Ziel dieser Arbeit ist es, ein sequentielles Extraktionsverfahren zur Erfassung unterschiedlich stabiler Anteile der orgnischen Bodensubstanz (OBS) zu entwickeln und zu klären, ob ein Zusammenhang zwischen Löslichkeit und Stabilität besteht. Darüber hinaus sollen der Einfluss von Bewirtschaftungsmaßnahmen auf Menge und Zusammensetzung dieser OBS-Anteile und Zusammenhänge zwischen Fourier Transform Infrarot (FT-IR)-Spektroskopiedaten und der Kationenaustauschkapazität (KAK) der OBS analysiert werden. <br><br> Für die Untersuchungen wurden Böden der Langzeitfeldexperimente (LFE) in Halle, Bad Lauchstädt und Rotthalmünster beprobt. Zur Erfassung unterschiedlicher OBS-Fraktionen wurden im ersten Schritt die wasserlöslichen OBS-Anteile (OBS(W)-Fraktion) aus den Böden isoliert. Im zweiten Schritt wurden aus den Extraktionsrückständen der Wasserextraktion OBS-Anteile mit einer Natrium (Na)-Pyrophosphatlösung extrahiert (OBS(PY)-Fraktion). Die Stabilität der OBS-Fraktionen wurde anhand von &#948;13C-Bestimmungen und 14C-Messungen untersucht. Die Charakterisierung der Zusammensetzung der OBS-Fraktionen erfolgte mittels FT-IR Spektroskopie. <br><br> Generell wird mit der OBS(PY)-Fraktion ein größerer Anteil am organischen Kohlenstoffgehalt der Böden erfasst als mit der OBS(W)-Fraktion. Die &#948;13C- und 14C-Daten zeigen, dass die OBS(W)-Fraktion höhere Anteile jungen organischen Materials als die OBS(PY)-Fraktion enthält. Das entwickelte sequentielle Extraktionsverfahren ist also prinzipiell geeignet unterschiedlich stabile OBS-Anteile anhand ihrer Löslichkeit zu isolieren. <br><br> Mittels FT-IR spektroskopischer Untersuchungen wird festgestellt, dass Bewirtschaftungsmaßnahmen, wie die Düngung, sowie Standorteigenschaften die Zusammensetzung der OBS-Fraktionen beeinflussen. Für die OBS(PY)-Fraktion ist dies stärker ausgeprägt als für die OBS(W)-Fraktion. Die KAK der OBS(PY)-Fraktion aus den Böden der LFE in Halle und Bad Lauchstädt ist positiv mit der Absorptionsintensität der C=O-Bande in den FT-IR Spektren dieser OBS-Fraktion korreliert. / The aim of this work is the development of a sequential extraction procedure for the isolation of different stable parts of soil organic matter (SOM) according to their solubility and to prove the relationship between solubility and stability. Additionally, the effects of management on amount and composition of different SOM fractions as well as relationships between data sets from Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy and cation exchange capacitity (CEC) of SOM should be analysed. <br><br> Soils from long term field experiments at Halle, Bad Lauchstädt and Rotthalmünster were sampled from the soil surface up to 30 cm depth. To obtain different SOM fractions water soluble SOM (SOM(W) fraction) were extracted at first before Na-pyrophosphat soluble SOM (SOM (PY) fraction) were isolated from the residue of water extraction. Stability of different SOM fractions were analyzed using 14C- and &#948;13C-measurements. Functional composition was studied with FT-IR spectroscopy. <br><br> Generally, SOM(PY) represents a larger part of soil organic carbon (SOC) than SOM(W) in relation to the total SOC-content of the investigated soils. &#948;13C- and 14C-measurements show that SOM(W) contains more younger material than SOM(PY). The findings suggest that different stable SOM fractions can be obtained according to their solubility by the sequential extraction procedure. <br><br> FTIR spectra show that SOM composition is influenced by management options like fertilization and field conditions. Such effects are more pronounced for SOM(PY) than for SOM(W). Furthermore data from FT-IR spectra and CEC measurements of SOMPY) show that the CEC is closely related to the C=O absorption intensities.

<p>Für das Verständnis der Strukturbildung bei Proteinen ist es wichtig, allgemein geltende Prinzipien der Stabilität und Faltung zu verstehen. Bisher wurde viel Arbeit in die Erörterung von Gesetzmäßigkeiten zu den Faltungseigenschaften von globulären Proteinen investiert. Die große Proteinklasse der solenoiden Proteine, zu denen z. B. Leucine-Rich Repeat- (LRR-) oder Ankyrin-Proteine gehören, wurde dahingegen noch wenig untersucht. Die Proteine dieser Klasse sind durch einen stapelförmigen Aufbau von sich wiederholenden typischen Sequenzeinheiten gekennzeichnet, was in der Ausbildung einer elongierten Tertiärstruktur resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, die Stabilität und Faltung eines LRR-Proteins mittels verschiedener biophysikalischer Methoden zu charakterisieren. Als Untersuchungsobjekt diente die für die Infektion ausreichende zentrale LRR-Domäne des Invasionsproteins Internalin B (InlB₂₄₁) des Bakteriums <i>Listeria monocytogenes</i>. Des weiteren sollten die Integrität und die Stabilitäts- und Faltungseigenschaften der sogenannten Internalin-Domäne (InlB₃₂₁) untersucht werden. Hierbei handelt es sich um die bei allen Mitgliedern der Internalinfamilie vorkommende Domäne, welche aus einer direkten Fusion des C-terminalen Endes der LRR-Domäne mit einer Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Domäne besteht.</p> <p>Von beiden Konstrukten konnte eine vollständige thermodynamische Charakterisierung, mit Hilfe von chemisch- bzw. thermisch-induzierten Faltungs- und Entfaltungsübergängen durchgeführt werden. Sowohl InlB₂₄₁ als auch InlB₃₂₁ zeigen einen reversiblen und kooperativen Verlauf der chemisch-induzierten Gleichgewichtsübergänge, was die Anwendung eines Zweizustandsmodells zur Beschreibung der Daten erlaubte. Die zusätzliche Ig-ähnliche Domäne im InlB₃₂₁ resultierte im Vergleich zum InlB₂₄₁ in einer Erhöhung der freien Enthalpie der Entfaltung (8.8 kcal/mol im Vergleich zu 4.7 kcal/mol). Diese Stabilitätszunahme äußerte sich sowohl in einer Verschiebung des Übergangsmittelpunktes zu höheren Guanidiniumchlorid-Konzentrationen als auch in einer Erhöhung der Kooperativität des Gleichgewichtsübergangs (9.7 kcal/mol/M im Vergleich zu 7.1 kcal/mol/M). Diese Beobachtungen zeigen dass die einzelnen Sequenzeinheiten der LRR-Domäne nicht unabhängig voneinander falten und dass die Ig-ähnliche Domäne, obwohl sie nicht direkt mit dem Wirtszellrezeptor während der Invasion interagiert, eine kritische Rolle für die <i style='mso-bidi-font-style:normal'>in&nbsp;vivo</i> Stabilität des Internalin B spielt. Des weiteren spiegelt die Kooperativität des Übergangs die Integrität der Internalin-Domäne wieder und deutet darauf hin, dass bei beiden Proteinen keine Intermediate vorliegen.