<p>An important step in tumorgenesis is the acquisition of cellular immortality. Tumor cells accomplish this by activating the enzyme telomerase, and thereby avoiding replicative senescence. The aim of this thesis was to study the activity and regulation of telomerase in a panel of malignant cell types.</p><p>We found that TGF-β1 (transforming growth factor-β1) mediated differential effects on telomerase activity in five ATC (anaplastic thyroid carcinoma) cell lines. Cells that harbored a <i>p53</i> mutation responded by up-regulation of telomerase activity after TGF-β1 treatment, whereas cell lines displaying wt <i>p53 </i>responded by down-regulation of telomerase activity. Thus, these results indicate a possible connection between <i>p53</i> genotype and telomerase response to TGF-β1 treatment. Furthermore, the decreased telomerase activity appeared to be due to transcriptional repression of the <i>hTERT</i> promoter and the increased activity possibly involved hTERT activation via phosphorylation. </p><p>We have previously shown that IFNs (interferons) sensitize MM (multiple myeloma) cells to Fas-mediated apoptosis. In the present investigation both IFN-α and IFN-γ down regulated telomerase activity in the MM cell line U-266-1970. The mechanism underlying the reduction of telomerase activity by IFN was shown to be transcriptional repression of the <i>hTERT </i>gene. We suggest that one potential mechanism whereby IFN sensitize MM cells to Fas-mediated apoptosis is by repressing <i>hTERT</i> activity at the transcriptional level. </p><p>In the next study we demonstrated that basal telomerase activity is not a key determinant of sensitivity to cytotoxic drugs in ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) cell lines. Furthermore, we observed no correlation between <i>c-Myc</i> amplification, <i>p53</i> mutations and high telomerase activity levels in these cell lines. </p><p>Finally, neuroblastoma cell lines were shown to up-regulate telomerase activity in response to hypoxic exposure and the main regulatory mechanism was not mediated by increased hTERT mRNA expression. This finding might constitute an adaptive stress response of tumor cells exposed to hypoxia. </p>

Hypoxia-reoxygenation (H-R) injury is an important clinical phenomenon in patients with coronary artery disease (CAD). Endothelial injury is a critical step in the initiation and progression of atherosclerosis. Therefore, endothelial and cardiomyocyte protection has been considered an effective step in prevention and treatment of CAD. To investigate the cardioprotective effect of tocopherols, omega-3 fatty acid [eicosapentaenoic acid (EPA)] and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) during H-R, calcium tolerant myocytes isolated from adult rats were cultured and subjected to hypoxia for 24 hrs followed by reoxygenation of 3 hrs. All strategies, including tocopherol preparations, EPA and TGF-β1, showed attenuation of H-R-induced myocyte injury indicated by reduction of lactate dehydrogenase (LDH) release. Both a-tocopherol and a mixed- tocopherols (α-, γ-, and δ-) decreased the effects of H-R on iNOS expression and SOD activity in cultured myocytes. The mixed-tocopherols was more potent than a-tocopherol alone. EPA inhibited H-R-induced lipid peroxidation, MMP-1 expression and p38MAPK phosphorylation. TGF-β1 blocked the increase in iNOS and PKB phosphorylation as well as the decrease in eNOS expression in cultured myocytes exposed to H-R. To further investigate the protective effect of omega-3 fatty acids [docosahexaenoic acid (DHA) and EPA] and TGF-β1, the cultured endothelial cells were exposed to oxidant injury mediated by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL). Ox-LDL markedly reduced TGF-β1 release, increased the expression of TGF-β1 receptors, upregulated the expression of adhesion molecules, P-selectin and ICAM-1, enhanced the adhesion of monocytes to endothelial cells, and decreased protein kinase B (PKB) activation. Both DHA and EPA blocked these effects of ox-LDL on endothelial cells. Exogenous recombinant TGF-β1 also ameliorated ox-LDL-induced expression of adhesion molecules and monocytes adhesion, which were blocked by antibodies to the TGF-β1 type 2, but not to the type 3 receptor. These observations provide mechanistic insights into H-R and oxidant injury and tissue protection by three different strategies.

