Thesis (Ph.D. (Tropical Medicine))--Mahidol University, 2003.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The nematode Strongyloides stercoralis responsible for strongyloidiasis diagnosed by detection of larvae in feces. However, the elimination of low larvae hampers the detection of disease particularly in cases of immunosuppression. Immunodiagnostic tests have been developed, but the difficulty of obtaining larvae of S. stercoralis for the production of homologous antigenic extract, thereby Strongyloides venezuelensis and their different evolutionary forms for the production of antigen extracts. The aim of this study was to evaluate the detection of antibodies anti S. venezuelensis against alkaline extracts of L3 larvae, parthenogenetic females or eggs in experimental strongyloidiasis associated with immunosuppression. Male rats were divided into two groups: non-immunosuppressed and immunosuppressed experimentally infected and serum from all animals were obtained at 0, 5th, 8th, 13th and 21th days post infection (d.p.i.). The test enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to compare the reactive potential of alkaline extracts of L3 larvae, parthenogenetic females and eggs of S. venezuelensis in rats non-immunosuppressed and immunosuppressed. Immunoblotting was also evaluated for detection of IgG anti S. venezuelensis in both groups front to alkaline of the three developmental forms of the parasite extracts. In all comparative ELISA extracts were skilled in detecting IgG S. venezuelensis. The extract of larvae showed reactivity from the 5th dpi ceasing at 21th d.p.i in the non-immunosuppressed group while the group immunosuppressed this reactivity remained at 21th d.p.i. immunoblotting showed the reactivity profile with immunoreactive fractions in immunosuppressed group from the 5th d.p.i. while the non-immunosuppressed group reactivity from 8th d.p.i. The alkali extracts of parthenogenetic females and eggs showed a similar profile of reactivity in both ELISA and immunoblotting. Immunoreactive protein fractions of 26 and 17 kDa present in the alkaline extract of larvae presented as important markers of infection in immunosuppressed animals. It is concluded that all alkali extracts have diagnostic potential in experimental strongyloidiasis especially the larval extract in cases of immunosuppression, and immunoblotting an important complementary diagnostic tool. / O nematódeo Strongyloides stercoralis é responsável pela estrongiloidíase cujo diagnóstico é realizado pela detecção de larvas nas fezes. Porém a baixa eliminação de larvas dificulta a detecção da doença em especial em casos de imunossupressão. Testes imunodiagnósticos têm sido desenvolvidos, porém há dificuldade de se obter larvas de S. stercoralis para a produção de extrato antigênico homólogo assim o parasito Strongyloides venezuelensis e suas diferentes formas evolutivas são utilizados para produção de extratos antigênicos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a detecção de anticorpos anti S. venezuelensis a partir de extratos alcalinos de larvas L3, fêmeas partenogenéticas ou ovos na estrongiloidíase experimental associada à imunossupressão. Ratos machos foram divididos em dois grupos: não-imunossuprimidos e imunossuprimidos experimentalmente infectados e o soro de todos os animais foram obtidos no 0, 5º, 8º, 13º e 21º dias pós-infecção (d.p.i.). O teste enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) foi realizado para comparar o potencial reativo dos extratos alcalinos de larva L3, fêmeas partenogenéticas e ovos de S. venezuelensis em ratos não-imunossuprimidos e imunossuprimido. Immunoblotting foi avaliado quanto sua detecção de IgG anti S. venezuelensis em ambos os grupos frente aos extratos alcalinos das três formas evolutivas do parasito. No ELISA comparativo todos extratos foram efetivos na detecção de anti-IgG de S. venezuelensis. O extrato de larvas apresentou reatividade a partir do 5º d.p.i cessando no 21º d.p.i. no grupo não-imunossuprimido enquanto o grupo imunossuprimido essa reatividade permaneceu no 21º d.p.i.. O immunoblotting apresentou perfil de reatividade com frações imunorreativas no grupo imunossuprimido a partir do 5º d.p.i. enquanto o grupo não-imunossuprimido a reatividade a partir do 8º d.p.i. Os extratos alcalinos de fêmeas partenogenéticas e de ovos apresentaram similar perfil de reatividade tanto no ELISA comparativo quanto no immunoblotting. Frações proteicas imunorreativas de 26 e 17 kDa presentes no extrato alcalino de larvas apresentaram como importantes marcadores de infecção em animais imunossuprimidos. Conclui-se que todos os extratos alcalinos possuem potencial diagnóstico na estrongiloidíase experimental com destaque para o extrato de larvas em casos de imunossupressão, sendo o immunoblotting uma importante ferramenta diagnóstica complementar. