Prostasomes are extracellularly occurring organelles which are secreted in human semen by the prostate gland. Prostasomes have several known biological activities, but their physiological function is still unclear. In this thesis some new aspects were studied on the biological role of the prostasomes. The motility-stimulatory effect of prostasomes on cryopreserved spermatozoa was further studied by supplementing the swim-up medium with seminal prostasomes, and with prostasomes purified from a PC-3 prostate cancer cell line (PC-3 prostasomes), on fresh spermatozoa. The recovery of motile spermatozoa after swim-up increased by 50% when the swim-up medium was supplemented with prostasomes. The PC-3 prostasomes bore a functional resemblance to seminal prostasomes as regards various expressions of sperm motility promotion. Prostasomes proved to have potent antibacterial effects. The effects were not strictly confined to Bacillus megaterium since a few other bacteria were also sensitive. The high percentage of patients with anti-prostasome antibodies showed that prostasomes could be one of the major targets for antisperm antibodies (ASA). The results demonstrate that ASA in serum of infertile men and women recognise prostasomes as antigens, and that polyclonal antibodies raised against prostasomes agglutinate human spermatozoa. This suggests that prostasomes contribute at least partly to immunological infertility. Three types of prostasomes (seminal-, native- and metastasis-derived prostasomes) demonstrated similarities regarding a high cholesterol/phospholipid ratio and some marker enzymes. The conclusion is that prostasomes have a common and exclusive prostatic origin in man and that they are internalised in storage vesicles of the secretory cells and released in toto by an ordinary exocytotic event.

La transgénesis es una potente herramienta biotecnológica para la generación de animales modificados genéticamente con aplicaciones en diversas áreas como veterinaria, biomedicina y agricultura. La técnica de transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) se basa en la habilidad intrínseca de las células espermáticas para unir e interiorizar ADN exógeno y permitir su transferencia al interior de los ovocitos tras la fecundación, e integrarse en el genoma del nuevo embrión. El objetivo global de este estudio fue desarrollar un método eficiente de producción in vitro de embriones porcinos y lechones transgénicos aprovechando la capacidad de transferencia de ADN exógeno que presenta el espermatozoide.La combinación de la técnica de ICSI y SMGT es un método eficiente para la producción de lechones y embriones transgénicos, viéndose incrementada su eficiencia mediante el uso de la recombinasa RecA, obteniendo los primeros lechones nacidos en España mediante ICSI, de los cuales 2 fueron transgénicos. / The transgenesis is a powerful biotechnological tool for the generation of genetically modified animal with applications in different areas such as veterinary medicine, biomedicine and agriculture. The technique of sperm mediated gene transfer (SMGT) is based on the intrinsic ability of the spermatozoa to bind exogenous DNA and to allow its transference to the oocytes after fertilization, and to integrate in the genome of the new embryo. The global objective of this study was to develop an efficient method of in vitro production of transgenic embryos and piglets using the spermatozoa capacity to bind to exogenous DNA.The combination of the ICSI technique and SMGT is an efficient method for the production of transgenic embryos and pigs. The efficiency was increased by the use of recombinase RecA, obtaining the first piglets born in Spain by means of ICSI and two of them were transgenic.

Este trabajo se ha centrado en el estudio de diferentes factores que afectan a la capacidad fecundante del semen congelado, como la velocidad de descongelación y el sistema antioxidante del semen porcino. También se ha estudiado la capacidad predictiva de la fertilidad in vivo que tienen las diferentes técnicas de análisis seminal tanto para el semen congelado como en condiciones de campo para el semen refrigerado. Se pudo determinar que la velocidad de descongelación más rápida tiene un efecto positivo sobre la funcionalidad espermática de las muestras evaluada mediante un sistema de FIV. Igualmente se concluyó también que el sistema de FIV parece ser la mejor herramienta disponible para evaluar la calidad del semen congelado-descongelado. Se evidenció que el proceso de crioconservación del semen supuso una pérdida siginificativa en el contenido de GSH intracelular. Finalmente, se demostró que el análisis seminal sólo puede identificar eyaculados con bajo potencial fértil. / Boar frozen-thawed semen is still a valuable tool as a complement to artificial insemination with fresh semen in some conditions. The objectives were firstly, the design of better freezing methods in order to obtain acceptable semen quality (freezing-thawing procedures) and secondly, to address the question of whether differences in farrowing rate and litter size after the use of different ejaculates could be predicted using the standard semen parameters under commercial conditions.We can determine that the IVF fertilization system seems to be a good tool to evaluate the quality of frozen-thawed boar semen previous to its commercial way. In other way, we found that there was a loss in GSH content after cryopreservation of boar semen and the addition of GSH to the thawing extender resulted in a significant increase in sperm fertilizing ability. Finally, semen analysis, under commercial conditions, allows to identify ejaculates with very low fertility potential. Therefore, it is unlikely to detect fertility differences associated with seminal parameters.