An important step in tumorgenesis is the acquisition of cellular immortality. Tumor cells accomplish this by activating the enzyme telomerase, and thereby avoiding replicative senescence. The aim of this thesis was to study the activity and regulation of telomerase in a panel of malignant cell types. We found that TGF-β1 (transforming growth factor-β1) mediated differential effects on telomerase activity in five ATC (anaplastic thyroid carcinoma) cell lines. Cells that harbored a p53 mutation responded by up-regulation of telomerase activity after TGF-β1 treatment, whereas cell lines displaying wt p53 responded by down-regulation of telomerase activity. Thus, these results indicate a possible connection between p53 genotype and telomerase response to TGF-β1 treatment. Furthermore, the decreased telomerase activity appeared to be due to transcriptional repression of the hTERT promoter and the increased activity possibly involved hTERT activation via phosphorylation. We have previously shown that IFNs (interferons) sensitize MM (multiple myeloma) cells to Fas-mediated apoptosis. In the present investigation both IFN-α and IFN-γ down regulated telomerase activity in the MM cell line U-266-1970. The mechanism underlying the reduction of telomerase activity by IFN was shown to be transcriptional repression of the hTERT gene. We suggest that one potential mechanism whereby IFN sensitize MM cells to Fas-mediated apoptosis is by repressing hTERT activity at the transcriptional level. In the next study we demonstrated that basal telomerase activity is not a key determinant of sensitivity to cytotoxic drugs in ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) cell lines. Furthermore, we observed no correlation between c-Myc amplification, p53 mutations and high telomerase activity levels in these cell lines. Finally, neuroblastoma cell lines were shown to up-regulate telomerase activity in response to hypoxic exposure and the main regulatory mechanism was not mediated by increased hTERT mRNA expression. This finding might constitute an adaptive stress response of tumor cells exposed to hypoxia.

The Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a ligand-activated transcription factor and member of the basic helix-loop-helix Per/ARNT/Sim (bHLH/PAS) family of chemosensors and developmental regulators. As a member of the PAS domain family of transcription factors responsive to exogenous signals, the AhR exerts influence on many processes relating to cellular fate. The activation of AhR is widely associated with toxic endpoints related to dioxin exposure. However, the AhR also activates endogenous gene programs related to development, cellular growth, and differentiation. The AhR is able to bind a variety of ligands, leading to a wide range of biological outcomes. Recent reports have shown that the AhR can mediate tumor suppressive effects. As a ligand-activated transcription factor, the AhR has the potential to actuate a variety of transcriptional programs that are dependent on the AhR ligand. Our central hypothesis is that AhR ligands can be identified that are capable of initiating tumor suppressive functions of the AhR. We utilized complementary cell-based and in silico virtual screening approaches to identify potential AhR ligands. We developed homology models of the AhR ligand-binding domain (LBD) for virtual ligand screening (VLS) of small molecule libraries. This led to the identification of new AhR ligands 5,7- dihydroxyflavanone!and 5-hydroxy-7-methoxyflavone. Additional small molecule libraries were screened in parallel that led to identification of flutamide as a putative AhR ligand. Flutamide is clinically approved for the treatment of prostate cancer due to its ability to antagonize androgen receptor mediated transcription. We investigated the biological effects of flutamide in AhR positive cancer cells that do not express the androgen receptor and found that flutamide inhibited the growth of HepG2 cells. Suppression of AhR expression reversed the anti-proliferative effects of flutamide. We tested 15 structural analogs of flutamide, including the flutamide metabolite 2-hydroxyflutamide for activation of AhR transcriptional activity. Flutamide is unique in its ability to activate the AhR, and suppresses hepatoma cell growth. These data suggests that flutamide-induced AhR transcriptional activity is required to initiate the tumor suppressive effects. We examined changes in cell cycle checkpoint proteins after flutamide treatment and discovered increased expression of cell cycle inhibitory proteins p27[superscript Kip1] and p15[superscript INK]. We also found that transforming Growth Factor β1 (TGFβ1), which regulates both p27[superscript Kip1] and p15[superscript INK], is upregulated by flutamide. We demonstrate that TGFβ1 is upregulated by flutamide in an AhR-dependent manner and is required for suppression of proliferation by flutamide. We identify specific and unique transcriptional signatures of the AhR upon activation by flutamide, that are distinct from the potent AhR agonist 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). In summary, we characterize flutamide as an AhR ligand and demonstrate its AhR-dependent tumor suppressive effects in hepatoma cells. We provide the first direct evidence that AhR regulates TGFβ signaling in a ligand dependent manner. We demonstrate that the AhR-induced downstream transcriptional signature and subsequent biological effects are specific to the AhR ligand. Our studies have broad impact for characterizing the AhR as a new therapeutic target in hepatocellular carcinoma. / Graduation date: 2013 / Access restricted to the OSU Community at author's request from March 28, 2013 - March 28, 2015

The Polycomb group (PcG) family of proteins form chromatin-modifying complexes essential for embryonic development, and stem cell renewal and are commonly deregulated in cancer. There are several reports that address the possible implication of PcG proteins in tumor progression and metastasis, but very little is known about the specific role of these proteins in tumor progression and invasion. On the other hand, the molecular processes of the worst cancer prognosis, metastasis, which leads to an incurable disease, are yet incompletely elucidated. Here we show a role for Ring1B, a PcG protein, in three processes related to metastasis: in the Epithelial-mesenchymal transition (EMT), a critical morphogenic event that occurs during embryonic development and during the progression of various epithelial tumors, an in the migration and the invasion of mammary epithelial cells. / Las proteínas del grupo Polycomb (PcG) forman complejos modificadores de la cromatina esenciales en el desarrollo embrionario y en la renovación de las células madre, y su desregulación ha sido asociada al cáncer. Varios estudios muestran la posible implicación de las proteínas de PcG en la progresión tumoral y en la metástasis, pero a pesar de ello se sabe muy poco de los procesos moleculares en los que estas proteínas están participando. Por otro lado, los procesos moleculares responsables del peor pronóstico en cáncer, la metástasis, que continua siendo una enfermedad incurable, siguen sin estar completamente elucidados. En esta disertación mostramos el papel de Ring1B, una proteína del PcG, en tres procesos implicados en la metástasis: en la transición epitelio-mesénquima (EMT), un proceso morfogénico crítico en el desarrollo embrionario y durante la progresión de varios cánceres epiteliales, y en la migración y la invasión de las células epiteliales mamarias.

