Metapneumovírus Aviário (aMPV), família Pneumoviridae, gênero Metapneumovírus, é o agente etiológico responsável pela rinotraqueíte dos perus e também está associada à síndrome da cabeça Inchada em galinhas, duas importantes doenças respiratórias que acometem aves comerciais e levam a grandes perdas econômicas. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de aMPV em amostras de aves silvestres e realizar a caracterização molecular dos isolados encontrados, com o intuito maior de contribuir para o entendimento da epidemiologia desse vírus. Para isso foram coletados no total, 448 suabes orofaringeanos (OP) e cloacais (C) oriundos de 234 aves silvestres em quatro locais do estado de São Paulo. Três tipos de amostras foram processadas e testadas: 1) 266 suabes agrupados de um ou até cinco animais que estavam no mesmo recinto e respeitando o mesmo tipo de suabe (OP ou C); 2)188 suabes foram agrupados na forma de pools de até dois animais, contendo os suabes OP e C de cada animal, formando então 48 pools; 3) amostras de tecido traqueal e pulmonar de três Egretta thula também foram coletados e testados. A purificação de RNA viral foi realizada utilizando o QIAmp RNA Mini Kit Kit (Qiagen). Para o teste de RT-PCR foi utilizado o kit OneStep RT-PCR (Qiagen) com primers baseados no gene N, previamente descritos, com fragmento esperado de 115 bp. As amostras foram também testadas por RT-PCR em tempo real (RRT-PCR) com primers específicos previamente descritos, para os subtipos A e B, com base no gene G com fragmentos de 116 e 135 bp, respectivamente. Os fragmentos das amostras positivas foram purificados e sequenciados pelo sequenciamento tipo Sanger para caracterização por análises filogenéticas. Das 126 amostras testadas pelo teste de RT-PCR baseado no gene N, quatorze foram positivas: oito amostras de Anseriformes (Aix sponsa, Aix galericulata, Dendrocygna viduata), três de Columbiformes (Columba livia), um de Falconiformes (Falco sparverius), um de Psittaciformes (Psittacara leucophthalma) e um de Pelecaniformes (Egretta thula). Das quatorze amostras positivas, treze eram provenientes de suabes, e a décima quarta era oriunda de tecido traqueal de Egretta thula. Pelo teste de RRT-PCR baseado no gene G nenhuma das 184 amostras testadas foi positiva. As análises filogenéticas realizadas com fragmentos de 44 e 54 bp do gene N de duas amostras positivas, que se agruparam com isolados pertencentes ao aMPV de subtipo A. Estes vírus apresentaram alta identidade com as estirpes derivadas de vacina e com estirpes vacinais, o que mostra uma possível ocorrência de escapes vacinais de aves de produção para as aves silvestres. / Avian metapneumovirus (aMPV), family Pneumoviridae, genus Metapneumovirus, it is the etiologic agent responsible for turkey rhinotracheitis and is also associated with swollen head syndrome in chickens, two important respiratory diseases in poultry which leads to large economic losses. The aim of this study was detect the presence of aMPV in wild birds samples, to perform the phylogenetic analysis of the isolates found with the major objective of contributing to the understanding of the epidemiology of this virus in poultry farms. In total, 448 oropharyngeal (OP) and cloacal (C) swabs from 234 wild birds collected in four different locations within the state of São Paulo. The samples were processed and tested in three different ways: 1) 266 swabs were in the form of pools of one up to five animals that were in the same enclosure and respecting the same type of swab (OP or C); 2) 188 remaining swabs were grouped into pools of up to two animals, containing the oropharyngeal and cloacal swabs of each animal; 3) tracheal and pulmonary tissue samples were also collected and tested. Purification was performed using the QIAmp RNA Mini Kit Kit (Qiagen). Viral detection was performed by conventional RT-PCR technique using the OneStep RT-PCR kit (Qiagen) with primers based on the N gene, previously described with expected fragment of 115 bp. The samples were also tested by a real time RT-PCR (RRT-PCR) with specific primers previously described, for subtypes A and B, based on the G gene with fragments of 116 and 135 bp, respectively. Of the 126 samples tested by the RT-PCR N gene based, fourteen were positive: eight samples of Anseriformes (Aix sponsa, Aix galericulata, Dendrocygna viduata), three Columbiformes (Columba livia), one Falconiformes (Falco sparverius), one Psittaciformes (Psittacara leucophtalma) and one Pelecaniformes (Egretta thula). Of the swab samples, five were derived from oropharyngeal swabs and four from cloacal swabs, the other four samples were detected in the samples processed in pools of up to two animals, which contained the oropharyngeal and cloacal swabs of each bird. The positive Egretta thula sample was from a tracheal tissue sample. Based on the RRT-PCR G gene based, none of the 184 samples tested were detected. Phylogenetic analyzes were performed on two positive samples that proved to belong to aMPV subtype A, showing high similarity with the strains derived from the vaccine and with vaccine strains.

