[EN] Citrus is a diverse genus within the Aurantioideae subfamily that comprises an undetermined number of pure species natively found in a vast territory extending from India to Japan and Australia. Besides pure species, countless citrus admixtures of commercial interest such as mandarins, oranges and lemons have been traditionally included in this genus, even though they are the product of several interspecific crosses between pure species. Recently, a genome-wide analysis provided the backbone of the Citrus phylogeny, showing that the wild species diverged from an ancestral citrus in a rapid radiation during the Late Miocene. Understanding the processes that shaped the evolution and domestication of the genus will provide novel insights in the field of plant genome evolution. In this doctoral thesis, multiple genomic approaches have been used to expand the existing knowledge on major determinants driving the processes of evolution, diversification and domestication in Citrus. First, a genome-wide Aurantioideae phylogeny was generated, revealing the existence of several independent dispersal events in this subfamily in the last 10 million years, from Asia to Africa and Australia, and rooting the Citrus genus within this subfamily. The Citrus phylogeny was then studied under the multispecies coalescent model, which can capture the variability generated during fast radiations. The dating of the speciation events allowed to advance original proposals on the paleogeographic events triggering the migration of the Citrus species through the South East Asian region. The Citrus radiation generated the great genetic and phenotypic diversity found in this genus. To investigate the effects of the Late Miocene climate change on the genomic structure of the Citrus pure species, the activity and evolution of retrotransposons, which can significantly alter the genome of their hosts, was analyzed. Most of the Citrus retrotransposon families are shared with Severinia buxifolia, an Aurantioideae species that diverged from Citrus more than 10 million years ago, implying that few retrotransposon families are specific to the genus Citrus. However, estimations of the retrotransposon insertion rates within Citrus revealed that, shortly after the radiation, the transposon activity rapidly changed among the different species. Hence, the data indicates that retrotransposon dynamics are linked to the stress caused by the Late Miocene climate change and the Citrus speciation, although specific responses likely depend on the particular evolutionary history of each species. The differences of gene expression in fruits of domesticated and wild cultivars were then studied to understand the role of interspecific hybridizations during Citrus domestication. The results presented suggest that these events, together with asexual propagation, were key for the domestication process. Different mechanisms explaining commercially relevant Citrus traits are also proposed. For example, pulp acidity in citrons and lemons is linked to an increased proton influx to the pulp vacuoles. The data also indicate that the peel pigmentation might be controlled by the additive effect of several minor genes, and not by a single gene or mechanism. Finally, an allele-dependent expression pattern of a chalcone synthase, involved in the flavonoid biosynthesis, advocates for the existence of a stepwise evolution in the mandarin flavonoid accumulation. All in all, the transcriptomic approach used in this work allowed to generate broader hypotheses that stand from a genus-wide perspective. Overall, the results provide a comprehensive framework of Citrus phylogenetic relationships, the effect of the mobile elements during its diversification and the role of interspecific hybridizations in the citrus domestication. The insights here exposed reveal the inherent complexity of the evolutionary history of this fascinating genus. / [ES] El género Citrus (Aurantioideae) abarca un número desconocido de especies puras, nativas en buena parte del sudeste asiático y Oceanía. Muchas variedades comerciales, como mandarinas o naranjas, también forman parte de este género. Recientemente, la estructura de la filogenia del género Citrus ha sido publicada en un estudio el que se propone que los cítricos actuales surgieron en un proceso de radiación rápida durante el Mioceno tardío, hace 8 millones de años. Una mejor comprensión de los procesos involucrados en la evolución y posterior domesticación del género Citrus proporcionaría nuevas perspectivas en el ámbito de la genómica de plantas. En esta Tesis Doctoral se han empleado diversas estrategias genómicas para ampliar el conocimiento existente sobre los procesos implicados en la evolución, diversificación y domesticación de los cítricos. En primer lugar, se generó un árbol filogenético de las Aurantioideae, anclando el género Citrus dentro esta subfamilia. Esta filogenia reveló varios eventos de dispersión entre estas especies, generalmente desde Asia hacia África u Oceanía. Después, se estudió la filogenia del género Citrus empleando el modelo coalescente de multiespecie, que refleja la variabilidad inherente a los procesos de radiación. La datación de los distintos eventos de especiación ha permitido hacer nuevas propuestas sobre la paleogeografía y su papel en la distribución actual de los cítricos a lo largo del sudeste asiático. Para investigar los efectos del cambio climático del Mioceno tardío en el genoma de los cítricos, se analizó la actividad y la evolución de los retrotransposones como fuente de variabilidad genética en distintas especies de cítricos. Muchos de los retrotransposones de los cítricos también se encuentran en Severinia¿ un género de las aurantioideas que divergió del ancestro de los cítricos hace 10 millones de años, sugiriendo que pocos de los retrotransposones de cítricos son exclusivos de este género. En cambio, las tasas de inserción de retrotransposones en cítricos revelaron que la actividad de estos elementos cambió drásticamente entre especies poco después de la radiación de los cítricos. Por tanto, es posible que dicha actividad esté ligada al estrés climático durante el Mioceno tardío, así como a la especiación de los cítricos, aunque también parece verse afectada por las condiciones evolutivas particulares de las especies estudiadas. Por último, se estudiaron las diferencias en la expresión génica entre variedades domesticadas y especies salvajes para conocer el papel de las hibridaciones interespecíficas en la domesticación de los cítricos. Los resultados obtenidos sugieren que dichas hibridaciones, junto a la propagación clonal, fueron clave para el proceso de domesticación. Estos resultados también permiten proponer un mecanismo que explica la acidez de la pulpa de cidros y limones basado en el flujo de protones al lumen vacuolar. Los datos también parecen indicar que el color de los cítricos no depende de un único gen, sino que depende del efecto aditivo de varios genes en conjunto. Finalmente, se descubrió una copia del gen de la chalcona sintasa, necesario para la síntesis de flavonoides, que tan solo se expresa en mandarinas y variedades derivadas, lo que sugiere que la acumulación de flavonoides en estas variedades proviene de un proceso evolutivo escalonado. La obtención de estos resultados fue posible gracias a la estrategia de análisis transcriptómico escogida, que abarca varias especies del género Citrus. En conclusión, los resultados presentados en este trabajo aportan un marco de trabajo global en la filogenia del género Citrus, además de realizar nuevas propuestas sobre el efecto de los elementos móviles en la diversificación de los cítricos y el papel de las hibridaciones interespecíficas durante su domesticación. Los datos presentados en este trabajo revelan la compl / [CAT] El gènere Citrus (Aurantioideae) comprèn un nombre desconegut d'espècies pures, natives en un ampli territori que s'estén pel sud-est asiàtic i Oceania. Un gran nombre de varietats comercials de cítrics, com mandarines, taronges o llimes, també s'inclouen dins del gènere Citrus. L'estructura bàsica de la filogènia del gènere Citrus ha sigut publicada recentment, a un estudi al que es proposa que els cítrics actuals sorgiren en un procés de radiació ràpida que va tindre lloc en el Miocè superior, fa 8 milions d'anys. Una millor comprensió dels processos involucrats en l'evolució i posterior domesticació del gènere Citrus podria proporcionar noves perspectives dins de l'àmbit de l'evolució del genoma de plantes. Al llarg d'aquesta Tesi Doctoral s'han emprat diverses estratègies genòmiques per a ampliar el coneixement existent sobre els processos que van dirigir l'evolució, diversificació i domesticació dels cítrics. En primer lloc, es va generar una filogènia de les aurantioideas, ancorant el gènere Citrus dins d'aquesta subfamília. Esta filogènia va revelar l'existència de diversos esdeveniments de dispersió en estes espècies, generalment des d'Àsia cap a Àfrica o Oceania. Després, la filogènia dels cítrics es va estudiar emprant el model evolutiu coalescent multiespècie, que reflecteix la variabilitat inherent als processos de radiació ràpida. La datació de la especiació dels cítrics han permès fer noves propostes sobre la paleografia i el seu paper en