Introdução A preocupação crescente com as possíveis consequências da replicação viral no sistema nervoso central mostra a necessidade da detecção do HIV no compartimento cerebral. O teste de PCR em tempo real desenvolvido pela Abbott, o Abbott m2000 RealTime HIV-1 (m2000rt), quantifica a carga viral do HIV em amostras de sangue com um procedimento efetivo e de baixo custo no nosso país, por isso é adotado como método padrão pelo Ministério da Saúde, mas não é utilizado em amostras de líquor. O ensaio produzido pela Roche, o COBAS TaqMan HIV-1, version 2 (COBAS v2.0), é o método de PCR em tempo real que tem sido amplamente utilizado para detectar a carga viral do HIV no compartimento cerebral. No entanto, esse método ainda não foi validado para esse propósito e seu custo pode ser uma limitação em diversas regiões com baixos recursos. Objetivos Considerando que não há uma metodologia padronizada para essa situação específica (detecção do HIV no líquor), nós conduzimos esse estudo a fim comparar os desempenhos dos testes m2000rt e COBAS v2.0, na tentativa de propôr um método alternativo e com baixos custos ao mais utilizado nesse contexto (COBAS v2.0). Métodos O estudo foi realizado no período de maio de 2015 a julho de 2016. O cálculo do tamanho da amostra foi baseado em dados de um estudo piloto que revelaram ser necessário um número mínimo de 37 amostras, para detectar uma diferença de 0,20 log10 na carga viral, com um coeficiente de correlação de 0,979 e um poder de 90%. Essa equação permitiria uma perda de 10%. As amostras de líquor foram coletadas consecutivamente a partir de 37 pacientes HIV positivos atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre/RS. Os métodos foram processados de acordo com o proposto pelo fabricante para utilização com amostras de plasma. Pequenas modificações foram necessárias no teste em estudo (m2000rt) para neutralizar qualquer diferença metodológica e evitar vieses de mensuração: o congelamento das amostras foi realizado a -20ºC até o momento da análise. O ensaio COBAS v2.0 foi utilizado como referência, uma vez que é o método mais utilizado. Foram realizadas análises quantitativas com resultados que estavam dentro da faixa linear em ambos os métodos (n = 18). Para tornar os métodos comparáveis, adotou-se o limite de detecção do ensaio m2000rt para ambos (40 cp/mL ou 1,60 log10 cp/mL). Os resultados abaixo do limite de detecção foram apresentados como uma variável categórica, uma vez que não são quantificáveis. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para comparar os métodos. A normalidade das variáveis foi então resumida calculando o viés estimado pela diferença média "đ " e o desvio padrão das diferenças realizadas pelo teste t para amostras pareadas. Com base na falta de normalidade dos métodos, o grau de concordância dos resultados das cargas virais de HIV foi analisado pelo índice Kappa. Esse estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (RS)/ Brasil, registrado na Plataforma Brasil como sendo CAAE: 35072214.7.0000.532. Conclusão Em conclusão, o teste m2000rt que foi modificado para este ensaio mostrou boa concordância e correlação com o teste mais utilizado nesse contexto e pode ser considerado um método alternativo com resultados semelhantes ao COBAS v2.0 e baixos custos na quantificação da carga viral do HIV no líquor. Sugerimos, principalmente em locais onde este método está prontamente disponível com uma relação custo-benefício aceitável, que o exame m2000rt deva ser realizado. / Introduction Growing concern about possible consequences of viral replication in the central nervous system shows the need for HIV detection in the cerebral compartment. The real time PCR test developed by Abbott, Abbott RealTime m2000 HIV-1 (m2000rt) quantifies HIV viral load in blood samples effectively and with low costs Brazil. It is the standard method by the Brazilian Ministry of Health, but it has never been utilized to measure HIV in cerebrospinal fluid samples. The assay produced by Roche, COBAS TaqMan HIV-1, version 2 (COBAS v2.0) is the real-time PCR method that has been widely used to detect HIV viral load in cerebral compartment. However, this method has not yet been validated for this purpose and its cost may be a limitation in several regions in the world with low resources. Objective Taking under consideration that there was no standard methodology for this specific situation (detecting HIV in cerebrospinal fluid), we conducted this study to compare the performances of the m2000rt and COBAS v2.0 assays, to propose an alternative and low-cost method to more used in this context (COBAS v2.0). Methods The study was conducted from May 2015 to July 2016. The sample size calculation was based on data from a pilot trial that revealed that a minimum of 37 samples would be needed to detect a difference of 0.20 log10 in viral load, with a correlation coefficient of 0.979 and a 90% power. This equation would allow a 10% lost. CSF samples were collected consecutively from 37 HIV-positive patients seen at Hospital de Clínicas, Porto Alegre, RS. Methods were processed according to proposed by the manufacturer for utilization with plasma samples. Small modifications were necessary in the study test (m2000rt) to neutralize any methodological differences, thus avoiding measurement bias: the freezing of samples was carried out at -20ºC until the moment of the analysis. The COBAS v2.0 test was used as a reference since it is the most commonly used method. Quantitative analyzes were performed with results that were within the linear range in both methods (n=18). To make the methods comparable, the detection limit of the m2000rt assay for both (40 cp/mL or 1.60 log10 cp/mL) was adopted. The results below the limit of detection were presented as a categorical variable, since they are not quantifiable. The Pearson correlation coefficient was used to compare methods. The normality of the variables was then summarized calculating the estimated bias by the mean difference "đ" and standard deviation of the differences performed by t test for paired samples. Based on the lack of normality of the methods, the degree of agreement of the HIV viral load results was analyzed by the Kappa index. This study was approved by the Hospital de Clínicas of Porto Alegre (southern Brazil) Ethics Review Board, registered in the Brazil Platform as CAAE: 35072214.7.0000.532. Conclusion In conclusion, the m2000rt test that was modified for this trial showed good agreement and correlation with the most used test in this context and can be considered an alternative method with similar results to COBAS v2.0 and low costs in the HIV viral load quantification in cerebrospinal fluid. We suggest, especially in places where this method is readily available with an acceptable cost-benefit ratio, that the m2000rt exam should be performed.