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-12T14:42:08Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Silvane Maria Braga Santos.pdf: 3289698 bytes, checksum: 7e660470acd85c6b8fccb37fbc473eea (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2016-08-22T13:19:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Silvane Maria Braga Santos.pdf: 3289698 bytes, checksum: 7e660470acd85c6b8fccb37fbc473eea (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-22T13:19:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Silvane Maria Braga Santos.pdf: 3289698 bytes, checksum: 7e660470acd85c6b8fccb37fbc473eea (MD5) / FAPESB; CNPq / O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-I) é um retrovírus que infecta preferencialmente células T, causando grandes alterações na resposta imune. A maioria dos indivíduos infectados é assintomática (portadores do HTLV-I) e somente uma minoria desenvolve doenças como a leucemia/linfoma de células T do adulto (LLcTA) ou a mielopatia associada ao HTLV-I / paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). A resposta imune nos indivíduos infectados pelo HTLV-I é caracterizada por uma ativação intensa e persistente das células T com proliferação e produção espontânea de citocinas pro-inflamatórias como IFN- e TNF-. Este estudo avalia a resposta imune de indivíduos infectados pelo vírus e a capacidade de citocinas, antagonistas de citocinas e infecções causadas por helmintos de modular esta resposta. A resposta imune foi determinada pelo perfil de citocinas presentes no sobrenadante de cultura de células mononucleares não estimuladas, descrição das populações de células envolvidas na resposta imune e na avaliação da freqüência e tipo de células que apresentam marcadores de ativação celular e secretam citocinas. Pacientes com HAM/TSP apresentaram uma ativação celular intensa caracterizada por uma maior proliferação e produção espontânea de IFN- e TNF-, maior freqüencia de linfócitos T CD4+ e CD8+ produzindo IFN- e TNF- e um aumento de células T CD8+/CD28- quando comparados com indivíduos assintomáticos. Observou-se, entre os portadores assintomáticos, uma grande variabilidade na produção de IFN-, com alguns indivíduos apresentando concentrações similares às observadas nos pacientes com HAM/TSP. A adição de citocinas supressoras da resposta imune (IL-10 e TGF-) e antagonistas de citocinas (anti-IL-2, anti-IL-12 e anti-IL-15) às culturas de células dos indivíduos infectados pelo HTLV-I mostrou que a IL-10 e a adição simultânea de anti-IL-2 e anti-IL-15 reduzem significantemente a síntese espontânea de IFN- em indivíduos assintomáticos quando comparados com HAM/TSP. Adicionalmente, xv foi identificado um sub-grupo de indivíduos assintomáticos, freqüentemente alto produtores de IFN-, que não apresentam atividade imunoregulatória após adição de citocinas e antagonistas de citocinas, comportando-se imunologicamente como os pacientes com HAM/TSP. A co-infecção de indivíduos assintomáticos infectados pelo HTLV-I com helmintos (Strongyloides stercoralis e Schistosoma mansoni) resultou na diminuição da síntese de IFN-, menor freqüência de células T CD4+ e CD8+ produzindo IFN- e uma maior freqüência de células produzindo IL-5 e IL-10. Quando comparados com portadores assintomáticos, sem co-infecção por helmintos, indivíduos co-infectados apresentaram uma carga proviral menor. Adicionalmente, observou-se uma maior prevalência de infecções por helmintos entre os portadores assintomáticos do que nos pacientes com HAM/TSP. Estes resultados sugerem que a co-infecção por helmintos reduz a ativação das células tipo 1 e influencia a expressão clínica da infecção pelo HTLV-I.

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2016-10-19T16:18:49Z No. of bitstreams: 1 Tese Elizabete Inês 02012016.pdf: 4733623 bytes, checksum: 8a1ffca0e2467119048af81a914bba45 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T16:18:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Elizabete Inês 02012016.pdf: 4733623 bytes, checksum: 8a1ffca0e2467119048af81a914bba45 (MD5) / prevalência da infecção por Strongyloides stercoralis é elevada em pacientes alcoolistas. O consumo excessivo de álcool eleva os níveis de corticosteroides endógenos, os quais estimulam a fecundidade da fêmea e a diferenciação das larvas rabditoides em filarioides infectantes, mimetizando o efeito do hormônio parasitário ecdisona,levando a autoinfecção interna. Além disso, as alterações da barreira intestinal e da resposta imune do hospedeiro, pelo uso crônico do álcool, contribuem para o desenvolvimento da hiperinfecção e estrongiloidíase grave. A atividade da paraoxonase (PON1) tem sido implicada na patogênese de doenças inflamatórias, além de doenças causadas por bactérias, vírus eparasitos. A PON1 é predominantemente sintetizada pelos hepatócitos e liberada na circulação associada com as lipoproteínas de alta densidade (HDL), que é a principal fonte de colesterol, para a síntese de esteroides. Os pacientes infectados com parasitos intestinais têm alterações no seu perfil lipídico e na atividade da PON1. Neste estudo, o diagnóstico da estrongiloidiase atraves da detecção de IgG anti-S. stercoralis demonstrou 88,6% de sensibilidade e 98,4% de especificidade. Através da analise proteômica é possívele estabelecerproteínas com maior especificidade a serem utilizadas para em ensaios de diagnóstico e/ ou imunomodulação. Este trabalho teve como objetivo identificar a infecção por S. stercoralis e determinar os níveis de cortisol endógeno, o perfil lipídico e a atividade da paraoxonase nos pacientes alcoolistas, internados no Centro de Acolhimento e Tratamento de Alcoolistas (CATA), pertencente às Obras Sociais Irmã Dulce. Além, de realizar o estudo da proteômica de S. stercoralis e de S. venezuelensis. A frequência da infecção por S. stercoralis foi avaliada em 332 pacientes alcoolistas e 92 pacientes que não fazem uso crônico de álcool. A determinação dos níveis de cortisol foi realizada em 78 pacientes alcoolistas infectados com S. stercoralis, 80 pacientes alcoolistas não infectados e 76 pacientes não alcoolistas com resultados de três exames parasitológicos negativos para S. stercoralis. A frequência da