Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_silvana_marchioro.pdf: 699240 bytes, checksum: 32b6c311c57b68941cfdd0ee832643a1 (MD5) Previous issue date: 2008-11-27 / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia (EP), one the most common respiratory diseases of pigs worldwide. The disease is characterized by retarded growth rate in animals of mid-finishing to slaughter age, causing significant economic losses to swine production. Vaccination is the most cost-effective strategy for the control of this disease. However, the vaccines against the disease available on the market have a high production cost and only offer partial protection, not preventing the establishment from infection and the presence of pigs carriers. This issue highlights the need for the use of new strategies aiming at circumventing this problem. The recombinant DNA technology is an important tool for the development of vaccines. The publication of the sequence of three genomes of M. hyopneumoniae, two pathogenic strains (232 and 7448) and a non-pathogenic (J) is helping the researches, and accelerating the process of identification of new antigenic proteins. From the sequence data and proteomic analysis, it was possible to identify coding sequences (CDS) of transmembrane proteins. These antigens were cloned and expressed using E. coli as an expression system. A total of seven recombinant proteins were purified and evaluated regarding immunogenicity in mice and antigenicity with sera from animals with EP. All the antigens evaluated were able to induce a significant immune response in mice. The evaluation of antigenicity properties revealed the proteins reacted with sera from pigs infected with M. hyopneumoniae. The recombinant proteins evaluated in this study may be of value to use in the development of vaccines and tests for immunodiagnosis of swine enzootic pneumonia. / Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma das doenças respiratórias de suíno mais comum em todo o mundo. Ela é caracterizada por retardo no desenvolvimento em animais na fase de crescimento e terminação, causando perdas econômicas consideráveis na indústria suinícola. A vacinação parece ser a forma mais efetiva de controlar a PES, entretanto, as vacinas contra a doença disponíveis no mercado apresentam um elevado custo de produção e conferem uma proteção parcial, não impedindo o estabelecimento da infecção e nem a presença de suínos portadores. Desta forma, surge à necessidade da utilização de novas estratégias visando contornar este problema. A tecnologia do DNA recombinante constitui uma ferramenta importante para o desenvolvimento de vacinas. As publicações das seqüências de três genomas de M. hyopneumoniae, duas cepas patogênicas (232 e 7448) e uma não patogênica (J) estão contribuindo com pesquisas e, acelerando o processo de identificação de novas proteínas imunogênicas. A partir dos dados gerados e da análise proteômica complementar, foi possível a identificação de seqüências codificadoras (CDS) de proteínas transmembrana. Estas seqüências foram clonadas e expressas em E. coli. Um total de sete proteínas recombinantes foram purificadas e avaliadas quanto à imunogenicidade em camundongos e à antigenicidade frente a soros de suínos com PES. Todas as proteínas avaliadas foram capazes de induzir uma resposta imune significativa em camundongos. O estudo das propriedades antigênicas revelou que estas são reconhecidas pelo soro de suínos infectados com M. hyopneumoniae. As proteínas recombinantes avaliadas neste estudo poderão ser de valia para utilização como vacinas de subunidade e em testes de imunodiagnóstico da PES.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gabriel_klafke.pdf: 1619582 bytes, checksum: dcdfb7127ef88b680dc43b41887f2c86 (MD5) Previous issue date: 2010-03-18 / During the past decades, the development of genetically modified plants became a consolidated reality. Taking advantage of the genetic engineering process, it is possible to obtain modified plants to use as bioreactors in the production of tissue or organs expressing antigens which can be easily used as vaccines. The plant-based expression systems as tomato and lettuce, which attend as models for that process, present innumerous advantages such as conservation of eukaryotic machinery, which promote pos-translational modifications, possibility of large-scale production and development of safer and economically more attractive vaccines. Taking use of that strategy, the Swine mycoplasm hyopneumoniae (SMP) disease can be one important and possible target to either be eradicated or controlled. The SMP, caused by fastidious bacterium Mycoplasma hyopneumoniae, is one of the most important respiratory disease in swine breeding, due to its very high prevalence coupled with associated losses all over the whorld, and has in the recombinant DNA technology a viable alternative in the development of more effective and safe vaccines The objective of my work was to genetically manipulate tobacco plants in order to use them as bioreactor in the production of an antigen against PMS. Tobacco leaves and internodes were cultured in different concentrations