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:49:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hepatite_B_Oculta_2012.pdf: 1487094 bytes, checksum: 098e451e5a2e2af112aa8508df956a77 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Occult hepatitis B (OHB) is defined as the presence of low levels of HBV DNA in the liver or serum of individuals testing hepatitis B surface antigen (HBsAg) negative. In most cases of OHB, sera are positive for hepatitis B core antibody. The literature contains quite a few studies on the prevalence of OHB in Brazil, as well as in the worldwide population. Such reports, often controversial, demonstrate that the OHB prevalence varies among healthy individuals or patients with diseases unrelated to the liver and patients with chronic liver disease. Despite efforts, it is necessary a better understanding of: the reasons for the persistence of low levels of HBV-DNA in the absence of detectable HBsAg, the potential risk of OHB transmission and its role in the progression and aggravation of some liver diseases. Therefore, it is interesting to know the prevalence of OHB indifferent population samples which allows de monitoring of carriers of the occult infection, followed prospectively in order to try to surprise the possible effects of the presence of low levels of HBV-DNA in these individuals. In this study we investigated the presence of Occult Hepatitis B in peripheral blood obtained from 520 healthy donors of Vitoria, Espirito Santo, with the aim of guiding policies to include or not the sensitive HBV-DNA nucleic acid amplification technique (NAT) screening in blood donations with a detection limit of 54UI/mL. In order to enable the molecular detection we had also developed a method that screens plasma samples in pools which is capable of detecting the presence of HBV in the ratio of 1:40.Through the technique of nested-PCR we found that 0,2% (1/520) had occult HBV in serum samples. Despite the low prevalence of OHB detected in the study, a considerable number of patients with occult HBV infection may not have been detected if the blood units were only tested for serological markers of HBV infection. So it is important to know the prevalence of OHB in one or more additional population groups, in order to follow up carriers of occult infection prospectively to determine possible effects of the presence of HBV-DNA in low concentrations in these individuals / A Hepatite B Oculta (HBO) é definida pela presença do DNA do VHB com carga viral geralmente baixa (<200UI/mL), no fígado ou soro de pessoas com antígeno de superfície (HBsAg) indetectável. Na maioria dos casos de HBO há positividade para o anticorpo contra o antígeno core da Hepatite B (anti-HBc). Na literatura constam poucos estudos sobre a prevalência da HBO no Brasil, bem como na população mundial. Existem relatos, muitas vezes controversos, que reportam frequências variáveis da HBO em indivíduos sem doença ou portadores de doença não relacionada com o fígado e em hepatopatas crônicos. Apesar dos esforços, faz-se necessário ainda uma melhor compreensão das razões para a persistência da baixa viremia do VHB na ausência de HBsAg detectável, do potencial risco de transmissão da HBO e do seu papel na progressão e agravamento de algumas hepatopatias. No estudo investigou-se a presença de HBO em 520 doadores de sangue de Vitória, Espírito Santo, com o objetivo de nortear políticas para incluir ou não a triagem molecular NAT (Nucleic Acid Amplification Technique ) de bolsas de sangue. Para viabilizar a detecção molecular desenvolveu-se também uma metodologia de extração em pool de amostrascapaz de detectar a presença do VHB na proporção de 1:40 com limite de detecção de 54UI/mL. Através da técnica de nested-PCR detectou-se a presença do VHB oculto em 0,2% (1/520) das amostras. Apesar da baixa prevalência de HBO detectada no estudo, um número considerável de portadores da infecção oculta podem não estar sendo detectados, se apenas a pesquisa de marcadores sorológicos da presença do VHB esta sendo realizada nas bolsas de sangue. Sendo assim é importante conhecer a prevalência da HBO em diferentes amostras da população para que se possa ter em mãos portadores da infecção oculta acompanhados prospectivamente a fim de tentar surpreender possíveis efeitos da presença do DNA do VHB em baixas concentrações nesses indivíduos

