridos para que 75%, 50% e 25% dos espermatozóides permanecessem móveis. O sêmen fresco foi avaliado em relacão aos mesmos parâmetros. A solução contendo 2,5% frutose, 5% leite em pó e 10% metanol apresentou maior (P<0,05) índice de normalidade (71,13±4,79%) e maior motilidade inicial (85,56±15,31%). Com a utilização da solução contendo 5% frutose, 5% leite em pó e 10% metanol foram encontrados maiores médias para os parâmetros: motilidade espermática em 10s após a ativação (78,99±27,20%), velocidade espermática (75,62±18,76 &#956;m.s-¹) e esta solução prolongou a ativação espermática. As amostras de sêmen estocadas não diluídas e mantidas a 10 ou 25ºC apresentaram maiores médias para MOT. Indica-se a estocagem do sêmen S. melanodermatum não diluído por até 27 horas e a criopreservação com a utilização de solução crioprotetora contendo 5% frutose, 5% de leite em pó e 10% de metanol em solução aquosa.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giovano Neumann.pdf: 1483055 bytes, checksum: 73310de09daeb1b45d1ac1eda6a64ce0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation is based on the development of two separate scientific papers. (1) First article it is a scientometric analysis: In 2007 was released in the scientific means by Wilson-Leedy and Ingermann, the first article using the CASA free software in sperm mobility analysis for fish, for this study, from of scientometric techniques, the contribution has been assessed and the impact that the article caused the scientific community. It also evaluated the frequency in the number of publications using andrologic analysis in fish, from 2007 to 2014 in four magazines that publish articles related to this topic. Were evaluated under articles made soundness analysis in fish using any existing CASA system, the variables used and ways to interpret the results to determine the sperm viability and correlate the sperm motion parameters with the potential fertilization. For scientometry CASA launching the contribution in free software took place in the google scholar search to get all the work that had quoted the article. For scientometry of items with fish using CASA, was conducted using the search index of ScienceDirect. And to assess the variables and the interpretations made by the authors, harvest characteristics of the materials and methods and results in the articles. It was found 123 quotes Wilson-Leedy article and Ingermann these, 94 are articles, of which 66 were performed with fish, and 35 of these conducted their research using CASA in free software, and there was an increase of 85% in citing publications the author reference. In the search for articles that use in fish soundness analysis, an increase of 59.4% from 2007 to 2014. Of the publications articles using any home system for the assessment of sperm motility in fish, 75.76% of the two work assesses or more times the spermatic movement, 51.52% use at least four of the characteristics generated by CASA, about ¼ of the work validated the CASA results with fertilization and hatching of eggs and used statistical models to group correlated variables CASA and explanations them, less than 10% of articles explores statistical modeling in sperm kinetics and to explain the characteristics generated by CASA on sperm fertility. The article by Wilson-Leedy and Ingermann contributed to the advancement of research with fish sperm, and sperm was used in the evaluation of other animals and other cells also concluded that little is known of the relationship of some sperm variables generated by CASA with fertility sperm in fish. And the researchers do not use in full the resources of the CASA system. (2) According to an article this is an experiment of artificial reproduction: The objective of this study was to evaluate the interactive effects of the relationship or independent mobile sperm: oocyte and sperm speed on artificial reproduction procedures with the use of semen catfish (Rhamdia quelen) cryopreserved. Through the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) were evaluated in six replicates motility and sperm velocity of cryopreserved semen from eight seconds of its activation and to each according to the end of the spermatic movement. For the fertilization test an experimental design was used in a factorial (6x3x3) consists of six mobile sperm relations: oocyte (70,000, 90,000, 110,000, 130,000, 150,000 and 170,000), three sperm speeds (60, 40 and 20&#956;m.s-1) and three experimental replicates or blocks (pools of oocytes from three groups of female). Activation curves of sperm (kinetic) have been prepared with the help of non-linear statistical model. The effects were evaluated on the fertilization, hatching and normal larvae. In evaluating the variables, the response surface analysis showed no interaction effect (p>0.05) between the relationship moving sperm: oocyte and sperm speed, on the fertilization rates, hatching and normal larvae. Only linear effect was found (p<0.05) of sperm speed under the fertilization rates and hatching eggs. According to the results, it is concluded that there is no difference between the use of 70,000 up to 170,000 