infecção por S. stercoralis foi maior nos pacientes alcoolistas, 23,5% (78/332) do que nos pacientes que não faziam uso crônico de álcool, 5,4% (5/92) (p < 0,05). Os níveis de cortisol endógeno foram 3,7 vezes mais elevados nos pacientes alcoolistas comparado com os não alcoolistas (p < 0,05). Níveis elevados de cortisol endógeno não foi um fator que predispôs à infecção por S. stercoralis nos pacientes alcoolistas, entretanto uma vez infectado, o aumento dos níveis deste hormônio tiveram associados com a elevação da carga parasitária. A determinação da atividade da Paraoxonase (PON1) foi realizada em 202 alcoolistas e em 74 não alcoolistas infectados ou não com S. stercoralis. A atividade da PON1 nos indivíduos infectados com S.stercoralis foi mais baixa, tanto no grupo dos alcoolistas (1,4 vezes), quanto no grupo dos não alcoolistas (6,4 vezes) (p < 0,05). Uma correlação positiva foi observada entre a atividade da paraoxonase e a concentração de cortisol em indivíduos alcoolistas não infectados com S. stercoralis (R= 0,258; p < 0,05), enquanto uma correlação negativa ocorreu com indivíduos não alcoolistas infectados com S. stercoralis (R= -0,60; p < 0,05). Os níveis de triglicérides foram 1,3 vezes menores em indivíduos alcoolistas infectados, assim como o LDL-C e VLDL-C foram respectivamente 1,1 e 6,4 mais baixos nesse mesmo grupo (p < 0,05). No entanto, os níveis de HDL foram 1,3 vezes maior nos alcoolistas do que nos não alcoolistas (p < 0,05), independentemente da infecção. Indivíduos alcoolistas infectados com S. stercoralisapresentaram um perfil lipídico compatível com um padrão anti-aterogênico. A análise proteômica de antígenos brutos de larvas filarioides de S. stercoralis, S. venezuelensis e de produtos excretados / secretados de Strongyloides venezuelensis foi realizada utilizando a plataforma shotgun (LC-MS/MS) para separação e identificação dos péptideos trípticos. Em seguida os dados foram analisados por meio do COMET.Para a distribuição do gene ontology terms, foi utilizado o programa Blast2go. Um total de 272 proteínas do parasito foram identificados sendo 158, 62 e 52 encontradas em antígeno bruto de S.stercoralis (CSS), antígeno bruto de S.venezuelensis (CSV) e produtos secretados /excretados de S. venezuelensis (ESPSV), respectivamente. Dentre as 108 proteínas encontradas apenas no CSS, oito apresentaram homologia com Strongyloides sp. - proteínas foram compartilhadas entre os três antígenos. A ubiquitina foi a proteína mais representativa dos produtos secretados/excretados de S. venezuelensis, no entanto não apresentou peptidio de sinal sugerindo que múltiplas vias de secreção pode ser utilizada para proteínas homologas. A análise proteômica pode ser utilizada como uma ferramenta para identificar proteínas para testes de diagnóstico principalmente, para a estrongiloidíase que ainda carece de diagnóstico de elevada sensibilidade e especificidade.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-15T19:02:04Z No. of bitstreams: 1 ELIZABETE DE JESUS.pdf: 2250219 bytes, checksum: 4edb78551b0744264cf70e273e7072bc (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-05-23T21:16:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ELIZABETE DE JESUS.pdf: 2250219 bytes, checksum: 4edb78551b0744264cf70e273e7072bc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-23T21:16:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ELIZABETE DE JESUS.pdf: 2250219 bytes, checksum: 4edb78551b0744264cf70e273e7072bc (MD5) / FAPESB / O diagnóstico definitivo da estrongiloidíase é realizado pela pesquisa de larvas nas fezes utilizando o método de Baermann-Moraes, apesar da cultura em placa de agar (CPA) apresentar maior sensibilidade. Na maioria das infecções pelo Strongyloides stercoralis, a carga parasitária é baixa e a eliminação das larvas se faz de maneira intermitente, comprometendo a eficácia e precisão do diagnóstico. A pesquisa de anticorpos circulantes através do imunoensaio (ELISA) possui elevada sensibilidade e é utilizado também no auxílio ao diagnóstico da estrongiloidíase. Os objetivos deste trabalho foram (1) comparar os métodos de CPA, Baermann-Moraes e sedimentação espontânea para o diagnóstico da estrongiloidíase (2) avaliar o padrão de migração das larvas de S. stercoralis e ancilostomídeos em placas de agar e o tempo para positividade das culturas, (3) avaliar a interferência da refrigeração das fezes na viabilidade das larvas e (4) padronizar o ELISA para pesquisa de anticorpos anti-S. stercoralis. Para avaliar as sensibilidades dos métodos parasitológicos foram utilizadas 725 amostras de fezes de pacientes atendidos no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia, UFBA, e amostras de soros de 50 pacientes com S. stercoralis, 80 de indivíduos com outras parasitoses e 60 soros controles negativos. A CPA mostrou maior sensibilidade tanto para Strongyloides stercoralis (95%) como para os ancilostomídeos (77%). As sensibilidades da CPA e do método de Baermann-Moraes reduziram aproximadamente 50% quando as amostras foram conservadas a 4ºC. Através do padrão de migração das larvas foi possível realizar a diferenciação de 95,7% das amostras positivas para Strongyloides stercoralis e de 96,7% para os ancilostomídeos, confirmadas através da microscopia. O tempo de visualização macroscópica dos caminhos, deixados pelas larvas também variou significativamente (p < 0,05) entre S. stercoralis e ancilostomídeos, ocorrendo principalmente no primeiro e quarto dias de incubação, respectivamente. No ELISA para detecção de IgG