</p> <p>Kinetische Messungen über Tryptophanfluoreszenz und Fern-UV<span style='color:red'> </span>Circulardichroismus deuteten auf die Existenz eines relativ stabilen Intermediates auf dem Faltungsweg der LRR-Domäne hin. Faltungskinetiken aus einem in pH&nbsp;2 denaturierten Zustand zeigten ein reversibles Verhalten und verliefen über ein Intermediat. Eine Erhöhung der Salzkonzentration des sauer-denaturierten Proteins führte zu einer Kompaktierung der entfalteten Struktur und resultierte im Übergang zu einem alternativ gefalteten Zustand. Bei der Internalin-Domäne deuteten kinetische Messungen des Fluoreszenz- und Fern-UV Circulardichroismus-Signals während der Entfaltung möglicherweise auf die Präsenz von zwei Prozessen hin. Der erste langsame Entfaltungsprozess kurz nach dem Übergangsmittelpunkt zeigte eine starke Abhängigkeit von der Temperatur, während der zweite schnellere Prozess der Entfaltung stärker von der Guanidiniumchlorid-Konzentration abhing. Renaturierungskinetiken zeigten das Auftreten von mindestens einem Faltungsintermediat. Kinetische Daten aus Doppelsprungexperimenten lieferten für die Erklärung der langsamen Faltungsphase zunächst keinen Hinweis auf dass Vorliegen einer Prolinisomerisierungsreaktion. Die vollständige Amplitude während der Renaturierung konnte nicht detektiert werden, weswegen von einer zweiten schnellen Phase im Submillisekundenbereich ausgegangen werden kann.</p> <p>Die Ergebnisse der Faltungskinetiken zeigen, dass die InlB-Konstrukte als Modelle für die Untersuchung der Faltung von Solenoidproteinen verwendet werden können.<span lang=EN-GB style='mso-ansi-language: EN-GB'><o:p></o:p></span></p> / <p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>To understand the processes of protein structure formation, it is necessary to investigate protein stability and protein folding kinetics. The focus of many folding studies has been directed at small, globular proteins. The larger class of solenoid proteins, including leucine-rich repeat (LRR) and ankyrin proteins, has not been extensively investigated. These proteins contain tandem repeat motifs, and their tertiary structure consists of a regular linear array of modules that stack to form non-globular elongated or supercoiled structures. In the present work, the folding and stability of the central LRR domain of the invasion protein internalin B (InlB₂₄₁) from the bacterium <i>Listeria monocytogenes</i> was characterized using different biophysical techniques. In addition, the integrity, stability and folding behavior of the so-called internalin-domain (InlB₃₂₁) was investigated. In this single domain, which is found in all members of the internalin-family, an immunoglobulin (Ig)-like domain is directly fused to the C-terminal end of the LRR domain.<span style='color:red'><o:p></o:p></span></span></p> <p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>A complete thermodynamic characterization of the stability of both constructs was performed, using chemical- and temperature-induced folding and unfolding transitions. The reversible and cooperative equilibrium transition of InlB₂₄₁ and InlB₃₂₁ allowed the use of a two-state model for the description of the data points. The additional Ig-like domain present in InlB₃₂₁ resulted in an increase of the unfolding free energy (8.8 kcal/mol compared to 4.7 kcal/mol). This resulted both, from a shift of the transition midpoint to higher denaturant concentration, and from an increase in the <i>m</i>-value, the denaturant dependence of the unfolding free energy (9.7 kcal/mol/M compared to 7.1 kcal/mol/M). These observations suggest that the unravelling of the individual structural repeats in the LRR region is a cooperative process and that the tight fusion with the Ig-like domain leads to a dramatically increased stability <i>in vivo</i> without interfering with the functionality of the protein. In addition, the cooperativity of the equilibrium transition reflects the integrity of the internalin-domain, and suggests that both InlB fragments unfold without significantly populated equilibrium intermediates.<o:p></o:p></span></p> <p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>Kinetic measurements with tryptophan fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the existence of a relative stable intermediate on the folding pathway of the LRR domain. Refolding kinetics from an acid-denatured state showed a reversible behavior and passes off an intermediate. An increase in the salt concentration of the acid-denatured protein results in a transition of the unfolded structure to a compact and alternatively folded state. Unfolding kinetics of the internalin-domain measured by fluorescence and far-UV circular dichroism are indicative for the possible presence of two processes. The first slow unfolding process after the transition midpoint showed a strong dependence on temperature, whereas the second and faster unfolding process showed a stronger dependence on the denaturant concentration. Renaturation kinetics indicated the existence of at least one folding intermediate. Preliminary double-mixing experiments revealed no evidence for a rate-limiting proline isomerization reaction. It was not possible to detect the complete amplitude of the renaturation reaction, suggesting existence of a second faster phase occuring in the submillisecond range.<o:p></o:p></span></p> <p class=MsoBodyText><span lang=EN-GB style='mso-ansi-language:EN-GB'>The results on folding kinetics prove the InlB constructs to be suitable models for the investigation of solenoid protein folding by techniques of high structural resolution.<o:p></o:p></span></p>

