Introdução: A infecção genital pelo papilomavírus humano (HPV) é um fator necessário para o desenvolvimento do câncer cervical. Vacinas para prevenir a infecção pelos tipos de alto risco HPV 16 e 18 foram desenvolvidas e idealmente devem ser administradas antes da exposição ao HPV através do contato sexual. As variações na prevalência do HPV e na de seus tipos específicos em diferentes populações podem influenciar as recomendações da vacina contra o HPV em diferentes locais. A vacinação após o primeiro parto poderia ser uma estratégia em potencial para atingir mulheres jovens e saudáveis, dependendo da proporção de mulheres desse grupo ainda não infectadas pelos tipos de alto risco, HPV 16 e 18. Objetivos: O objetivo principal deste estudo foi determinar a prevalência genital do DNA de tipos específicos do HPV e avaliar a associação dessa infecção com fatores de risco selecionados em mulheres após o primeiro parto, usuárias de uma maternidade pública. Métodos: Esse estudo transversal foi realizado no Hospital Maternidade Leonor Mendes de Barros (HMLMB), uma das maiores maternidades públicas da cidade de São Paulo. Durante junho de 2006 até fevereiro de 2007, 301 primíparas de 15-24 anos, cujos partos ocorreram no referido Hospital, foram incluídas no estudo entre 43 e 60 dias após o parto. Na detecção de DNA do HPV extraído das células cervicais esfoliadas foi utilizado protocolo padrão da Reação em Cadeia por Polimerase (PCR), utilizando primers PGMY09/11. Para estimar a associação da infecção por HPV com fatores de risco selecionados, foi calculada a Razão de Prevalência (RP) e o intervalo de 95% de confiança [IC]; o ajuste foi realizado utilizando-se o Modelo Linear Generalizado (MLG) com distribuição binomial e função de ligação logarítmica. Resultados: O DNA do HPV foi detectado em 58,5% (IC 95% 52,7%-64,0%) das jovens mulheres. Os tipos de HPV mais comumente encontrados foram: HPV 16, HPV 51, HPV 52, HPV 58 e HPV 71. A prevalência dos tipos de HPV incluídos nas vacinas profiláticas foi: HPV 16 - 12,0%, HPV 18 - 2,3% e HPV 6+11 - 4,3%. Os tipos de alto risco de HPV foram encontrados em 133 (44,2%) mulheres, enquanto 43 delas (14,3%) apresentaram somente tipos de HPV de baixo risco. Cento e duas mulheres (33,9%) foram positivas para apenas um tipo de HPV; entretanto, 43 (14,3%) apresentaram dois tipos, e 31 (10,3%) apresentaram três ou mais tipos virais. A análise multivariada revelou que somente a idade (p=0,020) e o hábito de fumar (p <0,001) foram fatores de risco independentemente associados com a infecção por HPV. Conclusões: Essas adolescentes e jovens primíparas apresentaram elevada prevalência de infecção genital por tipos de alto risco do HPV, mostrando que constituem um grupo de risco para o desenvolvimento de câncer cervical. Contudo, apenas 17,3% apresentaram pelo menos um dos quatro tipos virais presentes na vacina quadrivalente (HPV 6, 11, 16 ou 18), 13,3% apresentaram infecção pelos tipos HPV 16 ou 18, e somente 1,0% apresentou concomitantemente infecção por esses dois tipos virais de alto risco presentes nas vacinas. Portanto, esse estudo indica que a grande maioria dessas jovens primíparas poderia ainda se beneficiar da imunização (catch-up) contra o HPV e constitui um grupo que deve ser alvo de programas efetivos de prevenção primária e secundária para o câncer cervical / Introdution: Genital infection by human papillomavirus (HPV) is a necessary factor in the development of cervical cancer. Vaccines to prevent infection by high risk HPV genotypes 16 and 18 were developed and ideally should be administered before exposure to HPV through sexual contact. Variations in HPV prevalence in different populations and of specific HPV types could affect vaccine recommendations in different settings. Vaccination after first delivery could be a potential strategy for reaching healthy young women depending on the baseline prevalence of high risk genotypes 16 and 18 in this target group. Objectives: The main objective of this study was to determine genital type specific HPV DNA prevalence and selected risk factors associated with HPV infection after the delivery of the first child among young women in a public maternity. Methods: This cross-sectional study was carried out at Hospital Maternidade Leonor Mendes de Barros (HMLMB), one of the largest public maternity hospitals in Sao Paulo. During June 2006 to February 2007, 301 primiparous women aged 15-24 years, who gave birth at that hospital, were included in the study between 43 and 60 days after delivery. Detection of HPV DNA in cervical specimens was performed using a standardized polymerase chain reaction (PCR) protocol with PGMY09/11 primers. To estimate the association of HPV infection with selected risk factors, prevalence ratios (PR) and 95% confidence interval [CI] were estimated using a Generalized Linear Model (GLM) with binomial distribution and log link function. Results: Any HPV DNA was detected in 58.5% (95% CI 52.7%-64.0%) of the enrolled young women. Most common types of HPV found were: HPV16, HPV51, HPV52, HPV58 and HPV71. The overall prevalence of HPV types targeted by the HPV prophylactic vaccines was: HPV16 - 12.0%, HPV18 -2.3% and HPV 6+11- 4.3%. High-risk HPV types were found in 133 (44.2%) women, whereas 43 women (14.3%) had only low-risk HPV types. One hundred and two women (33.9%) were positive for one HPV type only; however, 43 (14.3%) had two types, and 31 (10.3%) had three or more types detected. The multivariate analysis revealed that only age (p for trend =0.020) and smoking habits (p <0.001) were risk factors independently associated with HPV infection. Conclusions: These adolescents and young primiparous women had high cervical HPV prevalence, suggesting that this is a high risk group for cervical cancer development. Nevertheless, 17.3% were positive to any of the four HPV types included in HPV vaccines (HPV6, 11, 16 or 18), with 13.3% positive for HPV 16 or 18, and only 1.0% of them had both vaccine related oncogenic HPV types. Thus, this study supports that the most part of young primiparous women could benefit from catch-up HPV vaccination, and represents a target group for effective primary and secondary cervical cancer prevention programs

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose endêmica no Brasil. A busca por alternativas para reduzir o tempo de tratamento da PCM levou ao desenvolvimento de uma vacina de DNA contendo a sequência do peptídeo P10 de P. brasiliensis. Neste trabalho, avaliamos a geração de células T de memória e células T reguladoras em camundongos imunizados com esta vacina de DNA antes e após o desafio com o fungo, através da análise de seus esplenócitos e linfócitos pulmonares por citometria de fluxo. Os resultados mostram um aumento no percentual de células T reguladoras e de memória no baço e pulmões dos animais imunizados antes e depois de 30, 60 e 120 dias do desafio em comparação com os grupos controle e não imunizado. Outro experimento revelou que o modelo experimental da PCM in vivo é capaz de induzir a expressão de ROR&#947t. Este estudo mostra que nossa vacina de DNA contra a PCM gera células com fenótipo de reguladoras e de memória, caracterizando seu potencial para o tratamento desta micose. / Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungal pathogen that is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a mycosis endemic in Brazil. The search for new alternatives to reduce the duration of PCM treatment led to the development of a DNA vaccine encoding the peptide P10 of P. brasiliensis. Presently, we evaluated the generation of memory and regulatory T cells in mice immunized with this DNA vaccine, before and after the challenge with the fungus by analizing their splenocytes and pulmonary lymphocytes by flow cytometry. The results show an increase in the percentage of regulatory and memory T cells on spleens and lungs of immunized mice before and after 30, 60 and 120 days of challenge compared with the control and untreated groups. Another experiment revealed that the PCM in vivo infection model is capable of inducing ROR&#947t expression. This study demonstrates that our DNA vaccine against PCM generates cells with a regulatory and memory phenotype, which shows its potencial in the treatment of this mycosis.

Flagelina, a subunidade estrutural dos flagelos bacterianos, pode ser empregada em estratégias vacinais como carregadora de epitopos antigênicos fusionados ou como adjuvante. Neste trabalho avaliamos a imunogenicidade e o potencial vacinal das flagelinas Salmonella enterica sorovar Typhimurium em camundongos BALB/c após administração pelas vias oral ou intraperitoneal. Os resultados indicam que animais imunizados pela via oral com linhagens flageladas de S. Typhimurium não desenvolvem respostas de anticorpos, sistêmicos ou secretados, anti-flagelina, por outro lado, ativam respostas celulares específicas para as flagelinas em função da via de administração utilizada. Observamos ainda que as diferentes flagelinas testadas apresentam efeito adjuvante quando co-administradas pela via nasal com a fímbria CFA/I de ETEC. Em suma, os resultados apresentados contribuem para um melhor conhecimento sobre as propriedades imunológicas e adjuvantes das flagelinas de S. Typhimurium e agregam informações para o uso racional dessas proteínas em formulações vacinais. / Flagellin, the structural subunit of bacterial flagella, can be used in vaccine development as a fused antigenic epitope carrier or as an adjuvant. In this work we evaluated the immunogenicity and vaccine approach of S. Typhimurium flagellin in BALB/c mice after administration by oral or intraperitoneal route. Our results indicate that mice immunized by oral route with flagellated S. Typhimurium strains do not develop any anti-flagellin antibody response, be it serum or secreted. On the other hand, specific anti-flagellin cellular response was observed depending on the chosen route of immunization with S. Typhimurium attenuated strain. Furthermore, all flagellins tested proved to be efficient adjuvants when co-administrated with CFA/I fimbriae by nasal route. Together, these results contribute to a better understanding of the immunological and adjuvant properties of S. Typhimurium flagellins and also provide information on the rational use of these proteins in vaccine development.