a sensibilidade variou de 72 a 76%, e a especificidade foi de 92,8%, não apresentando diferenças significativas quando o antígeno foi tratado ou não com metaperiodato de sódio. Por outro lado, o ELISA para pesquisa de IgE apresentou sensibilidade de 80 % e após o tratamento do antígeno com metaperiodato de sódio reduziu para 74% (p > 0,05). Enquanto não houve variações nas especificidades, obtidas nos ensaios utilizando soros normais como controles negativos. O número de reações cruzadas de soros de pacientes com outras helmintoses aumentou em torno de 16% quando o antígeno foi tratado com o oxidante. Neste estudo, foi observado que houve uma redução nas médias das densidades ópticas dos soros de pacientes infectados com S. stercoralis com relação aos soros normais, quando o antígeno foi tratado com metaperiodato de sódio, demonstrando a importância dos epitopos glicosilados para o reconhecimento dos anticorpos anti-S. stercoralis. A depleção de IgG dos soros falso-negativos elevou a sensibilidade do ELISA-IgE, porém houve um aumento do número de reatividades cruzadas. A CPA é o método parasitológico mais sensível para o diagnóstico da estrongiloidíase e deve ser recomendado no diagnóstico de rotina. O ELISA pode ser utilizado no auxílio diagnóstico, principalmente em casos pacientes de imunossuprimidos ou antes de terapia imunossupressora. / Definitive diagnosis of strongyloidiasis is usually made by detection of larvae in stool samples using the Baermann-Moraes method, although fecal cultures in agar plate (CPA) have shown higher sensitivity. In the majority of Strongyloides stercoralis infections, the parasite load is low and the larvae output is irregular, influencing the effectiveness and accuracy of diagnosis. The detection of circulating antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has high sensitivity and it is also used as a tool for strongiloidiasis diagnosis. The objectives of this work were (1) to compare the methods of CPA, Baermann-Moraes and sedimentation for diagnosis of strongyloidiasis, (2) to evaluate the migration pattern of the S. stercoralis and hookworm larvae and the time for positivity of cultures, (3) to evaluate the influence of stool refrigeration on the viability of larvae and (4) to standardize the ELISA protocol to dilution serum anti-S. stercoralis IgG antibodies. To determine the sensitivity of the diagnosis methods, 725 stool samples from patients attending to the Clinical Laboratory Analysis of Faculty of Pharmacy, UFBA and serum samples from 50 patients with S. stercoralis, 80 with other parasitic infections and 60 negative control sera were used. The CPA was the most sensitive for both S. stercoralis (95%) and for hookworm (77%). The sensitivities of CPA and Baermann-Moraes decreased about 50% when samples were stored at 4º C. The migration pattern of larvae permitted the differentiation of 92 (95.7%) S. stercoralis and of 89 (96.7%) hookworm positive samples, confirmed by microscopy. The time for visible tracks on agar varied significantly (P < 0.05) between S. stercoralis and hookworms, occurring mainly in the first and fourth day of incubation, respectively. The sensitivity of ELISA for IgG anti-S. stercoralis range from 72% to 76%, and specificity was 91.7%, not showing significant differences when the antigen was treated or not with sodium metaperiodate. On the other hand, the ELISA for IgE had a sensitivity of 80% and after treatment of the antigen with sodium metaperiodate it significantly decreased to 74% (P > 0.05), while the specificities of ELISA-IgE, calculated using normal sera as negative controls, did not present significant variations. However, the number of cross-reactions in ELISA-IgE increased approximately 18% when the antigen was treated with the oxidizing agent. In this study, it was observed a reduction in the mean optical densities of sera from patients infected with S. stercoralis, compared with normal serum, when the antigen was treated with sodium metaperiodate, demonstrating the importance of glycosylated epitopes for the recognition by anti-S. stercoralis antibodies depletion of IgG from false-negative serum, increased the sensitivity of ELISA-IgE, even though there was an increase in cross-reactivity. The CPA is the most sensitive method for the parasitological diagnosis of strongyloidiasis and it should be recommended for routine diagnosis. ELISA should be used for diagnosis of S. stercoralis, especially in cases of immunosuppressed patients or before immunosuppressive therapy.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-30T20:18:50Z No. of bitstreams: 1 Souza, Joelma Nascimento de - Dissertação.pdf: 1809669 bytes, checksum: 95ca7ce225516b72a2282e9e3a7cd65e (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-06-01T17:34:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Souza, Joelma Nascimento de - Dissertação.pdf: 1809669 bytes, checksum: 95ca7ce225516b72a2282e9e3a7cd65e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T17:34:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza, Joelma Nascimento de - Dissertação.pdf: 1809669 bytes, checksum: 95ca7ce225516b72a2282e9e3a7cd65e (MD5) / The human strongyloidiasis is mainly caused by Strongyloides stercoralis, a parasite that infects about 100 million people worldwide. Usually, the infections caused by S. stercoralis are chronic and asymptomatic and may persist for decades undiagnosed. However, in immunocompromised individuals, the infection can cause hyperinfection and / or dissemination. Therefore, early