La neuropatia diabètica és una de les complicacions més freqüents de la Diabetis Mellitus. És una patologia del sistema nerviós perifèric que causa una incapacitat progressiva important de la funció motora i sensorial en els individus que la pateixen. L'afectació nerviosa es distingeix per una degeneració progressiva de les fibres nervioses i un retard en el procés de regeneració de les fibres danyades. Els símptomes de la neuropatia inclouen pèrdua de sensibilitat, rigidesa, coïssor i en ocasions dolor als peus i mans. La teràpia intensiva amb insulina redueix la incidència de les complicacions de la diabetis però els pacients diabètics continuen desenvolupant neuropatia diabètica a llarg plaç. Els tractaments actuals per la neuropatia diabètica no són efectius i estan orientats principalment a pal·liar el dolor neuropàtic. La teràpia gènica podria ser un tractament alternatiu per aquesta patologia. Els vectors Adeno-associats són uns dels vectors de teràpia gènica interessants per assajos clínics en humans, ja que són capaços de dirigir l'expressió del transgen a llarg plaç, mantenint-se de forma episomal a la cèl·lula hoste. A més no presenten toxicitat associada al virus silvestre, el que augmenta la bioseguretat d'aquests vectors i es poden produir a títols alts. La recent descripció de nous serotips de vectors Adeno-associats, els quals entren a les cèl·lules humanes mitjançant diferents receptors cel·lulars, ha obert la possibilitat de delimitar selectivament la infecció de diferents tipus cel·lulars dins d'un mateix òrgan. Amb la finalitat de caracteritzar vectors com a eines de teràpia gènica eficients per neuropatia diabètica es van utilitzar els serotips AAV1 i AAVrh10 per infectar cultius organotípics de ganglis de l'arrel dorsal (DRG) de ratolí. Ambdós vectors van mostrar un tropisme preferencial per neurones sensorials petites, correlacionant després amb el tipus de neurones transduïdes més eficientment mitjançant injecció intratecal in vivo en ratolins. L'estabilitat dels vectors AAV1 i AAVrh10 in vivo es va confirmar fins a setmana 10, duració màxima de l'experiment. No obstant l'eficiència d'AAVrh10 era molt superior a la d'AAV1 tant a neurones sensorials com motores, aconseguint un percentatge de transducció al voltant del 50% en DRG i del 30% en motoneurones amb el serotip rh10. A més a més, s'ha demostrat que AAV1 és més immunogènic que AAVrh10 quan s'injecten a líquid cefaloraquidi, doncs l'administració d'AAV1 genera un títol molt més elevat d'anticossos neutralitzants en sang contra aquest serotip. Com a assaig preclínic de teràpia gènica es van administrar els vectors AAV1 i AAVrh10 codificant per el factor de creixement similar a la insulina I (IGF-I) o codificant per la proteïna GFP com a control, en el líquid cefaloraquidi d'un model murí per neuropatia diabètica, que combina diabetis induïda amb estreptozotozina (STZ) junt amb lesió a nervi ciàtic (crush). IGF-I és un factor de creixement que juga un paper important en la supervivència i diferenciació de neurones, oligodendròcits i cèl·lules de Schwann i també en la formació de la mielina. Aquest factor de creixement ha estat utilitzat com a tractament d'una gran varietat de patologies del sistema nerviós, incloent neuropaties diverses, degut a la seva acció com a potent agent en la supervivència i diferenciació cel·lular. L'anàlisi molecular dels nervis perifèrics dels animals tractats amb AAV-IGF-I mostrava un augment de l'expressió del gen terapèutic IGF-I, que correlacionava amb l'activació de la via de senyalització d'aquest factor de creixement, així com dels gens implicats en la regeneració (GAP43) o els gens relacionats amb la mielina (P0, PMP22, MAG, MBP), en comparació amb els animals control. A diferència d'AAV1, AAVrh10 mostrava expressió del transgen també en neurones motores de la medul·la espinal. La correlació entre les dades bioquímiques obtingudes i els tests neurofisiològics realitzats en els animals injectats amb AAV-IGF-I, va permetre observar una millora de la velocitat de conducció nerviosa sensorial en els animals tractats amb AAV1-IGF-I i una millora de la velocitat de conducció nerviosa sensorial i motora en els animals transduïts amb AAVrh10-IGF-I, respecte els animals diabètics control. Per tant, l'administració intratecal dels vectors AAV1 i principalment AAVrh10 codificant per IGF-I ofereixen una visió prometedora pel tractament o prevenció de les neuropaties perifèriques, en general, i de la neuropatia diabètica, en concret. / Diabetic neuropathy is one of the most common complications of diabetes mellitus. It is a peripheral nervous system disease that causes a progressive inability of sensory and motor nerve function in diabetic patients. Abnormalities are characterized by progressive degeneration of nerve fibres and a delay in the regeneration process of damaged fibres. Symptoms of neuropathy include loss of sensitivity, stiffness, burning sensation and sometimes pain in feet and hands. Intensive insulin therapy reduces the incidence of complications in diabetic patients but diabetic neuropathy continues to develop at long-term. Current treatments for diabetic neuropathy are not effective and are targeted primarily to alleviate neuropathic pain. Gene therapy could be an alternative treatment for this disease. Adeno-associated (AAV) vectors are interesting gene therapy vectors for human clinical trials since they are capable of directing expression of the transgene in the long term, maintained as episomal in the host cell nuclei. Besides, they do not show toxicity associated with wild-type virus, which increases the bio-safety of these vectors, and they can be produced at high titters in the laboratory. The recent description of new serotypes of adeno-associated vectors, which enter the human cells by different cellular receptors, has opened the possibility to selectively infect particular cell types in a defined organ. In order to characterize AAV vectors as tools for gene therapy for diabetic neuropathy, AAV1 and AAVrh10 serotypes were used to infect organotypic cultures of mouse dorsal root ganglia (DRG). Both vectors showed a preferential tropism for small sensory neurons, correlating with the type of neurons more efficiently transduced by intrathecal injection in mice. The stability of AAV1 and AAVrh10 vectors in vivo were confirmed up to 10 weeks, maximum duration of the experiments. However, AAVrh10 efficiency was significantly higher than AAV1, both in motor and sensory neurons, reaching transduction levels of about 50% in DRG neurons and 30% in motoneurons with serotype rh10. In addition, we have demonstrated that AAV1 is more immunogenic than AAVrh10 when injected into the cerebrospinal fluid, as administration of AAV1 generates significantly higher titre of circulating neutralizing antibodies against this serotype in blood. As a preclinical trial of gene therapy, was administered AAV1 and AAVrh10 vectors coding for insulin-like growth factor I (IGF-I) or for green fluorescent protein (GFP), as a control, in the cerebrospinal fluid of a mouse model for diabetic neuropathy, combining streptozotozin-induced diabetes with sciatic nerve injury (crush). IGF-I is a growth factor that plays an important role in the survival and differentiation of neurons, oligodendrocytes and Schwann cells and in the formation of myelin. This growth factor has been used to treat a variety of diseases affecting the nervous system, including various neuropathies, due to its role in cell differentiation and survival. Molecular analysis of the peripheral nerves of animals treated with AAV-IGF-I showed increased expression of the therapeutic gene, IGF-I, which correlates with activation of the signalling pathway of this growth factor and genes involved in regeneration (GAP43) or myelin-related genes (P0, PMP22, MAG, MBP), compared with control animals. Unlike AAV1, AAVrh10 also showed expression of the transgene in motor neurons of the spinal cord. The correlation between data obtained from biochemical and neurophysiological tests conducted in animals injected with AAV-IGF-I, showed an improvement in sensory nerve conduction velocity in mice treated with AAV1-IGF-I and improved motor and sensory nerve conduction velocity in animals transduced with AAVrh10-IGF-I, compared to control diabetic animals. Therefore, intrathecal administration of AAV1 and, mainly, AAVrh10 vectors coding for IGF-I offer a promising approach for the treatment or prevention of peripheral neuropathies, in general, and diabetic neuropathy, in particular.