En la siguiente tesis se obtuvieron los siguientes resultados. La adición de plasma seminal a los espermatozoides altamente diluidos ejerce un efecto beneficioso variable dependiendo de la fuente de plasma seminal. El heterodímero PSP-I/PSP-II ejerce un efecto beneficioso sobre los espermatozoides altamente diluidos mediante su adhesión al acrosoma. La incubación produce la migración del heterodímero a la región post-acrosomal, siendo eliminado de la superficie espermática. La adición del heterodímero a los medios de cocultivo entre gametos disminuye significativamente la capacidad fecundante de los espermatozoides. La preincubación de los espermatozoides de verraco tanto frescos como congelados preserva la viabilidad y motilidad espermáticas no afecta a la capacidad fecundante de los espermatozoides frescos de verraco y disminuye la capacidad fecundante de los espermatozoides congelados, la cual puede ser restaurada parcialmente mediante un lavado a través de un gradiente de Percoll. / The addition of 10% of seminal plasma from certain boars maintains or enhances the viability of largely extended boar spermatozoa in vitro. The protective effect of the PSP-I/PSP-II heterodimer on highly-extended boar spermatozoa could be related to the adhesion of the heterodimer to the acrosome. Exposures of the gametes to the heterodimer during in vitro gamete co-incubation significantly decrease the sperm penetration rates and number of spermatozoa per oocytes in denuded oocytes. The effect could be mediated by exposed ZP receptors. Exposure of fresh or frozen-thawed boar spermatozoa to PSP-I/PSP-II preserves sperm viability and motility. Although there is no obvious influence of the heterodimer on the capability of fresh diluted boar spermatozoa to penetrate homologous oocytes, PSP-I/II exerts a deleterious effect when frozen-thawed spermatozoa are used to penetrate IVM-oocytes. A subsequent washing through a Percoll gradient estored sperm function in some of the cells.

La separación espermática por citometría de flujo de los espermatozoides X e Y, es actualmente el único método eficaz para la obtención de descendencia de sexo deseado. En porcino, la selección del sexo de las camadas incrementaría notablemente los beneficios productivos de las explotaciones productoras de animales de alto valor genético al poder manejar los esquemas de selección, desviándolos hacia un sexo u otro según las necesidades de cada explotación. Recientemente, se han realizado avances importantes en la separación espermática mediante esta técnica en porcino. Sin embargo, es necesario un mayor conocimiento de diferentes aspectos relacionados con la eficiencia del proceso, con el efecto del procedimiento sobre la viabilidad y la capacidad fecundante de estos espermatozoides, así como del posible efecto perjudicial del propio proceso de separación sobre el ADN de los espermatozoides de verraco. Esta tesis recoge resultados derivados de experiencias destinadas a estudiar estos aspectos. / Flow cytometric sorting technology based on differential DNA content between X- and Y- spermatozoa is the only effective procedure for achieving offspring of the desired sex. In swine production the application of this method could improve significantly the productive benefits by planning the insemination to produce a specific sex. A detailed knowledge of aspects related to the efficiency of the sperm sorting technique and to aspects related with effects of sorting procedure on the viability and penetration ability of pig oocytes of flow sorted boar spermatozoa, and of the potential damaging effect of the procedure on sperm DNA is necessary to obtain optimal results. This thesis presents the results of experiences about, the usefulness and efficiency of this technology, followed by the analysis of sorted boar spermatozoa motility, viability, penetration ability. Results of mutagenic effect of Hoechst 33342 staining and sorting on sorted boar spermatozoa are also included.