As formulações vacinais contra o Vírus Respiratório Sincicial Humano, HRSV, estão associadas à indução de eosinofilia pulmonar mediada por uma resposta de células TCD4+ Th2, após exposição ao HRSV selvagem. Foi identificado um peptídeo da proteína viral G, que modificado perde a capacidade de predispor à eosinofilia, tornando-o um imunógeno atraente. Células T CD8+ específicas para HRSV reduzem a resposta Th2, mediam resistência a desafio com o vírus, e estão relacionadas à redução dos sintomas. Assim, neste trabalho buscamos e identificamos epítopos de células TCD8+ na polimerase viral, utilizando programas de predição, imunização com peptídeos e avaliação da resposta celular. Também construímos vacinas de DNA contendo a seqüência nucleotídica do peptídeo da proteína G modificado. A caracterização da resposta imune estimulada por essas vacinas e por peptídeos purificados revelou que o plasmídio pTGMCTB, bem como os peptídeos GM e GMCTB, foram capazes de induzir anticorpos que, porém, não se mostraram neutralizantes de HRSV e protetores frente a desafio. / Vaccines against human respiratory syncytial virus (HRSV) are associated with pulmonary eosinophilia induction mediated by a TCD4+ Th2 response, after exposition to wild HRSV. A peptide from the viral protein G was identified to predispose to eosinophilia and loses this ability when mutated, making it an interesting immunogen. CD8+ T cells specific to HRSV reduce the Th2 response, mediate resistance to virus challenge, and are related to symptom-reduction. Thus, in the present work, we searched for and identified CD8+ T cell epitopes in the viral polymerase; using prediction programs, peptide immunization and evaluation of the cellular response. We also constructed DNA vaccines containing the nucleotide sequence of the mutated peptide from G protein mentioned above. The characterization of the immune response elicited by these vaccines and purified peptides showed that the pTGMCTB plasmid, as well as GM and GMCTB peptides were able to induce antibody response; however they are not neutralizing and protective against HRSV challenge.

Orientadores: José Dirceu Ribeiro, Renato Tetelbom Stein / Tese (doutorado) ¿ Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T01:47:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_EmersonRodriguesda_D.pdf: 2935794 bytes, checksum: a3a21e8b226c670f1ac8d027e5ed10a1 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Introdução: A infecção do trato respiratório inferior (ITRI) é uma das principais causas de morbimortalidade em crianças, principalmente em países em desenvolvimento e em crianças menores de 3 anos de idade. Os vírus estão entre os principais agentes etiológicos das ITRI em crianças. No entanto, poucos estudos até o momento investigaram o impacto dos vírus respiratórios em populações de crianças de países em desenvolvimento e de que maneira as codetecções de dois ou mais vírus modificam a gravidade das infecções. Objetivo: identificar quais vírus respiratórios causam ITRI em lactentes e crianças até 3 anos de idade hospitalizadas e qual o impacto das codetecções virais sobre a gravidade destes episódios. Métodos: crianças de até 3 anos de idade internados em um hospital terciário no Brasil durante os meses de alta prevalência de vírus respiratórios tiveram amostras coletadas de aspiração nasofaríngea. Estas amostras foram testadas para 13 diferentes vírus respiratórios através de PCR em tempo real (RT-PCR). Os pacientes foram acompanhados durante a internação, e dados clínicos e das características da população foram registradas durante esse período e na alta para avaliar marcadores de gravidade, como tempo de internação e uso de oxigênio. Foi usada análise univariada para identificar potenciais fatores de risco e a regressão logística multivariada para determinar o impacto de detecções virais específicas sobre os desfechos, bem como para avaliar o efeito das codetecções sobre estes mesmos desfechos. Resultados: Foram analisados 260 episódios de ITRI com uma taxa de detecção viral de 85% (n = 222). Codetecção foi observada em 65% de todos os episódios de vírus-positivos. O vírus foi mais prevalente Vírus Sincicial Respiratório (RSV) (54%), seguido por Metapneumovirus humano (hMPV) (32%) e Rinovírus humano (HRV) (21%). Nos modelos multivariados, lactentes com codetecção de HRV + RSV permaneceram 4,5 dias a mais no hospital (p = 0,004), quando comparados ao grupo sem a codetecção. A mesma tendência foi observada para o número de dias de uso de oxigênio suplementar. Conclusões: Embora RSV permaneça como