of BAP and AIA hormones. The best regeneration results for both explants were seen with 1,5mg.L-1 BAP and 0,1mg.L-1 AIA. The selection test with the kanamycin antibiotic appeared to be highly effective, showing a total inhibition of regeneration with 30 mg.L-1 and 100 mg.L-1 for leaves and internodes respectively. The recombinant colonies of A. tumefaciens, containing ltb-r, were co-cultivated with the internodes and leaves from plants germinated in vitro. The next step, the explants were transferred to the selection medium in order to induce the selection of the putatively transformed cells. The genomic DNA from regenerated and putatively transformed plants were extracted and amplified by PCR, where it was detected the presence of a band referent to ltb r1. The analyses of the integration and the transcription of ltb-r1 were carried out by Southern blot and RT-PCR, respectively. In both techniques, it was possible to confirm the presence of one band which corresponds to the expected size of ltb-r1, supporting the integration and expression of the gene. However, with the tests used here, it was not possible to detect with accuracy the recombinant protein / Nas últimas décadas, o desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma realidade consolidada. Nesse sentido, utilizando-se da engenharia genética, é possível obter plantas servindo como biorreatores na produção de tecidos ou orgãos expressando antígenos que podem ser facilmente utilizados como vacina. Os sistemas de expressão em plantas como tomate, alface, tabaco que servem como modelos desse processo, apresentam várias vantagens, entre elas, a conservação da maquinaria eucariótica que promove as modificações póstraducionais das proteínas e ainda a possibilidade de produção em larga escala. Dentro desta estratégia de produção de proteínas, pode-se citar a pneumonia micoplásmica suína (PMS), causada pelo agente Mycoplasma hyopneumoniae, uma das principais doenças de suínos que provoca elevadas perdas econômicas em todo mundo, e tem, na tecnologia do DNA recombinante, uma alternativa de desenvolvimento de vacinas mais efetivas. O objetivo do trabalho foi transformar plantas de tabaco para sua utilização como biorreator na produção de um antígeno vacinal contra a PMS. Folhas e entrenós foram cultivados em diferentes concentrações de BAP e AIA. As melhores taxas de regeneração foram encontradas utilizando 1,5 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA para segmentos de folhas e entrenós. O teste de seleção utilizando canamicina mostrou-se altamente eficiente, obtendo-se a supressão da regeneração com 30 mg.L-1 e 100 mg.L-1 para segmentos de folhas e entrenós, respectivamente. Colônias recombinantes de A. tumefaciens contendo ltb-r1 foram co-cultivadas com entrenós e segmentos foliares de plantas germinadas in vitro. Após esta etapa, os explantes foram transferidos para meios de seleção, visando selecionar células possivelmente transformadas. O DNA genômico das plantas regeneradas e putativamente transformadas foi extraído e amplificado por PCR, na qual foi possível visualizar uma banda referente ao ltb-r1. A detecção da integração e transcrição do gene foi realizada por Southern blot e RTPCR, respectivamente. Em ambas as técnicas, foi possível verificar a presença de uma banda do tamanho esperado para ltb-r1, demonstrando assim, a integração e expressão do gene. Entretanto, não foi possível detectar com precisão, através dos testes utilizados, a proteína recombinante.

O processo de micrencapsulação de proteínas em microesferas (MS) de PLGA [poli (ácido lactico-co-glicolico)] é fácil de fazer e é uma ferramenta útil para melhorar tanto uma formulação quanto para aumentar a atividade imunológica de vacinas de novas gerações. A MS-PLGA têm caráter adjuvante porque é um sistema particulado e, além disto, controla a liberação do antígeno. O escopo desta tese foi o de dar uma nova roupagem para um antígeno vacinal tradicional e muito bem estudado- o toxoide diftérico (Dtxd). Estudaram-se a produção de MS de tamanho desejado; os mecanismos que controlam danos nas proteínas durante o processo de micrencapsulação; a produção de microesferas com características de liberações em tempos distintos e ensaios biológicos. O tamanho de MS é um determinante fundamental para controlar a velocidade de liberação de um soluto. Para se produzir MS com tamanhos controlados usou-se um desenho fatorial experimental com três fatores distintos e três pontos centrais, para se determinar a influência das variáveis (concentração de poli álcool vinílico; velocidade de agitação e relação fase dispersa/fase contínua) na determinação do tamanho das MS. Foram obtidas MS esféricas e lisas de 4- 15 µm de diâmetro. Estes resultados abrem a possibilidade de se formular PLGA-MS com tamanhos planejados através de um mínimo de experimentos. O mecanismo de danos conformacionais nas proteínas nas várias fases do processo de produção de PLGA-MS é ainda uma questão em aberto. Usaram-se várias técnicas biofísicas (HPLC, espectroscopias no uv, fluorescência e CD) além de ELISA para se testar a interferência dos sais da série de Hofmeister sobre a