mobile sperm for each oocyte on the reproductive success in terms of fertilization rate, hatching and larval normality of catfish (Rhamdia quelen) and that the value of the sperm velocity is decisive on the reproductive success of sperm catfish (Rhamdia quelen) decreasing the fertilization and hatching rates as decreases sperm speed. / Esta dissertação baseia-se na elaboração de dois artigos científicos distintos. (1) Primeiro artigo trata-se de uma análise cientométrica: Em 2007 foi lançado no meio cientifico por Wilson-Leedy e Ingermann, o primeiro artigo utilizando o CASA em software livre em análise de mobilidade espermática para peixes, para este estudo, a partir de técnicas cientométricas, foi avaliado a contribuição e o impacto que o artigo provocou na comunidade cientifica. Também foi avaliada a frequência no número de publicações utilizando analises andrológicas em peixes, desde 2007 à 2014 em quatro revistas que publicam artigos referentes a este tema. Foram avaliados sob artigos que realizaram analise andrológica em peixes utilizando algum sistema CASA existente, as variáveis utilizadas e as formas de interpretação dos resultados para determinar a viabilidade espermática e correlacionar os parâmetros de movimento espermático com o potencial de fertilização. Para a cientometria da contribuição do lançamento do CASA em software livre foi realizada busca no google acadêmico para levantar todos os trabalhos que haviam citado o artigo. Para a cientometria dos artigos com peixes utilizando o CASA, foi realizado busca utilizando o indexador da ScienceDirect. E para avaliar as variáveis e as interpretações realizadas pelos autores, colhemos suas características dos materiais e métodos e resultados nos artigos. Encontrou-se 123 citações do artigo de Wilson-Leedy e Ingermann destes, 94 são artigos, dos quais 66 foram realizados com peixes e, 35 destes realizaram suas pesquisas utilizando o CASA em software livre, e ocorreu um aumento de 85% nas publicações citando o autor referência. Na busca de artigos que utilizam analise andrológica em peixes, ocorreu um aumento de 59,4% das publicações de 2007 à 2014. Dos artigos que utilizam qualquer sistema CASA para a avaliação da mobilidade espermática em peixes, 75,76% dos trabalhos avalia dois ou mais tempos do movimento espermático, 51,52% utiliza pelo menos quatro das características geradas pelo CASA, aproximadamente ¼ dos trabalhos validou os resultados do CASA com fertilização ou eclosão dos ovos e usou modelos estatísticos para agrupar as variáveis correlacionadas do CASA e explica-las, menos de 10% dos artigos explora modelagem estatística na cinética espermática e para explicar as características gerados pelo CASA sobre a fertilidade espermática. O artigo de Wilson-Leedy e Ingermann contribuiu para o avanço das pesquisas com espermatozoides de peixes, e foi utilizado na avaliação espermática de outros animais e outras células, também concluímos que pouco se sabe da relação de algumas variáveis espermáticas geradas pelo CASA com a fertilidade espermática em peixes. E que os pesquisadores não utilizam em sua totalidade os recursos do sistema CASA. (2) Segundo artigo trata-se de um experimento de reprodução artificial: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos interativos ou independentes da relação espermatozoides móveis:ovócito e da velocidade espermática em procedimentos de reprodução artificial com o uso do sêmen do jundiá (Rhamdia quelen) criopreservado. Através do Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) foram avaliadas em seis réplicas a motilidade e a velocidade espermática do sêmen criopreservado a partir de oito segundos da sua ativação e a cada um segundo até o termino do movimento espermático. Para o ensaio de fertilização foi aplicado um delineamento experimental em esquema fatorial (6 x 3) composto de seis relações espermatozoides móveis:ovócito (70.000, 90.000, 110.000, 130.000, 150.000 e 170.000), três velocidades espermáticas (60, 40 e 20µm.s-1) e três réplicas ou blocos experimentais (pools de ovócitos provenientes de três grupos de fêmeas). As curvas de ativação dos espermatozoides (cinéticas) foram elaboradas com auxílio de modelo estatístico não linear. Os efeitos foram avaliados sobre as taxas de fertilização, eclosão e larvas normais. Na avaliação das variáveis, a análise de superfície de resposta não mostrou efeito interativo (p>0,05) entre a relação espermatozoides móveis:ovócito e as velocidades espermáticas, sobre as taxas de fertilização, de eclosão e de larvas normais. Somente foi encontrado efeito linear (p<0,05) da velocidade espermática sob as taxas de fertilização e de eclosão dos ovos. De acordo com os resultados, conclui-se que não há diferença alguma entre uso de 70.000 até 170.000 espermatozoides móveis para cada ovócito sobre o sucesso reprodutivo em termos de taxa de fertilização, eclosão dos ovos e normalidade larval do jundiá (Rhamdia quelen) e, que o valor da velocidade espermática é determinante sobre o sucesso reprodutivo dos espermatozoides de jundiá (Rhamdia quelen) diminuindo as taxas de fertilização e eclosão conforme diminui a velocidade espermática.