As células tumorais prosperam como consequência da capacidade de resistir aos mecanismos de morte celular e de evasão da vigilância imunológica. Nós propomos que, em cânceres que possuem o supressor de tumor p53 selvagem, a remediação de ambas dessas defesas pode ser promovida pela transferência genica combinada de vetores adenovirais portadores dos transgenes de p19Arf (proteína supressora de tumor, parceira funcional de p53) e de interferon-beta (IFNbeta, citocina imunomoduladora). De fato, em resultados anteriores, notamos que a transdução combinada (p19Arf/IFNbeta), mas não os tratamentos individuais, em células de melanoma murino B16F10 resulta em aumento massivo de morte celular. Porém a capacidade destas células em processo de morte de desencadear imunidade antitumoral não foi analisada. Nesta tese e em estudos complementares, buscamos investigar os mecanismos moleculares de morte celular envolvidos na resposta imune estimulada por p19Arf/IFNbeta e explorar sua aplicação como imunoterapia do câncer. Inicialmente, em modelo de vacinação profilática, revelamos que o tratamento combinado em células B16F10 promove a expressão de IL-15, ULBP1, dos receptores de morte FAS/APO1 e KILLER/DR5, assim como uma resposta de células natural killer que rejeitam estas células tratadas quando inoculadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Após desafio tumoral no flanco oposto, a progressão desses tumores foi fortemente reduzida devido ao engajamento de linfócitos T CD4+ e CD8+, que apresentaram produção aumentada das citocinas IFN-? e TNF-alfa e medeiam proteção antitumoral de longo prazo. Em seguida, explorando um contexto de imunização diferente, a transferência de gênica in situ foi realizada em carcinoma heterotópico de pulmão e exibiu proteção significativa contra um desafio tumoral secundário, apenas quando o tumor primário foi tratado com p19Arf/IFNbeta. Análise de transcriptoma destes tumores indicou uma assinatura quimiotáxica de neutrófilos e linfócitos T CD8+ através das quimiocinas CCL3, CXCL3 e da IL-1beta. Em apoio destas observações, análises mecanicistas in vitro revelaram que células tratadas com p19Arf/IFNbeta ativam programas apoptóticos de p53 e antivirais de IFNbeta, enquanto sucumbem a um processo de morte por necroptose que também libera moléculas de morte celular imunogênica (MCI), calreticulina, ATP e HMGB1. No entanto, procurando potencializar ainda mais o benefício terapêutico dos nossos vetores, exploramos sua associação com o quimioterápico imunogênico doxorrubicina (Dox), que também é indutor de MCI. E nesta associação, percebemos que a Dox aumenta não apenas os níveis de morte celular, mas também a imunogenicidade das células tratadas, proporcionando em um modelo de vacina terapêutica, um controle tumoral superior em camundongos que já portavam antes da vacinação tumores B16F10 ou MCA205. Além disso, a associação in situ destas terapias restaurou a eficácia de uma dose sub-terapêutica de Dox, que em contraste com sua dose terapêutica, não prejudica a função cardíaca. Finalmente, também exploramos a associação com o bloqueio dos pontos de controle imunológicos PD-1 ou CTLA-4, que no modelo de vacina terapêutica, sua associação induziu maior rejeição completa de tumores B16F10. Em conclusão, aqui apresentamos evidências sobre a capacidade da combinação p19Arf/IFNbeta de induzir morte celular e estimulação imunológica. E ressaltamos seu potencial como uma estratégia de imunoterapia do câncer / Cancer cells thrive as a consequence of resisting cell death mechanisms and escaping from immune surveillance. We propose that, in cancers that harbor the wild-type tumor suppressor p53, remediation of both of these defenses can be achieved by harnessing the adenoviral vector mediated gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein, p53 functional partner) together with interferon-beta (IFNbeta, immunomodulatory cytokine). Indeed, in our initial observations, it was noticed that combined-transduction (p19Arf/IFNbeta), but not the individual treatments, of B16F10 mouse melanoma cells results in massive cell death levels. Yet, the capability of these dying cells to unleash antitumor immunity was not investigated. Here in this thesis and in complementary studies, we sought to investigate the molecular mechanisms of cell death involved in the p19Arf/IFNbeta immune stimulation and explore its potential as a mediator of cancer immunotherapy. First, in a prophylactic B16F10 vaccine model, we revealed that the dual treatment led to the up-regulation of IL-15, ULBP1, FAS/APO1 and KILLER/DR5 death receptors, plus a natural killer cell response that completely rejects treated cells when inoculated in syngeneic immunocompetent mice. Whereas, upon a contralateral tumor challenge, progression was strongly reduced by engaging both CD4+ and CD8+ T cells, which displayed augmented production of IFN-? and TNF-alpha cytokines and provided long term antitumor protection. Next, exploring different immunization context, in situ gene transfer in a heterotopic lung carcinoma exhibited significant protection against a secondary tumor challenge only when the primary tumor was treated with p19Arf/IFNbeta. Transcriptome analysis of these treated tumors indicated