solubilidade e estabilidade da proteína durante a emulsificação e do contacto com a interface água/cloreto de metileno (primeira etapa do processo de preparação de MS). Estudaram-se também a influência de oligômeros de PLGA e SDS sobre a estrutura da proteína no meio de liberação (etapa de liberação do soluto). A emulsificação de Dtxd na presença de Mg2+ induziu agregação protéica, com exposição de resíduos hidrofóbicos para o meio; variações no ângulo diédrico do S-S proteico e perda de identidade imunológica. Esta agregação foi quase abolida pelo caotrópico SCN- (toxicidade = 30 g/ homem adulto de 70 kg). A conformação \"nativa\" do Dtxd e sua atividade biológica foram protegidas pelo KSCN. Os oligômeros de PLGA e o SDS induziram uma conformação de Dtxd nova. A adição de KSCN na fase aquosa aumentou a eficiência de encapsulação de Dtxd pela PLGA-MS em 20 %. Esta foi a solução mais simples quando comparada com aquelas descritas na literatura. Produziram-se seis formulações diferentes (diferentes massas molares e carboximetilações do PLGA) com pelo menos três cinéticas de liberações distintas. Imunizaram-se camundongos com 5 µg de Dtxd encapsulado em MS-PLGA usando-se dois polímeros de 12 kDa (-COOH livre ou metilado) e um outro de 63 kDa (metilado). O padrão de resposta e a maturidade imunológicas foram medidos por titulações de IgG1 e IgG2a. Mantiveram-se os mesmos padrões de resposta humoral (desejável). Menores quantidades de antígenos foram necessárias para se obter os mesmos benefícios gerados pela vacina tradicional de Dtxd. Aumentaram-se a produção e a seletividade de anticorpos através de duas manipulações simples: a formulação e o tempo da aplicação da dose de reforço. Estes resultados colocam estas formulações na área de vacinas de sucesso uma vez que também foram obtidas memórias imunológicas. / The protein microencapsulation within microspheres (MS) of PLGA (Poly-lactide-co-glycolide) is easy to do and, it is a useful tool to enhance formulation and immunologic performances for new generation vaccines. MS-PLGA has adjuvant character because it is a particulate system and can control the antigen release. The question addressed in this thesis was to give this new dress for the traditional and well studied vaccine antigen - the diphtheria toxoid (Dtxd). The steps of MS control size production; mechanism to control protein damages; MS production with different polymers and biological assay were addressed here. MS size is a primary determinant of solute release velocity. A full factorial experimental design 23 with triplicate at the central point was used to determine the influence of variables (polyvinyl alcohol concentration, stirring velocity and the relationship between dispersed /continuous phase) on MS size. Uniformly spherical and smooth microspheres (4 - 15 µm of diameter) were obtained. These results open the possibility of formulating PLGA microspheres with custom sizes performing a minimum of experiments as required for specific applications. It stills an open question to detail the conformational mechanism of protein damages during the various steps of the PLGA microencapsulation process. Various techniques (HPLC gel filtration, ELISA, Fluorescence, UV and Circular dichroism spectroscopies) were tested on the interference of the Hofmeister ion series over protein solubility and stability during the emulsification and contact with the interface water/CH2Cl2 interface (First step on MS preparation). The interference of SDS and PLGA olygomers over protein structure in the liberation media was also studied (solute liberation step). The Dtxd emulsification in the presence of Mg2+ was followed by protein aggregation, with exposition of hydrophobic residues and changes on the dihedral S-S protein angle and loses on immunological identity. This aggregation is 95% avoided by the chaotropic and little toxic salt KSCN (30g/ adult human of 70 kg). All the \"native\" Dtxd conformation and biological properties were maintained by KSCN. MS with different liberation kinetics profile and different erosion characteristics were obtained by using six different polymers. The SDS and PLGA olygomers exerted a generation of new Dtxd molecular organization. The KSCN increased Dtxd encapsulation within PLGA-MS in more than 20 %. This was the simplest solution used to solve protein aggregation compared with others solutions used in the literature. The six different formulations produced (differing in molar mass and carboxymethylation) produced, at least, three different Dtxd liberation profiles. Mice were primed with 5 µg of Dtxd microencapsulated within MS prepared with 12 kDa (ended carboxymethylated or free PLGA) and with 63 kDa (methylated) PLGA. The response patterns and the immune maturity were measured by IgG1 and IgG2a titrations. The humoral pattern was maintained, but fewer antigens were needed to obtain the same traditional Dtxd vaccine benefits. The simple change on Dtxd-PLGA formulation and timing of the booster enhanced both, antibody production and selectivity. An immunological memory was also obtained, putting so, these formulations in the field of successful vaccine.