la distribució actual dels cítrics per tot el sud-est asiàtic. Per a investigar els efectes del canvi climàtic ocorregut durant el Miocè superior en l'estructura genòmica dels cítrics, s'analitzà l'activitat i evolució dels retrotransposons com a font de variabilitat genètica en distintes espècies de cítrics. La majoria dels retrotransposons dels cítrics també es troben en Severinia¿ un gènere de les aurantioidees que va divergir de l'avantpassat dels cítrics fa 10 milions d'anys, la qual cosa suggereix que tan sols unes poques famílies de retrotransposons son exclusives dels cítrics. En canvi, l'estimació de les taxes d'inserció dels retrotransposons revela que l'activitat d'aquests elements va patir canvis dràstics entre espècies poc després de la radiació dels cítrics. Per tant, l'esmenada activitat podria estar lligada a l'estrès climàtic de finals del Miocé, així com a l'especiació dels cítrics, encara que també sembla veure's afectada per les condicions evolutives particulars de cada espècie. Finalment, es van estudiar les diferències a l'expressió gènica entre varietats domesticades i espècies salvatges per a conèixer el paper de les hibridacions interespecífiques en el procés de domesticació dels cítrics. Els resultats suggereixen que aquestes hibridacions, junt a la propagació clonal de les varietats de interès, foren clau en la domesticació. Els resultats també han permès proposar un mecanisme que explica l'acidesa de la polpa de poncems i llimes basat en el flux de protons al lumen vacuolar. D'altra banda, el color dels cítrics no pareix dependre d'un únic gen, sinó de l'efecte additiu de diversos gens en conjunt. Finalment, s'ha trobat una còpia del gen de la chalcona sintasa, necessària per a la síntesi de flavonoides, que tan sols s'expressa en mandarines i varietats derivades, suggerint que l'acumulació de flavonoides en aquestes varietats és el resultat d'un procés evolutiu escalonat. L'obtenció d'aquests resultats fou possible gràcies a l'estratègia d'anàlisi escollida, que inclou diverses espècies del gènere Citrus. En conclusió, els resultats presentats en aquest treball aporten un marc de treball global a la filogènia dels cítrics, a banda de permetre realitzar noves propostes sobre el efecte dels elements mòbils en la diversificació dels cítrics i el paper de les hibridacions interespecífiques durant la seua domesticació. Les dades presenta / Borredá Fernández, C. (2021). A genomic approach to the evolution, diversification and domestication of the genus Citrus [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176003

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común de nuestra sociedad tras el de Alzheimer. Se caracteriza por una disminución de los niveles del neurotransmisor dopamina asociada a la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra del mesencéfalo, proceso que sucede de forma análoga en las células dopaminérgicas de la retina, el subtipo de células amacrinas A18. En consecuencia, además de las múltiples deficiencias motoras y cognitivas que conlleva esta enfermedad, también se han observado alteraciones, a nivel morfológico y fisiológico, en la retina de enfermos de Parkinson y animales modelo de esta enfermedad. Dichas alteraciones incluyen deficiencias en la agudeza visual, sensibilidad al contraste, percepción del color y adaptación a la oscuridad, así como en la detección del movimiento. Sin embargo, se hace necesario esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes a esta patología en la retina con el fin de facilitar el diagnóstico molecular y la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas. En esta Tesis Doctoral se ha analizado la expresión génica y el patrón de distribución en la retina de distintos mamíferos, desde roedores hasta la especie humana, de dos proteínas de elevada relevancia en la enfermedad de Parkinson, denominadas parkina y UCH-L1, dos importantes componentes del sistema ubicuitina-proteasoma, implicado en la homeostasis proteica celular. En este contexto, se han revisado en profundidad los componentes que integran este sistema en la retina, junto a su papel en el desarrollo y función de este tejido en condiciones fisiológicas y sus alteraciones en condiciones patológicas. Por otra parte, se ha estudiado el patrón de procesamiento ('splicing') alternativo del ARNm del gen PARK2, el cual codifica la proteína parkina, en la retina de mamíferos en condiciones fisiológicas, proceso cuya desregulación está implicada en el desarrollo y progresión de diversas patologías que afectan a la retina, incluida la enfermedad de Parkinson. Adicionalmente, se han investigado las alteraciones a nivel proteico en la retina de monos parkinsonianos tratados con el compuesto neurotóxico MPTP, mediante técnicas de proteómica. Finalmente, se han catalogado y cuantificado todos los genes expresados en la retina adulta humana mediante secuenciación masiva del transcriptoma (RNA-Seq), con especial énfasis en aquellos relacionados con enfermedades neurodegenerativas que afectan a la retina. En conclusión, en esta Tesis Doctoral se ha abordado mediante diferentes aproximaciones experimentales en la retina de mamíferos el estudio de la expresión de los genes y proteínas relacionados con enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central que cursan con alteraciones en la estructura y función de la retina.

Muchos productos hortofrutícolas desarrollan 'daños de frío' durante la conservación a temperaturas inferiores a 12-15 ºC. El tratamiento de 'curado' (3 días 37 ºC) previene la aparición de esta alteración en los frutos cítricos cuando se conservan a 2 ºC. En la mandarina 'Fortune', muy susceptible al frío, los daños se manifiestan como un picado y áreas de color pardo en la parte más externa de la corteza (flavedo). Otra de las alteraciones frecuentes en la postcosecha de los frutos cítricos es el 'colapso de la corteza', que se produce a temperaturas superiores a las que causan 'daños de frío' y cuyos síntomas se caracterizan por la aparición de depresiones en la piel. El acondicionamiento de frutos de 'Navelate' durante 4 días con 10 ?L L-1 de etileno a 22 ºC y 90-95% de humedad relativa (HR) redujo notablemente la incidencia de esta alteración, mientras que la aplicación de 1 ?L L-1 de 1-metilciclopropeno (1-MCP), un inhibidor de la percepción de etileno, la potenció. Para entender los mecanismos asociados al efecto beneficioso del curado reduciendo el 'daño de frío' y del etileno frente al 'colapso de la corteza', se han evaluado cambios globales en la expresión génica en el flavedo de frutos de mandarina 'Fortune' almacenados a 2 ºC, directamente o después del curado, y en el flavedo y albedo de frutos de naranja 'Navelate' almacenados a 22 ºC y 90-95% de HR después de ser tratados con etileno o 1-MCP. Para ello se han empleado dos micromatrices de cDNA generadas en el Consorcio de Genómica Funcional de Cítricos (CFGP). La eficacia del curado reduciendo la incidencia de 'daños de frío' parece estar más relacionada con su efecto evitando la inducción de genes implicados en la degradación de lípidos durante el almacenamiento en frío, que con cambios en la expresión de genes del metabolismo de ácidos grasos que afectan al grado de insaturación de los mismos o a la síntesis de ceras. Además, la expresión de genes del metabolismo de fenilpropanoides, y de otros que / Establés Ortiz, BA. (2008). Estudio transcriptómico de los mecanismos implicados en la tolerancia inducida por el curado al daño de frío y por el etileno al colapso de la corteza en los frutos cítricos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3782

Tesis por compendio / [EN] The reduction of agricultural biodiversity is a serious problem for our agriculture. Increasingly fewer species are cultivated, and these are also increasingly homogeneous. The introduction of new crops for the horticultural diversification is one of the activities that can be implemented to minimize the impact of this variability loss. In this regard, pepino (Solanum muricatum) is a crop that may be of interest to our horticulture and neighboring markets. It is a species of Andean origin, usually propagated vegetatively, and that can be grown in the Mediterranean area. The pepino is used for its juicy, sweet and aromatic fruits, which in addition presents significant amounts of beneficial compounds for health. The COMAV genebank has a collection of pepino and wild relatives accessions. At present, morphological descriptors are available for proper characterization of these materials, but it was necessary to develop phenological descriptors as the ones presented in this work. In particular, the BBCH scale developed in this thesis is a key that allow us to describe and define the various stages of phenological development in the species, displaying numerous applications. On the other hand, a correct characterization of the accessions preserved in the genebank was necessary. For this reason, and in addition to carrying out a morphological characterization, a molecular characterization using SSR markers derived from tomato was performed. In this case, the benefit of the genetic proximity between the two species allowed us to transfer the tomato markers (widely studied species) to pepino, allowing us to differentiate