a chemotaxic signature of neutrophils and CD8+ T cells with the involvement of CCL3, CXCL3 chemokines and IL-1beta. Moreover, in support of this evidence, mechanistic in vitro studies revealed that p19Arf/IFNbeta treated cells reactivate p53 apoptotic and IFNbeta antiviral programs, while succumbing to a necroptosis cell death processes that also releases immunogenic cell death (ICD) molecules, calreticulin, ATP and HMGB1. Yet, aiming to potentiate therapeutic benefit of our vectors, we explored their association with doxorubicin (Dox) immunogenic chemotherapy, which is also an inducer of ICD. And in this setting, this association with Dox enhances not only cell death levels but also immunogenicity of treated cells, providing superior tumor control in a therapeutic vaccine model, where mice were already bearing B16F10 tumors or MCA205 sarcomas before vaccination. Moreover, associated use of these therapies in situ rescued efficacy of a sub-therapeutic dose of Dox, which in contrast to its therapeutic dose, does not impair cardiac function. Finally, we also evaluated the association with PD-1 or CTLA-4 checkpoint blockade immunotherapy, which in the therapeutic vaccine model induced full tumor rejection in a greater number of mice. In sum, here we provide compelling evidence for the ability of the p19Arf/IFNbeta combined gene transfer to promote cell death and immunogenic stimuli and underscored its potential to be applied as a cancer immunotherapy strategy

Desde o início da pandemia de HIV/aids, a imunoterapia vem sendo utilizada como alternativa terapêutica numa tentativa de estimular uma resposta do sistema imunológico contra o agente agressor. Esta abordagem tem sido considerada promissora para obtenção do controle da infecção em longo prazo. A administração de células apresentadoras de antígeno, em especial células dendríticas, é fundamentada pelos conceitos de imunoterapia passiva e de terapia celular ativa (vacina terapêutica) além da perspectiva da eliminação dos chamados reservatórios virais, unindo assim estas diversas estratégias de intervenção. Dentre os diferentes antígenos do HIV utilizados para pulsar as células dendríticas, alguns dos melhores resultados foram obtidos com a inativação química do vírus, preservando a integridade da estrutura da sua superfície.Há alguns anos nosso grupo vem trabalhando com terapia celular baseada em células dendríticas derivadas de monócitos autólogos, pulsadas com HIV inativado quimicamente, seguindo o protocolo descrito por Lu e colaboradores em 2004. Aqui, nós apresentamos os resultados de um ensaio clínico de fase I/II que teve como objetivos avaliar a tolerância, segurança e impacto imunovirológico, de diferentes formulações do produto em pacientes cronicamente infectados pelo HIV, sem uso de antirretrovirais. Os participantes foram alocados em três braços para receber composições distintas: 3x107 células dendríticas sem pulso adicional de HIV inativado (Braço A), 3x106 células dendríticas com pulso adicional de HIV inativado (Braço B) ou 3x107 células dendríticas com pulso adicional de HIV inativado (Braço C). O número de participantes no braço A evoluiu com uma considerável diminuição ao longo do período de observação do estudo, prejudicando as avaliações. As análises dos outros braços mostraram que as preparações foram seguras, não se observando eventos adversos relacionados à intervenção. Os resultados sugeriram um aumento na carga viral plasmática associados a uma redução das sub-populações de linfócitos TCD4+ e TCD8+ nos pacientes do braço C além de uma redução na quantidade de linfócitos T reguladores nos indivíduos do braço B / Since the beginning of the HIV / aids pandemic, immunotherapy is being used as an alternative therapy in attempt to stimulate an immune response against the pathogenic agent. This approach has been considered as promising for achieving the control of infection in the long term. Administration of antigen presenting cells, particularly dendritic cells is based on the concepts of passive immunotherapy and active cellular therapy (therapeutic vaccine), with the perspective of eliminating the so-called viral reservoirs, thus joining different intervention strategies. From different antigens tested for loading DCs, some of the best results were obtained with chemically inactivated virus, which preserves its surface proteins.Our group has been working with cellular therapy based on dendritic cells derived from autologous monocytes pulsed with chemicallyinactivatedHIV, following the protocol described by Lu et al in 2004.Here, we present the results of a phase I / II clinical trial aimed to evaluate tolerance, safety and immunovirological impact of different product formulations in chronically HIV-infected individuals, naïve for antiretroviral treatment.Participants were allocated to receive: 3x107 un-pulsed DCs (Arm A), 3x106 HIV-pulsed DCs (Arm B) or 3x107 HIV-pulsed DCs (Arm C). The number of participants in the arm A evolved with a considerable decrease over the study, so any considerations about effect of DCs without antigen overload were difficult to carry out. Outcomes in other arms showedthat they were safe, with no adverse events related to the products. The results suggested an increase in plasma viral load and decline in CD4+ and CD8+ T cells subpopulations after intervention in arm C. Additionally, we observed a decrease in percentage of regulatory T cells in arm B patients