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria encapsulada causadora de doenças infecciosas como pneumonia, bacteremia e meningite, infecções essas que estão entre as principais causas de morte entre crianças, idosos e imunodeprimidos, indivíduos que constituem o grupo de risco para tais infecções. A vacinação tem sido a mais eficaz forma de conter tais infecções. A vantagem das vacinas conjugadas em comparação às polissacarídicas é a capacidade de indução de uma resposta imune T-dependente o que garante proteção mesmo ao grupo de risco para infecções por S. pneumonia. A proposta do projeto foi estabelecer um protocolo para obtenção de um conjugado constituído pelo polissacarídeo capsular de S. pneumonia sorotipo 1 (PS1) e pela proteína de superfície pneumocócica A (PspA). A síntese do conjugado empregou uma metodologia inédita para o sorotipo 1. A avaliação da resposta imune humoral induzida pelo conjugado mostrou a indução de IgG anti-PS1 gerada pelas imunizações com o conjugado PS1-PspA. / Streptococcus pneumoniae is an encapsulated bacteria causing infectious diseases such as pneumonia, bacteremia and meningitis, these infections are among the leading causes of death among children, elderly and immunocompromised, who constituting individuals of risk group. The vaccination has been the more effective form to counter these infection. The advantage of conjugated vaccines compared to vaccines polysaccharide, is the ability to induce a T-dependent immune response which provides protection even at risk groups for infection by S. pneumoniae. The project proposal was establish a protocol for obtaining a conjugate consisting of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae serotype 1 (PS1) and the pneumococcal surface protein A (PspA). The synthesis of conjugate employed a new methodology for serotype 1. The evaluation of humoral immune response induced by the conjugate showed anti-PS1 IgG induction generated by immunization with the PS1-PspA.

Neisseria meningitidis é um diplococo Gramnegativo, aeróbio e encapsulado, causador mais comum de meningite e septicemia. Este agente é o principal causador de infecções bacterianas invasivas no mundo. Apesar de existirem 13 sorogrupos de N. meningitidis, apenas 6 são capazes de causar infecção: A, B, C, W135, X e Y. O sorogrupo B difere dos outros sorogrupos patogênicos por sua cápsula polissacáride ter composição idêntica ao ácido policiálico, presente em muitas glicoproteínas humanas, particularmente encontrados no tecido cerebral fetal, e bioquimicamente homóloga com a estrutura molecular de adesão do neurônio. Sendo assim, a cápsula polissacáride não pode ser usada em vacinas conjugadas, pois pode causar autoimunidade, sendo pouco imunogênica. Doenças meningocócicas causadas pelos sorogrupos A, C, Y e W135 podem ser prevenidas pelas vacinas que contêm polissacarídeos capsulares específicos conjugados. Para que uma vacina seja eficaz contra o sorogrupo B, é importante que esta abranja todos os sorotipos e seja capaz de promover imunidade duradoura, principalmente em crianças abaixo de dois anos, as mais acometidas. Vacinas baseadas em vesículas de membrana externa (OMVs, do inglês Outer Membrane Vesicles) de N. meningitidis B são amplamente estudadas. No presente estudo, OMVs de meningococo B (B:4:P1.9) foram associadas a um lipídio catiônico, o dioctadecildimetilamônio (DDA-BF) em preparação antigênica testada em camundongos fêmeas não isogênicos, e comparamos os títulos de anticorpos IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b com os anticorpos produzidos por camundongos imunizados com a mesma OMVS associada ao hidróxido de alumínio, por ELISA. As análises foram realizadas com soros de cada animal colhidos individualmente, após 60 dias de imunização. A avidez dos anticorpos também foi analisada por ELISA. Immunoblot e Dot-ELISA avaliaram a reação específica entre a cepa homóloga usada na imunização e a reação a antígenos cruzados com outras cepas de meningococo. A hipersensibilidade tardia (HTT) foi comparada entre os dois grupos experimentais, após o desafio com cepa homóloga em uma das patas, depois de 24 horas da injeção, após 14 dias da primeira dose de imunização. / Neisseria meningitidis is an encapsulated Gram-negative aerobic diplococcus, the most commom meningitidis and sepsis agent , and the major bacterial invasive disease agent worldwide. Infections are caused by only 6 of 13 pathogenic serogroups: A,B,C, W135 and Y. Meningococcal serogroup B differs from the other pathogenic