La diabetis mellitus és una malaltia metabòlica molt freqüent, que comprèn una gran varietat de síndromes amb diferents etiologies i afecta en total a un 2-7% de la població mundial. Aquesta malaltia es caracteritza, bàsicament, per una hiperglucèmia deguda a la manca d'insulina o bé a una alteració en l'acció de l'hormona. Al nostre laboratori estem desenvolupant aproximacions per reduir la hiperglucèmia diabètica mitjançant la manipulació genètica de teixits extrapancreàtics per tal que captin glucosa. Per comprovar in vivo la validesa d'aquestes aproximacions hem dut a terme estudis en diferents models d'animals transgènics i genosuprimits.El múscul esquelètic és el principal teixit implicat en la captació de glucosa sanguínia després d'una ingesta, eliminant al voltant d'un 75% del sucre. El teixit muscular capta glucosa per difusió facilitada de forma dependent i independent de la insulina. Per tant, com a conseqüència de la manca d'insulina en la diabetis tipus 1 o de la resistència a l'hormona en la diabetis tipus 2, el múscul esquelètic és incapaç de captar glucosa de la sang.En el nostre laboratori s'havien generat ratolins transgènics que expressen l'enzim hepàtic glucoquinasa en múscul esquelètic. Aquests ratolins presenten un increment en la captació i utilització de la glucosa, però romanen hiperglucèmics en alimentació després del tractament amb STZ. Aquest fet podria ser degut a una alteració en el transport de la glucosa cap a l'interior de la cèl.lula muscular. Així, en aquest treball hem obtingut ratolins transgènics que expressen ambdós, el transportador GLUT2 i l'enzim GK, en múscul esquelètic, amb la finalitat d'incrementar el transport i la fosforilació de la glucosa. Això es va realitzar per tal d'estudiar si la coexpressió d'aquestes proteïnes resultava en una normalització de la hiperglucèmia diabètica. No obstant, els resultats obtinguts indiquen que l'expressió de GLUT2 en múscul esquelètic de ratolins MLC/GK tractats amb STZ no millora els resultats obtinguts amb ratolins que expressen únicament GK a múscul. En canvi, i contràriament als ratolins control diabètics, hem demostrat que petites dosis d'insulina exògena permeten aconseguir una normalització de la glucèmia en animals diabètics que expressen GK en múscul esquelètic.Per altra banda, també s'han manipulat cèl.lules musculars en cultiu per tal que expressin l'enzim GK i estudiar si el transplantament d'aquestes cèl.lules a ratolins tractats amb STZ permet aconseguir una contrarrestació o una prevenció de la hiperglucèmia diabètica. Els resultats presentats en aquesta memòria mostren que els mioblasts C2C12 que expressen GK presenten un increment en la captació de glucosa de forma dependent de la concentració extracel.lular del sucre. Així, quan aquestes cèl.lules són transplantades a ratolins tractats amb STZ, els animals presenten una disminució de la hiperglucèmia diabètica degut a un increment en la captació i utilització de la glucosa per part de l'implant. Per tant, això podria constituir una aproximació ex vivo per tal d'incrementar l'eliminació de glucosa sanguínia en la diabetis tipus 1.Les causes de l'aparició de diabetis tipus 2 encara són desconegudes, però es creu que interaccionen la susceptibilitat genètica i una sèrie de factors ambientals, principalment la dieta i l'activitat física. En el present estudi hem investigat l'efecte de l'expressió de GK en múscul esquelètic de ratolins models de resistència a la insulina. Per dur a terme això hem utilitzat dues aproximacions diferents: per una banda, s'ha expressat GK en múscul esquelètic d'un model de resistència a la insulina obtingut per combinació d'una alteració genètica a la via de senyalització de l'hormona, concretament una genosupressió parcial de l'IRS-1 (IRS-1+/-), juntament amb una dieta d'alt contingut en lípids. Per altra banda s'ha electrotransferit in vivo el gen de la GK a múscul esquelètic d'animals IRS-1-/-, un model de resistència a la insulina sense obesitat prèviament descrit i caracteritzat (Araki, 1994; Tamemoto, 1994). Així, els resultats obtinguts en aquesta part de l'estudi suggereixen que l'expressió de GK en múscul esquelètic permetria una millora en la sensibilitat a la insulina en aquests dos models de resistència a l'hormona. Per tant, l'expressió de GK en múscul esquelètic també podria resultar una bona aproximació per tal d'incrementar la captació de glucosa i incrementar la sensibilitat a la insulina en la diabetis tipus 2. / Diabetes mellitus is the most common of all metabolic disorders, and comprises a great variety of disorders with different aetiologies. This disorder is mainly characterized by hyperglycemia due to a lack of insulin or a defect in insulin activity in peripheral tissues. Increased glucose disposal by tissues engineered to express key regulatory genes in glucose transport or phosphorylation can reduce diabetic hyperglycemia. To investigate this approach in vivo, we performed studies in different transgenic and knock-out animal models. Skeletal muscle is the major site for insulin-mediated whole-body glucose disposal and it has been stimated to account for about 75% of glucose uptake after a meal. To reduce or delay the development of secondary complications, diabetic hyperglycemia might be decreased by engineering skeletal muscle to increase glucose transport and/or glucose phosphorylation. In our laboratory, transgenic mice expressing glucokinase in skeletal muscle were obtained. These mice showed an increase in glucose uptake and utilization, and a partial reduction in diabetic hyperglycemia after streptozotocin-treatment, but glucokinase expression did not restore normal glycemia. A decrease in glucose transport might impair glucokinase-induced glucose phosphorylation in these animals. Here we examined whether the expression of the glucose transporter 2 (GLUT2) in skeletal muscle increases glucose uptake and counteracts diabetic hyperglycemia. To this end, transgenic mice expressing both glucokinase and GLUT2 genes in skeletal muscle were obtained. However, our results showed that GLUT2 expression in skeletal muscle doesn't increase glucose uptake in streptozotocin-treated transgenic mice expressing glucokinase. Furthermore, injection of low doses of soluble insulin to fed streptozotocin-treated GLUT2/glucokinase-expressing or glucokinase-expressing mice restored normoglycemia, indicating that these mice were more sensitive to the hormone treatment as the streptozotocin-treated control diabetic mice. Furthermore, here we examined whether genetically manipulated glucokinase (GK)-expressing muscle cells could remove excess glucose from blood, without causing hypoglycemia, as a new ex vivo gene therapy approach to diabetic hyperglycemia. After streptozotocin treatment, mice transplanted with GK-expressing myotubes counteracted hyperglycemia, whereas mice transplanted with control myotubes developed diabetes. These results suggest that the use of GK-expressing myotubes may be a suitable approach to reduce diabetic hyperglycemia.Although the aetiology of type 2 diabetes is unclear, both genetic factors and environmental factors (high-energy diets combined with a sedentary lifestyle) seem to contribute to the onset of this disease. In type 2 diabetes, glucose phosphorylation, a regulatory step in glucose utilization by skeletal muscle, is impaired. Here we investigated the effect of GK expression in skeletal muscle in insulin resistance animal models. To this aim, we have studied two different approaches:first, we expressed GK in skeletal muscle in an insulin resistance animal model obtained by combining a genetic alteration in insulin's signal transduction pathway (a targeted partial disruption of the IRS-1 gene, IRS-1+/-), with a high fat diet. Furthermore, GK gene was electrotransfered invivo to skeletal muscle of IRS-1-/- knock-out mice, an insulin resistance animal model without obesity which was previously described and characterized (Araki, 1994; Tamemoto, 1994). Our results indicate that the increase in glucose phosphorylation by GK gene expression in skeletal muscle may lead to an increase in insulin sensitivity in this two different animal models. Therefore, GK expression in skeletal muscle may be a therapeutic approach to increase glucose uptake and to improve insulin sensitivity in type 2 diabetes.