Introdução A preocupação crescente com as possíveis consequências da replicação viral no sistema nervoso central mostra a necessidade da detecção do HIV no compartimento cerebral. O teste de PCR em tempo real desenvolvido pela Abbott, o Abbott m2000 RealTime HIV-1 (m2000rt), quantifica a carga viral do HIV em amostras de sangue com um procedimento efetivo e de baixo custo no nosso país, por isso é adotado como método padrão pelo Ministério da Saúde, mas não é utilizado em amostras de líquor. O ensaio produzido pela Roche, o COBAS TaqMan HIV-1, version 2 (COBAS v2.0), é o método de PCR em tempo real que tem sido amplamente utilizado para detectar a carga viral do HIV no compartimento cerebral. No entanto, esse método ainda não foi validado para esse propósito e seu custo pode ser uma limitação em diversas regiões com baixos recursos. Objetivos Considerando que não há uma metodologia padronizada para essa situação específica (detecção do HIV no líquor), nós conduzimos esse estudo a fim comparar os desempenhos dos testes m2000rt e COBAS v2.0, na tentativa de propôr um método alternativo e com baixos custos ao mais utilizado nesse contexto (COBAS v2.0). Métodos O estudo foi realizado no período de maio de 2015 a julho de 2016. O cálculo do tamanho da amostra foi baseado em dados de um estudo piloto que revelaram ser necessário um número mínimo de 37 amostras, para detectar uma diferença de 0,20 log10 na carga viral, com um coeficiente de correlação de 0,979 e um poder de 90%. Essa equação permitiria uma perda de 10%. As amostras de líquor foram coletadas consecutivamente a partir de 37 pacientes HIV positivos atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre/RS. Os métodos foram processados de acordo com o proposto pelo fabricante para utilização com amostras de plasma. Pequenas modificações foram necessárias no teste em estudo (m2000rt) para neutralizar qualquer diferença metodológica e evitar vieses de mensuração: o congelamento das amostras foi realizado a -20ºC até o momento da análise. O ensaio COBAS v2.0 foi utilizado como referência, uma vez que é o método mais utilizado. Foram realizadas análises quantitativas com resultados que estavam dentro da faixa linear em ambos os métodos (n = 18). Para tornar os métodos comparáveis, adotou-se o limite de detecção do ensaio m2000rt para ambos (40 cp/mL ou 1,60 log10 cp/mL). Os resultados abaixo do limite de detecção foram apresentados como uma variável categórica, uma vez que não são quantificáveis. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para comparar os métodos. A normalidade das variáveis foi então resumida calculando o viés estimado pela diferença média "đ " e o desvio padrão das diferenças realizadas pelo teste t para amostras pareadas. Com base na falta de normalidade dos métodos, o grau de concordância dos resultados das cargas virais de HIV foi analisado pelo índice Kappa. Esse estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (RS)/ Brasil, registrado na Plataforma Brasil como sendo CAAE: 35072214.7.0000.532. Conclusão Em conclusão, o teste m2000rt que foi modificado para este ensaio mostrou boa concordância e correlação com o teste mais utilizado nesse contexto e pode ser considerado um método alternativo com resultados semelhantes ao COBAS v2.0 e baixos custos na quantificação da carga viral do HIV no líquor. Sugerimos, principalmente em locais onde este método está prontamente disponível com uma relação custo-benefício aceitável, que o exame m2000rt deva ser realizado. / Introduction Growing concern about possible consequences of viral replication in the central nervous system shows the need for HIV detection in the cerebral compartment. The real time PCR test developed by Abbott, Abbott RealTime m2000 HIV-1 (m2000rt) quantifies HIV viral load in blood samples effectively and with low costs Brazil. It is the standard method by the Brazilian Ministry of Health, but it has never been utilized to measure HIV in cerebrospinal fluid samples. The assay produced by Roche, COBAS TaqMan HIV-1, version 2 (COBAS v2.0) is the real-time PCR method that has been widely used to detect HIV viral load in cerebral compartment. However, this method has not yet been validated for this purpose and its cost may be a limitation in several regions in the world with low resources. Objective Taking under consideration that there was no standard methodology for this specific situation (detecting HIV in cerebrospinal fluid), we conducted this study to compare the performances of the m2000rt and COBAS v2.0 assays, to propose an alternative and low-cost method to more used in this context (COBAS v2.0). Methods The study was conducted from May 2015 to July 2016. The sample size calculation was based on data from a pilot trial that revealed that a minimum of 37 samples would be needed to detect a difference of 0.20 log10 in viral load, with a correlation coefficient of 0.979 and a 90% power. This equation would allow a 10% lost. CSF samples were collected consecutively from 37 HIV-positive patients seen at Hospital de Clínicas, Porto Alegre, RS. Methods were processed according to proposed by the manufacturer for utilization with plasma samples. Small modifications were necessary in the study test (m2000rt) to neutralize any methodological differences, thus avoiding measurement bias: the freezing of samples was carried out at -20ºC until the moment of the analysis. The COBAS v2.0 test was used as a reference since it is the most commonly used method. Quantitative analyzes were performed with results that were within the linear range in both methods (n=18). To make the methods comparable, the detection limit of the m2000rt assay for both (40 cp/mL or 1.60 log10 cp/mL) was adopted. The results below the limit of detection were presented as a categorical variable, since they are not quantifiable. The Pearson correlation coefficient was used to compare methods. The normality of the variables was then summarized calculating the estimated bias by the mean difference "đ" and standard deviation of the differences performed by t test for paired samples. Based on the lack of normality of the methods, the degree of agreement of the HIV viral load results was analyzed by the Kappa index. This study was approved by the Hospital de Clínicas of Porto Alegre (southern Brazil) Ethics Review Board, registered in the Brazil Platform as CAAE: 35072214.7.0000.532. Conclusion In conclusion, the m2000rt test that was modified for this trial showed good agreement and correlation with the most used test in this context and can be considered an alternative method with similar results to COBAS v2.0 and low costs in the HIV viral load quantification in cerebrospinal fluid. We suggest, especially in places where this method is readily available with an acceptable cost-benefit ratio, that the m2000rt exam should be performed.