morphologically and molecularly the wild species from the cultivated one, and within the latter, differentiate modern and traditional types. A limitation in the study of the genetics of pepino was the small number of DNA sequences available in the databases. For this reason, we sequenced the transcriptome of a variety of pepino (Sweet Long) as well as the species that is considered the wild ancestor of the pepino, S. caripense. The sequencing and subsequent assembly of the transcriptome has allowed an initial comparative analysis between pepino and its closely related species, tomato and potato, a phylogenetic study of cultivated Solanaceae, a comparative analysis of some genes of agronomic interest, and the massive development of molecular markers. Because of the potential nutraceutical properties of the pepino fruit, we decided to perform a characterization using the previously studied collection. We have evaluated the dry matter, protein, antioxidants, pigments and minerals contents. On the other hand, considering that polyphenols are one of the most important antioxidant compounds, we conducted a study trying to elucidate the profile of polyphenols and their antioxidant activity in four pepino and one S. caripense entries. We also measured the effect of the pepino extracts on macrophage cells subjected to oxidative stress. The results obtained revealed a significant reduction in nitric oxide production, which indicates the existence of an anti-inflammatory effect. These beneficial properties of pepino are its main strength and, together with a high organoleptic quality and good promotion can encourage the introduction and development of this crop. In summary, in this thesis we have obtained relevant information about the diversity of pepino and we have studied its phenological, morphological, molecular, genomic, nutritional and nutraceutical characteristics. / [ES] La reducción en la diversidad agrícola es un problema grave en nuestra agricultura. Cada vez se cultiva un menor número de especies distintas, y estas además son cada vez más homogéneas. Una de las actividades que se pueden llevar a cabo para minimizar el impacto de esta pérdida de variabilidad es la introducción de nuevos cultivos para la diversificación hortícola. En este sentido, el pepino dulce (Solanum muricatum) es un cultivo que puede tener interés para nuestra horticultura y para los mercados vecinos. Se trata de una especie de origen andino que normalmente se propaga vegetativamente, y que se puede cultivar en el área mediterránea. El pepino dulce se aprovecha por sus frutos jugosos, dulces y muy aromáticos, además de ello presenta cantidades relevantes de compuestos beneficiosos para la salud. El banco de germoplasma del COMAV conserva una colección de entradas de pepino dulce y de especies silvestres relacionadas. En la actualidad se disponen de descriptores morfológicos para la correcta caracterización de estos materiales, pero se hacía necesario disponer descriptores fenológicos como los desarrollados en este trabajo. En particular, la escala BBCH desarrollada es una clave que permite describir y delimitar los distintos estadios de desarrollo fenológico en la especie, presentando numerosas aplicaciones. Por otro lado era necesaria una correcta caracterización de estas entradas conservadas en el banco de germoplasma, para ello y como complemento a la realización de una caracterización morfológica, se llevó a cabo una caracterización molecular empleando marcadores SSR derivados de tomate. En este caso, se sacó beneficio de la proximidad genética entre ambas especies para transferir los marcadores de tomate (especie ampliamente estudiada) a pepino dulce, permitiendo diferenciar tanto morfológicamente, como molecularmente las especies silvestres de la cultivada, y dentro de esta los tipos modernos de los tradicionales. Una limitación en el estudio de la genética del pepino dulce era el número reducido de secuencias de ADN disponibles en las bases de datos, razón por la cual se proyectó la secuenciación del transcriptoma de una variedad de pepino dulce (Sweet Long) y de una entrada de la especie que se considera el ancestro silvestre del pepino dulce S. caripense. Esta secuenciación y posterior ensamblaje del transcriptoma ha permitido realizar un estudio inicial donde se ha realizado un análisis comparativo entre pepino dulce y sus especies cercanas tomate y patata, un estudio filogenético entre Solanáceas cultivadas, un análisis comparativo de algunos genes de interés agronómico, así como el desarrollo masivo de marcadores moleculares. Debido a las potenciales propiedades nutracéuticas de los frutos de pepino dulce, se decidió realizar una caracterización de la misma en la colección de entradas estudiada anteriormente. Por un lado se ha evaluado el contenido en materia seca, proteínas, antioxidantes, pigmentos y minerales; por otro lado, teniendo en cuenta que los polifenoles son unos de los compuestos con mayor poder antioxidante, se llevó a cabo un estudio que pretendió dilucidar el perfil de polifenoles en cuatro entradas de pepino dulce y una entrada de S. caripense, así como su poder antioxidante. Como complemento a esto último se evaluó el efecto de extractos de pepino dulce sobre células de macrófagos sometidas a estrés oxidativo, observándose una reducción significativa en la producción de óxido nítrico, lo cual indica la existencia de un efecto antiinflamatorio. Estas propiedades beneficiosas del pepino dulce son su mayor virtud, y junto con una elevada calidad organoléptica y una buena promoción, pueden favorecer la introducción y desarrollo de este cultivo. En definitiva, esta tesis supone la obtención de información relevante sobre la diversidad del pepino dulce, además de un estudio en distintos aspectos, como el fenológico, morfol / [CA] La reducció en la diversitat agrícola és un problema greu en la nostra agricultura. Cada vegada es cultiva un menor nombre d'espècies diferents, i aquestes a més són cada vegada més homogènies. Una de les activitats que es poden dur a terme per a minimitzar l'impacte d'aquesta pèrdua de variabilitat és la introducció de nous cultius per a diversificació hortícola. En aquest sentit, el cogombre dolç (Solanum muricatum) és un cultiu que pot tenir interès per a la nostra horticultura i per als mercats veïns. Es tracta d'una espècie d'origen andí que normalment es propaga vegetativament, i que es pot cultivar en l'àrea mediterrània. El cogombre dolç s'aprofita pels seus fruits sucosos, dolços i molt aromàtics, a més d'això presenta quantitats rellevants de compostos beneficiosos per a la salut. El banc de germoplasma del COMAV conserva una col·lecció d'entrades de cogombre dolç i d'espècies silvestres relacionades. En l'actualitat es disposen de descriptors morfològics per a la correcta caracterització d'aquests materials, però es feia necessari disposar descriptors fenològics com els desenvolupats en aquest treball. En particular, l'escala BBCH desenvolupada és una clau que permet descriure i delimitar els diferents estadis de desenvolupament fenològic en l'espècie, presentant nombroses aplicacions. D'altra banda era necessària una correcta caracterització d'aquestes entrades conservades en el banc de germoplasma, per a això i com a complement a la realització d'una caracterització morfològica es va dur a terme una caracterització molecular emprant marcadors SSR derivats de tomaca. En aquest cas, es va traure benefici de la proximitat genètica entre ambdues espècies per a transferir els marcadors de tomaca (espècie àmpliament estudiada) a cogombre dolç, permetent diferenciar tant morfològicament, com molecularment les espècies silvestres de la cultivada, i dins d'aquesta els tipus moderns dels tradicionals. Una limitació en l'estudi de la genètica del cogombre dolç era el nombre reduït de seqüències d'ADN disponibles en les bases de dades, raó per la qual es va projectar la seqüenciació del transcriptoma d'una varietat de cogombre dolç (Sweet Long) i d'una entrada de l'espècie que es considera l'ancestre silvestre del cogombre dolç, S. caripense. Aquesta seqüenciació i posterior assemblatge del transcriptoma ha permès realitzar un estudi inicial on s'ha realitzat una anàlisi comparativa entre cogombre dolç i les seues espècies properes tomaca i creïlla, un estudi filogenètic entre solanàcies cultivades, una anàlisi comparativa d'alguns gens d'interès agronòmic, així com el desenvolupament massiu de marcadors moleculars. A causa de les potencials propietats nutracèutiques dels fruits de cogombre dolç, es va decidir realitzar una caracterització de la mateixa en la col·lecció d'entrades estudiada anteriorment. D'una banda s'ha avaluat el contingut en matèria seca, proteïnes, antioxidants, pigments i minerals; d'altra banda, tenint en compte que els polifenols són uns dels compostos amb major poder antioxidant, es va dur a terme un estudi que va pretendre dilucidar el perfil de polifenols en quatre entrades de cogombre dolç i una entrada de S. caripense, així com el seu poder antioxidant. Com a complement a això últim es va avaluar l'efecte d'extractes de cogombre dolç sobre cèl·lules de macròfags sotmeses a estrès oxidatiu, observant-se una reducció significativa en la producció d'òxid nítric, la qual cosa indica l'existència d'un efecte antiinflamatori. Aquestes propietats beneficioses del cogombre dolç són la seua major virtut, i juntament amb una elevada qualitat organolèptica i una bona promoció, poden afavorir la introducció i desenvolupament d'aquest cultiu. En definitiva, aquesta tesi suposa l'obtenció d'informació rellevant sobre la diversitat del cogombre dolç, a més d'un estudi en diferents aspectes, com el feno / Herraiz García, FJ. (2016). Desarrollo de herramientas morfológicas y genómicas para el estudio del pepino dulce (Solanum muricatum) y especies relacionadas. Caracterización de su valor nutracéutico [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61962 / Compendio