A criopreservação de sêmen humano tem sido amplamente utilizada como método de preservação da fertilidade. A fim de reduzir os danos causados pelo processo de congelamento, diversos estudos utilizaram substâncias antioxidantes e estimulantes, porém, sua eficácia, bem como seu papel no controle funcional dos espermatozoides, não está bem estabelecida na literatura. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-descongelamento. Para isso, este estudo prospectivo utilizou 30 amostras seminais de pacientes entre 19 e 45 anos de idade da rotina do Laboratório Androscience entre maio de 2013 e maio de 2017. Todas as amostras foram classificadas como normozoospérmicas, segundo análise seminal inicial de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em seguida, as amostras foram criopreservadas com Human Tubal Fluid modificado sem suplemento ou com 2mM de melatonina. Após o descongelamento, as amostras foram analisadas ou suplementadas com 2 mM de cafeína, incubadas por 15 minutos. Ao final dos experimentos, obtivemos 4 grupos: Amostras pós-descongelamento sem suplementação (CONT), amostras suplementadas com cafeína (CAF), melatonina (MEL) e cafeína + melatonina (CM). Parâmetros seminais de contagem, motilidade e cinética, analisados pelos critérios da OMS e pelo software SCA®, a atividade mitocondrial, pela coloração por diaminobenzidina, avaliação da taxa de fragmentação de DNA, pelo método SCSA® e a dosagem dos níveis de radicais livres de oxigênio (ROS), pelo método de luminescência, foram realizados pré-criopreservação e pós-descongelamento com ou sem suplementação. Os dados foram analisados pelo teste T de Student pareado e pela análise de variâncias de uma via com medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Holm-Sidak, e adotado um alfa de 5%. Observamos redução significativa concentração espermática (p < 0,001), motilidade total (p < 0,001) e progressiva (p < 0,001), parâmetros cinéticos (p < 0,009) e atividade mitocondrial (p < 0,001) e aumento das taxas de fragmentação de DNA (p=0,046) e ROS (p=0,052) nas amostras CONT quando comparadas com as amostras a fresco. Quando suplementadas com cafeína e melatonina, observamos aumento da motilidade progressiva nos grupos CAF (p=0,005) e CM (p=0,048) e aumento da atividade mitocondrial no grupo CM (p < 0,05). Podemos concluir que a associação da suplementação com cafeína e melatonina nas amostras pré-criopreservação e pós-descongelamento demonstrou ser uma ferramenta importante para ser aplicada em amostras criopreservadas para atuarem como substâncias estimuladoras de motilidade espermática / Human semen cryopreservation has been widely used as a method of preserving fertility. In order to reduce the damages caused by the freezing process, several studies used antioxidant and stimulant substances, however, their efficiency as well as their role in the functional control of spermatozoa have not been well established in literature. Thus, the goal of this study was to investigate the effect of melatonin and caffeine supplementation on the structural and functional characteristics of pre-cryopreservation and post-thaw spermatozoa. For this, this prospective study used 30 seminal samples from patients aged from 19 to 45 years in the routine of the Androscience Laboratory between May 2013 and May 2017. All samples were classified as normozoospermic, according to the initial seminal analysis following criteria of the World Health Organization (WHO). Then, the samples were cryopreserved with modified Human Tubal Fluid without supplement or with 2 mM of melatonin. After thawing, the samples were analyzed or supplemented with 2 mM of caffeine, and incubated for 15 minutes. At the end of the experiments, we obtained 4 groups: Post-thaw samples without supplementation (CONT), samples supplemented with caffeine (CAF), melatonin (MEL) and caffeine + melatonin (CM). Seminal parameters for count, motility and kinetics, analyzed by WHO criteria and by the SCA® software, mitochondrial activity, by diaminobenzidine staining, evaluation of DNA fragmentation rate, by the SCSA® method, and dosage of radical oxygen species (ROS) levels, by the luminescence