Ο ρινικός πολύποδας (ΡΠ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος του ρινικού βλεννογόνου, η οποία χαρακτηρίζεται από διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, όπως ηωσινόφιλα, λεμφοκύτταρα και πλασμοκύτταρα, τροποποιήσεις στη διαφοροποίηση του επιθηλίου και ανάπλαση ιστού, που περιλαμβάνει υπερπλασία της βασικής μεμβράνης, συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού και οίδημα. Ο παράγοντας αναστολής της μετανάστευσης μακροφάγων (MIF) είναι μία μοναδική κυτταροκίνη με σημαντικό ρόλο στο σηπτικό σόκ και στις χρόνιες φλεγμονώδεις και αυτοάνοσες ασθένειες.Παράγεται από ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα, μακροφάγα αλλά και από ποικιλία άλλων κυττάρων. Εκτός των άλλων, έχει βρεθεί ότι επάγει την έκφραση της IL-6 από διάφορα κύτταρα και ανταγωνίζεται την κατασταλτική επίδραση των γλυκοκορτικοειδών στην έκφρασή της. Απαντάται σε αυξημένα επίπεδα στο ρινικό πολύποδα. Ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β1 (TGF-β1) θεωρείται ένας αντιφλεγμονώδης παράγοντες, ο οποίος ανταγωνίζεται τη δράση της IL-1β και του TNF-α, στην έκφραση της ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3. Διεγείρει επίσης την έκφραση του ΤΙΜΡ-1, του κολλαγόνου τύπου Ι και της IL-6 και λόγω των δράσεών του αυτών εμπλέκεται ισχυρά στις διαδικασίες ίνωσης. Απαντάται σε σημαντικά επίπεδα στο ρινικό πολύποδα. Η IL-6 είναι μία Th2 πολυλειτουργική κυτταροκίνη η οποία εμπλέκεται σε ποικίλες φλεγμονώδεις καταστάσεις. Διεγείρει την ανάπτυξη των ινοβλαστών, αυξάνει τη σύνθεση και εναπόθεση του κολλαγόνου και μειώνει την αποικοδόμησή του. Απαντάται σε αυξημένα επίπεδα στο ρινικό πολύποδα και θεωρείται σημαντικός παθαγενετικός παράγοντας μέσω της επαγωγής του σχηματισμού των πλασμοκυττάρων και της σύνθεσης συστατικών του στρώματος, και της προαγωγής της σύνθεσης και εναπόθεσης κολλαγόνου και της ανάπλασης ιστού. Σκοπός της παρούσης εργασίας είναι η μελέτη της συμβολής του MIF και του TGF-β1 στη παραγωγή της IL-6 από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα, των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται, και η διερεύνηση της πιθανής συνεργειακής δράσης τους στην έκφραση της κυτταροκίνης. Τόσο ο TGF-β1 (0,01-1 ng/ml) όσο και ο MIF (1-100 ng/ml) προκάλεσαν διέγερση της έκφραση της IL-6 σε ινοβλάστες ρινικού πολύποδα κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο, η οποία κατεστάλλει σημαντικά από αναστολέις των ΜΑΡ κινασών και της ΡΙ-3 κινάσης. Ο TGF-β1 (1 ng/ml) προκάλεσε επίσης χρονοεξαρτώμενη αύξηση στα επίπεδα της IL-6 γιά χρόνο επώασης μέχρι 2 ώρες, τα οποιά έμεινα σταθερά στη συνέχεια μέχρι τις 72 ώρες επώασης, επαγωγή της παραγωγής ενδοκυτταρικών ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) με μέγιστο σε δύο χρόνους επώασης 20 και 180 λεπτά, και ενεργοποίηση των ERK κινασών από 15-60 λεπτά επώασης, με μέγιστη ενεργοποίηση στα 30 λεπτά, και στη συνέχεια πτώση στα επίπεδα του μάρτυρα. Ενώ ο MIF σε συγκέντρωση 1-100 ng/ml προκάλεσε μικρή μείωση στην έκφραση της φωσφατάσης-1 των ΜΑΡΚ (ΜΚΡ-1), ο TGF-β1 αντίθετα, σε συγκέντρωση 1 ng/ml προκάλεσε αύξηση στην έκφραση της ΜΚΡ-1 σε δύο χρόνους επώασης 0,5 και 24 ώρες. Μετά από επώαση των ινοβλαστών ρινικού πολύποδα παρουσία TGF-β1 (1 ng/ml) και MIF (100 ng/ml) μαζί, δεν παρατηρήθηκε συνεργειακή επίδραση στην έκφραση της IL-6. Ενώ τόσο ο TGF-β1 όσο και ο MIF προκάλεσαν διέγερση στην έκφραση της IL-6 από ινοβλάστες πνεύμονα, δεν παρατηρήθηκε και πάλι συνεργειακή επίδρασή τους στην έκφραση της κυτταροκίνης αυτής. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι ο MIF, ενώ ανταγωνίζεται την κατασταλτική επίδραση των γλυκοκορτικοειδών στην έκφραση της IL-6 μέσω της ρύθμισης των επιπέδων της ΜΚΡ-1, δεν έχει την ίδια επίδραση στην έκφραση της IL-6 από τον TGF-β1, μέσω ρύθμισης της έκφρασης της φωσφατάσης αυτής. Από την άλλη μεριά η επαγωγή της έκφρασης της ΜΚΡ-1 από τον TGF-β1 φαίνεται να μην επηρεάζει την παραγωγή της IL-6 για μικρούς χρόνους επώασης, μέχρι 2 ώρες, πιθανόν λόγω της ανασταλτικής επίδρασης των ROS, που επάγονται από τον TGF-β1, στη δράση της ΜΚΡ-1, ενώ την επηρεάζει για μεγάλους χρόνους επώασης , εξ ού και τα σταθερά επίπεδα της IL-6 μέχρι και 72 ώρες επώασης. / Nasal polyp (NP) is a chronic inflammatory condition of nasal mucosa, characterized by infiltration of inflammatory cells such as eosinophils, lymphocytes and plasma cells, alterations in epithelial differentiation and tissue reconstruction, involving hyperplasia of basal membrane, accumulation of extracellular material and edema. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a unique cytokine, the role of which in chronic inflammatory and autoimmune diseases and septic shock pathogenesis is very important. MIF is produced by activated T-lymphocytes, macrophages and a plethora of other cells. MIF appears to antagonize the suppressive effect of glucocorticoids as well as induce the expression of IL-6 in multiple cells. High levels of MIF are detected in nasal polyps. Transforming growth factor- β1 (TGF-β1) is an anti-inflammatory factor antagonizing the positive effect of IL-1β and TNF-α on the expression of MMP-1 and MMP-3, TGF-β1 also stimulates the expression of TIMP-1, collagen type I and IL-6; because of these effects, TGF-β1 is involved in the process of fibrosis. TGF-β1 levels in nasal polyps are significantly elevated. IL-6 is a cytokine participating in Th2 response and consequently is involved in a subset of inflammatory reactions. IL-6 stimulates the growth of fibroblasts, increases the production and deposition of collagen and it decreases its degradation. IL-6 is found in nasal polyps at elevated levels and it is thought to be an important pathogenic factor acting mainly in tissue reconstruction, stimulation of plasma cell differentiation, production of stromal material, promotion of collagen synthesis and deposition. The purpose of this paper is to study the effect of MIF and TGF-β1 in IL-6 production by fibroblasts isolated from nasal polyps, dissect the signaling pathways involved, and investigate their synergistic effect on the production of IL-6. Both TGF-β1 (0, 01-1 ng/ml) and MIF (1-100 ng/ml) induced IL-6 expression in nasal polyp fibroblasts in a dose-dependent manner. This effect was significantly suppressed by inhibitors of MAP and PI-3 kinase pathways. TGF-β1 (1 ng/ml) also induced IL-6 expression within 2 hours of administration. Elevated IL-6 levels remained unchanged for 72h further. TGF-β1 also promoted the production of intracellular reactive oxygen species (ROS), which peaked in 20 and 180 minutes and the activation of ERK kinase, peaked in 30 minutes. While MIF, at a concentration of 1-100 ng/ml, caused a slight decrease in the expression of phospatase-1 of MAPK (MKP-1), TGF-β1, at a concentration of 1 ng/ml, increased the expression of MKP-1. No synergistic effect on IL-6 expression was detected after incubating nasal polyp and lung fibroblasts together with TGF-β1 (1 ng/ml) and MIF (100 ng/ml). In conclusion, while MIF antagonizes the suppressive effect of glucocorticoids on the expression of IL-6 by regulating the levels of MKP-1, it fails to antagonize the TGF-β1 inducing effect on IL-6 via MKP-1. The induction of MKP-1expression by TGF-β1 is not affecting the production of IL-6 after short incubation periods; this effect can be explained by the inhibitory effect of TGF-β1 induced ROS on MKP-1. After prolong incubation with TGF-β1 (up to 72 hours), IL-6 levels remain elevated.