serogroups because it has a capsular polysaccharide identical to the polysialic acid present in many human glycoproteins, in particular, it is similar to carbohydrates found in fetal brain tissue. This is the reason that it does not allow the use of polysaccharide protein in conjugate vaccine, and for its low immunogenic. An effective meningococcal B vaccine development should cover all serotypes and be able to promote long term immunity, mainly in children under 2 years, the most affected age. Meningococcal outer membrane vesicles (OMVs) vaccines are widely studied. In this present study, meningococcal serogroup B OMVs (B:4:P1.9) was associated with a cationic lipid, dioctadecyldimetylammonium (DDA-BF) in an antigenic preparation tested in female outbred mice. Individual serum was collected, and antibodies titles IgG, IgG1, IgG2a were compared with animals immunized with OMVs and aluminium hydroxide, analyzed by ELISA. Analyses were carried out 60 days after first immunization. Antibodies avidity index were also analyzed by ELISA. Immunoblot and Dot-ELISA were carried out to evaluate specific reaction for homologous stranis and cross-reactive antigens present in other meningococcal strains. Delayed type hypersensitivity (DTH) was compared between two experimental groups, 24 hours before injection of homologous strain challenge.

Neisseria lactamica, uma bactéria comensal não patogênica, predominantemente humana e usualmente encontrada no trato respiratório superior de crianças, está intimamente relacionada a Neisseria meningitidis patogênica. A colonização com N. lactamica pode ser responsável pelo envolvimento da imunidade natural contra a infecção pelos meningococos em crianças pequenas, quando as taxas de portadores de meningococos são baixas. Estas características levam a sugerir que os componentes de N. lactamica possam ser um elemento-chave para a produção de uma nova vacina para N. meningitidis. Devido ao pouco conhecimento sobre a dinâmica dos portadores e sobre a diversidade da população de N. lactamica em crianças, tem sido difícil escolher um isolado representativo para preparar um adequado produto imunogênico. Em nosso estudo, foi proposto um protocolo para estudar a imunogenicidade de whole cells de N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca ou N. meningitidis c (isoladas de portadores), através da imunização intranasal em coelhos, considerando a via de entrada natural do patógeno. Isolados da orofaringe de N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca ou N. meningitidis c, foram inoculados em coelhos adultos pela via intranasal, numa concentração de densidade ótica 1.0 a 650nm, num volume de 1000 ?L. Os coelhos foram imunizados por quatro vezes em intervalos de sete dias. Também foram usadas cepas como N. subflava, N. elongata, N. sicca, N. perflava, N. mucosa isoladas do líquido cérebro-espinhal ou sangue de pacientes. Os coelhos desenvolveram níveis de anticorpos IgG específicos no soro, como foi determinado por ELISA usando whole cells de cepas homólogas e heterólogas. O soro dos coelhos imunizados com N. lactamica, N. meningitidis, N.sicca ou N. meningitidis c, apresentaram anticorpos IgG que reagiram com antígenos numa faixa de 5 a 130 kDa por meio de immunoblot. Os anticorpos presentes nos soros dos coelhos imunizados com N. lactamica não induziram altos títulos de anticorpos com atividade bactericida contra as cepas de N. meningitidis, no entanto, esta atividade pode ser observada com anticorpos produzidos pelos coelhos imunizados intranasalmente com N. meningitidis. Anticorpos IgG de alta avidez foram produzidos, embora não tenha sido determinada uma significativa correlação entre atividade bactericida e a indução de anticorpos IgG de alta avidez, principalmente nos coelhos imunizados com N. lactamica. A imunização RESUMO intranasal usando whole cells de N. lactamica foi adequada para sensibilizar eficientemente o sistema imune de mucosa no modelo coelho. / Neisseria lactamica, a commensal bacterium non-pathogenic to human beings and usually found in the upper respiratory tract of children, is closely related to pathogenic Neisseria meningitides. Colonization with N. lactamica can be responsible for evolving natural immunity to meningococcal infection in childhood, when rates of meningococcus carriers are low. These features lead to suggest that N. lactamica components can be key-elements in the production of a new vaccine for N. meningitides. As little is known about dynamic carriers and N. lactamica population