Introdução: O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço avançado é uma doença de difícil tratamento. Apesar dos avanços nas técnicas de diagnóstico e tratamento nos últimos 30 anos não ocorreram ganhos significativos em sobrevida. A falha no tratamento ocorre principalmente pela recidiva locorregional e freqüentemente impede a realização de tratamentos de resgate. Com o desenvolvimento da imunoterapia novas abordagens tem sido descritas para o combate ao câncer. Estudos em animais demonstraram a redução de tumores com a utilização de vacinas de DNA contendo a HSP-65 do Mycobacterium leprae. Neste estudo avaliou-se a utilização desta proteína em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço em estádio avançado e fora de possibilidades terapêutica curativa pelos métodos convencionais. Objetivos: Testar a viabilidade de realização da injeção intratumoral do DNA HSP65 nesse grupo de doentes, avaliar a resposta tumoral através da análise comparativa do volume, pesquisar a transfecção do DNA HSP65 do M. Leprae e verificar se o tratamento realizado apresentou impacto na evolução dos pacientes. Casuística e métodos: Foram incluídos 21 pacientes em três grupos. Cada grupo recebeu diferentes doses da vacina de DNA HSP-65 do Mycobacterium leprae: 150, 600 e 400µg, através de aplicações intratumorais guiadas por ultra-som com Doppler. Foram realizadas tomografias computadorizadas antes e após o tratamento, para avaliação da resposta tumoral através da comparação de volume tumoral. Realizaram-se biópsias antes e após o tratamento, e o material foi submetido a reação em cadeia da polimerase (Rt-PCR) para identificar a transfecção do DNA injetado. Durante o protocolo os pacientes foram acompanhados para observação de eventos adversos que pudessem ser relacionados à medicação. Resultados: Dos 21 pacientes, sete faleceram antes do término do protocolo. Nos 13 pacientes passíveis de análise, ocorreram quatro respostas parciais e estabilidade da lesão em um caso. Em nove casos houve progressão da doença. Dois pacientes encontram-se vivos em seguimento a mais de oitocentos dias do inicio do protocolo. Os eventos adversos ocorridos foram principalmente aumento da dor local e edema. Não foi possível comprovar a transcrição do DNA injetado no Rt-PCR pela ocorrência de um resultado falso positivo. Conclusões: A aplicação foi segura na dose de 400µg por aplicação. Não foi possível comprovar a transfecção de DNA de HSP65. Nos pacientes que apresentaram diminuição do volume tumoral parece ter havido benefício clínico. / Introduction: The squamous cell carcinoma of the head and advanced neck is an disease difficult to treat. Despite the advances in diagnosis and treatment in last the 30 years had not occurred major survival improvements. The treatment failure occurs mainly locorregionaly and recurrences frequently canot be rescued. immunotherapy has had encouraging results in the last years. Studies in animals had demonstrated the reduction of tumors with the DNA vaccine containing HSP-65 of the Mycobacterium leprae. In this study we evaluate the use of this protein in patients with avdanced head and neck carcinoma, stages II and IV without possibilities of curative treatment. Objectives: To test the viability of accomplishment of the intratumoral injection of DNA HSP65 in this group of patients, test its effectiveness through the comparative analysis of the volume, to verify transfeccion of the DNA injected and to see if the carried through treatment presented impact in the evolution of the patients. Patients and methods: 21 patients in 3 groups of doses 150,600 and 400µg of the vaccine of DNA HSP-65 of M leprae, through intratumoral applications guided by USG Doppler repeated 3 times every 21 days. CT scans before and after the treatment had been carried through, for evaluation of the tumoral response through the comparison of tumoral volume. We also did biopsis before and after the treatment, and the material was submitted the Rt-PCR in search of tranfeccion of the injected DNA. During the protocol the patients had been evalueted to rule observe adverse events that could be related to the medication. Results: Of 21 patients, seven died before the end of the protocol. In the 13 suitable for analysis, 4 partial responses and stability of the disese in 1 case had occurred. In 9 cases the tumors progressed. Two patients are still alive, with more than eight hundred days of the beginning of the protocol. The adverse events occurred mainly as an increase of local pain and edema. It was not possible to prove the transcription of the DNA injected in the Rt-PCR because of the occurrence of positive a false result. Conclusions: The application was secure in the dose of 400mcg . We saw reduction of tumoral volume in 5 of the 13 patients suitable for analysis, four partial responses and one stable disease. In the patients who had presented reduction of the tumoral volume there seems to be clinical benefit. It was not possible to prove the transfeccion of the injected DNA.