O bocavirus humano (HBoV) é um parvovirus recentemente identificado em associação com a presença de sintomas de infecção do trato respiratório. Esse vírus possui um genoma de aproximadamente 5217 nucleotídeos que contém 3 open reading frames que codificam 4 proteínas (NS1, NP-1, VP-1 e VP-2). HBoV tem sido detectado em amostras respiratórias de diversas partes do mundo, incluindo Austrália, América do Norte, Europa, Ásia e África, o que sugere uma distribuição global desse vírus. Entretanto, nenhum estudo longitudinal de HBoV em amostras respiratórias foi realizado na América Latina. Dessa forma, nós realizamos um estudo prospectivo de HBoV em lavados nasofaríngeos (LFNs) coletados de pacientes com sintomas de infecção do trato respiratório (IRA) atendidos em um hospital universitário de Ribeirão Preto, SP e em um hospital universitário de Salvador, BA no período entre 2005 a 2007. 1288 LFNs de 1217 pacientes foram encaminhados ao laboratório de virologia e foram testados por PCR para HBoV. Desses pacientes, 962 eram menores de 5 anos e 177 eram maiores de 5 anos. Além disso, também foram analisados 50 LFNs de crianças menores de 5 anos que não tinham sintomas respiratórios. Todas as amostras positivas para HBoV foram testadas para todos os outros vírus respiratórios, incluindo o vírus sincicial respiratório (HRSV), rinovirus humano (HRV), influenza humano (HFLU), metapneumovirus humano (HMPV), parainfluenza humano (HPIV), coronavirus humano (HCoV) e adenovirus humano (HAdV). A carga viral de HBoV foi determinada por PCR em tempo real em todas as amostras positivas e o genoma completo de 19 amostras de HBoV foi seqüenciado. Com intuito, de fazer um levantamento sorológico e determinar sítios replicativos de HBoV, nós ainda clonamos e expressamos em S. cerevisae (Y258) o gene de VP2, que codifica uma das proteínas do capsídeo viral. A prevalência desse vírus foi de 4,8% em crianças menores de cinco anos e de 1% em pacientes maiores de cinco anos. HBoV não foi detectado em crianças sem sintomas. Dos 259 pacientes analisados em 2005, 25 (10%) foram positivos para HBoV. Esse vírus circulou mais frequentemente em abril, mês de maior incidência do HRSV. Em 2006, HBoV foi detectado em apenas 10 LFNs de 334 (3%) amostras testadas, sem qualquer pico de freqüência. Em 2007 HBoV foi detectado em 13 de 552 (2%) amostras, com uma freqüência de detecção um pouco maior em junho e julho. Os sintomas mais comumente observados foram rinorréia, tosse, febre e chiado, que foram observados geralmente em mais de 50% dos casos positivos para HBoV. Não houve uma diferença significativa na prevalência desses sintomas entre as crianças positivas e negativas para HBoV. Entretanto, foi observada uma maior freqüência de diarréia entre as crianças com esse vírus. Nesse estudo também foi documentado uma alta freqüência de co-infecções virais entre os pacientes com HBoV. Os vírus mais frequentemente associados com o bocavirus humano foram: HRSV, HRV e HAdV. Além disso, foi detectado uma maior carga viral media e uma maior freqüência de diarréia nos 15 pacientes com infecção exclusiva por HBoV do que nos pacientes com co-infecção. Esses resultados mostraram que HBoV pode alcançar títulos enormes (tão grandes como1014/mL) em LFNs de pacientes com sintomas respiratórios e que isso é associado a de diarréia. O seqüenciamento do genoma inteiro de HBoV realizado nesse estudo indica que a divergência genômica entre as amostras desse vírus é muito pequena. Como conclusão, nós demonstramos que HBoV circula e é detectado em associação com sintomas de infecção respiratória e diarréia no Brasil. Novos estudos, com um longo acompanhamento em diferentes populações serão necessários para determinar a sazonalidade e o real impacto clínico de HBoV em nosso país. / Human bocavirus (HBoV) is a parvovirus recently identified in association with respiratory tract infections. HBoV 5217 nt genome contains 3 open reading frames encoding four proteins (NS1, NP-1, VP-1 and VP-2). HBoV has been reported in respiratory samples from children in several parts of the world (including Australia, North America, Europe, Asia, and Africa), suggesting that the virus circulates worldwide. However, no longitudinal studies of HBoV in respiratory samples have been reported in Latin America. We report a prospective study of HBoV in nasopharyngeal aspirates (NPAs) collected from patients seen for acute respiratory tract infections (ARI) at the University of Sao Paulo Hospital in Ribeirao Preto, southeast Brazil and at the University Hospital in Salvador, Brazil. 1288 NPAs from 1217 patients was submitted to the virology lab for respiratory virus detection from 2005 to 2007 and were screened for HBoV by polymerase chain reaction (PCR), whom 962 were under 5 years of age and 177 were older than 5 years. In addition, NPAs from 50 children under 12 years without IRA was also tested to HBoV for PCR. All samples positive of HBoV was tested for others respiratory virus, including the human respiratory syncitial virus (HRSV), human rhinovirus (HRV), human influenza (HFLU), human metapneumovirus (HMPV), human parainfluenza virus (HPIV), human coronavirus (HCoV) and human adenovirus (HAdV). These samples had their HBoV viral load determined by real time PCR and the viral entire genome of nineteen HBoV sample was sequenced. We also cloned and expressed in S. cerevisae (Y258) the gene of VP2, one protein of viral capside. The prevalence of this virus was of 4,8% in children under 5 years and 1% in adults, both with IRA. HBoV was not found on the patients without symptoms. In 2005, of the 259 patients tested, 25 (10%) were positive for HBoV. Interestingly, the virus circulated more frequently in April, the month of peak activity of respiratory HRSV. In 2006 HBoV was detected in only 10 NPAs out of 334 samples (3%) tested, without any notable peak of frequency. In 2007 HBoV was detected in 13 out of 552 (2%) tested samples with little higher frequency of detection in June an July. Rhinorrhea, cough, and wheezing were observed in more than 50% of the HBoV-positive children, and no obvious respiratory clinical differences were noted between HBoV-positive and negative children. However, was noted a higher frequency of diarrhea on HBoV-positive patients. In this study was also observed a larger frequency (71%) of viral coinfections between the HBoV-positive patients. The respiratory viruses more frequently associated with human bocavirus were: HRSV, HRV and HAdV. Interestingly, on the 15 HBoV-alone patients was observed a higher viral load and a higher prevalence of diarrhea than HBoV-coinfection patients. These results showed that this virus can reach enormous titles (like 1014) in NPAs from patients with respiratory infection symptoms and this is associated with diahhrea. The entire genome sequencing of HBoV of our study indicates that the genetic divergence between the HBoV lineages is small. In conclusion, we demonstrated that HBoV circulates and is detected in association with respiratory symptoms and diarrhea in Brazil. Long term surveillance will be needed to determine whether or not an HBoV season occurs and what is the real clinical impact of this virus in our country.