method, pre-cryopreservation and post-thaw were carried out with or without supplementation. The data were analyzed by the paired Student\'s t-test and by one-way analysis of variance with repeated measurements, followed by the Holm-Sidak post-test, adopting an alpha of 5%. We observed a significant reduction in sperm concentration (p < 0.001), total (p < 0.001) and progressive (p < 0.001) motility, kinetic parameters (p < 0.009) and mitochondrial activity (p < 0.001), and increased rates of DNA fragmentation (p=0.046) and ROS (p=0.052) production in the CONT samples when compared with fresh sample. When supplemented with caffeine and melatonin, we observed an increase in progressive motility in the CAF (p=0.005) and CM (p=0.048) groups, and an increase in mitochondrial activity in CM group (p < 0.05). We can conclude that that the combination of caffeine and melatonin supplementation in pre-cryopreservation and post-thaw samples proved to be an important tool to be applied in cryopreserved samples to act as substances that stimulate sperm motility

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-06-20T20:06:17Z No. of bitstreams: 1 leonardotoshiooshio.pdf: 6184732 bytes, checksum: 2ae5dded31a5fbae3336c3f4555afe20 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-07-13T15:26:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 leonardotoshiooshio.pdf: 6184732 bytes, checksum: 2ae5dded31a5fbae3336c3f4555afe20 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T15:26:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 leonardotoshiooshio.pdf: 6184732 bytes, checksum: 2ae5dded31a5fbae3336c3f4555afe20 (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / O Extrato de Ginkgo biloba (EGb) é um dos fitoterápicos mais consumidos no mundo e tem sido utilizado no tratamento da disfunção erétil e como afrodisíaco. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade sistêmica do EGb e o efeito sobre o sistema reprodutor masculino de ratos Wistar. Oitenta animais de três meses de idade foram tratados com água destilada (Grupo Controle) e extrato aquoso de Ginkgo biloba nas seguintes doses: 3,5 (EGb 3,5); 7,0 (EGb 7,0) e 14,0 mg/kg (EGb 14,0) uma vez ao dia, por 56 dias consecutivos. Foram avaliados o peso corporal, estimativa de consumo diário de ração, indícios de sinais clínicos de toxicidade, peso de órgãos e glândulas acessórias do sistema reprodutor masculino e dados histométricos testiculares. Espermatozoides foram coletados da cauda do epidídimo e foram submetidos à contagem e avaliados quanto à vitalidade e morfologia. Foram realizados hemograma completo, dosagem bioquímica sérica de ureia, creatinina e alanina aminotransferase (ALT) e concentração de testosterona total sérica. Não foram observados nos animais sinais clínicos de toxicidade sistêmica e mortes. Apesar de ter ocorrido diferenças estatísticas significativas na estimativa de consumo de ração, hemoglobinometria, concentração de hemoglobina globular média e volume das células de Leydig, concluise que o EGb no presente trabalho, e com as doses utilizadas, não causou toxicidade sistêmica nem promoveu alteração na morfometria testicular e qualidade espermática de ratos Wistar. / Ginkgo biloba Extract (GBE) is one of the most consumed herbal medicines in the world and it has been used in the treatment of erectile dysfunction and as an aphrodisiac. The present study had as objective to evaluate the GBE systemic toxicity and its effect on male reproductive system of Wistar rats. Eighty animals of threemonth- old age were treated with distilled water (Control Group) and aqueous extract of Ginkgo biloba in the following doses: 3.5 (GBE 3.5); 7.0 (GBE 7.0) and 14.0 mg/kg (GBE 14.0) once per day, for 56 consecutive days. Body weight, daily food consumption estimation, toxicity clinical signs evidences, male reproductive system organs and accessory glands weights and testis histometric analysis data were evaluated. Spermatozoa were collected from the cauda epididymis and were subjected to counting and evaluations of vitality and morphology. Complete blood count test, serum biochemistry test of urea, creatinine and alanine aminotransferase (ALT) and total serum testosterone levels were realized. Clinical signs of systemic toxicity and deaths were not seen. In spite of it had had significant statistical differences on daily food consumption estimation, hemoglobinometry, mean corpuscular hemoglobin concentration and Leydig cell volume, it was concluded that GBE in the present study and with the doses used, did not cause systemic toxicity nor promoted alterations on testicular morphometry and spermatic quality of Wistar rats.