El càncer de pròstata és el càncer majoritàriament diagnosticat en homes adults i la segona causa de mort, després del càncer de pulmó. Els tractaments convencionals com la prostatectomia radical, radioteràpia i quimioteràpia tan sols funcionen en la malaltia localitzada, essent el desenvolupament de metàstasis la principal causa de mort dels pacients. Per tant, és necessària la cerca de noves teràpies que millorin l'eficàcia dels tractaments del càncer de pròstata, sobretot en presència de focus metastàtics en altres òrgans. En aquest sentit, la teràpia gènica - que consisteix en la transferència de material genètic per a substituir, restablir o potenciar les funcions biològiques de cèl·lules i teixits- s'ha proposat com una alternativa al tractament del càncer de pròstata. La majoria dels protocols de teràpia gènica en càncer de pròstata utilitzen la injecció intratumoral, que limita la teràpia als tumors localitzats, sent necessària l'administració sistèmica del vector terapèutic per tal d'arribar a la malaltia disseminada. Per a poder administrar sistèmicament un vector cal evitar la transferència del transgen als teixits i cèl·lules no diana i, per tant, aquest vector haurà d'estar específicament dirigit a aquests. Els Adenovirus són els vectors més utilitzats tant en teràpia gènica del càncer com en teràpia gènica del càncer de pròstata ja que presenten una elevada transferència del transgen sense introduir el seu genoma al de la cèl·lula hoste, poden transportar fragments grans de DNA i es poden infectar una gran varietat de cèl·lules i teixits. Aquest extens tropisme és alhora que una avantatge una limitació ja que es pot produir la infecció de cèl·lules i teixits no diana degut a l'expressió ubiqua del seu receptor primari: el Coxsackie's and Adenovirus Receptor (CAR). Així doncs, el direccionament específic d'aquests vectors és de gran interès. En aquest treball, mitjançant el cribratge in vitro de la llibreria de Phage Display PhD-C7C sobre cèl·lules de càncer de pròstata metastàtic (PC3MM2) hem seleccionat 3 seqüències peptídiques (CTPQNTTMC, CYPSRSPLC i CPLHQRPMC) que han demostrat una major eficiència d'unió a les variants metastàtiques de càncer de pròstata que a les altres línies cel·lulars analitzades. Per tal de determinar si aquestes seqüències podrien ser funcionals pel direccionament específic de vectors terapèutics, les hem introduït a l'HI loop de la fibra de l'Adenovirus 5. Hem obtingut 3 Adenovirus recombinants: l'AdTLCTPQ (amb la seqüència CTPQNTTMC a l'HI loop), l'AdTLCYPS (amb la seqüència CYPSRSPLC a l'HI loop) i l'AdTLCPLH (amb la seqüència CPLHQRPMC a l'HI loop) i hem comprovat la seva infectivitat tant en sistemes in vitro com in vivo. Tot i que no hem obtingut diferències estadísticament significatives en la infecció de tumors i metàstasis en sistemes in vivo, els resultats obtinguts in vitro demostren que l'AdTLCTPQ i l'AdTLCPLH poden infectar les cèl·lules emprant un receptor diferent a CAR i que, per tant, utilitzant un vector terapèutic adequat, aquestes seqüències podrien ser funcionals pel direccionament de vectors terapèutics. / Prostate cancer is most commonly diagnosed in adult men and is the second cause of death after lung cancer. Radical prostatectomy, radiotherapy and chemotherapy only are effective in localized disease, being metastasis the principal cause of patient's death. Therefore, it's necessary the development of novel therapies to improve prostate cancer treatment. Gene therapy -which consists in the transfer of genetic material to restore, promote or replace biological functions of cells and tissues- has been proposed as an alternative to prostate cancer treatment. The major part of prostate cancer gene therapy studies use intratumoral injection, limiting the therapy to localized disease and being necessary the systemic administration to reach disseminated disease. In order to administrate systemically a vector it is necessary to avoid transgen transfer to non-target cells, and so it will have to be specifically directed to target cells.Adenoviruses are the vectors more used in cancer gene therapy and in prostate cancer gene therapy because present an elevated transgen transfer, can accommodate large DNA fragments and can infect a large variety of cells and tissues. This extended tropism is an advantage but a limitation too because non-specific transgen transfer due to ubiquitous expression of the primary receptor: Coxsackie's and Adenovirus Receptor (CAR). So on, there's a big interest in specific targeting of these vectors.In this work, through the screening in vitro of the Phage Display library PhD-C7C on metastatic prostate cancer cells PC3MM2, we have selected 3 peptide sequences (CTPQNTTMC, CYPSRSPLC and CPLHQRPMC) that have demonstrate a higher binding efficiency to metastatic prostate cancer cells than to the rest of cell lines analyzed. To determine if these peptide sequences could be functional in specific targeting of therapeutic vectors we have introduced them into the HI loop of Ad5 fiber. We have generate 3 recombinant adenoviruses: AdTLCTPQ (CTPQNTTMC sequence into the HI loop), AdTLCYPS (CYPSRSPLC sequence into the HI loop) and AdTLCPLH (CPLHQRPMC sequence into the HI loop) and analyzed its infectivity in vitro and in vivo. Although we have not observed and increase in tumor and metastasis infectivity in vivo, in vitro results demonstrate that AdTLCTPQ and AdTLCPLH can transduce cells using a CAR independent pathway and, so on, using an adequate therapeutic vector these sequences could functions as target specific peptides.

n aquest estudi s'ha dut a terme una nova aproximació de teràpia gènica per a la diabetis basada en l'expressió conjunta d'insulina i de glucoquinasa en el múscul esquelètic utilitzant vectors virals adenoassociats de tipus 1 (AAV1). Els ratolins diabètics tractats amb els vectors AAV1-Ins+GK varen recuperar i mantenir la normoglucèmia, tant en condicions d'alimentació com de dejú, al llarg de més de 4 mesos després de la inducció de diabetis experimental. A més, es va observar una normalització de la tolerància a la glucosa i de la ingesta de menjar i d'aigua. Així doncs, l'acció conjunta de la producció basal d'insulina i de l'activitat de la glucoquinasa haurien generat en el múscul esquelètic un "sensor" de la glucosa que permetria la correcta regulació de la glucèmia en ratolins diabètics, evitant així l'aparició de complicacions secundàries.Un dels principals reptes en el camp de la teràpia gènica és el pas dels protocols de transferència gènica des de models murins fins a models animals grans, com ara gossos. Per això, l'última part d'aquest estudi ha pretès iniciar els primers passos en aquesta direcció. L'administració d'un vector AAV1-Ins al múscul esquelètic d'un gos diabètic ha permès, en primer lloc, establir les condicions per a la transferència de vectors a múscul esquelètic de gossos diabètics; i en segon lloc, ha evidenciat la viabilitat d'aquest tractament per contrarestar la hiperglucèmia en condicions de dejuni, i per millorar-ne la tolerància a la glucosa. Així doncs, els estudis realitzats en ratolins han demostrat l'eficàcia a llarg termini del tractament basat en l'ús de vectors adenoassociats per a la producció d'insulina i de glucoquinasa en el múscul esquelètic per contrarestar la hiperglucèmia diabètica i prevenir així l'aparició de complicacions secundàries. D'altra banda, els estudis portats a terme en un model caní han posat de relleu l'efectivitat preclínica de la tècnica en grans animals, com a pas previ al desenvolupament d'assajos clínics. / In this study we designed a new gene therapy approach based on the expression of insulin together with glucokinase in skeletal muscle using adenoassociated virus vectors of serotype 1 (AAV1). AAV-treated diabetic mice completely restored blood glucose levels in fed and in fasted conditions for more than 4 months after diabetes induction. Moreover, the animals normalized glucose tolerance, as well as food and fluid intake. Thus, insulin action together with glucokinase activity have generated a glucose sensor in skeletal muscle that allows tight regulation of glucose levels in diabetic mice, avoiding long term secondary complications.One of the main goals in gene therapy field is to scale up gene transfer protocols from mice to large animal models, such as the dog. For this reason, the last part of this study aimed to develop the first steps in this direction. AAV1 administration of the insulin transgene to skeletal muscle in a diabetic dog established first, the conditions for gene transfer in skeletal muscle of a large animal model and secondly, have shown evidence of the ability of this treatment to counteract diabetic hyperglycemia in fasted conditions and to ameliorate glucose tolerance.In summary, the presented studies in mice have demonstrated the long term efficacy of the treatment using AAV vectors to produce insulin and glucokinase in skeletal muscle to counteract diabetic hyperglycemia and prevent secondary complications. On the other hand, the studies presented in the large animal model demonstrated the preclinical efficacy of the treatment in dogs as a first step towards clinical trials.