diagnosis is essential to prevent the severe forms of the disease. The aims of this work were: (1) to evaluate the frequency of S. stercoralis infection in patients with Systemic Lupus Erythematous (SLE) and infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV), by spontaneous sedimentation (SS), Baermann-Moraes (BM) and agar plates culture methods (ACP) methods, (2) to perform specific IgG and IgE serological diagnosis by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), (3) to evaluate the presence of S. stercoralis infection and/or production of specific antibodies associated with the use of corticosteroids and (4) to follow up patients treatment with Strongyloides hyperinfection syndrome (SHS). There were evaluated 75 patients with SLE, 20 patients infected with HIV and two patients with SHS. The frequency of intestinal parasites was 10.7% in the SLE group and 40% in the HIV group (p <0.05), whereas the frequency of S. stercoralis infection in SLE patients was 1.3% and 10% in HIV-infected patients. The sensitivity of the ELISA was 80% to detect IgG and 76.9% to IgE anti-S. stercoralis. Both assays presented the same specificity, of 96.7%. The frequency of IgG and IgE anti-S. stercoralis in patients with SLE was 16% and 28%, respectively. In patients with HIV, the frequency of specific antibodies was 10% for IgG and 20% for IgE. Eight patients (six with LES and two with HIV) were positive for both ELISAs. Among the patients with LES under corticotherapy, there were 75% (9/12) and 81% (17/21) positive for detection of IgG and IgE anti-S. stercoralis antibodies, respectively. While performing this work, two cases of hyperinfection were diagnosed: the first one was a leprosy patient under corticosteroid regimen and the second was a patient infected with HTLV-1. Both patients were initially treated with albendazole and after treatment failures, the patients were successfully treated with ivermectin. In one-year follow up of both patients was observed the cure of infection by parasitological and serological methods. A diagnostical approach using the APC method and the detection of specific antibodies associated with laboratory findings (such as eosinophilia and total IgE) are essential for the diagnosis and follow-up of S. stercoralis infected patients. Early detection of the infection can alter the course of the disease, after appropriate treatment, preventing the occurrence of severe strongyloidiasis. / A estrongiloidíase humana é causada, principalmente, pelo Strongyloides stercoralis, parasito que infecta cerca de 100 milhões de pessoas em todo o mundo. Usualmente, as infecções causadas pelo S. stercoralis são crônicas e assintomáticas, podendo persistir por décadas sem serem diagnosticadas. No entanto, em indivíduos imunocomprometidos, a infecção pode se desenvolver para quadros de hiperinfecção e/ou disseminação. Assim, o diagnóstico precoce é essencial para prevenir as formas graves da doença. Os objetivos deste trabalho foram: (1) avaliar a frequência da infecção por S. stercoralis em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) e portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), através de três métodos parasitológicos (Sedimentação Espontânea (SE), Baermann-Moraes (BM) e Cultura em Placa de Agar(CPA));(2) determinar os níveis séricos de IgG e IgE específicos para S. stercoralis através do ensaio imunoenzimático (ELISA); (3) avaliar a infecção por S. stercoralis e/ou a produção de anticorpos específicos correlacionando-os com a terapia com glicocorticoides e (4) acompanhar a resposta terapêutica aos antiparasitários utilizados pelos pacientes com síndrome da hiperinfecção por S. stercoralis(SHS). Foram avaliados 75 pacientes com LES, 20 pacientes portadores do HIV e dois pacientes com SHS. A frequência de parasitos intestinais nos pacientes com LES foi de 10,7% e nos pacientes infectados com o HIV de 40% (p<0,05), sendo que a frequência de S. stercoralis nos pacientes com LES foi de 1,3% e nos pacientes com HIV de 10%. As sensibilidades dos ELISAs foram de 80% para detecção de IgG e 76,9 % para o IgE. Ambos os ensaios apresentaram a mesma especificidade, de 96,7%. A frequência de IgG e IgE reativos ao antígeno de S. stercoralis nos pacientes com LES foi de 16% e 28%, respectivamente. No grupo de pacientes com HIV, a frequência de anticorpos específicos foi de 10% para IgG e 20% para IgE. Oito pacientes (seis com LES e dois com HIV) foram positivos tanto para detecção de IgG como para IgE. Entre os pacientes com LES que apresentaram níveis de IgG e IgE anti-S. stercoralis positivo, 75% (9/12) e 81% (17/21), respectivamente, faziam uso de glicocorticoides. Durante o período de execução deste trabalho, dois casos de hiperinfecção foram diagnosticados: o primeiro em um paciente com hanseníase sob corticoterapia e o segundo em uma paciente infectada com o HTLV-1. Ambos os pacientes foram tratados inicialmente com albendazol e, após falhas terapêuticas, com ivermectina. O tratamento foi avaliado durante o período de um ano e a cura da infecção parasitária foi confirmada através de exames parasitológicos e da sorologia. A utilização da CPA e da pesquisa de anticorpos específicos associadas aos achados laboratoriais (como eosinofilia e níveis de IgE total) são fundamentais para a realização do diagnóstico e avaliação do tratamento da infecção pelo S. stercoralis, uma vez que a detecção precoce da infecção pode alterar o curso da doença, após tratamento adequado, prevenido a ocorrência da estrongiloidíase grave.