Parmi les activités catalytiques les plus intéressantes présentes dans le latex de Carica papaya on trouve l'activité lipolytique (EC 3.1.1.X). En effet les enzymes lipolytiques peuvent catalyser des réactions d’hydrolyse sur divers substrats mais également, dans des conditions thermodynamiques favorables, des réactions de synthèse. De plus, elles sont actives en présence de solvants organiques, ce qui fait de ce type d’enzymes des biocatalyseurs spécialement attractifs pour des applications industrielles. Enfin, cette activité lipolytique est associée à la matrice insoluble du latex, et constitue donc une activité immobilisée. Cependant et pour cette même raison, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'élucider la ou les séquences protéiques dans le latex responsables de cette activité lipolytique. En conséquence, cette thèse est dédiée à l'étude de l'activité lipolytique du latex de C. papaya. Pour cela, la purification partielle du latex de C. papaya a été réalisée. Ainsi, les propriétés catalytiques des fractions partiellement purifiées ont pu être déterminées pour l'hydrolyse de triglycérides, la résolution de mélanges racémique d'octyl ester de l'acide 2-bromo-phenylacétique, la synthèse de biopolymères et des lipides structurés. Parallèlement à cela, une recherche dans le génome de C. papaya des séquences codant les motifs conservés dans les protéines lipolytiques, ainsi que des essais d'expression in vivo dans les feuilles de la plante en conditions de stress a été effectuée, ce qui a permis d’isoler pour la première fois une lipase, CpLip2, exprimée in vivo chez C. papaya. Cette protéine, ainsi que 2 autres protéines déjà identifiées dans le latex de C. papaya, CpEst et CpLip1, ont été produites sous forme fonctionnelle en employant respectivement Nicothiana sp., Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris comme systèmes d'expression. Finalement, certaines des propriétés biochimiques et catalytiques de ces protéines recombinantes ont pu être déterminées / Lipolytic activity (EC 3.1.1.X) is one of the most interesting catalytic activities from Carica papaya latex. Indeed lipolytic enzymes can catalyze not only hydrolysis but also various synthesis reactions due to their activity in organic solvents, which make them especially attractive for industrial applications. Nevertheless, most of the lipolytic activity present in latex is tightly associated to the insoluble fraction of the latex and up to now it has not been possible to determine which enzymes are responsible for the lipolytic activity of C. papaya latex. This PhD work is dedicated to the study of the lipolytic activity present in Carica papaya. Partial purification of lipolytic activity from C. papaya latex was carried out to evaluate the catalytic properties of the partially purified fractions in the hydrolysis of triglycerides, the resolution of racemic mixtures of 2-bromo-phenylacetic octyl ester, biopolymers and structured lipids synthesis. Bioinformatic analysis was also realized on C. papaya genome by searching conserved motifs for lipolytic proteins. Finally, assays of in vivo transcriptomic in the leaves of stressed C. papaya allowed the isolation of a new lipase produced in vivo (CpLip2, gene 1973.2). This protein, as well as two previously identified lipolytic enzymes from C. papaya, CpEst (gen 25.180) and CpLip1 (gen 55.143) were functionally expressed using Nicotiana sp.,Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris as expression hosts, respectively. Finally, some of the biochemical and catalytic properties of these produced recombinant proteins were evaluated / Una de las actividades catalíticas más interesantes presentes en el látex de Carica papaya es la actividad lipolítica (3.1.1.X).Las enzimas lipolíticas pueden catalizar reacciones de hidrólisis sobre varios sustratos e igualmente, en condiciones termodinámicas favorables, pueden catalizar reacciones de síntesis. Adicionalmente, son activas en presencia de solventes orgánicos, por lo que son biocatalizadores atractivos para aplicaciones industriales. Sin embargo, la mayor parte de la actividad lipolítica del látex se encuentra asociada a la matriz insoluble del látex, formando un biocatalizador auto-inmovilizado.Por esta razón, hasta la fecha no ha sido posible elucidar qué enzima o enzimas son responsables de la actividad lipolítica observada en el látex de C. papaya. En consecuencia, la presente investigación está dedicada al estudio de la actividad lipolítica en Carica papaya. Para ello, se realizaron estudios de purificación parcial del látex de Carica papaya, así como la evaluación de las propiedades catalíticas de las fracciones parcialmente purificadas en la hidrólisis de triglicéridos, resolución de mezclas racémicas de octil éster del ácido 2-bromo-fenilacético y síntesis de biopolímeros y lípidos estructurados. Paralelamente, se realizó un análisis genómico mediante la búsqueda con motivos conservados que codifican para diversas proteínas lipolíticas, así como ensayos de transcriptómica para buscar la expresión in vivo de secuencias seleccionadas en las hojas de la planta, que permitieron encontrar por primera vez una expresión in vivo de una lipasa en C. papaya (CpLip2). Esta proteína y otras dos previamente identificadas en el látex de papaya (CpEst y CpLip1), fueron expresadas de forma funcional empleando respectivamente Nicotiana sp., Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris como sistemas de expresión. Finalmente algunas de las propiedades bioquímicas y catalíticas de las proteínas expresadas fueron determinadas

[ES] La introducción de la secuenciación de ARN a nivel de célula única (scRNA-seq) en el ámbito de la transcriptómica ha redefinido nuestro entendimiento de la diversidad celular, arrojando luz sobre los mecanismos subyacentes a la heterogeneidad tisular. No obstante, al inicio de esta tesis, las limitaciones de a esta tecnología obstaculizaban su aplicación en el estudio de procesos complejos, entre ellos el splicing alternativo. A pesar de ello, los patrones de splicing a nivel celular planteaban incógnitas que esta tecnología tenía el potencial de resolver: ¿es posible observar, a nivel celular, la misma diversidad de isoformas que se detecta mediante RNA-seq a nivel de tejido? ¿Qué función desempeñan las isoformas alternativas en la constitución de la identidad celular? El objetivo de esta tesis es desbloquear el potencial del scRNA-seq para el análisis de isoformas, abordando sus dificultades técnicas y analíticas mediante el desarrollo de nuevas metodologías computacionales. Para lograrlo, se trazó una hoja de ruta con tres objetivos. Primero, se establecieron cuatro requisitos para el estudio de las isoformas mediante scRNA-seq, llevando a cabo una revisión de la literatura existente para evaluar su cumplimiento. Tras completar este marco con simulaciones computacionales, se identificaron las debilidades y fortalezas de los métodos de scRNA-seq y las herramientas computacionales disponibles. Durante la segunda etapa de la investigación, estos conocimientos se utilizaron para diseñar un protocolo óptimo de procesamiento de datos de scRNA-seq. En concreto, se integraron datos de lecturas largas a nivel de tejido con datos de scRNA-seq para garantizar una identificación adecuada de las isoformas así como su cuantificación a nivel celular. Este proceso permitió ampliar las estrategias computacionales disponibles para la reconstrucción de transcriptomas a partir de lecturas largas, mejoras que fueron implementadas en SQANTI3, software de referencia en transcriptómica. Por último, los datos procesados se utilizaron para desarrollar un nuevo método de análisis de co-expresión de isoformas a fin de desentrañar redes de regulación del splicing alternativo implicadas en la constitución de la identidad celular. Dada la elevada variabilidad de los datos de scRNA-seq, este método se basa en la utilización de una estrategia de correlación basada en percentiles que atenúa el ruido técnico y permite la identificación de grupos de isoformas co-expresadas. Una vez configurada la red de co-expresión, se introdujo una nueva estrategia de análisis para la detección de patrones de co-utilización de isoformas que suceden de forma independiente a la expresión a nivel de gen, denominada co-Differential Isoform Usage. Este enfoque facilita la identificación de una capa de regulación de la identidad celular atribuible únicamente a mecanismos post-transcripcionales. Para una interpretación biológica más profunda, se aplicó una estrategia de anotación computacional de motivos y dominios funcionales en las