Das homotrimere Tailspikeadhäsin des Bakteriophagen P22 ist ein etabliertes Modellsystem, dessen Faltung, Assemblierung und Stabilität in vivo und in vitro umfassend charakterisiert ist. Das zentrale Strukturmotiv des Proteins ist eine parallele beta-Helix mit 13 Windungen, die von einer N‑terminalen Kapsidbindedomäne und einer C‑terminalen Trimerisierungsdomäne flankiert wird. Jede Windung beinhaltet drei kurze beta-Stränge, die durch turns und loops unterschiedlicher Länge verbunden sind. Durch den sich strukturell wiederholenden, spulenförmigen Aufbau formen beta-Stränge benachbarter Windungen elongierte beta-Faltblätter. Das Lumen der beta-Helix beinhaltet größtenteils hydrophobe Seitenketten, welche linear und sehr regelmäßig entlang der Längsachse gestapelt sind. Eine hoch repetitive Struktur, ausgedehnte beta-Faltblätter und die regelmäßige Anordnung von ähnlichen oder identischen Seitenketten entlang der beta-Faltblattachse sind ebenfalls typische Kennzeichen von Amyloidfibrillen, die bei Proteinfaltungskrankheiten wie Alzheimer, der Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Chorea Huntington und Typ-II-Diabetes gebildet werden. Es wird vermutet, dass die hohe Stabilität des Tailspikeproteins und auch die der Amyloidfibrille durch Seitenkettenstapelung, einem geordneten Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen und den rigiden, oligomeren Verbund bedingt ist. Um den Einfluss der Seitenkettenstapelung auf die Stabilität, Faltung und Struktur des P22 Tailspikeproteins zu untersuchen, wurden sieben Valine in einem im Lumen der beta-Helix begrabenen Seitenkettenstapel gegen das kleinere und weniger hydrophobe Alanin und das voluminösere Leucin substituiert. Der Einfluss der Mutationen wurde anhand zweier Tailspikevarianten, dem trimeren, N‑terminal verkürzten TSPdeltaN‑Konstrukt und der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne analysiert. Generell wurde in den Experimenten deutlich, dass Mutationen zu Alanin stärkere Effekte auslösen als Mutationen zu Leucin. Die dichte und hydrophobe Packung im Kern der beta-Helix bildet somit die Basis für Stabilität und Faltung des Proteins. Anhand hoch aufgelöster Kristallstrukturen jeweils zweier Alanin‑ und Leucin‑Mutanten konnte verdeutlicht werden, dass das Strukturmotiv der parallelen beta-Helix stark formbar ist und mutationsbedingte Änderungen des Seitenkettenvolumens durch kleine und lokale Verschiebung der Haupt‑ und Seitenketten ausgeglichen werden, sodass mögliche Kavitäten gefüllt und sterische Spannung abgebaut werden können. Viele Mutanten zeigten in vivo und in vitro einen temperatursensitiven Faltungsphänotyp (temperature sensitive for folding, tsf), d.h. bei Temperaturerhöhung waren die Ausbeuten des N‑terminal verkürzten Trimers im Vergleich zum Wildtyp deutlich verringert. Weiterführende Experimente zeigten, dass der tsf‑Phänotyp durch die Beeinflussung unterschiedlicher Stadien des Reifungsprozesses oder auch durch die Verminderung der kinetischen Stabilität des nativen Trimers ausgelöst wurde. Durch Untersuchungen am vollständigen und am N‑terminal verkürzten Wildtypprotein wurde gezeigt, dass die Entfaltungsreaktion des Tailspiketrimers komplex ist. Die Verläufe der Kinetiken folgen zwar einem apparenten Zweizustandsverhalten, jedoch sind bei Darstellung der Entfaltungsäste im Chevronplot die Abhängigkeiten der Geschwindigkeitskonstanten vom Denaturierungsmittel nicht linear, sondern in unterschiedliche Richtungen gewölbt. Dieses Verhalten könnte durch ein hoch energetisches Entfaltungsintermediat, einen breiten Übergangsbereich oder parallele Entfaltungswege hervorgerufen sein. Mit Hilfe der monomeren, isolierten beta-Helix Domäne, bei der die N‑terminale Capsidbindedomäne und die C‑terminale Trimerisierungsdomäne deletiert sind und welche als unabhängige Faltungseinheit fungiert, wurde gezeigt, dass alle Mutanten im Harnstoff‑induzierten Gleichgewicht analog zum Wildtypprotein einem Zweizustandsverhalten mit vergleichbaren Kooperativitäten folgen. Die konformationellen Stabilitäten von in der beta-Helix zentral gelegenen Alanin‑ und Leucin‑Mutanten sind stark vermindert, während Mutationen in äußeren Bereichen der Domäne keinen Einfluss auf die Stabilität der beta-Helix haben. Bei Verlängerung der Inkubationszeiten der Gleichgewichtsexperimente konnte die langsame Bildung von Aggregaten im Übergangsbereich der destabilisierten Mutanten detektiert werden. Die in der Arbeit erlangten Erkenntnisse lassen vermuten, dass die isolierte beta-Helix einem für die Reifung des Tailspikeproteins entscheidenden thermolabilen Faltungsintermediat auf Monomerebene sehr ähnlich ist. Im Intermediat ist ein zentraler Kern, der die Windungen 4 bis 7 und die „Rückenflosse“ beinhaltet, stabilitätsbestimmend. Dieser Kern könnte als Faltungsnukleus dienen, an den sich sequenziell weitere Helixwindungen anlagern und im Zuge der „Monomerreifung“ kompaktieren. / The homotrimeric tailspike adhesin of bacteriophage P22 is a widely used model system for studying different aspects of multi-domain protein folding, assembly and stability, both in vivo and in vitro. The central domain of the tailspike protein is a 13-turn right-handed parallel beta-helix, flanked by an N-terminal capsid-binding domain and a C-terminal trimerization domain. In the beta-helix motif the polypeptide backbone winds up to form a right-handed helix, with each coil consisting of three short beta-strands connected by turns and loops of varying lengths. Due to this repetitive and solenoidal structure, beta-strands of adjacent coils participate in building up three elongated beta-sheets. The internal lumen of the beta-helix is tightly packed and contains mostly hydrophobic side-chains, which are stacked along the helical axis in a linear and very regular manner. A highly repetitive structure, elongated beta-sheets and stacking of similar or identical side chains along the beta-sheet axis are also typical characteristics of amyloid fibrils, which are associated with protein folding diseases such as Alzheimer’s disease, Creutzfeldt-Jacob disease, Huntington’s disease and type II diabetes. It is assumed that the high stability of both, the tailspike protein and amyloid fibrils, is determined by side chain stacking, a well‑ordered network of H-bonds and the rigid, oligomeric state. To systematically investigate the influence of side chain stacking for stability, folding and structure of the P22 tailspike protein, a hydrophobic stack located