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_jorgea_pradiee.pdf: 964026 bytes, checksum: e100969ef5fb9f72ec9bf73b616695fd (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / In an attempt to diminish the structural damage to the plasma membrane, due to free radicals and reactive oxygen species (ROS), the antioxidants β-mercaptoethanol (BME) and cysteine (CIS) were tested for semen cryopreservation and in vitro maturation (IVM) and culture (IVC) of ovine embryos. Semen samples from four rams of the Crioula Lanada breed were collected with artificial vagina twice weekly (n = 23). Samples of four rams were pooled and split in six treatments: T1, control without antioxidant, T2, with 2mM BME, T3, with 5mM BME, T4, with 2mM BME and 5mM cysteine; T5, with 5 mM BME and 5mM cysteine, and T6 with 5 mM cysteine. Semen was diluted in tris-egg yolk-glycerol and stored in straws of 0.25 mL containing 100 x 106 spermatozoa. Cooling and freezing were performed using a TK3000 and thawing was performed at 37°C for 20 s. Sperm motility, membrane integrity and mitochondrial activity and acrosome, before freezing and after thawing, did not differ between treatments (P> 0.05). Quantification of ROS and total antioxidant activity after thawing were similar between treatments (P> 0.05). At the tested concentrations, the inclusion of BME, and cysteine did not affect sperm viability after thawing. In the first experiment of IVP, the inclusion of 20 mM of BME in IVM and IVC of embryos was compared to a control treatment without antioxidants. There was no deleterious effect of antioxidant on the cleavage rate (control: 70.0%; BME: 69.8%). However, the rate of development to the blastocyst stage with BME (5.2%) was lower (P <0.001) than with the control (16.9%). In the second experiment, we tested the association of 50 mM BME and 600 mM of CIS in IVM and IVC. There was no difference between control and BME/CIS (P> 0.05), for cleavage (60.3% and 64.3%, respectively) and embryonic development rates (33.6% and 36.6 %, respectively). The addition of 20 mM of isolated BME in IVM and IVC sheep embryos was associated with decreased embryonic development to blastocyst. However, the addition of antioxidants BME, and cysteine in combination, did not affect the rates of cleavage and embryo development to blastocyst. Therefore, the combination of antioxidants and CIS BME used in freezing ram semen and PIV, did not improve the treatments that have been added, albeit at different concentrations. / Na tentativa de diminuir os danos estruturais na membrana plasmática, devido aos radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ROS), os antioxidantes β-mercaptoetanol (BME) e cisteína (CIS) foram testados na criopreservação de sêmen e na maturação (MIV) e cultivo (CIV) in vitro de embriões de ovinos. Amostras de sêmen de quatro carneiros da raça Crioula Lanada foram coletadas com vagina artificial, duas vezes por semana (n = 23). As amostras dos quatro machos foram combinadas em pool e divididas em seis tratamentos: T1, Controle, sem antioxidante; T2, com 2mM BME; T3, com 5mM BME; T4, com 2mM BME e 5mM de cisteína; T5, com 5mM BME e 5mM de cisteína; e T6 com 5mM de cisteína. O sêmen foi diluído em tris-gema-glicerol e estocado em palhetas de 0,25 mL contendo 100 x 106 espermatozoides. O resfriamento e o congelamento foram realizados em máquina TK3000 e o descongelamento foi realizado a 37ºC por 20 s. A motilidade, a integridade da membrana espermática e do acrossoma e a atividade mitocondrial, antes do congelamento e após o descongelamento, não diferiram entre os tratamentos (P> 0,05). A quantificação de ROS e da atividade antioxidante total