La terapia génica nació a principios de los años 90 como una estrategia para la sustitución de genes defectuosos en determinadas células o tejidos en el ámbito de las enfermedades hereditarias, aunque desde entonces se han desarrollado múltiples estrategias para tratar enfermedades adquiridas, que incluyen diferentes tipos de cáncer o enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM). La EM es una enfermedad crónica, inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), mediada por células T CD4+, que produce parálisis y discapacidad. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal de la EM, con la que comparte múltiples características clínicas e histopatológicas.La creación de quimerismos moleculares mediante la expresión de transgenes en el sistema hematopoyético se ha asociado a la tolerización por parte del sistema inmune frente a estos transgenes. En este trabajo proponemos expresar un autoantígeno candidato de la EM (el péptido 40-55 de la glicoproteína mielínica de los oligodendrocitos) en el sistema hematopoyético murino con la finalidad de inducir tolerancia frente a éste.Utilizando procedimientos lo más cercanos posible a la clínica humana, hemos comprobado que la creación de quimerismo molecular utilizando el autoantígeno previene muy eficazmente la enfermedad, mientras que en animales con EAE establecida, la transferencia de células hematopoyéticas expresando el autoantígeno mejora significactivamente la enfermedad, si bien en este caso observamos que no se producía quimerismo molecular estable ya que las celulas infundidas que expresaban el autoantígeno eran rechazadas, probablemente debido a la inmunización previa.Esto nos indujo a hipotetizar que la mieloablación no es necesaria y que el efecto terapéutico no era debido a células con capacidad de repoblación sino a células mieloides que expresan el autoantígeno y que tendrían capacidad tolerogénica in vivo.Así, comprobamos experimentalmente que el beneficio terapéutico se producía también en ratones con EAE no sometidos a mieloablación alguna, lo que permitiría obviar por completo el uso de tratamientos de acondicionamiento y haría más factible la aplicabilidad clínica de este tipo de estrategia terapéutica.Para investigar los mecanismos por los cuales se induce tolerancia específica en este modelo, se estudió el patrón de citocinas de los ratones tratados terapéuticamente. Se hallaron niveles más elevados de IL-10 e IL-5 en los cultivos deesplenocitos de los ratones tratados con el autoantígeno, dos citocinas que, entre otras, son secretadas por células T reguladoras de tipo 1 (Tr1). Estos resultados nos sugieren una posible implicación de este tipo celular en la inducción de tolerancia conseguida en este modelo.Además, a raíz de estos experimentos hemos descubierto que el nivel de expresión de un transgén potencialmente inmunogénico (EGFP) en el contexto del trasplante hematopoyético en ratones sometidos a mieloablación parcial encondiciones parcialmente mieloablativas pero en ausencia de inmunosupresion, puede ser determinante en la induccion de una respuesta inmune frente a las células transducidas. También hemos demostrado que la respuesta celular in vitro frente a células transducidas es igualmente dependiente del nivel de expresión del transgén. / Hematopoietic gene therapy is a promising strategy to treat hereditary diseases. In addition, many strategies have been developed to induce tolerance in autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS). MS is a chronic, inflamatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS) mediated mainly by CD4+T cells, that produces discapacity and paralysis. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model for MS, shares clinical and histopathological features with the human disease.Molecular chimerism using hematopoietic cells expressing transgenes is usually associated with tolerance induction to transgene products. In this work we hypothesized that the expression of a candidate autoantigen (the MOG40-55 peptide) inthe murine hematopoietic system would induce specific tolerance in the EAE model.We found that EAE was strongly prevented when molecular chimerism was established prior to EAE induction. On the other hand, when EAE was already established, the transfer of BMC expressing the autoantigen ameliorated EAE clinical outcome and the CNS histopathological lesions. In this therapeutic approach, molecular chimerism was not detected, probably because cells expressing the MOG40-55 peptide were rejected due to the pre-established immune response to this antigen.These results suggested that myeloablation was not necessary to induce specific tolerance. Indeed, clinical amelioration was also observed in mice with EAE infused with BMC expressing the MOG peptide in the absence of any conditioning treatment.This approach is more feasible for human clinical application, it circumvents the risks ofmyeloablation and those of insertional mutagenesis since the transduced cells do not survive in vivo.Regarding the potential mechanisms involved, we analyzed the cytokine pattern upon antigen exposure in the treated mice. Higher levels of IL-10 and IL-5 were found in mice treated with bone marrow cells expressing the autoantigen. Both cytokines are secreted by many cell types, including type 1 regulatory T cells (Tr1). These results suggest a role of transduced cells inducing Tr1 cells in vivo as a potential mechanism of tolerance induction in our model.In the second part of this work we demonstrated that the level of expression of a potentially immunogenic transgene such as EGFP in the context of bone marow transplantation into partially myeloablated mice in the absence of immnuosupression is determinant to induce immune responses towards the transduced cells.