in the lumen of the beta-helix domain was subjected to site-directed mutagenesis. Each of seven valine residues, distributed over the whole length of the beta-helix domain, was substituted by the smaller and less hydrophobic alanine and the bulkier leucine. The influence of these substitutions was investigated with the help of two tailspike protein constructs, namely the N-terminally shortened TSPdeltaN construct and the isolated, monomeric BHX construct. In general, almost all experiments showed that alanine mutations cause a stronger effect than leucine mutations, which demonstrates that the tight and hydrophobic packing in the lumen of the beta-helix domain is the basis for stability and folding of the tailspike protein. High-resolution crystal structures of two alanine and two leucine mutants revealed that the parallel beta-helix motif shows considerable plasticity. Small and local adjustments of side chains and the polypeptide backbone compensate for changes induced by the mutations, herewith potential cavities are filled and steric strain is released. Compared to the wild type, many mutations lead to a temperature sensitive for folding (tsf) phenotype in vivo and in vitro, i.e. mutations reduce folding yields of TSPdeltaN at high temperatures, but had little effect at low temperatures. Our experiments have elucidated that the tsf phenotype was caused either by an impact on different stages of the maturation process or by a reduction of the kinetic stability of the native trimer. Using TSPdeltaN and the complete wild type protein, it was shown that the tailspike trimer unfolds in a complex manner. Although unfolding kinetics exhibit a two-state behaviour, analysis of the apparent rate constants of unfolding in a Chevron plot revealed their non-linear denaturant-dependence. Typically, the natural logarithm of the apparent rate constants depend linearly on the denaturant concentration. However, in case of TSPdeltaN and the complete wild type protein, unfolding branches of the Chevron plot are curved. Such a behaviour could arise from a high energy intermediate on the unfolding pathway, a broad activation barrier or parallel unfolding pathways. The monomeric BHX construct lacks both the N-terminal and C-terminal domain. It folds into a conformation very similar to that of the -helix domain in the tailspike trimer and acts as an independent folding unit. Unfolding and refolding equilibrium transitions of mutant and wild type BHX constructs are reversible and follow a two-state behaviour with comparable cooperativities. However, conformational stabilities of alanine and leucine mutations located in the central part of the beta-helix domain are highly reduced, whereas mutations at the ends of the domain show a wild type-like stability. Furthermore, these destabilizing mutations tend to form aggregates around the transition midpoint when equilibrium experiments were incubated for longer time periods. Taken together, the results suggest that the structure of the isolated beta-helix seems to be similar to an essential, monomeric intermediate during tailspike folding. In this intermediate, a central core including coils 4 to 7 and the dorsal fin determines the stability of the whole folding unit. This core may act as a nucleus on which beta-helix coils can associate in a sequential manner and compact during maturation of the monomer.

Pektatlyase (Pel-15) aus dem alkalophilen Bodenbakterium Bacillus spec. KSM-P15 ist mit 197 Aminosäuren eines der kleinsten, bekannten β-3-Solenoidproteine. Sie spaltet Polygalakturonsäurederivate in einem Ca2+-abhängigen β-Eliminierungsprozess. Wie bei allen Proteinen dieser Enzymfamilie ist auch die Polypeptidkette von Pel-15 zu einer einsträngigen, rechtsgängigen, parallelen β-Helix aufgewunden. In diesem Strukturmotiv enthält jede Windung drei β-Stränge, die jeweils durch flexible Schleifenbereiche miteinander verbunden sind. Insgesamt acht Windungen stapeln sich in Pel-15 übereinander und bilden entlang der Helixachse flächige, parallele β-Faltblätter aus. Im Bereich dieser β-Faltblätter existiert ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen, durch das der hydrophobe Kern, der sich im Inneren der β-Helix befindet, vom umgebenden Lösungsmittel abgeschirmt wird. Besondere Abschlussstrukturen an beiden Enden der β-Helix, wie sie typischerweise bei anderen Ver-tretern dieser Strukturklasse ausgeprägt werden, sind in Pel-15 nicht zu beobachten. Stattdessen sind die terminalen Bereiche der β-Helix über Salzbrücken und hydrophobe Seitenkettenkontakte stabilisiert. In der vorliegenden Dissertation wurde die Pektatlyase Pel-15 hinsichtlich ihres Faltungsgleichgewichtes, ihrer enzymatischen Aktivität und der Kinetik ihrer Strukturbildung charakterisiert. In eine evolutionär konservierte Helixwindung wurden destabilisierende Mutationen eingeführt, und deren Auswirkungen mittels spektroskopischer Methoden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Pel-15 in Gegenwart des Denaturierungsmittels Guanidiniumhydrochlorid einen hyperfluoreszenten Gleichgewichtsustand (HF) populiert, der nach Messungen von Faltungs- und Entfaltungskinetiken ein konformationelles Ensemble aus den Zuständen HFslow und HFfast darstellt. Diese HF-Zustände sind durch eine hohe Aktivierungsbarriere voneinander getrennt. In Rückfaltungsexperimenten populieren nur etwa 80 % der faltenden Moleküle den Zwischenzustand HFslow, der mit einer Zeitkonstante von ca. 100 s zu HFfast weiterreagiert. Die Denaturierungsmittelabhängigkeit dieser Reaktion ist sehr gering, was eine trans-/cis-Prolylisomerisierung als geschwindigkeitslimitierenden Schritt nahelegt. Die Existenz eines cis-Peptides in der nativen Struktur macht es erforderlich, den denaturierten Zustand als ein Ensemble kinetisch separierter Konformationen, kurz: DSE, zu betrachten, das durch die Spezies Ufast und Uslow populiert wird. Nach dem in dieser Arbeit aufgestellten „Minimalmodell der Pel-15 Faltung“ stehen die HF-Spezies (HFslow, HFfast) mit den Konformationen des DSE in einem thermodynamischen Kreisprozess. Das Modell positioniert HFfast und die native Konformation N auf die „native Seite“ der Aktivierungsbarriere und trägt damit der Tatsache Rechnung, dass