diversity in children, it has been difficult choosing a representative for preparing an adequate immunogenic product. A protocol was proposed to study immunogenicity of whole cells of N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca or N. meningitides c (carrier-isolated) by i.n. immunization in rabbits considering the natural pathogen entry route. Oropharinx-isolated N. lactamica, N. meningitidis, N. sicca, or N. meningitides c were i.n. inoculated into adult rabbits, in a concentration of optical density 1.0 at 650nm in a volume of 1000 ?L. The rabbits were immunized four times at seven-day intervals. N. subflava, N. elongata, N. sicca, N. perflava, N. mucosa strains isolated from CSF and blood from patients were also used. The rabbits developed levels of specific lgG antibodies in serum, as determined by ELISA using whole cells of homologous and heterologous strains. Serum from rabbits immunized with N. lactamica, N. meningitidis, and N. sicca or N. meningitides c, presented lgG antibodies reactive to 5 to 130 kDa antigens on immunoblot. Antibodies in serum from rabbits immunized with N. lactamica failed to induce high concentration of antibodies with bactericidal activity against N. meningitidis; however, this activity could be observed with antibodies produced by rabbits i.n. immunized with N. meningitidis. High avidity lgG antibodies were produced, although a significant correlation between bactericidal activity and induction of lgG antibodies of high avidity could not be determined, mainly in rabbits immunized with N. lactamica. Intranasal immunization of N.lactamica whole cells was suitable to efficiently sensitize mucosal immune system in rabbit model.

Streptococcus pneumoniae é o principal causador da pneumonia bacteriana. As vacinas atualmente disponíveis contêm polissacarídeo capsular conjugado ou não com proteínas carreadoras. No entanto, elas apresentam elevado custo ou proteção reduzida nos grupos de risco (crianças abaixo de 5 anos de idade e idosos). Proteínas de superfície de S. pneumoniae, como a PsaA e PspA, são consideradas fortes candidatas vacinais. Com o objetivo de se desenvolver uma vacina de ampla cobertura e baixo custo contra pneumococos, os genes psaA e pspA foram clonados em vetores de expressão em E. coli, pAE e pET e as proteínas expressas foram purificadas por cromatografias de afinidade e de troca aniônica. O rendimento de proteína recombinante obtido com a construção baseada em pET foi 3 vezes maior que o obtido com pAE. Condições de cultivo foram estabelecidas utilizando meio definido com indução por IPTG e/ou por lactose. As cepas recombinantes estão adequadas para serem usadas em estudos para escalonamento da produção em biorreatores. / Streptococcus pneumoniae is the main causative agent of bacterial pneumonia. The current vaccines available contain capsular polysaccharide conjugated or not with carrier proteins. However these are either too expensive or do not protect the high-risk groups. Surface proteins of S. pneumoniae, such as PsaA and PspA, are considered strong vaccine candidates. With the aim of developing a broad-coverage and low-cost vaccine against pneumococcus, the psaA and pspA genes were cloned in E. coli expression vectors, pAE and pET and the expressed proteins were purified through affinity and anion exchange chromatography. The yield of the recombinant protein obtained with the construction based in pET was 3-fold higher than that obtained with pAE. Culture conditions were established using defined media with IPTG and/or lactose induction. The recombinant strains are now ready to undergo studies for scale-up of production in bioreactors.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Final_Mestrado_LUIS.pdf: 605028 bytes, checksum: 6ca4c3db0bd66eea45bbf1d31830b978 (MD5) Previous issue date: 2007-02-28 / The effect of Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) and number of doses of rabies vaccines on the humoral immune response in cattle were evaluated through rabies neutralizing antibody titers. Sixty cattle were randomly divided into four groups: animals from FEV1 and FEV2 received Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) mixed with mineral salt, and animals from groups V1 and V2 received only mineral salt. Cattle from group FEV2 and V2 were immunized with two rabies vaccine doses on days 0 and 30, respectively; cattle from groups FEV1 and V1 were vaccinated only once on day 0. The results obtained show that no significant difference was found among neutralizing-antibody