La present investigació es va dur a terme al centre Can Rubió d'Esparreguera (BCN). HIPÒTESI: el Programa de Teràpia Institucional (PTI) que se segueix al centre opera algunes modificacions en el funcionament psíquic i relacional dels adolescents que el segueixen.OBJECTIUS: avaluar els canvis que produeix el PTI en l'organització de la personalitat, en el funcionament relacional, en les estratègies d'afrontament de problemes i en els recursos cognitius, i, en segon lloc, cercar la possible relació d'aquests canvis amb algunes circumstàncies dels subjectes (adolescents en situació de desemparament i amb trastorns psíquics greus).PROCEDIMENT: s'han practicat tres avaluacions: moment inicial, curt termini (8 mesos) i mitjà termini (15 mesos). Les puntuacions obtingudes en el moment inicial s'han comparat amb els barems dels respectius tests (barem per a adolescents italians en el cas del Rorschach).Les puntuacions obtingudes a curt i mitjà terminis s'han comparat amb les puntuacions obtingudes en el moment inicial, calculant la significació estadística de les diferències (T de Wilcoxon) i la significació clínica (mètode de Cohen) de les diferències, prenent com a criteri de significació clínica un ES>0,37 (Lipsey).S'han calculat les tendències (regressions lineals, mètode de mínims quadrats) per a una selecció de 17 índexs i la relació (Spearman) d'aquestes tendències amb algunes circumstàncies dels subjectes.INSTRUMENTS: test de Rorschach, YSR,CRI i els subtests de Vocabulari, Semblances i Cubs del WISC-R.SUBJECTES: 31 en el moment inicial, 25 i 19 a curt i mitjà terminis, respectivament, d'ambdós sexes, amb diversos tipus de patologia psíquica.RESULTATS: en el moment inicial: els subjectes presenten nombrosos problemes emocionals i de conducta, predomini de l'ús d' estratègies d'evitació en l'afrontament de problemes, tendència a la dissociació i/o actuació, fallades en la percepció interna i externa, escassos recursos ideacionals i emocionals, nombrosos trastorns del curs i del contingut del pensament, manca d'interès en els altres, passivitat i dependència de l'entorn, i dificultats per percebre la convencionalitat social i les normes del grup.A curt termini: s'observen molt pocs canvisA mitjà termini: s'observen millores en el control i la tolerància a l'estrès, l'autopercepció., la identificació social, la internalització, l'externalització i en l'ús de les estratègies d'aproximació als conflictes, disminució dels trastorns del pensament. S'incrementen la tendència a la passivitat ideacional, la dependència de l'entorn i l'ús de l'evitació com a estratègia d'afrontament. La tendència a la millora presenta una correlació significativa negativa amb el nombre d'ingressos psiquiàtrics i la seva duració. La tendència a l'immobilisme psíquic presenta una correlació significativa negativa amb el suport familiar. DISCUSSIÓ: la discreció dels resultats pot ser deguda a la presència de molts factors relacionats amb l'abandonament, la carència i la situació familiar dels subjectes i a l'absència de patiment psíquic/raons per canviar, d'introspecció i de confiança en els altres.CONCLUSIONS: la implantació d'un model multimodal és factible i proporciona informació vàlida per a l'anàlisi de l'evolució clínica individual, per a intercanviar-la amb altres professionals, com a indicador de la qualitat del Servei i genera una base de dades estandarditzades que possibilita la investigació. Aquest PTI no està indicat per a subjectes que han fets nombrosos i/o llargs ingressos psiquiàtrics. L'edat, la psicopatologia, la situació familiar, la comorbilitat i les perspectives de futur configuren unes organitzacions de la personalitat cristal·litzades i molt difícils de modificar. L'increment de la passivitat ideacional, de la dependència de l'entorn i de l'evitació com a estratègia d'afrontament requereixen que s'identifiquin els elements del propi PTI, de la quotidianitat i de la normativa que regeix el centre que poden contribuir a l'increment d'aquests factors i introduir les modificacions pertinents en cada un d'aquests tres àmbits. / OBJECTIVE: To evaluate the impact of an institutional therapy programme on adolescents' (aged between 12 and 18 years, both sexes) personality, relationships, and coping strategies suffering severe mental disorders and coming from broken families. PROCEDURE: Three evaluations were carried out. At income (n=31), after 8 (n=25) and 15 months (n=19). Participants were evaluated with the Rorschach test, YSR, CRI, and WISC-R. Income scores bring information about kind, degree, and variety of mental dysfunctions. Scores obtained after 8 and 15 months were compared with income ones in order to explore statistically (Wilcoxon) and clinically significant differences (Cohen; ES>0.37 Lipsey). A total of 17 indices were calculated (minimum least squares regression) and their correlation (Spearman) with some other variables of participants were explored. RESULTS. At income, severe dysfunctions were observed in domains such as emotions, thoughts, perception, behaviour, interpersonal relationships, coping styles, and social relationships.After 8 months under treatment, changes were minimum.After 15 months, stress control and tolerance, self-perception, social conventions, internalisation, externalisation, approach strategies, and thoughts improved. Additionally, ideational passivity, dependence on the environment, and avoidance as a coping strategy augmented.Improvement was negatively and significantly associated to psychiatric hospitalisations and their duration. Family support was negatively and significantly associated to psychic immobility. DISCUSSION: Variables such as abandonment, lack, family situation, sense of controlling everything, and therefore, absence of motivation to change and lack of insight and feelings of distrust could hinder treatment benefits and explain poor results. CONCLUSIONS: This programme is not recommended for subjects with many or long psychiatric inpatient stays. Age, psychopathology, family situation, comorbidity, and perspectives about the future conform some strong pathological personality features that could hardly change. The programme must be reviewed to identify and modify factors that could be contributing to augment passivity, avoidance, and dependence on the environment.

1) INTRODUCCIÓNConsideramos que aún no podemos hablar de Psicología de la Salud -o Medicina Conductual- aplicada a la Dermatología como un campo de estudio o de intervención claramente definido y delimitado. Pensamos que estamos en una etapa inicial, de aplicación de algunas técnicas y teorías propias de la Modificación de Conducta a un número limitado de trastornos dermatológicos. Falta, quizá, un cierto tiempo para que los psicólogos de la salud puedan integrar sus conocimientos con los profesionales de la dermatología, del mismo modo que esta integración ha sido posible en otros campos de la medicina, tales como la neurología, cardiología, pediatría, endocrinología, oncología, etc.Dentro de esta etapa inicial un equipo de psicólogos de la Unidad de Terapia de Conducta de la facultad de Psicología de la Universidad de Barcelona ha efectuado la investigación que a continuación se presenta. No era nuestra pretensión el superar el estado de la cuestión planteada en las líneas precedentes, superación esta que es tarea de todo un colectivo de profesionales y no sólo de un equipo de trabajo; tan sólo pretendíamos presentar un trabajo con un cierto rigor metodológico que permitiese afianzar nuestros conocimientos en esta área.2) INVESTIGACIÓNEscogimos el trastorno denominado "Acné Vulgaris"(AV) por diferentes motivos: a) Su prevalencia entre la población general es muy elevada: Fellowes, Billewicz y Thompson (1981) hallaron una prevalencia del 75-80% en mujeres de 15 a 16 años de edad y del 90-95% en varones de 17 a 18 años; b) Suele ser un trastorno refractario al abordaje medicamentoso (August, 1985); c) Es un trastorno cuya organicidad es indiscutible; y d) La escasez de trabajos conductuales sobre el mismo.El AV es una dermatosis inflamatoria que afecta a los folículos pilosebáceos y tejidos adyacentes. Suele seguir un curso crónico que requiere intervención profesional en la mayoría de los casos. Se