die Gleichgewichtseinstellung zwischen diesen Spezies zu schnell ist, um mit manuellen Techniken erfasst zu werden. Die hochaffine Bindung von Ca2+ (Kd = 10 μM) verschiebt sich das Faltungsgleichgewicht bereits in Gegenwart von 1 mM CaCl2 soweit auf die Seite des nativen Zustandes, das HFfast nicht länger nachweisbar ist. Entgegen anfänglicher Vermutungen kommt einer lokalen, evolutionär konservierten Disulfidbrücke im Zentrum der β-Helix eine wichtige Stabilisierungsfunktion zu. Die Disulfidbrücke befindet sich in einem kurzen Schleifenbereich der β-Helix nahe dem aktiven Zentrum. Obwohl ihr Austausch gegen die Reste Val und Ala die freie Stabilisierungsenthalpie des Proteins um ca. 10 kJ/mol reduziert, lässt die Struktur im Bereich der Mutationsstelle keine gravierende Veränderung erkennen. Auch die katalytisch relevante Ca2+-Bindungsaffinität bleibt unbeeinflusst; dennoch zeigen Enzymaktivitätstests für VA-Mutanten eine Reduktion der enzymatischen Aktivität um fast 50 % an. Die evolutionär konservierte Helixwindung im Allgemeinen und die in ihr enthaltene Disulfidbrücke im Besonderen müssen nach den vorliegenden Ergebnissen also eine zentrale Funktion sowohl für die Struktur des katalytischen Zentrums als auch für die Strukturbildung der β-Helix während der Faltungsreaktion besitzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit finden in mehreren Punkten Anklang an Faltungseigenschaften, die für andere β -Helixproteine beschrieben wurden. Vor allem aber prädestinieren sie Pel-15 als ein neues, β-helikales Modellprotein. Aufgrund seiner einfachen Topologie, seiner niedrigen Windungszahl und seiner hohen thermodynamischen Stabilität ist Pel-15 sehr gut geeignet, die Determinanten von Stabilität und Strukturbildung des parallelen β-Helix-Motivs in einer Auflösung zu studieren, die aufgrund der Komplexität bestehender β-helikaler Modellsysteme bislang nicht zur Verfügung stand. / Pectate lyase Pel-15 was isolated from alcaliphlic Bacillus spec. strain KSM-P15. Like all pectate lyases Pel-15 binds and subsequently cleaves polygalacturonic acid, the main pectic compound in plant cell walls and middle lamellae, in a Ca2+ dependent beta-elimination reaction. With 197 amino acids and a molecular mass of only 21 kDa the protein is one of the smallest right-handed parallel beta-helical proteins known today. Polypeptide chains that are classified into this structural family adopt super-helical folds in which each “solenoid stack” consists of three beta-structured regions that are connected by flexible turn segments. Along its longitudinal axis the right-handed parallel beta-helix thus comprises three elongated parallel beta-sheets that are stabilized by an extensive network of hydrogen bonds wrapping around the densely packed hydrophobic core. Together with the shield-like arrangement of hydrogen bonds this hydrophobic core is considered as the main contributor to an exceptionally high stability that is a common feature of all beta-helical proteins. In contrast to most right-handed parallel beta-helices, Pel-15 is devoid of any terminal capping domains and laterally associated secondary structure. Therefore, this protein is considered to be a promising model protein of a pure beta-helix which will help to understand the determinants of both parallel beta-sheet formation and stability. In the dissertation at hand optical spectroscopic methods were used to assess the enzymatic activity, the folding/unfolding equilibrium and the kinetic mechanism of structure formation in neutral buffered solutions. Results indicate that Pel-15 populates a hyper-fluorescent equilibrium intermediate (HF) that is effectively populated in presence of the denaturing agent guanidinium hydrochloride (GdmCl). According to kinetic folding and unfolding experiments HF is not only an essential on-pathway intermediate but has to be considered as a conformational ensemble in which several hyperfluorescent states are in thermodynamic equilibrium with each other. According to their existence in kinetic folding trajectories these different HF-species were termed HFslow and HFfast. The activation energy between both states is remarkably high leading to a time constant of about 100 seconds for the reaction HFslow ⇆ HFfast. Since native Pel-15 contains an energetically disfavoured cis-prolyl peptide between A59 and P60 it is proposed that HFslow and HFfast differ in their prolyl peptide conformations. Two main results emerge from this dissertation. First, an extensive study of the Pel-15 folding- and unfolding behaviour facilitated the proposal of a “minimal folding model”. According to this model the HF-states and the according denatured species Uslow and Ufast are aligned into a thermodynamic circle. This implies that unfolded polypeptide chains reach the HF-ensemble via parallel folding trajectories. Since the native conformation N together with HFfast are on the same side of the activation barrier, it is the reaction HFslow ⇆ HFfast that is the rate limiting step in the folding reaction of Pel-15. Second, the importance of an evolutionarily conserved disulfide bond in the central region of Pel-15 was tested by site directed mutagenesis and subsequent spectroscopic characterization. The exchange of the disulfide against a hydrophobic pair of alanine and valine decreases the folding free energy by about 10 kJ/mol. Although this value is unexpectedly high, structural perturbations around both mutational positions are small as was deduced from X-Ray crystallography. Interestingly, the stability decrease is accompanied by a major loss of enzymatic activity while the Ca2+ binding affinity is not significantly affected. It is therefore concluded that the allosterically relevant disulfide bond stabilizes long-range interactions that stabilize several adjacent solenoid turns near the N-terminus of the protein. Indeed, planar stacking interactions are perturbed and flexibility of N-terminal loops is increased once the disulfide bond is removed. This dissertation establishes Pel-15 as a novel beta-helical model protein and – even more important – smoothes the way for a generally accepted perspective on the formation and stability of parallel beta-sheet proteins.