Objetivo: Determinar la prevalencia de infección por Strongyloides stercolaris y otras enteroparasitosis en el pueblo joven Santo Toribio de Mogrovejo de Chiclayo durante Junio-Octubre del 2011. Material y Métodos: Estudio descriptivo, trasversal; muestreo aleatorio, estratificado, polietápico, siendo el tamaño muestral de 106 pobladores. Se diseñó y validó una ficha de recolección epidemiológica. Un biólogo recibió entrenamiento en las técnicas de diagnóstico de Strongyloides stercolaris en un centro referencial de Lima. Se recolectaron 3 muestras por paciente, sometidas a 5 técnicas parasitológicas: Examen directo de heces, Baermann modificado en Copa por Lumbreras, Test de sedimentación espontánea, Cultivo en agar y Cultivo Dancescu. Resultados: Se visitaron 124 casas; el porcentaje de respuesta fue de 85,7%. Se logró entrevistar 106 personas. El promedio de edad fue de 27,8 +/- 16,9 años; hubieron 31 hombres (29,2%) y 75 mujeres (70,8%). El 26,4% de personas habían realizado un viaje a la Sierra y/o Selva en los últimos 5 años con una estancia mayor a un mes. El piso de tierra fue el más frecuente en el total de viviendas (55,6%); 102 personas (96,2 %) tenían desagüe; 23 pobladores (21,7 %) tuvieron al menos un parásito detectado. No se hallaron pobladores infectados con Strongyloides stercolaris. La enteroparasitosis más frecuente fue por protozoarios, con predominio de Blastocystis hominis en un 12,3%. Conclusiones: Se halló una baja frecuencia de enteroparasitosis y ausencia de pobladores infectados con Strongyloides stercolaris. El parásito más frecuente fue Blastocystis hominis.

A estrongiloidíase é uma infecção intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. A maioria dos casos evolui para um quadro crônico benigno; entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Os métodos parasitológicos convencionais apresentam baixa sensibilidade e, com isso, os testes sorológicos podem representar uma boa alternativa para o diagnóstico dessa helmintíase. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as técnicas de RIFI, ELISA e WB para o diagnóstico da estrongiloidíase em pacientes candidatos a transplante. Para validação dos testes, foram utilizadas amostras de soros de pacientes imunocompetentes (positivos para S. stercoralis, positivos para outras parasitoses e negativos). Foram utilizadas amostras de fezes e soros de pacientes candidatos a transplante, a saber: 50 para transplante renal; 50 para transplante de fígado; 50 para transplante de medula óssea. As amostras fecais de todos os pacientes foram analisadas pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai, e cultura em placa de ágar. Para a execução das técnicas sorológicas foram utilizadas como fonte de antígeno larvas filarioides de S. venezuelensis. Para a RIFI, os soros foram diluídos a 1:40 em tampão PBS-TM e o conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína diluído 1:500 em PBS acrescido de 4% de azul de Evans, sendo realizada a leitura em microscópio de imunofluorescência, utilizando as objetivas de 20X e 40X. Para a técnica ELISA foram utilizadas placas poliestireno sensibilizadas com 10?g de antígeno (frações solúveis salina e alcalina), soro dos indivíduos diluídos a 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBS-TM) e conjugado (anti-IgG humana peroxidase) em PBS-TM. As amostras foram consideradas positivas quando o índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB, os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBS-TM. Dos 150 pacientes candidatos a transplante analisados, 9,3% (n=14) foram positivos pelas técnicas parasitológicas, sendo que a cultura em placa de ágar detectou 6,6% (n=10). Na RIFI a soropositividade para detecção da infecção por S. stercoralis foi de 16,6% (n=25), sendo, 22% transplante renal, 18% hepático e 10% medula óssea. Pela técnica ELISA a soropositividade foi de 11,3% (n=17), sendo 14% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 3% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 24,6% (n=37), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 50% hepático e 6% medula óssea, utilizando o antígeno salino. Pela técnica WB a soropositividade foi de 20,6% (n=31), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 32% hepático e 12% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 18,6% (n=28) sendo 10% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 32% medula óssea, utilizando o antígeno salino. A utilização de técnicas imunodiagnósticas pode ser indicada na triagem de pacientes em fila de transplante, devendo-se levar em conta as limitações de reações sorológicas em pacientes imunodeprimidos / Strongyloidiasis is an intestinal infection caused by the nematode Strongyloides stercoralis. Most cases progress to a benign chronic condition; however hyperinfection and dissemination may occur, especially in immunocompromised patients. Conventional parasitological methods have low sensitivity and, thus, serological tests may be a good alternative for the diagnosis of this helminthiasis. The aim of this study was to evaluate RIFI, ELISA and WB techniques for the diagnosis of strongyloidiasis in patients candidates for transplants. In order to validate the tests samples of sera from immunocompetent patients (positive for S. stercoralis, positive for other parasitosis, and negatives) were used. Feces and sera samples of patients candidates for transplants were used as follows: 50 for renal transplant, 50 for liver transplant, 50 for bone marrow transplant. Fecal samples of all patients were analyzed by spontaneous sedimentation, Rugai and Agar plate culture techniques. Filarioid larvae of S. venezuelensis were used as source of antigen for serological tests. For RIFI, sera were diluted 1:40 in PBS-TM buffer and human anti-IgG conjugate labeled with fluorescein was diluted 1:500 in PBS with 4% Blue Evans, reading being performed in immunofluorescence microscope using 20X and 40X objectives. For ELISA technique polystyrene plates sensitized with 10?g of antigen (saline and alkaline soluble fractions), individual sera diluted at 1:200 in PBS 0.05% Tween 3% of milk (PBS-TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM were used. Samples were considered positive when ELISA index was higher than 1. For WB technique, sera were diluted in Tris-HCl 5% of milk (TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM. From 150 patients candidates for transplants analyzed 9.3% (n=14) were positive by parasitological techniques, agar plate culture detected 6.6% (n=10). In RIFI seropositivity for S. stercoralis infection detection was 16.6% (n=25) being 22% renal transplant, 18% hepatic and 10% for bone marrow. By ELISA technique seropositivity was 11.3% (n=17), being 14% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 3% bone marrow, using alkaline antigen and 24.6% (n=37), being 18% in patients candidates for renal transplant, 50% hepatic and 6% bone marrow, using saline antigen. By WB technique seropositivity was 20.6% (n=31), being 18% in patients candidates for renal transplant, 32% hepatic and 12% bone marrow, using alkaline antigen, and 18.6% (n=28) being 10% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 32% bone marrow, using saline antigen. Application of immunodiagnostic techniques could be indicated in screening of patients in transplant waiting list, however limitations of serological reactions in immunodepressed patients should be considered

A estrongiloidíase é uma infecção intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. A maioria dos casos evolui para um quadro crônico benigno; entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Os métodos parasitológicos convencionais apresentam baixa sensibilidade e, com isso, os testes sorológicos podem representar uma boa alternativa para o diagnóstico dessa helmintíase. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as técnicas de RIFI, ELISA e WB para o diagnóstico da estrongiloidíase em pacientes candidatos a transplante. Para validação dos testes, foram utilizadas amostras de soros de pacientes imunocompetentes (positivos para S. stercoralis, positivos para outras parasitoses e negativos). Foram utilizadas amostras de fezes e soros de pacientes candidatos a transplante, a saber: 50 para transplante renal; 50 para transplante de fígado; 50 para transplante de medula óssea. As amostras fecais de todos os pacientes foram analisadas pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai, e cultura em placa de ágar. Para a execução das técnicas sorológicas foram utilizadas como fonte de antígeno larvas filarioides de S. venezuelensis. Para a RIFI, os soros foram diluídos a 1:40 em tampão PBS-TM e o conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína diluído 1:500 em PBS acrescido de 4% de azul de Evans, sendo realizada a leitura em microscópio de imunofluorescência, utilizando as objetivas de 20X e 40X. Para a técnica ELISA foram utilizadas placas poliestireno sensibilizadas com 10?g de antígeno (frações solúveis salina e alcalina), soro dos indivíduos diluídos a 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBS-TM) e conjugado (anti-IgG humana peroxidase) em PBS-TM. As amostras foram consideradas positivas quando o índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB, os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBS-TM. Dos 150 pacientes candidatos a transplante analisados, 9,3% (n=14) foram positivos pelas técnicas parasitológicas, sendo que a cultura em placa de ágar detectou 6,6% (n=10). Na RIFI a soropositividade para detecção da infecção por S. stercoralis foi de 16,6% (n=25), sendo, 22% transplante renal, 18% hepático e 10% medula óssea. Pela técnica ELISA a soropositividade foi de 11,3% (n=17), sendo 14% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 3% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 24,6% (n=37), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 50% hepático e 6% medula óssea, utilizando o antígeno salino. Pela técnica WB a soropositividade foi de 20,6% (n=31), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 32% hepático e 12% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 18,6% (n=28) sendo 10% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 32% medula óssea, utilizando o antígeno salino. A utilização de técnicas imunodiagnósticas pode ser indicada na triagem de pacientes em fila de transplante, devendo-se levar em conta as limitações de reações sorológicas em pacientes imunodeprimidos / Strongyloidiasis is an intestinal infection caused by the nematode Strongyloides stercoralis. Most cases progress to a benign chronic condition; however hyperinfection and dissemination may occur, especially in immunocompromised patients. Conventional parasitological methods have low sensitivity and, thus, serological tests may be a good alternative for the diagnosis of this helminthiasis. The aim of this study was to evaluate RIFI, ELISA and WB techniques for the diagnosis of strongyloidiasis in patients candidates for transplants. In order to validate the tests samples of sera from immunocompetent patients (positive for S. stercoralis, positive for other parasitosis, and negatives) were used. Feces and sera samples of patients candidates for transplants were used as follows: 50 for renal transplant, 50 for liver transplant, 50 for bone marrow transplant. Fecal samples of all patients were analyzed by spontaneous sedimentation, Rugai and Agar plate culture techniques. Filarioid larvae of S. venezuelensis were used as source of antigen for serological tests. For RIFI, sera were diluted 1:40 in PBS-TM buffer and human anti-IgG conjugate labeled with fluorescein was diluted 1:500 in PBS with 4% Blue Evans, reading being performed in immunofluorescence microscope using 20X and 40X objectives. For ELISA technique polystyrene plates sensitized with 10?g of antigen (saline and alkaline soluble fractions), individual sera diluted at 1:200 in PBS 0.05% Tween 3% of milk (PBS-TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM were used. Samples were considered positive when ELISA index was higher than 1. For WB technique, sera were diluted in Tris-HCl 5% of milk (TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM. From 150 patients candidates