El objetivo de este trabajo ha sido evaluar la capacitación y reacción acrosómica de espermatozoides de verraco eyaculados lavados a través de un gradiente de percoll y no lavados e incubados en medio de fecundación M199 suplementado con progesterona o con complejos cumulus-ovocito así como la penetración espermática de estos con ovocitos homólogos madurados in vitro. La determinación de la capacitación se realizó mediante el uso de lectinas (PNA, SJA y ECA) y citometría de flujo. Los resultados mostraron que la progesterona posee efecto protector sobre la vitalidad espermática y los mayores porcentajes de reacción acrosómica ocurren ente los 45-90 minutos de incubación, En cuanto a la penetración espermática no hubo diferencias entre espermatozoides lavados y no lavados. / The purpose of the present study was to evaluate the sperm capacitation and acrosome reaction of spermatozoa washed in Percoll and unwashed undergo in an in vitro incubation system with progesterone or cumulus-oocyte and the penetration rate in homologous oocytes matured in vitro. The evaluation was done with lectin (PNA, SJA and ECA) and flow cytometry. The results shown that progesterone had a protective effect on sperm vitality and the highest percentages of acrosome reaction were obtained between 45-90 minutes of incubation. The penetration rate was similar between washed and unwashed spermatozoa.

Das CHARGE-Syndrom ist ein autosomal dominant vererbtes Dysmorphiesyndrom. Meistens handelt es sich um sporadische Fälle. Nur für ca. 2/3 der Betroffenen konnte als Ursache eine Mutation im CHD7-Gen nachgewiesen werden.  In dieser Arbeit wurde eine Familie untersucht, in der zwei Kinder gesunder Eltern von einem CHARGE-Syndrom betroffen sind und die Mutation c.7302dupA heterozygot aufweisen. Die  ursächliche Mutation c.7302dupA ließ sich in den väterlichen Spermien nachweisen. Ein Gonadenmosaik konnte somit beim Vater der betroffenen Kinder bestätigt werden.  Eine Methode zur DNA-Analyse an Einzelspermien wurde etabliert, mittels derer der Grad des Mosaiks näher bestimmt werden konnte. In einer Stichprobe des untersuchten Falles trugen 16 von 59 der untersuchten Einzelspermien die Mutation c.7302dupA. Aus diesem Ergebnis lässt sich ein deutlich erhöhtes Wiederholungsrisiko bei einem weiteren Kind ableiten. Eine Interaktion von CHD7 mit CHD8 konnte durch einen direkten Yeast-Two-Hybrid nachgewiesen werden. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch den Nachweis der Ko-Lokalisation der beiden Proteine sowie durch ein Signal in einem bimolekularen Fluoreszenzkomplement-Assay. Im direkten Yeast-Two-Hybrid ließ sich die Interaktionsstelle im CHD7 auf den AS Bereich 1950–2172 mit den Domänen SANT und CR3 mit distalen und proximalen Überhängen eingrenzen.  Durch das Einfügen einer bei einem CHARGE-Patienten identifizierten Missense-Mutation p.Trp2091Arg in den entsprechenden CHD7-Abschnitt ließ sich keine Interaktion mit CHD8 im direkten Yeast-Two-Hybrid mehr nachweisen. Die Bedeutung dieser Missense-Mutation beim Wegfall der Interaktion zwischen CHD7 und CHD8 als Ursache für das CHARGE-Syndrom ist in diesem Fall anzunehmen.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2007. / Härtill 5 uppsatser.