isoformas definidas con lecturas largas, revelando las propiedades biológicas de las isoformas involucradas en la red de co-expresión. Estas investigaciones culminan en el lanzamiento de acorde, un paquete de R que encapsula las diferentes metodologías desarrolladas en esta tesis, potenciando la reproducibilidad de sus resultados y proporcionando una nueva herramienta para explorar la biología de las isoformas alternativas a nivel de célula única. En resumen, esta tesis describe una serie de esfuerzos destinados a desbloquear el potencial de los datos de scRNA-seq para avanzar en la comprensión del splicing alternativo. Desde un contexto de escasez de herramientas y conocimiento previo, se han desarrollado soluciones de análisis innovadoras que permiten la aplicación de scRNA-seq al estudio de las isoformas alternativas, proporcionando recursos innovadores para profundizar en la regulación post-transcripcional y la función celular. / [CA] La introducció de la seqüenciació d'ARN a escala de cèl·lula única (scRNA-seq) en l'àmbit de la transcriptòmica ha redefinit el nostre enteniment de la diversitat cel·lular, projectant llum sobre els mecanismes subjacents a l'heterogeneïtat tissular. Malgrat les limitacions inicials d'aquesta tecnologia, especialment en el context de processos complexos com l'splicing alternatiu, els patrons d'splicing a escala cel·lular plantejaven incògnites amb potencial de resolució: és possible observar, a escala cel·lular, la mateixa diversitat d'isoformes que es detecta mitjançant RNA-seq en teixits? Quina funció tenen les isoformes alternatives en la constitució de la identitat cel·lular? L'objectiu d'aquesta tesi és desbloquejar el potencial del scRNA-seq per a l'anàlisi d'isoformes alternatives, abordant les seues dificultats tècniques i analítiques amb noves metodologies computacionals. Per a això, es va traçar una ruta amb tres objectius. Primerament, es van establir quatre requisits per a l'estudi de les isoformes mitjançant scRNA-seq, amb una revisió de la literatura existent per avaluar-ne el compliment. Després de completar aquest marc amb simulacions computacionals, es van identificar les debilitats i fortaleses dels mètodes de scRNA-seq i de les eines computacionals disponibles. Durant la segona etapa de la investigació, aquests coneixements es van utilitzar per dissenyar un protocol òptim de processament de dades de scRNA-seq. En concret, es van integrar dades de lectures llargues a escala de teixit amb dades de scRNA-seq per a garantir una identificació adequada de les isoformes així com la seua quantificació a escala cel·lular. Aquest procés va permetre ampliar les estratègies computacionals disponibles per a la reconstrucció de transcriptomes a partir de lectures llargues, millores que van ser implementades en SQANTI3, un programari de referència en transcriptòmica. Finalment, les dades processades es van fer servir per a desenvolupar un nou mètode d'anàlisi de coexpressió d'isoformes amb l'objectiu de desentranyar xarxes de regulació de l'splicing alternatiu implicades en la constitució de la identitat cel·lular. Donada l'elevada variabilitat de les dades de scRNA-seq, aquest mètode es basa en la utilització d'una estratègia de correlació basada en percentils que minimitza el soroll tècnic i permet la identificació de grups d'isoformes coexpressades. Un cop configurada la xarxa de coexpressió, es va introduir una nova estratègia d'anàlisi per a la detecció de patrons de co-utilització d'isoformes que succeeixen de forma independent a l'expressió del seu gen, denominada co-Differential Isoform Usage. Aquest enfocament facilita la identificació d'una capa de regulació de la identitat cel·lular atribuïble únicament a mecanismes post-transcripcionals. Per a una interpretació biològica més profunda, es va aplicar una estratègia d'anotació computacional de motius i dominis funcionals en les isoformes definides amb lectures llargues, revelant les propietats biològiques de les isoformes involucrades en la xarxa de coexpressió. Aquestes investigacions culminen en el llançament d'acorde, un paquet de R que encapsula les diferents metodologies desenvolupades en aquesta tesi, potenciant la reproducibilitat dels seus resultats i proporcionant una nova eina per a explorar la biologia de les isoformes alternatives a escala de cèl·lula única. En resum, aquesta tesi descriu una sèrie d'esforços destinats a desbloquejar el potencial de les dades de scRNA-seq per a avançar en la comprensió de l'splicing alternatiu. Des d'un context de manca d'eines i coneixement previ, s'han desenvolupat solucions d'anàlisi innovadores que permeten l'aplicació de scRNA-seq a l'estudi de les isoformes alternatives, proporcionant recursos innovadors per a aprofundir en la regulació post-transcripcional i la funció cel·lular. / [EN] In the world of transcriptomics, the emergence of single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) ignited a revolution in our understanding of cellular diversity, unraveling novel mechanisms in tissue heterogeneity, development and disease. However, when this thesis began, using scRNA-seq to understand Alternative Splicing (AS) was a challenging frontier due the inherent limitations of the technology. In spite of this research gap, pertinent questions persisted regarding cell-level AS patterns, particularly concerning the recapitulation of isoform diversity observed in bulk RNA-seq data at the cellular level and the roles played by cell and cell type-specific isoforms. The work conducted in the present thesis aims to harness the potential of scRNA-seq for alternative isoform analysis, outlining technical and analytical challenges and designing computational methods to overcome them. To achieve this, we established a roadmap with three main aims. First, we set requirements for studying isoforms using scRNA-seq and conducted an extensive review of existing research, interrogating whether these requirements were met. Combining this acquired knowledge with several computational simulations allowed us to delineate the strengths and pitfalls of available data generation methods and computational tools. During the second research stage, this insight was used to design a suitable data processing pipeline, in which we jointly employed bulk long-read and short-read scRNA-seq sequenced from full-length cDNAs to ensure adequate isoform reconstruction as well as sensitive cell-level isoform quantification. Additionally, we refined available transcriptome curation strategies, introducing them as innovative modules in the transcriptome quality control software SQANTI3. Lastly, we harnessed single-cell isoform expression data and the rich biological diversity inherent in scRNA-seq, encompassing various cell types, in the design of a novel isoform co-expression analysis method. Percentile correlations effectively mitigated single-cell noise, unveiling clusters of co-expressed isoforms and exposing a layer of regulation in cellular identity that operated independently of gene expression. We additionally introduced co-Differential Isoform Usage (coDIU) analysis, enhancing our ability to interpret isoform cluster networks. This endeavour, combined with the computational annotation of functional sites and domains in the long read-defined isoform models, unearthed a distinctive functional signature in coDIU genes. This research effort materialized in the release of acorde, an R package that encapsulates all analyses functionalities developed throughout this thesis, providing a reproducible means for the scientific community to further explore the depths of alternative isoform biology within single-cell transcriptomics. This thesis describes a complex journey aimed at unlocking the potential of scRNA-seq data for investigating AS and isoforms: from a landscape marked by the scarcity of tools and guidelines, towards the development of novel analysis solutions and the acquisition of valuable biological insight. In a swiftly evolving field, our methodological contributions constitute a significant leap forward in the application of scRNA-seq to the study of alternative isoform expression, providing innovative resources for delving deeper into the intricacies of post-transcriptional regulation and cellular function through the lens of single-cell transcriptomics. / The research project was funded by the BIO2015-71658 and BES-2016-076994 grants awarded by the Spanish Ministry of Science and Innovation / Arzalluz Luque, Á. (2024). Understanding Isoform Expression and Alternative Splicing Biology through Single-Cell RNAseq [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203888