INTRODUÇÃO: Pacientes em terapia anti-retroviral podem apresentar escapes transitórios de viremia plasmática (blip), porém os preditores desse evento e seu impacto sobre a incidência de falência virológica são ainda controversos na literatura. Neste estudo de coorte estimou-se a incidência de blip e de falência virológica e investigaram-se possíveis preditores de tais desfechos. Blip foi definido como carga viral superior a 50 cópias/mL com subseqüente supressão da viremia plasmática e falência virológica como duas medidas consecutivas de carga viral plasmática superiores a 50 cópias/mL. Adicionalmente, pesquisou-se, por ocasião desses eventos, a presença de mutações genotípicas de HIV capazes de conferir resistência aos anti-retrovirais e as concentrações plasmáticas de inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa e inibidores da protease, comparando-as com o relato dos participantes sobre adesão à medicação. MÉTODOS: 350 participantes infectados pelo HIV (250 homens e 100 mulheres) foram selecionados no Serviço de Extensão ao Atendimento de Pacientes com HIV/Aids Casa da Aids do Hospital das Clínicas da FMUSP, São Paulo, Brasil. Na admissão ao estudo e trimestralmente, ao longo de 78 semanas, foram coletadas informações sobre dados sóciodemográficos, forma presumida de aquisição do vírus, uso de e adesão a medicações anti-retrovirais, ocorrência de outras comorbidades, bem como uso de álcool e de drogas ilícitas. Investigaram-se fatores potencialmente associados à incidência dos desfechos de interesse, tais como ocorrência de outras doenças, exposição a imunizações e falha na adesão a práticas de sexo mais seguro. Amostras de sangue periférico foram coletadas a cada visita para determinação de carga viral plasmática por RT-PCR ultrassensível, e contagem de linfócitos T CD4+ por citometria de fluxo. Nos indivíduos que apresentaram os desfechos de interesse do estudo, procedeu-se ao seqüenciamento dos genes da transcriptase reversa e da protease de HIV e à dosagem plasmática dos anti-retrovirais por método de Cromatografia Líquida de Alta Performance. As incidências de blip e falência virológica foram estimadas e os fatores associados a ambos investigados em modelo de regressão logística múltipla. RESULTADOS: As incidências de blip e falência virológica foram 9,4 e 4,2/100 pessoas-ano, respectivamente. Três indivíduos apresentaram falência virológica precedidos por blip. À análise multivariada, a não adesão às praticas de sexo mais seguro no mês precedente se mostrou independentemente associada à ocorrência de blip (OR 24,64, IC 95% 4,40 137,88, p<0,001) e de falência virológica (OR 24,69, IC 95% 4,20 145,18, p<0,001). Adicionalmente, observou-se que a exposição prévia a maior número de esquemas anti-retrovirais foi preditora dos eventos blip (OR 1,82, IC 95% 1,41 2,36, p<0,001) e falência virológica (OR 1,67, IC 95% 1,19 2,35, p=0,003). A ocorrência de blip não se associou ao desenvolvimento posterior de falência virológica. Um maior número de mutações conferidoras de resistência medicamentosa foi identificado no momento de falência virológica, quando comparado ao momento de blip, com predomínio de mutações no gene da transcriptase reversa, refletindo o maior uso desses fármacos. Das 122 concentrações plasmáticas de anti-retrovirais analisadas em 120 amostras, 84 estavam em níveis terapêuticos adequados. Porém, tais resultados apresentaram apenas 69% de concordância com a adesão auto-referida à medicação. Este estudo mostra que apresentar blip em uma medida isolada pode ser um evento benigno; por outro lado, falência virológica pode ser conseqüente a acúmulo de mutações conferidoras de resistência a pelo menos um dos anti-retrovirais em uso, podendo comprometer a eficácia do esquema terapêutico utilizado. Ambos os desfechos mostraram-se mais incidentes na população multiexperimentada à terapêutica, que, portanto, merece atenção particular. Uma importante contribuição deste estudo foi a avaliação da dosagem plasmática dos antiretrovirais, método simples e de baixo custo, que, implantado na rotina laboratorial, pode contribuir para o monitoramento da adesão aos antiretrovirais e reduzir a demanda por testes genotípicos / BACKGROUND: HIV-1-infected patients under antiretroviral therapy may present intermittent viremia (blip); however, predictors of this outcome and its influence on the incidence of virologic failure remain controversial in the literature. The aim of this study is to estimate the incidence of blip and virologic failure in a cohort of patients under stable antiretroviral therapy and to investigate their associated factors. Blip was defined as a plasma HIVRNA load above 50 copies/mL followed by a subsequent value below 50 copies/mL. Virologic failure was defined as two consecutives measures of viral load above 50 copies/mL. Moreover, at time of occurrence of these outcomes, HIV genotyping assays were performed in search of drug resistance-associated mutations, and plasma concentrations of nonnucleoside reverse transcriptase and protease inhibitors assessed and compared with self-reported adhrence to therapy. METHODS: 350 subjects (250 male and 100 female) were enrolled at the HIV Clinic, School of Medicine, University of São Paulo, Brazil and followed for 78 weeks. At baseline and in 3-month interval follow-up visits we collected sociodemographic data and information on presumed mode of HIV acquisition, use of and adherence to antiretrovirals, comorbidities and use of alcohol and illicit drugs. Additionally, patients were questioned about potential predictors of the outcomes, including occurrence of other diseases, immunizations and risky sexual behavior. Blood samples were drawn for assessment of HIV plasma viral loads, using ultrasensitive RT-PCR, and T CD4+ cell counts by flow cytometry. Individuals who presented blip and/or virologic failure were