titers between groups treated and not treated with Matricaria chamomilla CH12; antibody titers were significantly higher in cattle immunized with two rabies vaccine doses; 93.3% of the animals vaccinated only once had antibody titers < 0.5 UI/mL sixty days after commencing vaccination. In conclusion, the use of Matricaria chamomilla CH12 added to mineral salt does not change humoral immune response in cattle, and two vaccine doses are suggested forachieving antibody titers in protective level (&#8805; 0.5UI/mL). / Objetivou-se avaliar o efeito da Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) e do número de doses de vacina na resposta imune humoral em bovinos por meio dos títulos de anticorpos anti-rábicos. Sessenta bovinos foram divididos randomicamente em quatro grupos: os animais dos grupos FEV1 e FEV2 receberam Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) misturados no sal mineral e os bovinos dos grupos V1 e V2 receberam somente sal. Nos bovinos dos grupos FEV2 e V2 aplicaram-se duas doses de vacina anti-rábica nos dias 0 e 30, respectivamente; enquanto que os bovinos dos grupos FEV1 e V1 foram vacinados somente no dia 0. Os resultados obtidos mostram diferença não significativa nos títulos de anticorpos anti-rábicos entre os grupos tratados ou não com Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®); os títulos de anticorpos aumentaram significativamente nos animais que foram imunizados com duas doses de vacina; 93,3% dos animais que receberam uma dose de vacina comercial apresentaram títulos de anticorpos < 0,50 UI/mL sessenta dias após a vacinação. Conclui-se que, a Matricaria chamomilla CH12 adicionada ao sal mineral não aumentou a resposta imune humoral em bovinos e é necessário a aplicação de duas doses de vacina para os bovinos obter títulos protetores de anticorpos.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Final_Mestrado_LUIS.pdf: 605028 bytes, checksum: 6ca4c3db0bd66eea45bbf1d31830b978 (MD5) Previous issue date: 2007-02-28 / The effect of Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) and number of doses of rabies vaccines on the humoral immune response in cattle were evaluated through rabies neutralizing antibody titers. Sixty cattle were randomly divided into four groups: animals from FEV1 and FEV2 received Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) mixed with mineral salt, and animals from groups V1 and V2 received only mineral salt. Cattle from group FEV2 and V2 were immunized with two rabies vaccine doses on days 0 and 30, respectively; cattle from groups FEV1 and V1 were vaccinated only once on day 0. The results obtained show that no significant difference was found among neutralizing-antibody titers between groups treated and not treated with Matricaria chamomilla CH12; antibody titers were significantly higher in cattle immunized with two rabies vaccine doses; 93.3% of the animals vaccinated only once had antibody titers < 0.5 UI/mL sixty days after commencing vaccination. In conclusion, the use of Matricaria chamomilla CH12 added to mineral salt does not change humoral immune response in cattle, and two vaccine doses are suggested forachieving antibody titers in protective level (&#8805; 0.5UI/mL). / Objetivou-se avaliar o efeito da Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) e do número de doses de vacina na resposta imune humoral em bovinos por meio dos títulos de anticorpos anti-rábicos. Sessenta bovinos foram divididos randomicamente em quatro grupos: os animais dos grupos FEV1 e FEV2 receberam Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®) misturados no sal mineral e os bovinos dos grupos V1 e V2 receberam somente sal. Nos bovinos dos grupos FEV2 e V2 aplicaram-se duas doses de vacina anti-rábica nos dias 0 e 30, respectivamente; enquanto que os bovinos dos grupos FEV1 e V1 foram vacinados somente no dia 0. Os resultados obtidos mostram diferença não significativa nos títulos de anticorpos anti-rábicos entre os grupos tratados ou não com Matricaria chamomilla CH12 (Fator Estresse®); os títulos de anticorpos aumentaram significativamente nos animais que foram imunizados com duas doses de vacina; 93,3% dos animais que receberam uma dose de vacina comercial apresentaram títulos de anticorpos < 0,50 UI/mL sessenta dias após a vacinação. Conclui-se que, a Matricaria chamomilla CH12 adicionada ao sal mineral não aumentou a resposta imune humoral em bovinos e é necessário a aplicação de duas doses de vacina para os bovinos obter títulos protetores de anticorpos.