Η Ιδιοπαθής Μεμβρανώδης Σπειραματονεφρίτιδα (ΙΜΣ) ή νεφροπάθεια, η πιο συχνή αιτία νεφρωσικού συνδρόμου στους ενήλικες, συνήθως αντιμετωπίζεται με τη χορήγηση κορτικοειδών και κυτταροτοξικών φαρμάκων ή κυκλοσπορίνης (cyclosporine-A, CsA). Σκοπός της μελέτης ήταν η εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της μακροχρόνιας χορήγησης CsA στην πρόκληση ύφεσης του νεφρωσικού συνδρόμου και των ιστολογικών αλλοιώσεων σε επαναληπτικές βιοψίες νεφρού μετά τη χορήγηση του δυνητικά νεφροτοξικού αυτού φαρμάκου. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η αποτελεσματικότητα του Mycophenolate Mofetil (MMF) ως σχήματος θεραπείας της ΙΜΣ σε μικρό αριθμό ασθενών και η προγνωστική αξία των επιπέδων του αυξητικού παράγοντα TGF-β1 στα ούρα και στο πλάσμα ως δεικτών εξέλιξης της νόσου. Μελετήθηκαν 32 ασθενείς με ΙΜΣ οι οποίοι εμφάνιζαν νεφρωσικό σύνδρομο και είχαν ικανοποιητική νεφρική λειτουργία κατά τη διάγνωση της νόσου και στους οποίους χορηγήθηκε συνδυασμός πρεδνιζολόνης και CsA. Παρατηρήθηκε πλήρης ύφεση του νεφρωσικού συνδρόμου σε 18 (56%) και μερική ύφεση σε 10 ασθενείς (31%) μετά από 12 μήνες θεραπείας (συνολικά στο 87% των ασθενών). Επεισόδια υποτροπών παρατηρήθηκαν στο 39% και 60% των ασθενών με πλήρη ή μερική ύφεση αντίστοιχα, και πολλαπλές υποτροπές στο 25% των ασθενών, οι οποίοι παρουσίασαν βαθμιαία μείωση της απαντητικότητας στη CsA και επιδείνωση της νεφρικής λειτουργίας. Επαναληπτική βιοψία νεφρού έγινε σε 18 ασθενείς με ύφεση του νεφρωσικού συνδρόμου μετά από 24 μήνες θεραπείας για να εκτιμηθεί η δραστηριότητα της νόσου και οι πιθανές ιστολογικές αλλοιώσεις σε πλαίσια τοξικότητας από κυκλοσπορίνη. Στις επαναληπτικές βιοψίες παρατηρήθηκαν: εξέλιξη του σταδίου της νόσου, επιδείνωση της σπειραματοσκλήρυνσης και της διαμεσοσωληναριακής βλάβης στο 60% των ασθενών. Δεν παρατηρήθηκαν χαρακτηριστικές αλλοιώσεις νεφροτοξικότητας από την κυκλοσπορίνη. Η βαρύτητα των ιστολογικών αλλαγών συσχετίστηκε με το χρονικό διάστημα που είχε παρέλθει από την πρώτη βιοψία νεφρού (r = 0.452, p < 0.05) και θεωρήθηκε ως φυσική εξέλιξη της νόσου. Ικανοποιητικά αποτελέσματα διαπιστώθηκαν από τη χορήγηση Mycophenolate Mofetil σε 6 ασθενείς με ΙΜΣ, στους οποίους το MMF χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με μικρή δόση πρεδνιζολόνης, είτε λόγω ανθεκτικότητας του νεφρωσικού συνδρόμου στην CsA, είτε ως αρχική θεραπεία σε περιπτώσεις αντένδειξης στην χορήγηση CsA. Ύφεση του νεφρωσικού συνδρόμου παρατηρήθηκε σε 4 από τους 6 ασθενείς. Τα επίπεδα του TGF-β1 στα ούρα ασθενών με ΙΜΣ και λευκωματουρία ήταν σημαντικά υψηλότερα συγκριτικά με αυτά υγιών εθελοντών και ασθενών με άλλες σπειραματοπάθειες που δεν παρουσίαζαν λευκωματουρία και μειώθηκαν σημαντικά μετά από χορήγηση κορτικοειδών και κυκλοσπορίνης. Η συγκέντρωση του TGF-β1 στο πλάσμα δε διέφερε σημαντικά μεταξύ υγιών εθελοντών και ασθενών με ΙΜΣ και νεφρωσικό σύνδρομο, καθώς και μεταξύ ασθενών με ή χωρίς ύφεση της λευκωματουρίας μετά από τη θεραπευτική αγωγή. / Idiopathic membranous nephropathy (IMN), the most common cause of nephrotic syndrome in adults, is usually treated with a combination of corticosteroids with cytotoxic drugs or cyclosporin A (CsA). The aim of this study was the estimation of the effectiveness of long-term use of CsA in the remission and relapse rate of nephrotic syndrome along with histological changes in repeat renal biopsies after treatment with this potentially nephrotoxic drug, and the evaluation of Mycophenolate Mofetil (MMF) as a treatment regimen for IMN. In addition, urinary and plasma TGF-β1 levels were evaluated as markers of progression of kidney disease. Thirty-two nephrotic patients with well-preserved renal function treated by prednisolone and CsA were studied. Complete remission of nephrotic syndrome was observed in 18 (56%) and partial remission in 10 patients (31%) after 12 months of treatment (total 87%). Relapses were observed in 39% and 60% of patients with complete and partial remission, respectively, and multiple relapses in 25% of patients, who showed gradual unresponsiveness to CsA and decline of renal function. A repeat biopsy was performed in 18 patients with remission of nephrotic syndrome, after 24 months of treatment, to estimate the activity of the disease and features of CsA toxicity. Progression of the stage of the disease, more severe glomerulosclerosis and tubulointerstitial injury were recognized in 60% of patients in repeat renal biopsies. Features of CsA nephrotoxicity were not observed. The severity of histological changes was related to the time elapsed from the first biopsy (r = 0.452, P < 0.05). MMF was proved effective in a small number of nephrotic patients with IMN and well-preserved renal function. MMF in combination with small dose of prednisolone was given in 6 patients with either persistent nephrotic syndrome to