submitted to HIV genotyping assays and assessment of antiretroviral plasma concentrations by high-performance liquid chromatography. Incidences of blip and virological failure were estimated and associated factors investigated, using a multiple logistic regression model. RESULTS: The incidence of blip and of virologic failure were 9.4/100 and 4.2/100 person-years, respectively. Three individuals presented virologic failure after blip episodes. On multivariate analysis, non-adherence to safer sex measures in the previous month was shown independently associated with the occurrence of blip (OR 24.64, 95%CI 4.40 137.88, p<0.001) and virologic failure (OR 24.69, 95%CI 4.20 145.18, p<0.001). In addition, history of multiple exposures to antiretroviral regimens was also a predictor of blip (OR 1.82, 95%CI 1.41 2.36, p<0.001) and virologic failure (OR 1.67, 95%CI 1.19 2.35, p<0.001). Blips were not predictive of virologic failure. A larger number of HIV mutations were identified at time of virologic failure, as compared to blip episodes, with mutations detected predominantly in the reverse transcriptase (RT) gene, probably due to larger exposure to RT inhibitors. Eighty-four out of 122 assessments of antiretroviral plasma concentrations analyzed in 120 samples resulted in the therapeutic range. However, these results were concordant with self-reported adherence to therapy in 69% of cases only. This study shows that a single blip episode may be considered benign, whereas virologic failure could result from accumulation of HIV drug resistance-associated mutations that may impair the efficacy of therapy. Both study outcomes occurred more frequently among patients with larger exposure to antiretrovirals, and therefore they should be monitored in this regard. An important contribution of this study concerns the assessment of antiretroviral plasma concentrations, a simple and low cost laboratory tool. Incorporated routinely in patient follow-up, it would help monitoring adherence to therapy and reduce the need for HIV genotyping assays

Indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) que controlam a replicação viral, mesmo na ausência de tratamento com drogas antirretrovirais, representam um exemplo de contenção bemsucedida do vírus. O entendimento das respostas imunes antivirais presentes nestes indivíduos pode auxiliar no delineamento de vacinas, particularmente no caso de estratégias vacinais desenvolvidas para induzir um fenótipo de controle da replicação viral e, assim, diminuir o ritmo da progressão à AIDS e/ou a taxa de transmissão para terceiros. A resposta imune celular contra HIV-1 é geralmente mapeada em ensaios de ELISPOT-IFN-&#947; empregando-se peptídeos pentadecâmeros sobrepostos por 11 aminoácidos sintetizados a partir de seqüências consensuais do vírus. Contudo, este método pode subestimar a detecção da real amplitude da resposta imune celular contra epitopos contidos na seqüência autóloga do vírus infectivo. Neste trabalho, foram comparadas respostas imunes celulares contra peptídeos 15-meros baseados nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1 e respostas imunes contra peptídeos HLA-restritos de nove ou 10 aminoácidos baseados tanto nas seqüências de vif e nef do consenso do subtipo B do HIV-1, quanto nas seqüências autólogas dos vírus seqüenciados a partir de seis pacientes controladores da replicação do HIV-1. Nossa análise revelou que três dos seis pacientes investigados mostraram maior amplitude de resposta imune celular contra epitopos em Vif e Nef quando os peptídeos HLA-restritos foram empregados, tenham sido eles preditos a partir da seqüência consensual ou a partir das seqüências do vírus autólogo. O número de respostas positivas aumentou de quatro para 16 em Vif e de oito para 22 em Nef, com o uso dos reagentes HLA-restritos. Estes resultados sugerem que emprego de peptídeos 15-meros pode sub-representar a amplitude real da resposta imune celular envolvidas no controle da replicação do HIV-1 e que o conhecimento acerca das respostas imunes de sucesso em indivíduos controladores pode ser melhorado e ampliado com a revisão dos métodos empregados. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals who spontaneously control viral replication represent an example of successful containment of the AIDS virus. Understanding the anti-viral immune responses in these individuals may help in vaccine design, particularly vaccine strategies designed to induce a controller phenotype and thus, prevent disease progression and decrease risk of transmission. Immune responses against HIV-1 are normally screened using 15-mer peptides overlapped by 11 amino acids from HIV-1 consensus sequences in ELISPOT-IFN-&#947; assays. However, this method may underestimate the real breadth of the cellular immune responses against the autologous sequence of the infecting virus. We compared cellular immune responses against nef and vif-encoded consensus B 15-mer peptides to responses against HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from consensus B and autologous sequences in six patients who have controlled HIV-1 replication. Interestingly, our analysis revealed that three of our patients had broader cellular immune responses against Vif- and Nef-HLA class I-predicted minimal optimal epitopes from either autologous viruses or from the consensus B sequence, when compared to responses against the 15-mer HIV-1 consensus B peptides. The number of positive responses against epitopes in these two HIV-1 proteins increased from four to 16 for Vif and from eight to 22 for Nef. These findings suggest that immune responses assessed using 15-mers peptides may underrepresent the real breadth of the immune control of the infecting virus and the knowledge about the successful responses in controller individuals could be improved after reviewing the employed methods.