A febre aftosa é causada por um vírus do gênero Aphtovirus, cujas proteínas não estruturais (PNE) estão relacionadas diretamente a replicação viral e são comuns a todos os sorotipos e, portanto, são mais adequadas à pesquisa de anticorpos contra este vírus. Métodos de diagnóstico capazes de diferenciar animais infectados de vacinados aliados ao uso de vacinas purificadas quanto à PNE são imprescindíveis na estratégia para comprovação de ausência de transmissão viral. Através da Instrução Normativa nº 50/2008, o Brasil passou a realizar o controle oficial da pureza nas vacinas contra a febre aftosa. O objetivo deste trabalho foi avaliar se as chances de encontrar bovinos reativos aos testes sorológicos serão maiores antes da implantação do controle oficial, tanto nos resultados do controle oficial das vacinas, quanto nos inquéritos. Para isto, foram utilizados modelos de regressão logística com efeitos aleatórios, interações e controle de possíveis confundidores. Os resultados demonstraram que no realizado em laboratório oficial em 1016 partidas de vacinas, observou-se que a chance de ocorrência de resultados reativos antes da implantação da norma utilizando o método de triagem ELISA 3ABC NCPanaftosa foi 2,86 (IC95%,1,92-4,14) vezes a chance de ocorrência nos testes de vacina feitos após a norma, utilizando-se o mesmo método de triagem. Já a chance de resultados reativos antes da norma, utilizando-se o método NCPanaftosa, foi 19,70 (IC 95%,8,55- 45,37) vezes a chance de ocorrência após a norma com o uso do método PrioCHECK como triagem Já, a partir da comparação entre inquéritos soroepidemiológicos, foi possível observar que antes da implantação da IN50/2008 a chance de ocorrência de resultados reativos em bovinos que receberam uma dose de vacina foi 2,22 (IC 95%, 1,22-4,06) vezes a chance da ocorrência em bovinos não vacinados. Já, a chance de ocorrência de resultados reativos em bovinos que receberam duas ou três vacinas foi 5,94 (IC 95%, 3,25-10,87) vezes a de bovinos não vacinados. Nas estimativas modeladas para os inquéritos soroepidemiológicos realizados após a implantação da norma, independentemente do método de triagem utilizado, não houve associação significativa entre diferentes doses de vacinas e a ocorrência de animais reativos. Os resultados obtidos sugerem que há uma associação do controle oficial com a melhoria da produção de vacinas no que diz respeito a purificação do antígeno, assim como, indicam que a melhoria na pureza está associada à diminuição na chance de ocorrência de bovinos reativos em inquéritos soroepidemiológicos, ou seja, redução nos falso-positivos a campo. / Foot and mouth disease (FMD) is a highly contagious disease caused by an Aphtovirus. Non-structural proteins (NSP) of this virus are directly related to viral replication and are common to all serotypes. Therefore, are more suitable for antibodies-based serological diagnosis. Diagnostic methods capable of differentiating infected from vaccinated animals (DIVA) are important surveillance tools; however, strategies should be in step with the development of vaccines. Since January 2009, the Brazilian government has been conducting an official control to evaluate NSP purity in vaccines production through the Normative Instruction No. 50 from 2008. This paper evaluates the situation of the vaccines produced in Brazil regarding NSP purification based on the results of the official control carried out by MAPA, as well as the adequacy of the surveillance system based on seroepidemiological surveys. Logistic regression with random effects, interactions and control for potential confounders were the chosen models. For the data obtained from the control of vaccines carried out in the official laboratory, the model estimated that the chance of occurrence of seroreactive results before the application of the official control using the 3ABC NCPanaftosa ELISA as screening method was 2.86 (95% CI, 1.92-4.14) times the chance of occurrence in the vaccine tests made after the standard, using the same method. The chance of seroreactive results before the official control, using the NCPanaftosa method as screening, was 19.70 (95% CI, 8.55 to 45.37) times the chance of occurrence after the official control with the use of the PrioCHECK method Comparing the seroepidemiological surveys results, the model indicated that, before the official control of vaccine purity, the chance of occurrence of reactive results in cattle receiving a single dose of vaccine was 2.22 (95% CI, 1.22 -4.06) times the chance of occurrence in unvaccinated animals. Furthermore, the chance of occurrence of reactive results in animals receiving two or three vaccines was 5.94 (95% CI, 3.25-10.87) times that of unvaccinated animals. Despite that, there was no significant difference in the estimates of the odds ratio between different doses of vaccines regardless of the screening method used for the seroepidemiological surveys performed after the official control of vaccines purity,. The present study suggests that there is an association of the implementation of Normative Instruction No. 50 from 2008 with the improvement of the NSP purity of vaccines, as well as indicates that this improvement is associated with a decrease in chance of occurrence of reactive animals in seroepidemiological surveys, i.e., reduction of false-positives in field monitoring.