CsA or as initial therapy because of contraindication to CsA administration. Remission of nephrotic syndrome was observed in 4 out of 6 MMF treated patients. Urinary and plasma TGF-β1 levels were examined as markers of progression of the disease. TGF-β1 levels in the urine of patients with proteinuria were significantly higher compared with those of healthy individuals and patients with other types of nephropathy without proteinuria. Furthermore, urinary TGF-β1 of nephrotic patients with membranous nephropathy significantly reduced after treatment with CsA and corticosteroids. Plasma TGF-β1 levels showed no difference between patients and healthy subjects as well as between patients with and without remission of proteinuria after treatment.

Les glandes salivaires sont des glandes mixtes : la salive (produit exocrine) estimpliquée dans le maintien de l'homéostasie buccale alors que les secrétions endocrines (ex :facteurs de croissance) ont un rôle physiologique (gamétogénèse, ostéogenèse,hypertension...) Chez les mammifères, elles affichent un dimorphisme sexuel qui laisseentrevoir une sensibilité éventuelle à des xeno-hormones.Ce mémoire présente l'action de la génistéine (phyto-oestrogène) et/ou de la vinclozoline(anti-androgène) sur la glande submandibulaire (SM) de rat lors d'une exposition précoce viala mère (gestation-lactation) et lors d'une exposition pendant la période de croissance (dusevrage à l'âge adulte). Les glandes SM, prélevées au stade immature et jeune adulte, ont faitl'objet d'une analyse histologique et d'une étude de marqueurs moléculaire des fonctionsendocrines et exocrines associées aux processus gustatifs. L'exposition précoce ralenti ledéveloppement de la glande SM et augmente sélectivement la préférence au sucré des malesimmatures mais pas des adultes ; l'analyse moléculaire révèle une action sélective sur lesfonctions exocrines corrélée à celle sur les préférences, ainsi qu'une action sur les fonctionsendocrines (facteurs de croissances) qui s'inverse avec l'âge. L'exposition à partir du sevrageperturbe seulement les mâles qui présentent des altérations des structures sécrétrices coupléesà des modifications d'expression des récepteurs hormonaux et facteurs de croissance, maisaussi au taux sérique de l'EGF.Cette étude identifie la glande submandibulaire comme cible de perturbateurs endocriniens etpose la question des conséquences physiologiques à terme

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie de forte incidence affectant les articulations. Elle est caractérisée principalement par une dégradation du cartilage articulaire, un déséquilibre au niveau du remodelage osseux et une sclérose de l’os sous-chondral. L’étiologie de cette pathologie reste encore méconnue, cependant il semble de plus en plus que tous les tissus composant l’articulation soient affectés dans cette pathologie. L’importance du rôle de l’os dans le développement de l’OA est incontestable et représente donc une cible thérapeuthique intéressante. Des études effectuées par tomodensitométrie ont démontré une structure et une organisation anormales du tissu osseux des patients OA. Parallèlement, les cultures primaires d’ostéoblastes (Ob) humains OA issus de l’os sous-chondral démontrent un phénotype altéré et une faible minéralisation in vitro. La signalisation Wnt, essentielle dans l’embryogenèse, a montré avoir un rôle clé dans la régulation de l’ostéogenèse en régulant notamment la différenciation terminale des Ob. Le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1), un facteur agissant notamment sur la prolifération et sur le début de la différenciation des Ob, est surexprimé par les Ob OA et pourrait moduler cette signalisation. Aussi, deux populations de patients OA peuvent être différenciées in vitro par la production de prostaglandines E2 (PGE2) par leurs Ob et les PGE2, dans une étude sur le cancer colorectal, ont montré moduler la signalisation Wnt. Notre hypothèse de travail est que l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine est diminuée dans les Ob OA. Cette diminution est responsable de la sous-minéralisation et de l’altération du phénotype des Ob humains OA. Par ailleurs, DKK2, dont l’expression est contrôlée par TGF-β1, est responsable de la diminution de l’activité Wnt/β-caténine et les PGE2 peuvent en partie corriger cette situation. L’objectif général de cette étude est d’une part, de démontrer le rôle de TGF-β1, DKK2 et de PGE2 sur l’altération de la signalisation Wnt/β-caténine et d’autre part, de démontrer le lien entre TGF-β1 et DKK2 et l’effet de ces derniers sur le phénotype des Ob. Dans cette étude on a montré que la signalisation canonique Wnt est altérée dans les Ob OA et que cela était responsable de l’altération du phénotype des Ob OA. On a montré, parmi les acteurs de la signalisation