The European natural gas market is characterised by higher demand than available supply from own resources. Therefore Europe is a gas net-importing region. The costs of potential problems or disruptions establish the need for an environment which stimulates sufficient investments in transmission line capacities. We examine the effects of the introduction of the recently developed Hogan, Rosellón and Vogelsang (HRV) incentive mechanism into the European natural gas market. In the simulations with GAMS we can confirm all results expected from theory. The validity of these simulation results is confirmed in a structural analysis, which comprised the variation of different exogenous input parameters. Therefore we conclude that the HRV incentive mechanism as a regulatory regime for the European natural gas market would be an advisable alternative, which should be considered in future discussions. (author's abstract) / Series: Working Papers / Research Institute for Regulatory Economics

Der Gegenstand dieser Dissertation sind Situationen, in denen die Aufgabe nicht durch einen Hinweisreiz vorgegeben wird. Die Idee besteht darin, die Reaktion der Versuchsperson (anders als beim klassischen Aufgabenwechselparadigma[TS] bzw. beim Wisconsin Card Sorting Test[WCST]) bei verschiedenen gleichzeitig gültigen Antwortalternativen zu untersuchen. Dafür gibt es methodische und empirische Gründe. Zum einen wurde kritisiert, dass ein Teil der Wechselkosten durch die Verarbeitung des Hinweisreizes entsteht. Zum anderen stellt sich die empirische Frage, ob es auch dann zu Wechselkosten kommt, wenn Wechsel und Wiederholung nicht durch Hinweisreize oder Rückmeldungen vorgegeben werden, sondern wenn die Versuchsperson frei entscheiden kann, ob sie die Regel wechselt oder bei der eben ausgeführten Regel bleibt. Im experimentellen Paradigma der vorliegenden Arbeit wurden den Versuchspersonen entweder nur eine oder zwei alternative Reaktionsmöglichkeiten vorgegeben. Zu diesem Zweck wurde der WCST so modifiziert, dass in der Hälfte aller Durchgänge die zum Lösen der Aufgabe relevante Merkmalsdimension gewechselt oder wiederholt werden musste, während in der anderen Hälfte aller Durchgänge gleichzeitig zwei unterschiedliche, jedoch gleichermaßen gültige Merkmalsdimensionen dargeboten wurden. Auf diese Art war es möglich, freie Wechsel unangekündigten gleichsam erzwungenen (forcierten) Wechseln gegenüberzustellen. Eine Besonderheit dieser Dissertation besteht ferner darin, dass neben den manuellen Reaktionen die Blickbewegungen analysiert wurden. Dabei eröffnete die Analyse von Blickbewegungen ein Fenster in die Prozessdynamik während eines Durchgangs und ermöglichte es, Hypothesen über Aufmerksamkeitsprozesse eingehender zu untersuchen. Mit dem Experiment 1 wird das Paradigma und der Basisbefund vorgestellt. Im Einzelnen wurde der WCST so modifiziert, dass Reaktionszeit, Fehlerrate und relative Häufigkeiten von Wiederholungen und Wechseln erhoben werden konnten. In jedem Versuchsdurchgang wurden gleichzeitig vier Einzelreize (drei Referenzreize und ein Target) dargeboten. Jeder Reiz bestand aus den Merkmalsdimensionen Farbe, Form, Anzahl, wobei jede Dimension jeweils eine von vier Ausprägungen annehmen konnte. Die Aufgabe der Versuchsperson bestand darin, aus drei dargebotenen Referenzreizen denjenigen zu identifizieren, der mit dem Target in einem von drei möglichen Reizmerkmalen übereinstimmte. Von besonderem Interesse war hierbei die Frage, ob es auch dann zu Wechselkosten bzw. einer Perseverationstendenz kommt, wenn die Versuchspersonen zwei in unterschiedlichen Merkmalsdimensionen mit dem Target übereinstimmende Referenzreize dargeboten bekommen. Der Ort, die Merkmalsdimension, die Merkmalsausprägung der mit dem Target übereinstimmenden Referenzreize, sowie die Anzahl der mit dem Target übereinstimmenden Referenzreize wurden randomisiert und waren für die Versuchspersonen nicht vorhersehbar. In den forcierte Wahl-Durchgängen stimmte ein Referenzreiz mit dem Target überein, während in den freie Wahl-Durchgängen zwei Referenzreize in unterschiedlichen Merkmalsdimensionen (zum Beispiel Farbe und Form) mit dem Target übereinstimmten. Die Ergebnisse zeigten, dass es auch dann zu Wechselkosten kam, wenn die Versuchsperson in den freie Wahl-Durchgängen denjenigen von zwei mit dem Target übereinstimmenden Referenzreizen wählte, bei dem die Übereinstimmung auf einer anderen Merkmalsdimension lag als im unmittelbar vorhergehenden Durchgang (Wechsel), im Vergleich dazu, dass sie den Referenzreiz wählte, der mit dem Target auf der gleichen Merkmalsdimension übereinstimmte, auf der auch im vorhergehenden Durchgang die Übereinstimmung lag (Perseveration). Im Einzelnen kam es bei den freie Wahl-Durchgängen zu einer Perseverationstendenz von etwa P = 2/3. Ferner führten Wechsel sowohl bei den forcierte als auch bei freie Wahl-Durchgängen zu längeren durchschnittlichen Reaktionszeiten als Perseverationen. Damit konnte gezeigt werden, dass Wechselkosten auch in einem Paradigma ohne Hinweisreize bei „freier Wahl“ entstehen, und zwar auch dann, wenn gleichzeitig die Möglichkeit zur Wiederholung und zum Wechsel bestand. Die durchgeführte Computersimulation eines neuronalen Netzes, mit dem die vermuteten kognitiven und aufmerksamkeitsbezogenen Prozesse in dieser Aufgabe modelliert wurden, unterstützte die Hypothese, dass die in den Experimenten gemessene Perseverationstendenz und die Wechselkosten durch eine intensivierte Enkodierung der zuvor relevanten Übereinstimmungsdimension erklärt werden kann. Experiment 2 untersuchte