[ES] El objetivo principal de este trabajo fue conocer las alteraciones inmunológicas asociadas a la inflamación periférica que desencadenan deterioro cognitivo en los pacientes cirróticos encefalopatía hepática mínima (EHM). Estos cambios pueden ser monitorizados como cascadas de señalización a lo largo de los tipos celulares del sistema inmune. Como estudio preliminar, se analizaron los cambios en la expresión génica (transcriptómica), los metabolitos de plasma (metabolómica) y un panel de citoquinas extracelulares en muestras de sangre de pacientes cirróticos con y sin EHM. Los resultados del análisis transcriptómico apoyaron la hipótesis de alternancias en las poblaciones celulares de linfocitos Th1/Th2 y Th17 como principales impulsores de la EHM. El análisis clúster de las moléculas del suero dio como resultado 6 grupos de compuestos químicamente similares. También se ha realizado un análisis de integración multiómica para detectar las relaciones entre los componentes intra y extracelulares que podrían contribuir a la inducción del deterioro cognitivo. Los resultados de este análisis integrativo sugirieron una relación entre las citocinas CCL20, CX3CL1, CXCL13, IL-15, IL-22 e IL-6 con la alteración de la quimiotaxis, así como un vínculo entre los fosfolípidos insaturados de cadena larga y el aumento del transporte de ácidos grasos y la producción de prostaglandinas. Estudios previos sugieren que un cambio en la inflamación periférica, orquestado principalmente por las células T CD4+, es un factor crítico que desencadena el deterioro cognitivo en EHM. La segunda parte de la tesis se centró en la comprensión de las rutas genéticas y los mecanismos por los que las alteraciones en los linfocitos CD4+ pueden contribuir a la inflamación periférica en EHM. Se analizaron los niveles de expresión de genes, factores de transcripción y miARNs en este subtipo de linfocitos mediante secuenciación de alto rendimiento (RNA-seq y miRNA-seq). El análisis individual de cada grupo de datos mostró diferencias de expresión de ARNm y miARN, así como las vías biológicas alteradas en los linfocitos CD4+ comparando pacientes cirróticos con y sin EHM. Encontramos alteraciones en 167 ARNm y 20 rutas biológicas en los pacientes con EHM, incluyendo los receptores tipo Toll, la señalización de la IL-17 y las vías del metabolismo de histidina y triptófano. Trece miRNAs y 7 factores de transcripción presentaron alteraciones en los pacientes con EHM. Utilizando bases de datos para determinar sus genes diana, encontramos una modulación por el aumento de miR-494-39, miR-656-3p y miR-130b-3p de la expresión de TNFAIP3 (proteína A20) y ZFP36 (proteína TTP) aumentaría los niveles de citoquinas proinflamatorias como IL-17 y TNF¿. Finalmente, estudiamos el repertorio de receptores de células T (TCR) de pacientes control, y de pacientes cirróticos con y sin EHM, a partir del conjunto de datos de RNA-seq procedentes de células T CD4+ aisladas previamente. Dado que los experimentos de RNA-seq contienen genes del TCR en una fracción de los datos, se puede analizar el repertorio sin necesidad de generar datos adicionales. Tras el alineamiento de las lecturas con la base de datos de los genes VDJ realizada por la herramienta MiXCR, recuperamos entre 498-1114 cadenas TCR beta distintas por paciente. Los resultados mostraron un bajo número de clones públicos (convergencia clonal), una alta diversidad (expansión clonal) y una elevada similitud en la arquitectura de la secuencia dentro de los repertorios, independientemente del estado inmunitario de los 3 grupos de pacientes. Además, detectamos una sobrerrepresentación significativa de los TCRs relacionados con la enfermedad celíaca y la enfermedad inflamatoria intestinal en los repertorios de los pacientes con EHM. / [CA] L'objectiu principal d'aquest treball va ser conèixer les alteracions immunològiques associades a la inflamació perifèrica que desencadenen deteriorament cognitiu en els pacients cirròtics amb encefalopatia hepàtica mínima (EHM). Aquests canvis poden ser monitoritzats com cascades de senyalització al llarg dels tipus cel·lulars del sistema immune. Com a estudi preliminar, es van analitzar els canvis en l'expressió gènica (transcriptòmica), els metabòlits de plasma (metabolòmica) i un conjunt de citocines extracel·lulars en mostres de sang de pacients cirròtics amb i sense EHM. Els resultats de l'anàlisi transcriptòmica van recolzar la hipòtesi d'alternances en les poblacions cel·lulars de limfòcits Th1/Th2 i Th17 com a principals impulsors de la EHM. L'anàlisi clúster de les molècules del sèrum va donar com a resultat 6 grups de compostos químicament similars. També s'ha realitzat una anàlisi d'integració multiòmica per detectar les relacions entre els components intra i extracel·lulars que podrien contribuir a la inducció del deteriorament cognitiu. Els resultats d'aquesta anàlisi d'integració van suggerir una relació entre les citocines CCL20, CX3CL1, CXCL13, IL-15, IL-22 i IL-6 amb l'alteració de la quimiotaxis, així com un vincle entre els fosfolípids insaturats de cadena llarga i l'augment del transport d'àcids grassos i la producció de prostaglandines. Estudis previs suggereixen que un canvi en la inflamació perifèrica, orquestrat principalment per les cèl·lules T CD4+, és un factor crític que desencadena el deteriorament cognitiu en EHM. La segona part de la tesi es va centrar en la comprensió de les rutes genètiques i els mecanismes pels quals les alteracions en els limfòcits CD4+ poden contribuir a la inflamació perifèrica en EHM. Es van analitzar els nivells d'expressió de gens, factors de transcripció i miARNs en aquest subtipus de limfòcits mitjançant seqüenciació d'alt rendiment (RNA-seq i miRNA-seq). L'anàlisi individual de cada grup de dades va mostrar les diferències d'expressió d'ARNm i miARN, així com les vies biològiques alterades en els limfòcits CD4+ comparant pacients cirròtics amb i sense EHM. Trobàrem alteracions en 167 ARNm i 20 rutes biològiques en els pacients amb EHM, incloent els receptors tipus Toll, la senyalització de la IL-17 i les vies del metabolisme de la histidina i el triptòfan. Tretze miRNAs i 7 factors de transcripció van presentar alteracions en els pacients amb EHM. Després utilitzàrem bases de dades per determinar els seus gens diana, els quals van resultar ser codificants per proteïnes clau implicades en el canvi immunològic que desencadena la EHM. Per exemple, la modulació per l'augment de miR-494-39, miR-656-3p i miR-130b-3p de l'expressió de TNFAIP3 (proteïna A20) i ZFP36 (proteïna TTP) augmentaria els nivells de citocines proinflamatòries com IL-17 i TNF¿. L'última part de la tesi comprèn un cas pràctic en el qual s'estudia el repertori de receptors de cèl·lules T (TCR) de pacients control, i de pacients cirròtics amb i sense EHM, a partir del conjunt de dades de RNA-seq procedents de cèl·lules T CD4+ aïllades prèviament. Atès que els experiments de RNA-seq contenen gens del TCR en una fracció de les dades, es crea una oportunitat per a l'anàlisi del repertori sense necessitat de generar dades addicionals, el qual redueix la quantitat i els costos de les mostres. Després de l'alineament de les lectures amb la base de dades dels gens VDJ realitzada per l'eina MiXCR, recuperàrem entre 498-1114 cadenes TCR beta diferents per pacient. Els resultats van mostrar un baix nombre de clons públics (convergència clonal), una alta diversitat (expansió clonal) i una elevada similitud en l'arquitectura de la seqüència dins dels repertoris, independentment de l'estat immunitari dels 3 grups de pacients. A més, detectàrem una sobrerepresentació significativa dels TCRs relacionats amb la malaltia celíaca i la malaltia inflamatòria intestinal en els repertoris dels pacients amb EHM. / [EN] The main objective of this work was to understand the immunological alterations associated with the peripheral inflammation that trigger minimal hepatic encephalopathy (MHE) in patients with cirrhosis. These changes can be monitored through the signaling cascades of different immune system cell types. In this work, in a preliminary study, changes in gene expression (transcriptomics), plasma metabolites (metabolomics), and a panel of extracellular cytokines were analyzed in blood samples from patients with cirrhosis with and without MHE. Transcriptomics analysis supported the hypothesis that alternations in the Th1/Th2 and Th17 lymphocyte cell populations are the major drivers of MHE. Cluster analysis of serum molecules highlighted 6 groups of chemically similar compounds. We also developed a multi-omic integration analysis pipeline to detect covariation between intra- and extracellular components that could contribute to the induction of cognitive impairment. Results of this integrative analysis suggested a relationship between cytokines CCL20, CX3CL1, CXCL13, IL-15, IL-22, and IL-6 and altered chemotaxis, as well as a link between long-chain unsaturated phospholipids and increased fatty acid transport and prostaglandin production. A shift in peripheral inflammation in patients with MHE, mainly orchestrated by CD4+ T cells, had been proposed in previous studies as a critical factor that triggers cognitive impairment. The second part of this thesis focused on understanding the pathways and mechanisms by which alterations in CD4+ lymphocytes may contribute to peripheral inflammation in MHE. Thus, the expression levels of genes, transcription factors, and miRNAs were analyzed in this lymphocyte subtype by high throughput sequencing (RNA-seq and miRNA-seq). Separate analysis of each dataset showed mRNA and miRNA expression differences and altered biological pathways in CD4+ lymphocytes when compared to patients with cirrhosis with and without MHE. We found alterations in 167 mRNAs and 20 pathways in patients with MHE, including toll-like receptors, IL-17 signaling, histidine, and tryptophan metabolism pathways. In addition, 13 miRNAs and 7 transcription factors