Orientadores: Clarice Weis Arns, Fernando Rosado Spilki / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:38:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_LucianaHelenaAntoniassida_D.pdf: 3352165 bytes, checksum: 1c8836441214fc41a7890899268f1163 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os membros da família Paramyxoviridae são vírus que causam infecções em humanos e animais de importância econômica global. Entre os membros desta família incluem patógenos de importância mundial para os humanos, como o vírus respiratório sincicial humano (hRSV), o metapneumovírus humano (hMPV) e vírus de importância em Medicina Veterinária, como o vírus respiratório sincicial bovino (bRSV) e o metapnemovírus aviário (aMPV). Os membros da família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae são vírus envelopados, não-segmentados dotados de genoma de RNA de fita simples com sentido negativo. Na primeira parte do estudo, desenvolvemos um adenovírus recombinante expressando a proteína F do aMPV. A expressão da proteína F foi determinada por Western Blot. Os níveis de transcrição do gene F foram avaliados por RT-PCR em tempo real, em células HEK-293 e células HEP-2. Foi realizada a imunização experimental de Ad-aMPV-F e foi analisada a indução de resposta de anticorpos em camundongos BALB/c. Os títulos de anticorpos neutralizantes foram detectados após a imunização com Ad-aMPV-F. Na segunda parte do trabalho o objetivo foi à construção de adenovírus recombinantes expressando a proteína F do bRSV. A proteína F parece ser um antígeno ideal para fins de diagnóstico. Utilizando anticorpo anti-V-5, uma banda de ~90 kDa foi detectada no sobrenadante de cultura de células HEK-293 infectadas com Ad-bRSV-F. Na terceira parte do estudo, o objetivo foi à construção de dois vetores adenovirais expressando as proteínas G do aMPV e bRSV, a expressão destas proteínas em células HEK-293 infectadas foi analisada pela expressão do gene repórter, da proteína verde fluorescente (GFP) / Abstract: The members of the family Paramyxoviridae are viruses that cause infectious in human and animals of importance to global economics. Among the member of this family include pathogens of importance global for humans such as human respiratory syncytial virus (hRSV), the human and metapneumovirus (hMPV) and of viruses importance in veterinary medicine, such as bovine respiratory syncytial virus (bRSV) and avian metapnemovírus (aMPV). The members of the Paramyxoviridae are enveloped, non-segmented viruses, with negative-sense single stranded genomes. In the first part of the study, we developed a recombinant adenovirus expressing the F protein of AMPV. The expression of F gene was determined by Western Blot. The levels of transcription were evaluated by RT-PCR in real time in HEK-293 cells and HEP-2 cells. Immunization experiment was carried out Ad-AMPV-F was analyzed and the induction of antibody response in BALB/c mice. The neutralizing antibody titers detected after immunization with Ad-AMPV-F. In the second part, the objective was to construct recombinant adenoviruses expressing the F protein of bRSV. Protein F appears to be an ideal antigen for diagnostic purposes. Using the anti-antibody AdV-5, a single band of ~ 90 kDa was detected in the culture supernatant in 293 cells infected with Ad-bRSV-F. In the third part of the study, the objective was to build two adenoviral vectors expressing the G protein of aMPV and bRSV and the expression of these proteins in infected HEK-293 cells were analyzed for expression of the reporter gene, green fluorescent protein (GFP) / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_luciana_aquini_fernandes_gil.pdf: 1257217 bytes, checksum: 0c4055569b5af0eb817b075544551d2f (MD5) Previous issue date: 2012-08-08 / Bovine Botulism is a lethal intoxication caused by the ingestion of the neurotoxins produced by Clostridium botulinum types C and D that inhibit the release of acetylcholine at the neuromuscular junction leading to death by flaccid paralysis. It produces important economic losses, being a major cause of casualties in cattle in several regions of Brazil. The control of the disease depends on the presence of neutralizing antibodies against botulinum neurotoxins (BONTs) in immunized cattle. Immunization is obtained inoculating toxoids produced from cultures of selected strains of C. botulinum types C and D, whose industrial production has limitations concerning efficiency and productivity. An alternative to the use of these toxoids is the production of recombinant antigens with high levels of purity and antigenicity. The C-terminal fraction of the heavy chain of botulinum neurotoxins has been the main target in the development of recombinant vaccines with promising results. In this work, two recombinant bivalent chimeras for the control of bovine botulism consisting of the neuronal receptor binding domains (NRBDs) of botulinum C and D toxins were efficiently produced in Escherichia coli. They were characterized and evaluated in mice, with promising results. Both the recombinant chimeras rLTB-C-D and rC-D were produced by cloning and expressing a synthetic gene encoding the C-terminal portion of both BONTs. The former also included the preferred codons of the E. coli heat labile enterotoxin B subunit (LTB), a potent humoral immune adjuvant. The levels of expression of the recombinant antigens were satisfactory, yielding approximately 100 mg of each recombinant antigen per liter of culture. An ELISA performed to assess the antigenicity of the molecules showed that both were recognized by sera of immunized mice suggesting the preservation of epitopes with the properties of