for transplants analyzed 9.3% (n=14) were positive by parasitological techniques, agar plate culture detected 6.6% (n=10). In RIFI seropositivity for S. stercoralis infection detection was 16.6% (n=25) being 22% renal transplant, 18% hepatic and 10% for bone marrow. By ELISA technique seropositivity was 11.3% (n=17), being 14% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 3% bone marrow, using alkaline antigen and 24.6% (n=37), being 18% in patients candidates for renal transplant, 50% hepatic and 6% bone marrow, using saline antigen. By WB technique seropositivity was 20.6% (n=31), being 18% in patients candidates for renal transplant, 32% hepatic and 12% bone marrow, using alkaline antigen, and 18.6% (n=28) being 10% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 32% bone marrow, using saline antigen. Application of immunodiagnostic techniques could be indicated in screening of patients in transplant waiting list, however limitations of serological reactions in immunodepressed patients should be considered

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A estrongiloidíase humana é uma parasitose intestinal negligenciada com ampla distribuição mundial, podendo acarretar cronificação e hiperinfecção caso não seja diagnosticada precocemente. Os casos que merecem mais atenção são aqueles relacionados, principalmente, à pacientes imunocomprometidos. O diagnóstico parasitológico desta helmintose é pouco sensível devido a eliminação pequena e irregular de larvas nas fezes. Os métodos imunológicos, principalmente enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), apresentam elevada sensibilidade e especificidade. No entanto há sempre a necessidade de aprimorar e elevar a eficiência diagnóstica para evitar reatividade-cruzada e casos de resultados falsos-negativos. O objetivo deste estudo foi de produzir e padronizar antígenos de excreção/secreção (E/S) de larvas filarioides (L3) de Strongyloides venezuelensis para uso no imunodiagnóstico. As larvas L3 de S. venezuelensis foram obtidas para a produção de extrato salino total (SE), E/S no meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e E/S em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Todos os antígenos foram utilizados na detecção de IgG anti-S. stercoralis em doentes com e sem condições imunossupressoras. Utilizaram-se 150 amostras de soro humano, divididas em 5 grupos. Indivíduos imunocompetentes positivos para estrongiloidíase (n = 30) ou negativos para estrongiloidíase (n = 30); Pacientes com outros parasitas (n = 30), como ancilostomídeos, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura e Taenia sp; pacientes imunossuprimidos positivos para estrongiloidíase (N = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoólatras, tuberculose, câncer e alcoólatras com câncer e pacientes imunossuprimidos negativos para parasitas intestinais (n = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoolistas, tuberculose e câncer. Observou-se que todos os antígenos apresentaram frações antigênicas semelhantes com peso molecular de 62, 44, 39, 33 e 18 kDa. No entanto, quando utilizados em teste ELISA os antígenos E/S tanto em meio RPMI quanto em PBS apresentaram-se mais específicos que o SE, 94,4%, 96,7% e 77,8% respectivamente, enquanto que o antígeno E/S em PBS foi mais sensível (95,0%) que os outros dois antígenos (SE 93,3% e RPMI 86,7%). Os antígenos E/S apresentaram-se de fácil execução e o produto E/S em PBS mostrou-se mais sensível e específico que os demais antígenos em estudo. Concluiu-se que, o antígeno E/S em PBS é uma boa alternativa para diagnóstico mais sensível e específico da estrongiloidíase humana. / Human strongyloidiasis is a neglected intestinal parasitosis, with a large worldwide distribution, affecting millions of people, and may lead to chronification and hyperinfection if not diagnosed early. The cases that deserve more attention are those related, mainly, to immunocompromised patients. The parasitological diagnosis of this helminth is not very sensitive due to the small and irregular larval output in the faeces. Immunological methods, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), present high sensitivity and specificity, however, there is always a need to improve and increase diagnostic efficiency to avoid cross-reactivity and cases of false-negative results. The aim of this study was to produce and standardize excretion/secretion (E/S) antigens of filarial larvae (L3) of Strongyloides venezuelensis for immunodiagnostic use. The L3 larvae of S. venezuelensis were obtained for the production of total saline extract (SE), E/S in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) and E/S in phosphate-buffered saline (PBS). All antigens were used in the detection of IgG anti- S. stercoralis in patients with and without immunosuppressive conditions. A total of 150 human serum samples were used, divided into 5 groups. Immunocompetent individuals positive for strongyloidiasis (n=30) or negatives for strongyloidiasis (n=30); patients with others parasites (n=30) such as hookworms, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura and Taenia sp; immunosuppressed patients positive for strongyloidiasis (n=30), including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis, cancer, and alcoholics with cancer and negative immunosuppressed patients for intestinal parasites (n=30) including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis and cancer. All antigens were observed to have similar antigenic fractions having molecular weights of 62, 44, 39, 33 and 18 kDa. However, when used in the ELISA test the E/S antigens in both RPMI and PBS media were more specific than SE, 94.4%, 96.7% and 77.8%, respectively, whereas the antigen E/S in PBS was more sensitive (95.0%) than the other two antigens (SE 93.3% and RPMI 86.7%). The E/S antigens were easy to perform and the E/S product in PBS was more sensitive and specific than the other antigens in the study. It may conclude that the E/S in PBS antigen is a good alternative for a more sensitive and specific diagnosis of human strongyloidiasis. / Dissertação (Mestrado)