INTRODUÇÃO: Poucos estudos têm focado as modificações fisiológicas que ocorrem no trato genital de mulheres menopausadas infectadas pelo HIV e sua associação com a excreção genital do vírus. Nesse estudo de corte transversal, comparou-se a excreção genital do HIV em mulheres menopausadas e em idade fértil em acompanhamento em um centro especializado em São Paulo, Brasil. Investigou-se também a associação entre a excreção genital de RNA de HIV e a viremia em ambos os grupos. Fatores associados com a intensidade da excreção genital de HIV também foram pesquisados, incluindo achados ginecológicos e marcadores de progressão da infecção por HIV. MÉTODOS: 146 mulheres infectadas pelo HIV [73 menopausadas (M)/73 em idade fértil (F)] foram selecionadas em Serviço de Extensão ao Atendimento de Pacientes com HIV/Aids Casa da Aids do Hospital das Clínicas da FMUSP, São Paulo, Brasil. As mulheres menopausadas referiram tempo médio de 8,17 anos (DP=6 anos) de menopausa. A contagem de linfócitos T CD4+ foi obtida por citometria de fluxo e a quantificação do RNA do HIV no plasma e no lavado cervicovaginal (LCV) foi realizada por RT-PCR quantitativo, utilizando-se o kit Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Test®, no método ultrasensível. Cloreto de lítio foi introduzido no tampão para obtenção do LCV e quantificado antes e depois da coleta do lavado, a fim de determinar o fator de diluição de cada amostra. A deteção do gene SRY por PCR também foi realizada a fim de eliminar amostras com eventual contaminação espermática. A prevalência de excreção genital foi estimada para ambos os grupos e os fatores associados à intensidade da excreção viral foram investigados, utilizando-se modelo de regressão linear múltipla. As variáveis com p<0,2 na análise bivariada foram incluídas na análise multivariada, assim como o grupo em estudo (M ou F). O modelo final incluiu fatores que se mostraram independentemente associados com a intensidade da excreção genital de HIV. RESULTADOS: A prevalência de excreção genital de HIV-RNA foi similar em ambos os grupos (M: 17,8%, IC 95% 9,8 28,5; F: 22%, IC 95% 13,1 33,1, p=0,678). Similarmente, a intensidade de excreção genital do HIV também não se mostrou diferente entre os grupos (mediana - M: 1,4log/mL; F: 1,4log/mL, p=0,587). A carga viral plasmática foi detectável em 34,2% das pacientes menopausadas (IC 95% 23,5 46,3) e em 42,5% entre as pacientes em idade fértil (IC 95% 31 54,6, p=0,395). Três pacientes (2 M/1 F) exibiram excreção genital de HIV-RNA na ausência de viremia detectável. Existe evidência de correlação entre a carga viral plasmática e a genital em ambos os grupos (rM: 0,658; rF: 0,684, p<0,01). Adicionalmente, o número de células CD4+ periféricas mostrou-se negativamente correlacionada à excreção genital do HIV em ambos os grupos (rM: -0,250; rF: -0,248, p<0,05). À análise multivariada, a carga viral plasmática mostrou-se independentemente associada à ocorrência de excreção genital do HIV em ambos os grupos (OR 4,03, IC 95% 2,52 6,45, p<0,001). Já a intensidade de excreção genital mostrou-se independentemente associada ao pH vaginal (p<0,001), concentração de TNF- no LCV (p=0,01), e à carga viral plasmática (p=0,001), todos com correlação positiva. CONCLUSÕES: Apesar das modificações significativas que ocorrem na mucosa vaginal da mulher menopausada, a excreção cervicovaginal do HIV parece não ser significativamente influenciada por esse estado. A carga viral plasmática e o número de células CD4+ periféricas estão correlacionadas com a excreção genital do vírus. A frequência de excreção genital mostrouse independentemente associada à intensidade de viremia. Além disso, o aumento do pH vaginal e evidência de inflamação genital, associada à concentração de TNF- no LCV, independentemente aumentam a intensidade de excreção genital nas mulheres estudadas. / BACKGROUND: Few studies have focused on physiological modifications that occur in the genital tract of HIV-infected postmenopausal women and their association with HIV cervicovaginal shedding. In this cross-sectional study we evaluated and compared HIV genital shedding among postmenopausal and fertile-aged women under care at a specialized center in Sao Paulo, Brazil, investigating the association between HIV-RNA shedding and HIV plasma viral loads in both groups. Factors associated with higher HIV shedding were also investigated, including gynaecological features and HIV disease progression markers. METHODS: 146 women living with HIV [73 postmenopausal (PM)/73 in fertile-aged (F)] were enrolled at the HIV Clinic, University of São Paulo Medical School, Brazil. Postmenopausal women referred a mean duration of 8.17y (SD=6y) since menopause. CD4+ cell counts were obtained by flow cytometry and HIV-RNA was quantified in plasma and in cervicovaginal lavages (CVL) by RT-PCR, using Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Ultrasensitive Test. Lithium chloride was introduced into the CVL buffer and measured before and after CVL collection in order to determine the dilution factor for each specimen. SRY gene detection by PCR was also performed in all samples in order to rule out sperm contamination. Prevalence of HIV genital shedding was estimated for both groups and factors associated with the intensity of viral shedding were investigated, using a multiple linear regression model. Variables with p<0.2 in bivariate analysis were included in multivariate analysis, as well as the study group (PM and F). The final model included factors shown to be independently associated with intensity of HIV genital shedding. RESULTS: The prevalence of HIV-RNA genital shedding was similar in both groups. (PM: 17.8%, 95%CI 9.8 28.5; F: 22%, 95%CI 13.1 33.1, p=0.678). Likewise, the intensity of HIV shedding was shown not to differ between PM and F women (means - PM: 1.4log/mL; F: 1.4log/mL, p=0.587). Plasma viral loads were detectable in 34.2% of PM patients (95%CI 23.5 46.3), as compared to 42.5% among F women (95%CI 31 54.6) (p=0.395). Three patients (2 PM/1 F) exhibited HIV-RNA genital shedding in the absence of detectable viremia. We found evidence of correlation between HIV plasma viral load and HIV cervicovaginal shedding in both groups (rPM: 0.658; rF: 0.684, p<0.01). In addition, CD4+ cell counts were shown negatively correlated to HIV shedding in both groups (rPM: -0.250; rF: -0.248, p<0.05). In multivariate analysis, HIV plasma viral load was shown independently associated with occurrence of HIV genital shedding in both groups (OR 4.03, 95%CI 2.52 6.45, p<0.001). In addition, the intensity of HIV shedding was shown independently associated with vaginal pH (p<0.001), TNF- concentrations in CVL (p=0.01), and with HIV plasma viral loads (p=0.001), all of them with positive correlation. CONCLUSION: Despite the significant changes that occur in the vaginal mucosa of postmenopausal women, HIV cervicovaginal shedding does not seem to be significantly influenced by this state. Plasma viral loads and CD4+ cell counts are correlated to HIV genital shedding. The frequency of HIV genital shedding was shown independently associated with viremia intensity. Moreover, increased vaginal pH and evidence of genital inflammation associated with TNF- concentration independently enhanced the intensity of HIV shedding in postmenopausal and fertile-aged women.