pós-descongelamento foram semelhantes entre os tratamentos (P> 0,05). Nas concentrações testadas, a inclusão de BME e cisteína não influenciou a viabilidade espermática pós-descongelamento. No primeiro experimento de PIV, a inclusão de 20 μM de BME na MIV e CIV de embriões foi comparada a um tratamento controle sem antioxidantes. Não houve efeito deletério do antioxidante sobre a taxa de clivagem (Controle: 70,0%; BME: 69,8%). Porém, a taxa de desenvolvimento até o estágio de blastocisto no tratamento BME (5,2%) foi inferior (P<0,001) à do controle (16,9%). No segundo experimento, foi testada a associação de 50 μM de BME e 600 μM de CIS, na MIV e CIV. Não houve diferença entre os tratamentos controle e BME/CIS (P>0,05), quanto às taxas de clivagem (60,3% e 64,3%, respectivamente) e de desenvolvimento embrionário (33,6% e 36,6%, respectivamente). A adição isolada de 20 μM de BME na MIV e CIV de embriões ovinos foi associada com redução no desenvolvimento embrionário até blastocisto. Porém, a adição dos antioxidantes BME e cisteína, em associação, não afetou as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário até blastocisto. Assim, a associação dos antioxidantes BME e CIS usados no congelamento de sêmen ovino e na PIV, não promoveu melhora dos tratamentos em que foram adicionados, ainda que em concentrações diferentes.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_marta_amaral.pdf: 872749 bytes, checksum: 441aef851eaec2633ad2f7530bf3c07c (MD5) Previous issue date: 2009-12-28 / Transgenic animals have been used as biological models in studies of the genes functions and their mechanisms of action, as well as to improve animal production. Researchers are trying to produce transgenic animals that will be organs donors in xenotransplants. Another use of the transgenic animal is in the production of recombinant proteins for pharmaceutical interest, starting from several tissues and corporal fluids of different animal species. Using TMGT (Testis Mediated Gene Transfer), the efficiency of pEGFP transgene transmission in mice using non surgical TMGT was evaluated, without epididymis electroporation; using transfectants as DMSO, liposomes, and for the first time the DMA. To evaluate the efficiency of non surgical TMGT in F0 the EGFP expression was evaluated in vivo and detection in genome was conducted by PCR analysis. Moreover, we evaluated which transfectants were more efficient in transgene transmission and if it induce histological damage in testis, by histological analysis. EGFP expression was not detected in F0 through the ultraviolet light.The result of the PCR analysis shows that liposomes and DMSO were the best transfectants for pEGFP in F0. The histological analysis shows that injections of DMSO with exogenous DNA could affect the development of the germ cell of seminal tubules. The purpose about SMGT was to evaluate the interaction of the spermatozoa of silver catfish with pEGFP vector. It was observed that the semen after three washes in isosmotic solution and at 1000 x g centrifugation could eliminate seminal plasma proteins and preserve cellular motility. The time of action of DNase in the seminal plasma was 30 minutes, the temperature of action of DNase ranged between 33-53°C and its inhibition was detected at 70°C. In the presence of EDTA 30mM the activity of DNase was inhibited. Through PCR it was detected that in the DNA of the silver catfish s spermatozoids, the amplicon of EGFP at different concentrations of pEGFP vector (5-100 ng/106 spermatozoa). We demonstrate that spermatozoa of the silver catfish need to be washed to remove seminal plasma before contact with exogenous DNA, after several washes exogenous DNA was internalized in spermatozoa. / Os animais transgênicos vêm sendo empregados como modelos biológicos em estudos das funções dos genes e dos seus mecanismos de ação, bem como para melhorar a produção animal. Pesquisadores vêm tentando produzir animais transgênicos que serão doadores de órgãos em xenotransplantes. Outra utilização da transgênese animal é a produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico a partir de diversos tecidos e fluidos corporais de diferentes