localiza ahí donde hay mayor concentración de glándulas sebáceas, responsables en última instancia del trastorno, esto es, en la cara, el cuello y la espalda.3) MÉTODO. SUJETOSSe reclutaron un total de 32 mujeres de edades comprendidas entre los 15 y los 25 años (X = 19.28. D.E. = 3.29) con una historia de AV, entre leve y grave, de 5 años aproximadamente. Todos los sujetos participaron voluntariamente sin recibir ningún tipo de incentivo por ello. Los sujetos hablan efectuado un promedio de 2,1 tratamientos anteriores para su AV obteniendo en más del 55% de los casos un resultado nulo o un empeoramiento del trastorno.4) INVESTIGADORES Dos médicos dermatólogos y dos médicos generalistas efectuaron las labores médicas propias de la investigación. Seis psicólogos, en formación de post-grado en la Unidad de Terapia de Conducta de la facultad de Psicología de la Universidad de Barcelona, dos en tareas de evaluación y dos parejas en tareas de aplicación del BF EMG a los sujetos de la investigación. Todos los participantes recibieron entrenamiento adecuado en sus tareas por parte de los autores del presente trabajo.5) DISEÑOSe efectuó un diseño factorial 2 x 2. Los dos factores eran el tratamiento médico y el entrenamiento en BF EMG, los niveles de los factores fueron SI y NO. Se configuraron, de este modo, 4 grupos: 1) de tratamiento médico; 2) de entrenamiento en BY EMG; 3) de tratamiento médico más entrenamiento en BF EMG; y 4) control (lista de espera).6) MATERIALSe utilizó un equipo completo de registro de la actividad muscular frontal (EMG LE 900) y un canal de BF preparado para la retroalimentación auditiva de la actividad muscular (LE 1100). Para los registros fotográficos se utilizó una cámara OLYMPUS 1000.7) PROCEDIMIENTOA) Fase de línea base ("pre"). Tras el examen médico los sujetos eran derivados a la Unidad de Terapia de Conducta mencionada. Esta fase se prolongó durante dos semanas a razón de una sesión de evaluación por semana. Se obtuvieron los siguientes datos: a) contaje de lesiones por parte del psicólogo evaluador; b) contaje de lesiones mediante el autorregistro del propio sujeto; e) dos registros de línea base de la actividad EMG Frontal (15 minutos de adaptación y 5 minutos de registro): y d) Dos fotografías del rostro del sujeto. Se controlaron variables como el nivel de ansiedad, el locus de control y el nivel de expectativas.B) Fase de tratamiento. Los sujetos fueron asignados de modo rotatorio a uno de los cuatro grupos del estudio. Los sujetos del grupo 1 recibieron tratamiento mediante el medicamento llamado "Dalacín Tópico" (Upjohn) - un antibiótico tópico muy usado en el tratamiento del AV - durante 30 días. Los sujetos del grupo 2 recibieron ocho sesiones de entrenamiento en BF EMG, a razón de dos sesiones por semana, (5 minutos de adaptación. 5 min. de línea base preentrenamiento, 20 minutos de entrenamiento con BF auditivo y 5 minutos de línea base post-entrenamiento). El objetivo era la reducción de la activación del músculo frontal. Durante las tres primeras sesiones se les ayudó con instrucciones estándar de relajación. Los sujetos del grupo 3 recibieron los dos tratamientos anteriormente reseñados con una duración semejante a la de los anteriores. Los sujetos del grupo 4 esperaron durante unos 40 días aproximadamente sin efectuar tratamiento alguno. Todos los sujetos efectuaron autorregistros diarios y semanales sobre diferentes cuestiones relacionas con su AV y el cuidado del mismo.C) Fase de post-tratamiento ("post"). Una semana después de finalizada la fase anterior se efectuó una serie idéntica a la fase " pre".D) Fase de seguimiento. Por motivos éticos sólo se efectuaron seguimientos en los grupos 1, 2 y 3. Los sujetos del grupo de lista de espera recibieron tratamiento médico para su AV. Se establecieron seguimientos a los 30 ("seg. 1"), 90 ("seg. 2") y 360 ("seg. 3") días de finalizado el tratamiento.En cada sesión de seguimiento se efectuó un registro EMG, un contaje de lesiones y dos fotografías del rostro del sujeto.8) RESULTADOSDe los 32 sujetos iniciales, 12 abandonaron la investigación antes de su finalización. De estos 12. 10 pertenecían al grupo de tratamiento médico, por ello los resultados de este grupo deben ser considerados teniendo en cuenta que para lograrlos se necesitaron 15 sujetos.A nivel descriptivo destaca que el 37% de la muestra atribuye la causa de su AV a problemas de estrés o ansiedad, así como un 62% de la misma afirma que su AV empeora cuando se siente "nervioso" mientras que mejora para un 56% de los sujetos en situaciones de "tranquilidad y relajación". Los grupos eran homogéneos entre sí al inicio de la investigación en las tres variables mostradas. Se observa como los grupos 1, 2 y 3 pero no el 4 presentaron una mejoría estadísticamente significativa (T. de Wilcoxon) en el número de sus lesiones a lo largo de las diferentes fases de la investigación, incluyendo el seguimiento realizado al año de seguimiento.Asimismo sólo los grupos que recibieron entrenamiento en BF EMG (grupos 2 y 3) mostraron una disminución de la actividad del músculo frontal. El análisis multivariante (Manova) de las diferencias en el número de lesiones entre la fase "pre" y la "post" según los monitores-evaluadores muestra que los sujetos que recibieron tratamiento médico (grupos 1 y 3) difieren significativamente de aquellos que no lo recibieron (grupos 2 y 4) (F = 4.77, p = 0.044). A su vez, los sujetos que fueron entrenados en BF EMG (Grupos 2 y 3) muestran diferencias con respecto a los que no lo fueron (Grupos 1 y 4) (F =- 5.29, p = 0.035). Sin embargo, los sujetos que recibieron la interacción de ambos tratamientos (Grupo 3) no difieren significativamente de los que no fueron tratados con tal interacción (Grupos 1, 2 y 4) (F = 3.11, p = 0.097). Se confirma, pues, que los sujetos que reciben tratamiento obtienen mejores resultados que los que no lo reciben; sin embargo, no se confirma que la interacción entre los dos tratamientos provoque una mejoría mayor en el grupo que la recibe.9) DISCUSIÓNLos resultados nos llevan a considerar que la aplicación del entrenamiento en BF EMG es un tratamiento útil, aún en solitario, para aliviar el AV.Sin embargo, y aún teniendo en cuenta el elevado número de abandonos en el grupo de tratamiento médico, este último se mostró igualmente eficaz. De ello podemos concluir que no hay un tratamiento más eficaz que otro. Asimismo de la adición de ambos tipos de tratamiento no resulta una mayor mejoría del AV.Por otra parte, hemos constatado que los datos del número de lesiones del AV y los de la actividad EMG no covarían necesariamente. Así el tratamiento médico mejora el AV (disminuye el número de lesiones) sin provocar cambio alguno en la actividad EMG (grupo 1). La disminución de la actividad EMG (mediante entrenamiento BF EMG) se sigue de una disminución del número de lesiones del AV (grupo 2).Se puede concluir, entonces, que si bien no es necesaria la disminución de la actividad EMG para aliviar el AV si esta se efectúa, el AV mejora. La disminución de la actividad EMG es condición suficiente pero no necesaria y lo mismo se puede decir del tratamiento médico; es suficiente, pero tampoco necesario, tal y como demuestran los datos del grupo 2. / In the present work different studies carried out from a behavioural perspective on dermatological problems are revised. This revision allows confirm the practical absence of basic research about this topic and the fact that the application of behavioural strategies to Dermatology it is still very limited. Furthermore, we present a research work that has been done with a sample of 32 women with Acne Vulgaris (AV) assigned to 4 different treatment groups: 1) medical treatment; 2) electromyographic biofeedback training (EMG BF); 3) the combination of the two previous (medical plus EMG BF); and 4) control on waiting list of results showed that at post-treatment and the one year follow-up the EMG BF appeared as ca useful procedure for the AV treatment al though the effect was not greater than that of the medical treatment. This research states the applicability of behavioural strategies to dermatological problems, opening new ways of collaboration between dermatologist and health psychologists.