presented alterations in patients with MHE. We used public databases to determine the target genes of these regulatory molecules and found that increased miR-494-39, miR-656-3p, and miR-130b-3p expression may modulate TNFAIP3 (A20) and ZFP36 (TTP) to increase levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-17 and TNF¿. Finally, we present a case study of the T-cell receptor (TCR) repertoire profiles of control patients and patients with cirrhosis with and without MHE obtained from the bulk RNA-seq dataset previously generated from isolated CD4+ T cells. Given that RNA-seq experiments contain the TCR genes in a fraction of the data, the receptor repertoire analysis without the need to generate additional data is possible. After read alignment to the VDJ genes was performed with the MiXCR tool, we successfully recovered 498-1,114 distinct TCR beta chains per patient. Results showed fewer public clones (clonal convergence), higher diversity (clonal expansion), and elevated sequence architecture similarity within repertoires, independently of the immune status of the 3 groups of patients. Additionally, we detected significant overrepresentation of celiac disease and inflammatory bowel disease related TCRs in MHE patient repertoires. To the best of our knowledge, this is one of the few studies to have shown a step-by-step pipeline for the analysis of immune repertoires using whole transcriptome RNA-seq reads as source data. In conclusion, our work identified potentially relevant molecular mechanisms of the changes in the immune system associated with the onset of MHE in patients with cirrhosis. Future work with a large sample cohort will be required to validate these results in terms of biomarker determination and the development of new, more effective treatments for MHE. / Rubio Martínez-Abarca, MT. (2022). Multi-omic data integration study of immune system alterations in the development of minimal hepatic encephalopathy in patients with liver cirrhosis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185116

Plastids are the cellular organelles where many of the visual, health and flavor-related metabolites are produced and stored in the fruit, and therefore are valuable components for consumers and breeders. The more sugar and flavor the fruit has, the more appreciated is for the consumer and industry. Thus, one of the breeder's goals is to obtain new varieties with fruits improved in these aspects. Paradoxically, fruits with a high content in chloroplasts have been avoided by the breeders because it usually suffers of oxidative stress disorders; such yellow shoulder impairment and fruit cracking when the light intensity increases. For this reason breeding efforts has been focused mainly on avoiding fruit losses and organoleptic characteristics have been neglected. This thesis aims to improve tomato fruit quality by engineering plants to produce fruits with enhanced fruit chloroplast functions and improved tolerance to oxidative stress, using cisgenic/ intragenic approaches. SlGLK1, SlGLK2 and SlAPRR2 transcription factors have been suggested to be involved in chloroplast development. Tomato MoneyMaker plants were engineered to express SlGLKs and SlAPRR2 either singly or in combination early in development. Those lines provide fruits which accumulate more sugars, carotenoids and specific volatiles than WT. The fruit chloroplast enhanced lines were characterized at the structural, metabolic, proteomics and transcriptomics. A novel additive effect in the chloroplast regulation network resulted when both transcription factors were coexpressed and a hypothesis for this effect is presented. In addition, two tomato traditional varieties (Muchamiel and Pera) expressing tomato genes for BMW anthocyanin regulatory complex under the control of the light inducible promoter (PLI) were produced and characterized. Engineered tomato plants showed large accumulation of anthocyanin specifically in the fruit peel and in Type VI trichomes. Characterization of those tissues indicated specific alterations of the flavonoid pathway that were highly dependent on the light conditions. These tomato lines could be of high interest to protect the fruit chloroplast enhancement lines from eventual stresses involving ROS, and also to assess the effect on plant growth under high light stress and in plant-pest interaction studies. / Los plastidos son orgánulos celulares donde se producen y almacenan muchos de los metabolitos relacionados con atributos organolépticos y compuestos beneficiosos para la salud, por lo tanto se consideran componentes de alto valor añadido para consumidores y mejoradores vegetales. Cuanto mayor contenido en azúcares solubles y sabor presente el fruto más se valoran por los consumidores y la industria. Por lo tanto uno de los objetivos actuales de los mejoradores de tomate es mejorar el fruto en estos aspectos. Paradójicamente, se ha seleccionado en contra de frutos con alto contenido en cloroplastos porque este carácter, bajo alta intensidad lumínica, suele estar asociado a daños en el fruto por estrés oxidativo; como los hombros amarillos del tomate o el agrietado del fruto. Por este motivo los esfuerzos en mejora se han orientado principalmente a evitar pérdidas y consecuentemente la calidad organoléptica se ha visto reducida. El objetivo de esta tesis es mejorar la calidad del fruto de tomate mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética orientadas a incrementar los cloroplastos en fruto y mejorar la tolerancia al estrés oxidativo con una aproximación cis/ intragenica. Los factores de transcripción SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 han sido estudiados por influir en el desarrollo del cloroplasto. Plantas de tomate de variedad MoneyMaker fueron mejoradas genéticamente para expresar de forma individual o conjunta SlGLKs y SlAPRR2 en estadios tempranos de desarrollo. Estas líneas proveen frutos con mayor acumulo de azúcares, carotenos y volátiles que el control MoneyMaker. Las líneas potenciadas en desarrollo de cloroplastos se caracterizaron a nivel estructural, metabólico, proteómico y transcriptómico. Se descubrió un novedoso efecto aditivo en la regulación génica del cloroplasto cuando ambos factores de transcripción se expresan simultáneamente y se presentó una hipótesis para dicho efecto. Además se caracterizaron dos variedades tradicionales de tomate (Muchamiel and Pera) diseñadas para expresar genes pertenecientes al complejo de regulación de antocianinas BMW, bajo el control del promotor inducible por luz (PLI). Las plantas mejoradas genéticamente presentan una gran acumulación de antocianos, especialmente en piel de fruto y en tricomas tipo VI. Caracterización de estos tejidos indican alteraciones específicas en la ruta de flavonoides y una alta dependencia a condiciones de luz. Estas plantas podrían ser de gran interés para proteger frutos con altos niveles de cloroplastos frente al estrés oxidativo generado por ROS, para evaluar el efecto en el crecimiento de la planta bajo condiciones de alta luz y en futuros estudios de interacción planta-patógenos / Els plastidis són orgànuls cel.lulars on es produeixen i emmagatzemen molts dels metabòlits relacionats amb atributs organolèptics i composts beneficiosos per a la salut, per tant es consideren components d'alt valor afegit per a consumidors i milloradors vegetals. Quant major contingut en sucres solubles i sabor presenta el fruït, més serà valorat per part dels consumidors i la industria. Paradoxalment, s'ha seleccionat en contra dels fruïts amb alt contingut en cloroplasts perquè aquest caràcter, davall alta intensitat lumínica, sol estar associat amb danys en el fruït per estrés oxidatiu; com muscles groguencs de la tomata o clevitjament del fruït. Per aquest motiu, l'esforç en millora s'ha orientat principalment a evitar pèrdues de manera que la qualitat organolèptica s'ha vist reduïda. L'objectiu d'aquesta tesi es millorar la qualitat del fruït de tomata mitjançant l'ús de tècniques d'enginyeria genètica orientades a incrementar els cloroplasts al fruït i millorar la tolerància a l'estrès oxidatiu amb una aproximació cis/intragènica. Plantes de tomata de la varietat MoneyMaker foren millorades genèticament per expressar de manera individual o conjunta SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 als moments inicials del desenvolupament. Aquestes línies donen fruïts amb major acumulació de sucres, carotens i volàtils que el control MoneyMaker. Les línies potenciades amb el desenvolupament de cloroplasts es caracteritzaren a nivell estructural, metabòlic, proteòmic i transcriptòmic. Es va descobrir un nou efecte additiu en la regulació gènica del cloroplast quan ambdós factors de transcripció s'expressen de manera simultània i es va presentar una hipòtesi per a dit efecte. A més, es van caracteritzar dos varietats tradicionals de tomata (Muchamiel i Pera) dissenyades per a expressar gens que pertanyen al complex de regulació d'antocians BMW, davall el control del promotor induïble per llum (PLI). Les plantes millorades genèticament presentaren una gran acumulació d'antocians, especialment a la pell del fruït i en tricomes de tipus VI. La caracterització d'aquest teixit indica alteracions específiques en la ruta dels flavonoides i una altra dependència a condicions de llum. Aquestes plantes podrien ser de gran interès per a protegir els fruïts d'alts nivells de cloroplasts front a l'estrès oxidatiu generat pels ROS, i per a avaluar l'efecte en el creixement de la planta davall condicions d'alta llum i en futurs estudis d'interacció planta-patògen. / Cocaliadis Caisson, MF. (2017). A multilevel, developmentally controlled gene engineering strategy for tomato fortification and protection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90401