La protéine TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) appartient à la famille des SLC26, une famille de transporteurs d’anions qui contribuent dans différents épithelia à l’homéostasie cellulaire. La protéine TAT1 s’exprime exclusivement dans les cellules germinales mâles, chez l’homme et chez la souris. Sur le spermatozoïde mature, la protéine TAT1 est localisée à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, au niveau de l’annulus, une structure en forme d’anneau composée de différents polymères de Septines (1, 4, 6, 7 et 12).Le modèle murin d’invalidation du gène Tat1 présente une infertilité mâle par asthénozoospermie totale (absence de mobilité des spermatozoïdes) et des défauts de capacitation associés à des anomalies structurales du flagelle (plicature du flagelle, disjonction entre la PI et la PP, atrophie de l’annulus). Ce modèle indique que la protéine TAT1 pourrait avoir un rôle structural dans le maintien de l’annulus et dans la mise en place du flagelle. Par ailleurs, la protéine TAT1 possédant une activité de transport d’anions, il est vraisemblable qu’elle puisse influer directement sur la régulation de la mobilité et de la capacitation puisqu’il est bien établi que les échanges ioniques sont essentiels au contrôle de ces deux processus.En effet, les ions chlorure, bicarbonate et calcium participent à l’activation de la voie de signalisation AMPc/PKA, au cours des processus de mobilité et de capacitation (i.e. processus de maturation ayant lieu dans le tractus génital féminin et conférant au spermatozoïde un mouvement hyperactivé et la capacité à interagir avec l’ovocyte).Plusieurs travaux ont montré une interaction physique et fonctionnelle des membres de la famille SLC26 avec le canal chlorure/bicarbonate CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) dont les mutations sont responsables de la mucoviscidose. De manière intéressante des données récentes ont montré l’expression de CFTR dans le spermatozoïde et son rôle dans la régulation des flux de chlorure au cours de la capacitation. Au cours de ma thèse, nous avons testé la coopération entre les protéines TAT1 et CFTR ; nous avons pu montrer que la protéine TAT1 est capable d’interagir physiquement avec CFTR et de stimuler son activité de transport d’anions, suggérant qu’in vivo les deux protéines forment un complexe moléculaire impliqué dans la régulation des flux de chlorure et de bicarbonate dans le spermatozoïde.Tout comme TAT1, plusieurs membres de la famille SLC26 ont une expression tissulaire spécifique. Par ailleurs, les mutations génétiques de certains SLC26 sont associées à des pathologies humaines (surdité, diarrhée chlorurée congénitale et chondrodysplasie). De par le phénotype du modèle murin Tat1 et l’importance des SLC26 en pathologie humaine, TAT1 constitue un bon candidat dans la recherche des causes génétiques des asthénozoospermies humaines.Le laboratoire a mis en place au cours de ma thèse, un projet de recherche de mutations du gène TAT1 dans les asthénozoospermies humaines. Le séquençage des régions codantes du gène TAT1 dans une cohorte de 147 hommes infertiles par asthénozoospermie a ainsi permis d’identifier des variations de séquence inédites du gène chez 7 sujets. L’étude in vitro de certains variants indique pour trois d’entre eux une instabilité des formes mutantes associée à un défaut de stimulation du canal CFTR, in vitro. Par ailleurs, les spermatozoïdes de ces patients présentent d’importantes anomalies flagellaires dans la mise en place de la pièce intermédiaire, compatible avec un rôle de la protéine TAT1 et de ses partenaires (les septines) dans la genèse du flagelle / TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) belongs to the SLC26 family of anion transporters, which is implicated in cellular homeostasis of different epithelia. TAT1 is exclusively expressed in male germ cells, in human and mouse. On mature spermatozoa, TAT1 is located at the annulus, a ring-shaped structure composed of different septins polymers (1, 4, 6, 7 and 12), at the junction of the midpiece (MP) and principal piece (PP) of the flagellum.The knock-out mouse model of Tat1 gene shows a male infertility by complete asthenozoospermia (lack of sperm motility) and capacitation defects combined with flagellar structural abnormalities (flagella bending, MP and PP disjunction and atrophy of the annulus). This model suggests that the TAT1 protein could fulfill structural roles in the annulus and during flagellum biogenesis. Moreover TAT1 displayind an anion transport activity, it could also be implicated in the control of sperm motility and capacitation by regulating anions exchannges, which are well known to be essential for both processes.Indeed, chloride, bicarbonate and calcium ions are involved in the activation of the cAMP/PKA pathway, controlling sperm motility and capacitation processes (i.e. maturation events occuring in the female genital tract and providing the spermatozoa an hyperactivation movement and the ability to interact with oocyte).Several publications have reported a physical and functionnal interaction between SLC26 family members and the chloride/bicarbonate CFTR channel (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), which mutations are responsible of cystic fibrosis. Interestingly, recent data showed CFTR expression in spermatozoa and its role in the regulation of chloride fluxes during capacitation. During my thesis, we tested TAT1 and CFTR cooperation; we showed that TAT1 can interact physically with CFTR and stimulate its anion transport activity, suggesting that in vivo they form a molecular complex involved in the regulation of chloride and bicarbonate fluxes during sperm capacitation.Like TAT1, several SLC26 family members have a tissue specific expression. Furthermore genetic mutations in several SLC26 members result in human pathology such as deafness, congenital chloride diarrhea and chondrodysplasia. According to the phenotype of the KO Tat1 mouse model and the role of SLC26 members in human pathology, TAT1 constitutes a good candidate for the search of genetic causes of human asthenozoospermia.During my thesis, the laboratory has set up, a research project aiming at identifying mutations in the TAT1 gene that are responsible for human asthenozoospermia.Sequencing of the TAT1 gene coding regions in a cohort of 147 infertile men presenting with asthenozoospermia allowed us to identify several new sequence variations in in the TAT1 gene. In vitro study of these variants shows that 3 of them are associated with protein instability and abrogate CFTR stimulation. Besides, patients sperm show important flagellar abnormalities in the midpiece, consistent with a role of TAT1 and its partners (septins) in flagellum biogenesis.