El adenocarcinoma de páncreas y el cáncer de colon son una de las causas de muerte, relacionadas con el cáncer, más comunes en los países desarrollados. Los tratamientos convencionales para este tipo de tumores son poco efectivos y es necesario el desarrollo de nuevas terapias. Entre las terapias experimentales destaca la terapia con genes suicidas, que consiste en la eliminación selectiva de las células tumorales que han sido modificadas con un gen suicida. La eficacia de dicha terapia depende de la transducción de una proporción elevada de células tumorales y de un potente efecto colateral in vivo. A pesar de las mejoras enfocadas a incrementar la llegada de los genes suicidas a las células tumorales con vectores más eficientes, los resultados obtenidos en los ensayos clínicos han sido muy reducidos.Con tal de aumentar el porcentaje de las células modificadas con genes suicidas en el tumor, proponemos utilizar los genes de resistencia a drogas en combinación con una droga de selección. En presencia de dicha droga, la población de células modificadas reemplazaría las células tumorales sensibles. Después de esta selección positiva, la terapia suicida induciría la muerte de las células modificadas. El efecto colateral permitiría eliminar todo el tumor aunque este reemplazamiento celular no fuese completo.La primera prueba de concepto se realizó en el modelo colorrectal HCT116 modificado con el marcador de selección dihidrofolato reductasa (DHFR) y el gen suicida timidina quinasa (TK). El gen DHFR otorga resistencia a metotrexato (MTX) y la TK confiere sensibilidad a la prodroga ganciclovir (GCV). En presencia del compuesto MTX, estas células se enriquecieron de un 0.1% a más de un 90% en cocultivos con HCT116 sin modificar. Después de esta selección positiva, la selección negativa con GCV eliminó las células modificadas. El tratamiento con MTX in vivo aumentó la proporción inicial de células modificadas. Este enriquecimiento mejoró la eficacia de la terapia suicida per se en tumores con un 1% o un 4% inicial de células modificadas.En una segunda aproximación, modificamos la línea de adenocarcinoma pancreático NP18 con el gen de resistencia a multidrogas MDR1 y con el gen suicida TK. Las células modificadas mostraron resistencia a docetaxel y sensibilidad a GCV, tanto in vitro como in vivo. La aplicación de la droga de selección en ratones aumentó la proporción de células modificadas de un 4% inicial a un 22%. La estrategia de selección positiva-negativa permitió inhibir completamente el crecimiento tumoral en un modelo murino a partir de tumores con un 10% inicial de células modificadas. Estas dos aproximaciones demuestran que la selección positiva-negativa de células modificadas con un marcador de selección y con el gen suicida TK representa una estrategia efectiva para aumentar la proporción de células que expresan el gen TK en el tumor y mejorar la eficacia de la terapia suicida.Por otro lado, las células madre mesenquimales (MSC) han mostrado su capacidad de dirigir genes suicidas de forma sistémica hacia el tumor. En este apartado, nos planteamos si estas células podían seleccionarse positiva y negativamente en presencia de células tumorales. En primer lugar, se determino el enriquecimiento de las MSC de ratón (mMSC) en cocultivos con NP18, mediante tratamiento con docetaxel. A pesar de observarse una cierta selección positiva de las mMSC en cultivo, este enriquecimiento no sucedió en tumores mixtos tratados con la droga de selección. La generación de MSC de hígado fetal de conejo (rFL-MSC) modificadas con el gen MDR1 y el gen suicida FCU mejoró la selección positiva in vitro y permitió eliminar estas células en presencia de la prodroga 5-FC. Aún así, estas células no se enriquecieron en tumores mixtos tratados con docetaxel. / Thymidine kinase (TK)-mediated suicide gene therapy has been considered for the treatment of cancer. However, despite a bystander effect, the proportion of transduced tumor cells has proven too low to result in efficacy. We propose the use of a drug-selectable marker (DHFR or MDR1) to enrich TK-expressing cells using chemotherapy. This enrichment or positive selection phase may increase the efficacy of suicide gene therapy. The prove of concept was performed in colon cancer cells modified with a fusion gene of dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase (TK). DHFR confers resistance to methotrexate (MTX) and TK confers sensitivity to ganciclovir (GCV). Under MTX treatment, tumor cells transfected with the DHFR-TK fusion gene efficiently replaced the parental cells (from 0.1 to 90% in 35 days). After this positive selection period, negative selection with GCV eliminated the transfected cells. In vivo, positive selection was also achieved and resulted in a statistically significant therapeutic effect.In other approximation we generated stable NP18MDR/TK-GFP transfectants and showed docetaxel resistance in vivo. Mixed tumors of MDR/TK-expressing cells and parental NP18 cells were established and docetaxel was used to increase the proportion of TK-expressing cells. Upon positive selection, the proportion of TK-expressing cells increased from 4% to 22%. Subsequent suicide gene therapy with GCV was more effective compared with a control group without positive selection. Starting with 10% of TK-expressing cells the positive-negative selection strategy completely inhibited tumor growth. Finally we tried to induce positive selection with Mesenchymal Stem Cells (MSC). We determined that mMSC could be enriched in cocultures with NP18 after docetaxel treatment. However, positive selection was not observed in vivo. The modification of rabbit fetal liver MSC (rFL-MSC) with the gene MDR1 and FCU improved positive selection in vivo and allowed negative selection in presence of the prodrog 5-FC. However, positive selection was not observed in mixed tumors. Taken together, these results suggest that a positive-negative selection strategy based on drug resistance genes represents an efficient way to increase the proportion of suicide expressing cells in the tumor and the efficacy of suicide gene therapy.

L'obesitat és una malaltia crònica que es caracteritza per una acumulació ectòpica excessiva de greix associada a la inflamació del fetge i del teixit adipós. A més és el principal factor de risc pel desenvolupament de malalties com la diabetis tipus 2 o malalties cardiovasculars. En els darrers temps, degut a la ingesta de dietes enriquides en greixos i al sedentarisme l'obesitat i el sobrepès han adquirit dimensions de pandèmia, fins el punt que la OMS l'ha etiquetat com l'epidèmia del segle XXI on mil milions de persones en tot el món pateixen algun tipus de sobrepès i uns 300 milions de persones es consideren que són obeses com a conseqüència de la sobrenutrició o sobrealimentació permanent en els països industrialitzats.El fetge és l'òrgan responsable de mantenir la homeostasi energètica de tot l'organisme i responsable en gran part del metabolisme de la glucosa i del metabolisme lipídic. A més, el fetge juga un paper fonamental en el desenvolupament de l'obesitat i en la desregulació metabòlica conseqüent. Nombrosos estudis han descrit l'acumulació d'espècies derivades d'àcids grassos en el fetge com a causants dels problemes associats a l'obesitat, ja sigui degut a una aportació excessiva de lípids o a una fallada en l'oxidació. En els individus obesos tot i tenir alts nivells de greix presenten una oxidació d'àcids grassos disminuïda. Per això, en aquesta tesi s'ha estudiat si un augment en l'oxidació d'àcids grassos en el fetge a llarg termini és capaç de reduir l'acumulació lipídica i per tant disminuir l'obesitat ens diferents models d'animals obesos. Per dur a terme aquest objectiu s'ha avaluat l'efecte de la sobreexpressió de la carnitina-palmitoïltransferasa (CPT) 1A, que és l'enzim responsable del control del transport d'àcids grassos en el mitocondri per ser oxidats, mitjançant l'administració de virus adenoassociats (AAVs). Els AAVs són una molt bona eina per utilitzar com a teràpia gènica per la seva capacitat d'expressar els gens que introdueixen durant llargs períodes de temps i per la resposta pràcticament nul·la del sistema immunitari de l'organisme el qual infecten. Els resultats presentats en aquesta tesi demostren que la sobreexpressió de la CPT1A i d'una forma mutada de CPT1A (CPT1AM), insensible al seu inhibidor fisiològic el malonil-CoA, és suficient per augmentar l'oxidació d'àcids grassos en el fetge, reduir l'acumulació lipídica i la inflamació en el fetge i en el teixit adipós. Per tan, la sobreexpressió de la CPT1A i en un major grau la CPT1AM protegeix a l'organisme enfront l'obesitat i els seus problemes associats. Aquests resultats obren un ventall de possibilitats en la recerca de noves teràpies gèniques contra l'obesitat. / Obesity-induced insulin resistance is associated with both ectopic lipid deposition and chronic, low-grade adipose tissue inflammation. Despite their excess fat, obese individuals show lower fatty-acid oxidation (FAO) rates. This has raised the question of whether burning off the excess fat could improve the obese metabolic phenotype. Here, we used human-safe non-immunoreactive adenoassociated viruses (AAV) to mediate long-term hepatic gene transfer of carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A), the key enzyme in fatty-acid β-oxidation, or its permanently active mutant form CPT1AM, to high-fat diet-treated and genetically obese mice. High-fat diet CPT1A- and, to a greater extent, CPT1AM-expressing mice showed an enhanced hepatic FAO which resulted in increased production of CO2, ATP and ketone bodies. Notably, the increase in hepatic FAO not only reduced liver triacylglyceride content, inflammation and ROS levels but also affected systemically to decrease epididymal adipose tissue weight and inflammation and to improve insulin signaling in liver, adipose tissue and muscle. Obesity-induced weight gain, increase in fasting blood glucose and insulin levels, and augmented expression of gluconeogenic genes were restored to normal only 3 months after AAV treatment. Thus, CPT1A- and, to a greater extent, CPT1AM-expressing mice were protected against obesity-induced weight gain, hepatic steatosis, diabetes and obesity-induced insulin resistance. In addition, genetically obese db/db mice that expressed CPT1AM showed reduced glucose and insulin levels, and liver steatosis. A chronic increase in liver FAO improves the obese metabolic phenotype, which indicates that AAV-mediated CPT1A expression could be a potential molecular therapy for obesity and diabetes.