native BONTs. Both chimeras induced high levels of neutralizing antibodies without undesirable effects. The level of neutralizing antibodies of the groups inoculated with equimolar concentrations of rLTB-C-D and rC-D containing Aluminum Hydroxide as adjuvant were similar, confirming the adjuvant properties of LTB. These results demonstrated that the recombinant chimeras were immunogenic. Sera from mice inoculated with commercial vaccines were also analyzed by ELISA using as antigens rC and rD, corroborating the neutralization. / O botulismo bovino é uma intoxicação letal causada pela ingestão da neurotoxina produzida pelo Clostridium botulinum principalmente dos tipos C e D que atua inibindo a liberação de acetilcolina na junção neuromuscular levando à morte por paralisia flácida, com grande importância econômica e sanitária, sendo uma das principais causas de morte em bovinos adultos no Brasil. O controle imunológico do botulismo bovino depende da presença de anticorpos neutralizantes contra as neurotoxinas botulínicas (NBOTs) no momento da ingestão da toxina pré-formada, por meio de imunização dos animais. Atualmente, a imunização é realizada com toxóides obtidos da detoxificação do extrato de cultivos de cepas selecionadas de C. botulinum dos tipos C e D que apresentam limitações quanto à eficiência e produção. Uma alternativa ao uso dos toxóides clássicos é a produção de vacinas recombinantes usando antígenos específicos de alta pureza e imunogenicidade. A fração C-terminal da cadeia pesada da neurotoxina botulínica tem sido o alvo principal no desenvolvimento de alternativas recombinantes a serem utilizadas como vacinas. Neste trabalho, duas quimeras recombinantes bivalentes compostas pelos domínios de ligação ao receptor neuronal (DLRNs) foram produzidas em Escherichia coli, caracterizadas e avaliadas em camundongos. As quimeras recombinantes rLTB-C-D e rC-D foram produzidas a partir da clonagem e expressão de um gene sintético que codifica a porção C-terminal das NBOTs construído com os códons preferenciais de E. coli e a subunidade B da enterotoxina termolábil de E. coli (LTB), um potente adjuvante da resposta imune humoral. O nível de expressão dos antígenos foi de aproximadamente 100mg de cada antígeno recombinante por litro de cultura. Um ELISA realizado para avaliar a antigenicidade das moléculas mostrou que ambas foram reconhecidas pelos soros padrões, sugerindo conservação de epitopos semelhantes aos dos DLRNs nativos. Ambas as quimeras foram inócuas para os camundongos, os quais não apresentaram lesões no local da inoculação bem como alteração de comportamento. Nos soros dos camundongos inoculados com as quimeras recombinantes foi possível detectar níveis de anticorpos neutralizantes. O grupo inoculado com a rLTB-C-D apresentou nível de anticorpos neutralizantes semelhante ao do grupo rC-D + hidróxido de alumínio confirmando o potencial adjuvante da LTB. As quantidades de antígenos utilizados foram equimolares. Esses resultados demonstram que as quimeras recombinantes foram imunogênicas. Os soros dos camundongos inoculados com as diferentes vacinas também foram analisados por ELISA indireto utilizando rC e rD como antígenos. Os dados obtidos neste ELISA corroboram os dados da soroneutralização.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_lilian_ferreira.pdf: 360548 bytes, checksum: 5b53738e6a0e6f27ef278c1c1b74e44c (MD5) Previous issue date: 2009-03-30 / The vaccines with multiple antigens have represented a major advance in the immunization of pets and production animals, since they represent economies of time, cost, and stress. However, the efficiency of these vaccines have sometimes been questioned and the choice of an appropriate adjuvant can mean a breakthrough in multiple immunizations. In this context, propolis, which is drawing the attention of many researchers due to its bioactive properties, emerges as a possible candidate, because many studies have demonstrated its stimulating activity on the humoral and cellular immune system. As studies have shown adjuvant activity in inactivated and monovalent vaccines, but there are no reports on its action on multiple and attenuated vaccines, this study aimed at evaluating the immunomodulatory capacity of ethanolic extract of green propolis and aqueous extract of brown propolis, against attenuate parvovirus canine (CPV) and inactivated canine coronavirus (CCoV), when associated with a vaccine composed of multiple antigens. Green propolis stimulated the production of antibodies against CPV in animals inoculated with the highest concentration of antigen (3.0 x106 TCID50) co-administered with 400 mg/dose of its ethanolic extract. The addition of 400 mg/dose of aqueous extract of brown propolis to different concentrations of commercial antigens (0.75, 1.5 e 3.0 x 106 TCID50) increased the humoral immune response against CPV in all groups. Regarding CCoV, green propolis showed no adjuvant activity. Already titration of the antibodies showed an increase in animals inoculated with 1.5 and 3.0 x106 TCID50 of antigens co-administered with aqueous extract of brown propolis. The cellular response was assessed by the expression of messenger RNA (mRNA) for interferon gamma (INFı), revealing that the green propolis showed no adjuvant activity, while the brown propolis increased the production of this cytokine against CPV in animals inoculated with 0.75 and 3.0 x106 TCID50 of antigens. The production of INF-ı specific to CCoV revealed properties immunostimulating agent of green propolis in concentrations of 0.75 and 3.0 x106 TCID50 of antigens and of brown propolis at a dose of vaccine of 3.0 x106 TCID50. The results presented in this