die Hypothese, dass Aufmerksamkeitseinstellungen aus dem vorherigen Durchgang einen bahnenden Effekt auf den Selektionsprozess und die Reaktionszeit von verschiedenen Antwortalternativen haben. Es wurde angenommen, dass ein Merkmal einer Dimension dann mehr Aufmerksamkeit auf sich zieht, wenn diese Dimension kurz zuvor relevant war. Dazu wurde das Paradigma aus Experiment 1 mit der Messung von Blickbewegungen kombiniert. Die Ergebnisse replizierten die in Experiment 1 gemessene Perseverationstendenz und die Wechselkosten in den Reaktionszeiten. Die Blickbewegungsanalysen klärten die Mikrostruktur der zugrunde liegenden Aufmerksamkeitsprozesse auf, indem neben den durchschnittlichen Fixationszeiten und der Fixationsanzahl eines Reizes auch der zeitliche Verlauf der Fixationswahrscheinlichkeit der Reize untersucht wurde. Wie vorhergesagt, war es in einem frühen Zeitbereich sowohl bei den freie als auch bei den forcierte Wahl-Durchgängen bei einer Perseveration wahrscheinlicher als bei einem Wechsel, dass derjenige Referenzreiz fixiert wurde, der eine Übereinstimmung zum Target enthielt und auf den am Ende des Durchgangs mit einem Tastendruck reagiert wurde. Ferner war die durchschnittliche Anzahl der Fixationen auf das Target und den gewählten Referenzreiz bei einem Wechsel höher als bei einer Perseveration. Dieser Befund ist konsistent mit Annahmen aus Theorien dimensionsbasierter Aufmerksamkeit, nach denen eine zuvor relevante Merkmalsdimension höher gewichtet verarbeitet wird, wodurch andere Merkmalsdimensionen in ihrer Verarbeitung beeinträchtigt werden. Des Weiteren gelang es mithilfe der Blickbewegungsdaten, die Wechselkosten in Such- und Verarbeitungszeit zu dekomponieren: Bei einem Wechsel war nicht nur die Zeit bis zur ersten Fixation des gewählten Referenzreizes, sondern auch die Zeit von dieser Fixation bis zum Tastendruck länger als bei einer Perseveration. Mit Experiment 3 wurde die Dynamik der Abschirmung gegenüber irrelevanten Reizmerkmalen während Perseveration und Wechsel untersucht. Wie in den vorangehenden Experimenten enthielt jeder Einzelreiz verschiedene Ausprägungen einzelner Merkmalsdimensionen. Im Gegensatz zu den vorangehenden Experimenten wurden den Einzelreizen drei weitere Merkmalsdimensionen hinzugefügt, so dass jeder Einzelreiz sechs Merkmalsausprägungen auf verschiedenen Merkmalsdimensionen enthielt. Gleichzeitig wurden die Versuchspersonen instruiert, innerhalb welcher von zwei zuvor definierten Klassen von relevanten Merkmalsdimensionen die Übereinstimmung zwischen Target und Referenzreiz in einer Abfolge von Versuchsdurchgängen gesucht werden sollte. Je nach Instruktion sollte entweder auf Merkmale der Klasse Symbole (Form, Farbe, Anzahl) oder auf Merkmale der Klasse Hintergrund (Textur, Ecke, Balken) reagiert werden. Neben der Replikation der Ergebnisse in Bezug auf die Wechselkosten (Experiment 1) und die damit einhergehenden Unterschiede in der aktiven visuellen Verarbeitung (Experiment 2) zeigte sich ferner, dass der Moment des Wechsels einer Merkmalsdimension durch eine geringere Abschirmung gegenüber irrelevanten Reizmerkmalen charakterisiert war als eine Wiederholung. Dies war insbesondere dann der Fall, wenn die irrelevanten Reizmerkmale, die intentional ausgeblendet werden sollten, der leichten, d.h. einfach zu verarbeitenden Klasse von Merkmalsdimensionen (Symbole) angehörten. Dabei waren die Reaktionszeiten auf die Merkmale der Klasse Hintergrund fast doppelt so lange wie die Reaktionszeiten auf die Merkmale der Klasse Symbole. Neben den Reaktionszeiten wurde auch die aktive visuelle Verarbeitung durch die unterschiedliche Dynamik von Aufrechterhaltung und Abschirmung bei Perseveration und Wechsel beeinflusst, was sich u.a. darin zeigte, dass die irrelevanten Reize während eines Wechsels verstärkt die Aufmerksamkeit auf sich lenkten und fixiert wurden. Die Ergebnisse der Experimente demonstrieren, dass die Verwendung eines Aufgabenwechselparadigmas mit zwei gleichzeitig richtigen Antwortalternativen einen wertvollen Beitrag zum Verständnis der kognitiven und aufmerksamkeitsbezogenen Prozesse leisten kann, die den Wechseln zwischen Reizdimensionen bzw. Zuordnungsregeln zugrunde liegen. Die Analyse der Blickbewegungen erwies sich dabei als besonders nützlich, um die Mikrostruktur der zugrunde liegenden Prozesse in ihrem Zeitverlauf aufzuklären. Die Ergebnisse der Experimente zeigen ferner, dass sich die Aufgabenträgheit im Sinne von persistierenden Aufmerksamkeitseinstellungen auch in Situationen widerspiegelt, in denen die Versuchspersonen zwischen zwei Reaktionsalternativen wählen können (in den Experimenten die Wahl der zuvor relevanten vs. nicht relevanten Merkmalsdimension). Weiterhin spiegeln die Ergebnisse zwei zentrale Organisationsprinzipien des kognitiven Systems wider. Zum einen wurde eine zuvor erfolgreiche Strategie (die zuvor relevante Übereinstimmungsdimension) in etwa 2/3 aller Durchgänge stabil erneut angewandt und zum anderen wurde in etwa 1/3 aller Durchgänge mit zwei Reaktionsalternativen flexibel auf eine zuvor nicht relevante Übereinstimmungsdimension gewechselt. Möglicherweise ist dieses Ungleichgewicht von Wechsel und Perseveration eine Art Kompromiss zwischen Stabilität/ exploitation und Flexibilität/ exploration. Es ist auch denkbar, dass diese gleichzeitig zu erfüllenden ‚Randbedingungen’ (constraints) kognitiver Kontrolle auch zu der unterschiedlichen Abschirmungsdynamik bei Perseveration und Wechsel führen, indem das System bei einem Wechsel anfälliger für Ablenkungen wird als bei einer Perseveration.