Objectiu de l’estudi: dissenyar un programa d'intervenció física rehabilitadora estandarditzada (IFRE) dirigit a pacients amb fibromiàlgia amb un grau d'afectació lleu moderada (FIQ <70) i valorar la repercussió d'aquesta intervenció sobre les manifestacions clíniques i l'impacte global de la malaltia, tant en medi aquàtic com en sec. Pacients i mètode: es va realitzar un estudi quasi-experimental, sense grup control, en pacients diagnosticats de FM segons els criteris del Col•legi Americà de Reumatologia. L’estudi es va iniciar amb 90 dones, que es van assignar de forma aleatòria a dos grups d'intervenció. Un grup va realitzar la IFRE en medi aquàtic (IFREA, n = 37) i un altre en medi sec (IFRES, n = 36). Les dimensions d'estudi van ser el dolor autopercebut (Escala Visual Analògica (EVA)), la fatiga percebuda (EVA), la capacitat aeròbica (Test dels 6 minuts (6MW)), la simptomatologia depressiva (Escala de depressió de Hamilton (HAM- D) i l'impacte global de la malaltia (Qüestionari d'Impacte de Fibromiàlgia (FIQ)). Les avaluacions es van realitzar en la línia base i en finalitzar les 20 setmanes d'intervenció. Resultats: la mitjana d’edat de la població va ser de 48,15 anys, amb un IMC de 27,67. A les 20 setmanes d'intervenció, en el grup IFREA es van obtenir diferències significatives (p <0,05), observant millores en el post-test respecte al pre-test, en el dolor (p <0,012), la fatiga (p <0,040), la simptomatologia depressiva (p <0,001) i l'impacte global de la malaltia (p <047). En el grup IFRES es van obtenir diferències significatives, observant millores en el post-test respecte al pre-test, en la capacitat aeròbica (p <0,42) i la simptomatologia depressiva (p <0,002), així com un augment en l'impacte global de la malaltia (p <016). Conclusions: La realització d'un programa de IFRE, durant 20 setmanes, comporta una millora en les manifestacions clíniques i la capacitat aeròbica en pacients amb FM amb afectació lleu moderada, mostrant millors resultats si la intervenció d'aquest programa es realitza en medi aquàtic vs. medi sec / Objetivo del estudio: diseñar un programa de intervención físico rehabilitadora estandarizada (IFRE) dirigido a pacientes con fibromialgia con un grado de afectación leve moderada (FIQ<70) y valorar la repercusión del mismo sobre las manifestaciones clínicas y el impacto global de la enfermedad, tanto en medio acuático como en seco. Pacientes y método: se realizó un estudio quasi-experimental, sin grupo control, en pacientes diagnosticados de FM según los criterios del Colegio Americano de Reumatología. 90 Mujeres iniciaron el estudio, que se asignaron de forma aleatoria a dos grupos de intervención, uno que realizó la IFRE en medio acuático (IFREA, n=37) y otro en medio seco (IFRES, n=36). Las dimensiones de estudio fueron el dolor autopercibido (Escala Visual Analógica (EVA)), la fatiga percibida (EVA), la capacidad aeróbica (Test de los 6 minutos (6MW)), la sintomatología depresiva (Escala de depresión de Hamilton (HAM-D) y el impacto global de la enfermedad (Cuestionario de Impacto de Fibromialgia (FIQ)). Las evaluaciones se realizaron en la línea base y al finalizar las 20 semanas de intervención Resultados: la media de edad de la población fue de 48,15 años, con un IMC de 27,67. A las 20 semanas de intervención, en el grupo IFREA se obtuvieron diferencias significativas (p<0,05), observándose mejoras en el post test respecto al pre test, en el dolor (p<0,012), la fatiga (p<0,040), , la sintomatología depresiva (p<0,001) y el impacto global de la enfermedad (p<047). En el grupo IFRES se obtuvieron diferencias significativas, observándose mejoras en el post test respecto al pre test, en la capacidad aeróbica (p<0,42) y la sintomatología depresiva (p<0,002), así como un aumento en el impacto global de la enfermedad (p<016). Conclusiones: la realización de un programa de IFRE, durante 20 semanas, conlleva una mejoría en las manifestaciones clínicas y en la capacidad aeróbica en pacientes con FM con afectación leve moderada, mostrando mejores resultados si la intervención de dicho programa se realiza en medio acuático vs. medio seco. / Aim of the study: was to design a standardized physical rehabilitation program (IFRE) for patients with FMS with a mild degree of the disease (FIQ<70) and to measure its impact on the clinical manifestations and on the global impact of the disease, in both land-based (LE) and pool-based (PE) environments. Patients and method: A quasi-experimental study was carried out with patients diagnosed with FMS according to the criteria of the American College of Rheumatology. The study group was composed by 90 women who were divided into two subgroups: on the one hand, the women receiving the pool-based program (IFREA, n=37) and, on the other hand, the ones receiving the land-based program (IFRES, n=36). The aspects analysed in the research were pain (Visual Analogue Scale, VAS), fatigue (Rating of Perceived of Exertion Scales, RPE), aerobic capacity (6-Minute Walk Test, 6WT), depression symptoms (Hamilton Depression Rating Scale, HAM-D) and the overall impact of the disease (Fibromyalgia Impact Questionnaire (FIQ). The assessment was conducted at the baseline and at the end of a 20-week period. Results: The average age of the group was 48,15 years with a BMI of 27.67. After 20 weeks of intervention, significant differences arose in the IFREA group (p<0,05), showing improvements in the post-test compared to pre-test, in pain (p <0.012), fatigue (p <0.040), depressive symptoms (p <0.001) and the overall impact of the disease (p <047). In the IFRES group, significant differences appear and improvements were observed in the post-test compared to pre-test in aerobic capacity (p <0.42) and depressive symptoms (p <0.002), and an increase in the overall impact of disease (p <016). Conclusions: The completion of the IFRE program for 20 weeks involves an improvement in the clinical manifestations and aerobic capacity in patients with moderate FMS, showing better results if the implementation of the program takes place in a pool-based environment vs. land-based