study demonstrated that the ethanol extract of green propolis increased humoral response against CPV and cellular response against CCoV.And the aqueous extract of brown propolis has adjuvant activity on the humoral and cellular immune responses against the attenuated CPV and inactivated CCoV, when incorporated into a multiple vaccine. The use of propolis may contribute to the effectiveness of multiple vaccines due its stimulating activity to both the humoral and cellular immune responses, which justifies more research in that area. / As vacinas com antígenos múltiplos têm representado um grande avanço na imunização de animais de companhia e de produção, já que aliam economias de tempo, custo, manejo e estresse. No entanto, a eficiência dessas vacinas tem sido por vezes questionada e a escolha de um adjuvante adequado pode significar um avanço nas imunizações múltiplas. Nesse contexto, a própolis, que vem chamando a atenção de muitos pesquisadores devido as suas propriedades bioativas, surge como uma possível candidata, pois muitas pesquisas vêm demonstrando suas atividades moduladoras sobre o sistema imune humoral e celular. Como estudos já demonstraram atividade adjuvante em vacinas inativadas e monovalentes, mas ainda não existem relatos sobre sua ação em vacinas múltiplas e atenuadas, o objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade imunomoduladora de extratos etanólico de própolis verde e aquoso de própolis marrom, contra o parvovírus canino (CPV) atenuado e o coronavírus canino (CCoV) inativado, quando associados com uma vacina composta por antígenos múltiplos. A própolis verde estimulou à produção de anticorpos contra o CPV nos animais inoculados com a maior concentração dos antígenos (3,0x106 TCID50) co-administrados com 400 μg de seu extrato etanólico. A adição de 400 μg/dose de extrato aquoso de própolis marrom a diferentes concentrações dos antígenos comerciais (0,75, 1,5 e 3,0 x 106 TCID50) incrementou a resposta imune humoral contra o CPV em todos os grupos. Com relação ao CCoV, a titulação dos anticorpos não revelou atividade adjuvante da própolis verde, no entanto foi verificado aumento na resposta humoral nos animais inoculados com 1,5 e 3,0x106 TCID50 dos antígenos co-administrados com extrato aquoso de própolis marrom. A resposta celular foi avaliada pela expressão de RNA mensageiro (mRNA) para interferon gamma (INF-ı), revelando que a própolis verde não apresentou ação imunoestimulante, já a própolis marrom incrementou a produção dessa citocina contra CPV nos animais inoculados com 0,75 e 3,0x106 TCID50 dos antígenos. A produção de INF-ı específico para CCoV revelou propriedade imunoestimulante da própolis verde nas concentrações de 0,75 e 3,0 x106 TCID50 dos antígenos e da própolis marrom na dose de vacina de 3,0x106 TCID50. Os resultados apresentados nesse estudo demonstraram que o extrato etanólico de própolis verde incrementou a resposta humoral contra o CPV e a celular contra o CCoV. Já o extrato aquoso de própolis marrom apresentou atividade adjuvante sobre as respostas imunes humoral e celular, contra o CPV atenuado e o CCoV inativado, quando incorporado a uma vacina múltipla. O uso da própolis pode contribuir para a eficácia de vacinas múltiplas devido à atividade estimulante tanto sobre a resposta imune humoral como celular, justificando mais pesquisas nessa área.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-02 / Avian Necrotic Enteritis (NE) is an acute enterotoxaemia caused by Clostridium perfringens A and C. The control of the disease is based on antibiotics added to animal feed. The ban of this practice by consumer markets, considered the biggest challenge to industrial aviculture, demanded the adoption of other alternatives for its control, among others, immunization with recombinant vaccines. The aim of this work was to produce and evaluate C. perfringens recombinant α toxin (rAT) vaccines adjuvanted with either Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3 or recombinant B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), and a chimeric protein containing the α toxin fused to rLTB (rLTB-AT). The rAT+Al(OH)3 was innocuous and protected mice against a challenge with native α toxin (sT), and it was immunogenic and did not affect productivity parameters in broilers. The rAT+rLTB showed a dose-protection relationship in mice, while rLTB-AT did not protect mice against sT challenge. The rAT could be an alternative for controlling NE. / A Enterite Necrótica Aviar (ENA) é uma enterotoxemia aguda, causada pelos Clostridium perfringens A e C, cujo controle baseia-se na adição de antibióticos na ração. A restrição dessa prática pelo mercado consumidor, que tornou seu controle o maior desafio para o setor avícola, exigiu a adoção de novas estratégias para o controle, entre elas a imunização. Vacinas recombinantes vêm despertando grande interesse entre pesquisadores e empresas do setor. O objetivo deste trabalho foi elaborar vacinas de toxina α recombinante de C. perfringens (rAT) utilizando como adjuvantes Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3) e subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), e construir e avaliar uma proteína quimérica contendo rAT fusionada a rLTB (rLTB-AT). A rAT+Al(OH)3 foi inócua e protetora contra agressão de toxina α nativa (sT) em camundongos, e imunogênica em frangos de corte, sem afetar a produtividade. A rAT+rLTB demonstrou relação dose-proteção em camundongos, entanto a rLTB-AT não protegeu camundongos contra agressão de sT. A rAT demonstrou ser uma alternativa para controlar a ENA. Palavras-chave: Enterite Necrótica Aviar, Clostridium perfringens A, toxina α recombinante, vacinas.