Nanoskalige Multischichten besitzen attraktive physikalische Eigenschaften wie den Riesenmagnetwiderstand, die sehr sensibel von der Struktur der Grenzfläche und der Einzelschichtdicke abhängen. Mit Hilfe einer Wärmebehandlung wird versucht, den Riesenmagnetwiderstand der durch Sputtern abgeschiedenen Schichten zu erhöhen. In entmischenden System Co/Cu wird bei Einzelschichtdicken von 2nm eine Erhöhung des Riesenmagnetwiderstandes gemessen. Allerdings verringert sich der Widerstand bei höheren Temperaturen drastisch. Die Verringerung wird begleitet von einem Zerfall der Schichtstruktur. Diese Arbeit untersucht die thermische Stabilität und morphologische Entwicklung nanoskaliger Multischichten mit binären nichtmischbaren Komponenten während der Wärmebehandlung mit Hilfe der Monte-Carlo-Methode und im Rahmen der Cahn-Hilliard-Theorie. Es wird gezeigt, dass bei einer Wärmebehandlung abgeschiedener Schichten die chemische Unschärfe der Phasengrenzfläche verringert werden kann. Bei der Wärmebehandlung bildet sich abhängig von der Temperatur eine morphologische Rauigkeit an der Phasengrenzfläche. Oberhalb einer kritische Temperatur findet ein Rauigkeitsübergang statt, bei der langwellige Rauigkeiten mit ständig wachsender Amplitude entstehen. Die Überlappung der Undulationen der morphologischen Rauigkeit von Unter- und Oberseite einer dünnen Schicht wurde als ein Mechanismus für die Bildung von Schichtdurchbrüchen identifiziert. In polykristallinen Schichten verursachen Korngrenzen thermische Instabilitäten der Multischicht. &amp;quot;Grain boundary grooving&amp;quot; wird als ein Mechanismus für die Bildung eines Schichtdurchbruchs an Korngrenzen vorgeschlagen. Durchbrochen Schichten ziehen sich getrieben durch Kapillarkräfte zurück. An den Endstellen bilden sich Wulste aus. Je nach Schichtdickenverhältnissesn kommt es zu einer Verschmelzung mit benachbarten Schichten gleicher Phase. Die ursprüngliche Schichtstruktur wird zerstört.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Strukturbildung in amorphen Al-ÜM-Legierungen, Quasikristallen und amorphen Halbleitern, sowie die Temperatur- und Konzentrationsabhängigkeit der elektrischen Transportgrößen Widerstand und Thermokraft untersucht. Die Legierungen wurden in Form dünner Schichten durch abschreckende Kondensation aus der Dampfphase hergestellt. Die atomare Struktur wurde durch Elektronenbeugung analysiert. Für die Beschreibung der atomaren Struktur werden der Durchmesser der Fermikugel (im k-Raum) und die Friedel-Wellenlänge (im r-Raum) als interne Skalen benutzt. Nach der Skalierung der atomaren Struktur mit diesen Größen zeigen sich große Ähnlichkeiten zwischen ganz verschiedenen Systemen. Durch Kombination der Strukturdaten mit elektronischen Transportgrößen ist es möglich, ein bereits bekanntes Szenarium der Strukturbildung, das auf Resonanzen zwischen dem Elektronensystem als Ganzem und der sich bildenten statischen Struktur der Ionen aufgebaut ist, zu erweitern. Bei der Strukturbildung und ihrem Einfluß auf die elektronischen Transporteigenschaften und die Stabilität der amorphen Phase wird bei den Al-ÜM-Legierungen der Einfluss eines Hybridisierungsmechanismus zwischen den Alp- und den TMd-Elektronen diskutiert. Für die Beschreibung der atomaren Struktur der Al-ÜM-Legierungen wird außer der schon bekannten sphärisch-periodischen Ordnung ein neuer Typ von Ordnung beobachtet, welcher eine lokale Winkelordnung verursacht. Die sphärisch-periodische und die Winkelordnung lassen sich bei der Untersuchung mit verschiedenen Anlasstemperaturen, insbesondere bei den Proben, die einen kontinuierlichen Übergang von amorpher zu quasikristalliner Phase ausführen, beobachten. Die sphärisch-periodische Ordnung führt zu einem breiten Pseudogap in der elektronischen Zustandsdichte bei EF , die Winkelkorrelation bei Quasikristallen, durch die relativ weit reichende Ordnung, zu einem scharfen Pseudogap. Die Änderung der elektronischen Eigenschaften in der amorphen und quasikristallinen Phase als Funktion der Übergangsmetalle aber auch als Funktion der Temperatur kann quantitativ mit dem Konzept der Spektralleitfähigkeit beschrieben werden, das auf zwei Pseudo-Energerielücken an der Fermikante beruht. Die Resonanz, die zu Winkelkorrelationen führt, wird bei amorphen Halbleitern weiter getestet. Es werden dazu sowohl reine Elemente als auch binäre Legierungen untersucht.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Konvergenztheorie für die regularisierten Lösungen inkorrekter inverser Probleme bei A-priori-Parameterwahl im Hilbertraum. Zunächst werden bekannte Konvergenzratenresultate basierend auf verallgemeinerten Quelldarstellungen systematisch zusammengetragen. Danach wird sich mit dem Fall befasst, was getan werden kann, wenn solche Quellbedingungen nicht erfüllt sind. Man gelangt zur Analysis von Abstandsfunktionen, mit deren Hilfe ebenfalls Konvergenzraten ermittelt werden können. Praktisch wird eine solche Abstandsfunktion anhand der Betrachtung einer Fredholmschen Integralgleichung 2. Art abgeschätzt. Schließlich werden die Zusammenhänge zwischen bedingter Stabilität, Stetigkeitsmodul und Konvergenzraten erörtert und durch ein Beispiel zur Laplace-Gleichung untermauert. / This dissertation deals with the convergence theory of regularized solutions of ill-posed inverse problems in Hilbert space with a priori parameter choice. First, well-known convergence rate results based on general source conditions are brought together systematically. Then it is studied what can be done if such source conditions are not fulfilled. One arrives at the analysis of distance functions. With their help, convergence rates can be determined, too. As an example, a distance function is calculated by solving a Fredholm integral equation of the second kind. Finally, the cross-connections between conditional stability, the modulus of continuity and convergence rates is treated accompanied with an example concerning the Laplace equation.

No description available.