O Papilomavírus humano (HPV) é provavelmente o agente mais prevalente das doenças sexualmente transmissíveis do trato genital.Este estudo foi realizado para comparar as prevalências de HPV nos 144 raspados penianos de homens HIV positivos e negativos.Utilizou PCR PGMY09/11 e hidridização em pontos. A prevalência de HPV nos indivíduos HIV positivo foi de 59% e no HIV negativo de 67%.A lesão aceto-branca pela peniscopia não demonstrou significativa positividade para HPV.Pacientes HIV positivo mostraram múltiplos tipos de HPV e os tipos oncogênicos (16/18) foram os de maior freqüência. Os HPV tipo 6/11 foram os mais freqüentes nos dois grupos. Observou-se maior prevalência de HPV nos HIV positivos com linfócitos T CD4 menor que 200 células/mm3. A carga viral plasmática do HIV não foi um fator de positividade para HPV / Genital tract human papillomaviruses (HPV) are probably the most prevalent sexually transmitted pathogens. This study is to compare HPV DNA prevalence in 144 penile smears, obtained from HIV positive and negative men. It was used PCR employing the PGMY09/11 generic HPV primers and dot blot hybridization. HPV prevalence was 59% in HIV positive men and 67% in HIV negative. Acetic white lesions by peniscopy did not show significant positive of HPV in neither HIV positive and negative groups. HIV positive men had more often multiple and oncogenic HPV types (16/18). HPV types 6/11 were more frequent in both groups. The HIV positive group with lower 200 T CD4 cell counts load reported more HPV prevalence. HIV load was not a positive factor for HPV

L'une des principales barrières à la prise en charge optimale des patients sous traitement antirétroviral est l'accès limité aux tests de charge virale (CV) et de génotypage particulièrement en milieu décentralisé. Ces tests ne sont généralement disponibles qu'au niveau des structures sanitaires centrales de grandes villes et le plasma en est l'échantillon de référence. Or, son transfert des régions périphériques vers les laboratoires de références est difficile, voire impossible. Pour rapprocher les patients du laboratoire, nous avons démontré la possibilité d'assurer un suivi virologique complet (CV et génotypage) à partir des DBS collectés et acheminés dans des conditions de terrain. Nous avons également pour la première fois, documenté la réponse virologique au traitement antirétroviral et la diversité génétique du VIH-1 chez des patients adultes suivis en milieux décentralisés au Sénégal, au Mali et en Guinée Conakry. Globalement, malgré les défauts d'observance au traitement souligné, les résultats de nos travaux ne montrent pas de différences significatives dans la survenue de l'échec virologique entre patients suivis dans les structures sanitaires centrales et périphériques, ceci quelque soit le pays considéré. Au Sénégal, chez les enfants nés de mères séropositives, la résistance vis à vis des INNTI était plus prépondérante, probablement du fait de l'utilisation systématique de la Névirapine durant la PTME. Par ailleurs, aucune mutation de résistance aux inhibiteurs d'intégrase n'a été observée malgré des taux de résistance élevés chez des patients en échec de première et deuxième ligne de traitement. Nos travaux confirment également une grande diversité génétique des sous-types viraux avec cependant la prédominance du CRF02_AG dans la sous région Ouest Africaine. Ces travaux de thèse mettent en évidence la faisabilité et la pertinence du DBS comme support pour le suivi virologique des patients en milieux décentralisés. Son utilisation a permis de montrer d'autre part des taux d'échecs virologiques élevés indiquant la nécessité de renforcer l'adhérence au traitement. Enfin, nos résultats soulignent l'utilité de prendre davantage en considération les profils de résistance pour initier un traitement de relais. / One of the major barriers to the optimal care of patients undergoing antiretroviral therapy is the limited access to viral load (VL) and genotyping tests, especially in remote areas. These technologies are usually available only at central health facilities in larger cities and plasma is the reference sample. However, plasma or whole blood samples shipment from remote areas to reference lab faces several constraints or even impossible. In order to bring closer patients to reference lab, we have demonstrated the ability of DBS (Dried Blood Spots) collected and shipped in field conditions to provide complete virological monitoring (VL and genotyping). We also documented for the first time, virological outcome of ART and HIV-1 genetic diversity in adult patients followed up in decentralized settings in Senegal, Mali and Guinea Conakry. Overall, despite the low treatment adherence noted sometimes, our findings show no significant differences in the occurrence of virological failure among patients followed up in the central and peripheral health facilities, whatever the country. In Senegal, no integrase inhibitors associated DRM has been found despite the high rate of resistance in patients failing first and second-line treatment. Furthermore, among children born to HIV infected mothers, NNRTI-associated drug resistant mutations (DRM) were more predominant, probably because of systematic use of Nevirapine in MTCT. Our studies also confirm the high genetic diversity of viral subtypes, with the dominance of CRF02_AG in West Africa. This work presented here highlights the feasibility and relevance of DBS as support for the virological monitoring of patients in decentralized settings in West Africa. Furthermore, its use showed high rate of virological failure indicating the need to reinforce adherence to treatment. Finally, our results highlight the utility to considering carefully drug resistance patterns before switching to another ART regimen.

We report on a stem cell-transplanted patient with B cell chronic lymphatic leukemia who presented with a subacute onset of focal neurological deficits, gait abnormalities, emotional lability and dementia. Progressive multifocal leukoencephalopathy was diagnosed by magnetic resonance imaging (MRI) of the brain and detection of JC virus genome in the cerebrospinal fluid. Cidofovir and the 5HT2A receptor antagonist chlorpromazine were subsequently administered. A follow-up MRI of the brain 2 weeks after initiation of the antiviral therapy displayed progress of the demyelination, and the patient died 3 months after onset of the neurological symptoms. This report highlights the need for the development of novel and potent strategies for treatment of progressive multifocal leukoencephalopathy. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.