Wnt, que l’expression de l’antagoniste Dickkopf-1 (DKK1) était relativement similaire entre les Ob OA et normaux contrairement à celle de l’antagoniste DKK2 qui était augmentée et à celle de l’agoniste Wnt7B qui était diminuée dans les Ob OA. On a également montré que les PGE2 pouvaient potentialiser l’activité de la signalisation Wnt dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 a permis d’augmenter l’activité de la signalisation Wnt et de corriger le phénotype anormal ainsi que d’augmenter la minéralisation des Ob OA. L’inhibition de TGF-β1, un facteur aussi surexprimé dans les Ob OA, a également permis la correction du phénotype et l’augmentation de la minéralisation dans les Ob OA. L’inhibition de TGF-β1 a aussi menée à l’inhibition de DKK2. Le contraire ne fût pas observé démontrant ainsi la régulation de DKK2 par TGF-β1. En conclusion, la signalisation canonique Wnt est diminuée dans les Ob OA et cela est dû au niveau élevé de DKK2 dans ces Ob. TGF-β1 régule positivement DKK2 et donc la surexpression de TGF-β1 entraîne celle de DKK2 ce qui a pour conséquences d’altérer le phénotype des Ob. Les PGE2 ont aussi montré pouvoir potentialiser l’activité de la signalisation Wnt et auraient donc un rôle positif. Ensemble, ces données suggèrent que ces altérations au niveau des Ob OA pourraient être responsables de la structure osseuse anormale observée chez les patients OA. / Osteoarthritis (OA) is a disease affecting joints and it has a very strong incidence in the population. It is characterized by articular cartilage degradation, an abnormal bone remodelling cycle and subchondral bone sclerosis. The aetiology of this disease is still unknown although OA is now considered as a joint disease involving all the tissues of the joint. The importance of bone in OA pathogenesis is now considered as fundamental and thus bone represent an interesting target for treatments. Tomodensitometric studies have shown an abnormal structure and organisation of the bone tissue of OA patients. In parallel, primary human OA osteoblast (Ob) cultures grown from the tibiofemoral subchondral bone show an abnormal phenotype and a reduced mineralization in vitro. The Wnt signalling pathway, known primarily for its important role in embryogenesis, is of utmost importance in osteogenesis and it has been shown to regulate terminal Ob differentiation. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1), known to act on proliferation and on early phases of the differentiation of Ob, is overexpressed by OA Ob and could also modulate the Wnt signalling activity. Furthermore, two populations of OA patients can be discriminated in vitro by the production of prostaglandins E2 (PGE2) of their Ob. In a study on colorectal cancer, PGE2 was shown to modulate the canonical Wnt signalling pathway. Our hypothesis is that canonical Wnt signalling is diminished in OA Ob. This reduction is responsible for the poor mineralization and the abnormal phenotype of human OA Ob. Furthermore, DKK2, overexpressed in OA Ob and whose expression is controlled by TGF-β1, is responsible for the diminution of Wnt signalling activity, and PGE2 can partly correct this situation. The general goal of this study is twofold: 1) to demonstrate the role of TGF-β1, DKK2 and of PGE2 in the Wnt signalling activity; 2) to demonstrate the link between TGF-β1 and DKK2 and their effect on the abnormal OA Ob phenotype. We have shown in this study that the canonical Wnt signalling pathway is altered in OA Ob and that this was responsible for the altered phenotype observed in OA Ob. Also, we have shown that among the mediators of the Wnt signalling pathway, the expression of antagonist Dickkopf-1 (DKK1) was similar between OA and normal Ob. In contrast, the antagonist DKK2 was overexpressed and the expression of the agonist Wnt7B was low in OA Ob. Moreover, PGE2 increased Wnt signalling activity in OA Ob. The inhibition of DKK2 expression also increased Wnt signalling activity and corrected the abnormal phenotype along with increasing the mineralization of OA Ob. The inhibition of TGF-β1 expression, also overexpressed in OA Ob, also resulted in the correction of the phenotype and increased the mineralization of OA Ob. Inhibiting TGF-β1 expression also led to DKK2 inhibition. As the contrary was not observed, this demonstrated that TGF-β1 could regulate DKK2 expression. To conclude, Wnt signalling is reduced in OA Ob and this is due to elevated DKK2 levels in these cells. High levels of TGF-β1 in OA Ob increased DKK2 expression which could be responsible, at least partially, for their altered phenotype. PGE2 was shown to also increase Wnt signalling activity in OA Ob. Taken together these data suggest that such alterations in OA Ob could be responsible for the abnormal bone structure observed in OA patients.