Tesis por compendio / [ES] La acuicultura se proyecta como un medio vital para alimentar de manera sostenible a la creciente población mundial. Sin embargo, para lograrlo, la producción de peces debe abordarse con sostenibilidad y adaptabilidad en mente, especialmente frente a desafíos como el cambio climático y la disminución de recursos. Esto requiere innovaciones en genética y nutrición para garantizar la resiliencia de las poblaciones de peces cultivados. Comprender las interacciones entre organismos, microbiota y el medio ambiente es crucial, y las tecnologías ómicas ofrecen una manera de profundizar en estas dinámicas. Se ha secuenciado el genoma del dorado, una especie significativa de acuicultura europea, lo que ha llevado a conocer la expansión génica y la plasticidad fenotípica. Esta tesis tuvo como objetivo aprovechar este conocimiento integrando diversas aproximaciones ómicas para anotar el genoma y la microbiota intestinal de esta importante especie mediterránea. El enfoque se centró en acciones para hacer más sostenibles las prácticas futuras de acuicultura. Un aspecto crítico abordado fue la gestión de los niveles de oxígeno, dada su disminución debido al cambio climático. Comprender las respuestas de los peces al oxígeno reducido es vital para la acuicultura sostenible. La investigación sobre el dorado reveló adaptaciones a la hipoxia leve, incluida una disminución general de la respuesta metabólica y variaciones a nivel de expresión génica. La selección genética y los avances en piensos acuícolas también son esenciales para la acuicultura sostenible. La tesis monitoreó la evolución de los peces y la dieta junto con un programa de cría para el crecimiento, revelando respuestas diferenciales en peces alimentados con recursos marinos reducidos. La selección genética por un crecimiento rápido es capaz de influir en la composición y la actividad de la microbiota intestinal. La caracterización de esta comunidad también reveló su importancia en la salud y el crecimiento de los peces. Los factores genéticos parecían jugar un papel más importante que la dieta en la formación de la composición de la microbiota intestinal, pero las interacciones entre genética y dieta influenciaron tanto las respuestas del huésped como las microbianas. En resumen, la tesis presenta resultados prometedores para mejorar el crecimiento, la salud y la adaptación ambiental en especies de acuicultura, contribuyendo también a la sostenibilidad del sector acuícola. / [CA] L'aqüicultura es projecta com un mitjà vital per a alimentar de manera sostenible la creixent població mundial. No obstant això, per a aconseguir-ho, la producció de peixos ha d'abordar-se amb sostenibilitat i adaptabilitat en ment, especialment front a desafiaments com el canvi climàtic i la disminució de recursos. Això requereix innovacions en genètica i nutrició per a garantir la resiliència de les poblacions de peixos cultivats. Comprendre les interaccions entre organismes, microbiota i el medi ambient és crucial, i les tecnologies òmiques oferixen una manera de profunditzar en aquestes dinàmiques. S'ha sequenciat el genoma de l'orada, una espècie significativa d'aqüicultura europea, la qual cosa ha portat a conèixer l'expansió gènica i la plasticitat fenotípica de l'espècie. Aquesta tesi té com a objectiu aprofitar aquest coneixement integrant diverses aproximacions òmiques per a anotar el genoma i la microbiota intestinal d'aquesta important espècie mediterrània. L'enfocament es va centrar en accions per a fer més sostenibles les pràctiques futures d'aqüicultura. Un aspecte crític abordat va ser la gestió dels nivells d'oxigen, donada la seua disminució a causa del canvi climàtic. Comprendre les respostes dels peixos a l'oxigen reduït és vital per a l'aqüicultura sostenible. La investigació va revelar adaptacions a la hipòxia lleu, inclosa una disminució general de la resposta metabòlica i variacions a nivell d'expressió gènica. La selecció genètica i els avanços en pinso per a l'aqüicultura també són essencials per a la sostenibilitat del sector. La tesi va monitorar l'evolució dels peixos i la dieta juntament amb un programa de sel·lecció genètica per creixement, revelant respostes diferencials en peixos alimentats amb recursos marins reduïts. La selecció genètica per a un creixement ràpid és capaç d'influir en la composició i l'activitat de la microbiota intestinal. La caracterització d'aquesta comunitat també va revelar la seua importància en la salut i el creixement dels peixos. Els factors genètics semblaven jugar un paper més important que la dieta en la formació de la composició de la microbiota intestinal, però les interaccions entre genètica i dieta van influir tant en les respostes de l'organisme com en les microbianes. En resum, la tesi presenta resultats prometedors per a millorar el creixement, la salut i l'adaptació ambiental en espècies d'aqüicultura, contribuint també a la sostenibilitat del sector aqüícola. / [EN] Aquaculture is projected as a vital means to feed the growing global population sustainably. However, to achieve this, fish production must be approached with sustainability and adaptability in mind, especially in the face of challenges like climate change and resource depletion. This requires innovations in genetics and nutrition to ensure the resilience of farmed fish populations. Understanding the interactions between organisms, microbiota, and the environment is crucial, and omics technologies offer a way to delve deeper into these dynamics. The genome of the gilthead sea bream, a significant European aquaculture species, has been sequenced, leading to insights into gene expansion and phenotypic plasticity. This thesis aimed to leverage this knowledge by integrating various omics approaches to annotate the genome and gut microbiome of this important Mediterranean species. The focus was on actions to conserve and "green" future aquaculture practices. One critical aspect addressed was the management of oxygen levels, given their declining availability due to climate change. Understanding fish responses to reduced oxygen is vital for sustainable aquaculture. Research on gilthead sea bream revealed adaptations to mild hypoxia, including a hypo-metabolic general response and changes in metabolic processes and gene expression profiling. Selective breeding and advancements in aquafeeds are also essential for sustainable aquaculture. The thesis monitored fish and diet evolution alongside a breeding program for growth, revealing differential responses in fish fed with reduced marine resources. Genetic selection for fast growth influenced the gut microbiota, highlighting the interconnectedness of genetics, diet, and microbial communities. Characterization of the gut microbiota revealed its importance in fish health and growth. Genetic factors appeared to play a more significant role than diet in shaping the gut microbiota composition, but interactions between genetics and diet influenced both host and microbial responses. Overall, the thesis presents promising outcomes for enhancing growth, health, and environmental adaptation in aquaculture species. By understanding the interconnectedness of genetics, nutrition, and microbiota, it aims to contribute to the sustainability of the aquaculture sector. / This PhD thesis has been elaborated by the PhD candidate thanks to two research contracts appointed to the framework of two H2020 European projects: AQUAEXCEL2020 “AQUAculture infrastructures for EXCELlence in European fish research towards 2020” (2015-2020; grant agreement nº 652831), and AquaIMPACT “Genomic and nutritional innovations for genetically superior farmed fish to improve efficiency in European aquaculture” (2019-2023; grant agreement nº 818367). During the thesis, the candidate completed a 3-months (91 days) stay in the Centre for Integrative Genetics (CIGENE), belonging to the Norwegian University of Life Sciences (NMBU) in Ås, Norway. This stay was financed by an EMBO Scientific Exchange Grant (grant agreement nº 10168). A grant from the iMOVE program from CSIC (grant agreement nº IMOVE23080) was also awarded, but not financially executed. Core publications of this thesis were funded by: AQUAEXCEL2020 H2020 EU Project (652831); PerformFISH H2020 EU Project (H2020-SFS-2016-2017; 727610); AquaIMPACT H2020 EU Project (818367); ThinkInAzul (THINKINAZUL/2021/024, PRTR-C17.I1); Bream-AquaINTECH (RTI2018–094128-B-I00); The rest of publications in which the candidate was involved received extra funding from: GAIN H2020 EU Project (773330) y AQUAEXCEL3.0 H2020 EU Project (871108) / Naya Català, F. (2024). The Two Genomes of Gilthead Sea Bream (Sparus aurata): a Multi-Omics and Holobiont Approach [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205692 / Compendio