espécies de animais. Em relação à TMGT (Testis Mediated Gene Transfer) foi avaliada a eficiência da transmissão do transgene EGFP em camundongos, utilizando a TMGT não cirúrgica, sem o uso de eletroporação no epidídimo; utilizando transfectantes como o DMSO, lipossomos, e pela primeira vez o DMA. A detecção da expressão do EGFP foi avaliada in vivo na F0 e por PCR, para comprovar a eficiência da TMGT não cirúrgica. Também foi analisado qual dos transfectantes propiciou a maior taxa de transmissão e se eles causaram danos histológicos aos testículos, através de análise histológica. Não foi detectada a expressão de EGFP, através da luz ultravioeta na F0. Os resultados da análise de PCR demonstraram que o lipossomo e o DMSO foram os melhores transfectantes do pEGFP na F0. A análise histológica demonstrou que a injeção de DMSO com o DNA exógeno, pode comprometer o desenvolvimento das células germinativas do túbulo seminal. O objetivo em relação à SMGT (Sperm-mediated gene transfer) foi avaliar a interação dos espermatozóides de silver catfish (Rhandia quelen) com o vetor pEGFP. Foi observado que o sêmen após três lavagens em solução isosmótica e centrifugadas à 1000 x g, eliminaram as proteínas do plasma seminal e preservaram a motilidade celular. O tempo de atividade da DNase no plasma seminal foi de 30 minutos, a temperatura de atividade da DNase variou entre 33-53°C e sua inativação ocorreu aos 70°C. Na presença de EDTA 30mM a atividade da DNase foi inibida. Através da PCR foi detectada a presença do pEGFP no DNA dos espermatozoides do silver catfish, que incorporaram o vetor em diferentes concentrações (5-100 ng/106 espermatozoides). Concluímos que os espermatozoides do silver catfish precisam ser lavados para retirada do da DNase do plasma seminal antes de entrar em contato com o DNA exógeno, e que após as lavagens ocorreu a internalização do DNA exógeno no espermatozoide.

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MSCAGR / Department of Animal Science / Preservation of semen is an important process to ensure that semen quality is sufficient for use in assisted reproductive technologies. This study evaluated the effectiveness of three different extenders to preserve bull semen stored under different conditions, as an alternative to frozen-thawed semen straws used for artificial insemination. Semen samples were collected from two Nguni bulls using an electro-ejaculator and transported to the laboratory at 37 °C for evaluation. Pooled semen was first aliquoted into three extenders namely Triladyl, Ham’s F10 and M199 at a dilution ratio of 1:4 (semen:extender), and then stored at controlled room temperature 24 °C. Secondly pooled semen was aliquoted into four groups of Ham’s F10 extender and diluted at a ratio of 1:4, then stored at 24 °C, 17 °C, 12 °C and 5 °C respectively. Sperm motility rates were analysed after 0, 24, 48 and 72 hours. Morphology, viability and sperm DNA fragmentation were analysed after 72 hours. The study was replicated four times and data was analysed by ANOVA. Triladyl had higher sperm viability rate and total motility rate for 72 hours (P<0.01). However, Ham’s F10 had higher progressive motility rate as compared to the other extenders. There was no significant difference (P<0.01), in the viability rate between Ham’s F10 and M199. No significant difference was also observed in total sperm abnormalities (absent tails, coiled tails and bent tails), except for reacted acrosomes (P>0.05), between the two Nguni bulls. Lower temperatures than 24 °C influenced sperm motility and viability in Ham’s F10. There was no significant difference in sperm DNA fragmentation rates (P<0.01), between all the four storage temperatures which indicated that temperature did not have an influence on sperm DNA fragmentation. In conclusion, bull semen can be preserved in Triladyl or Ham’s F10 and M199 culture media stored at 24 °C and stay alive for 72 hours. Triladyl proved to be the best suitable extender showing higher sperm viability and total motility rates as compared to Ham’s F10 and M199. Lower temperatures than 24 °C noticeably decreased sperm motility and viability in Ham’s F10 culture medium.