The TGFβ family of cytokines are potent signalling molecules that regulate tissue development, inflammation and immunity. Previous studies in mice with a null mutation in the Tgfb1 gene (TGFβ1-/- mice) implicate a key role for TGFβ1 in male reproductive function. These mice show profound infertility due to an inability to copulate successfully, associated with reduced testosterone and sperm production. The focus of this project was to 1) further characterize mechanisms underpinning reproductive deficiency in male TGFβ1-/- mice, 2) identify a reliable physiological marker of TGFβ1 availability in vivo, and 3) to determine whether exogenous TGFβ1 administration influences TGFβ1 availability and restores fertility. To investigate the causes of unsuccessful copulation by TGFβ1-/- mice, penis morphometry was examined. Penile organ structure, as assessed by scanning electron microscopy, was comparable between genotypes however a superfluous epidermal covering that impeded penile spine protrusion was evident in TGFβ1-/- mice. The epidermal covering was not due to increased epithelial cell proliferation, as measured by Brdu labelling and immunohistology. Behavioural observations of erectile activity showed that TGFβ1-/- mice achieved spontaneous erections albeit at reduced frequency compared to TGFβ1+/+ mice. The efficacy of exogenous TGFβ1 replacement was evaluated by first identifying measures of in vivo TGFβ1 availability and/or function and selecting an effective route of administration. Serum TGFβ1 and testosterone levels were reliable discriminators of TGFβ1 genotype. Gene expression and phagocytic function of peritoneal macrophages revealed no differences between genotypes. Exogenous sources of TGFβ1 for replacement studies included colostrum, naturally occurring in breast milk and recombinant human latent TGFβ1 (rhLTGFβ1). Colostrum did not increase circulating levels and rhTGFβ1 injection caused only transient elevation of serum levels. Thus mini-osmotic pumps were used to deliver a constant supply of cytokine to TGFβ1-/- mice. The fertility status of TGFβ1-/- mice receiving exogenous TGFβ1 was investigated. Reproductive behaviour in response to normal receptive female mice was assessed twice during treatment, on day 7 and day 14. Blood, liver and reproductive tissues were collected at sacrifice. Circulating TGFβ1 was increased in TGFβ1 treated TGFβ1-/- mice above TGFβ1-/- control levels, although this did not affect circulating testosterone. Erectile activity and sperm production were unchanged. Videotaping behaviour with estrous females revealed that the TGFβ1+/+ mice successfully mounted and intromitted, unlike the TGFβ1-/- controls. The TGFβ1-/- mice receiving exogenous TGFβ1 displayed moderately enhanced mounting and intromission behaviour although this remained less frequent than in the TGFβ1+/+ controls. Ejaculation behaviour was not observed in any TGFβ1-/- mice regardless of TGFβ1 replacement, compared to TGFβ1+/+ controls where >90% mice displayed ejaculated. Modest improvement in the copulation activity of the TGFβ1-/- mice receiving exogenous TGFβ1 suggests that systemic TGFβ1 availability can influence reproductive performance in male TGFβ1-/- mice. However since fertility was not restored, locally produced TGFβ1 in the reproductive tract and/or hypothalamic pituitary axis are also implicated in regulating fertility. These findings advance our knowledge of the role of the TGFβ1 cytokine in male reproductive physiology and may have relevance for devising new treatments for infertility and erectile dysfunction in men. / Thesis (Ph.D.) - University of Adelaide, School of Paediatrics and Reproductive Health, 2008