a principal causa da ITRI em crianças, mostrou-se um aumento no tempo de internação e uso de oxigênio em crianças com RSV e HRV codetectados por RT-PCR em comparação com aqueles com RSV mas sem HRV em codetecção. Além disso, nosso estudo identificou um número significativo de crianças infectadas por vírus recentemente identificados, tais como hMPV e bocavirus Humano (HBoV), e este é um achado relevante para comunidades pobres de países em desenvolvimento / Abstract: Introduction: lower respiratory tract infection (LRTI) is a major cause of morbidity and mortality in infants and children, especially in developing countries and in children under 3 years old. Viruses are among the major etiologic agents of LRTI in children. However, few studies to date have investigated the impact of respiratory viruses in populations of children in developing countries and how the co-detections of two or more viruses modify the severity of infections. Objective: To identify respiratory viruses in infants and children up to 3 years of age hospitalized due to LRTI and verify the impact of viral co-detections on the severity of these episodes. Methods: Children less than 3 years of age admitted to a tertiary hospital in Brazil during the months of high prevalence of respiratory viruses had collected samples of nasopharyngeal aspirate. These samples were tested for 13 different respiratory viruses by real-time PCR (RT-PCR). Patients were followed during hospitalization, and clinical and population characteristics were recorded during this period and at discharge to assess markers of severity, such as length of stay and use of oxygen. Univariate analysis was used to identify potential risk factors and multivariate logistic regression was used to determine the impact of specific viral detections on outcomes and to evaluate the effect of co-detections on these same outcomes. ix Results: We analyzed 260 episodes of LRTI with an overall viral detection rate of 85% (n = 222). Co-detection was observed in 65% of all virus-positive episodes. The most prevalent virus was Respiratory Syncytial Virus (RSV) (54%), followed by human metapneumovirus (hMPV) (32%) and human rhinovirus (HRV) (21%). In multivariate models, infants with co-detection of HRV + RSV stayed 4.5 days longer in the hospital (p = 0.004), when compared to the group without this co-detection. The same trend was observed for the number of days using supplemental oxygen. Conclusions: Although RSV remains the leading cause of LRTI in children, our study has shown an increase in the length of stay and use of oxygen in children with RSV and HRV co-detected by RT-PCR in comparison with those with RSV alone. Furthermore, our study identified a significant number of children infected by viruses recently identified, such as hMPV and Human bocavirus (HBoV), and this is an important finding for poor communities in developing countries / Doutorado / Pediatria / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente

Orientadores: Clarice Weis Arns, Liana M. Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:24:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_RenataServande_D.pdf: 8139323 bytes, checksum: 5f1811651bc45b3676a6e65c545345ff (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: O Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV) é o agente etiológico de infecções respiratórias amplamente distribuídas e que produzem perdas importantes na criação comercial de bovinos. A infecção pelo BRSV produz alterações patológicas como bronquiolite e pneumonia intersticial e acomete, sobretudo, animais jovens. A limitada multiplicação do vírus em cultivos celulares e a sua instabilidade, representam dificuldades durante os procedimentos de isolamento do BRSV a partir de amostras clínicas. O presente trabalho teve como objetivo padronizar técnicas rápidas, sensíveis e específicas para a detecção do BRSV, utilizando um isolado brasileiro. Para tanto, foram utilizados camundongos Balb/c como modelo de infecção experimental pelo BRSV, a partir dos quais o vírus foi detectado pelas técnicas de RT-nested-PCR e imuno-histoquímica (IHQ) e os resultados foram comparados com aqueles obtidos em bovinos infectados experimentalmente. A técnica de RT-nested-PCR mostrou-se mais sensível para detecção do BRSV do que a técnica de IHQ, tanto para tecidos murinos quanto bovinos. As técnicas foram utilizadas em tecidos de bovinos suspeitos de infecção por BRSV. Uma destas amostras apresentou resultado positivo no RT-nested-PCR e na IHQ. O seqüenciamento dos produtos de PCR deste vírus detectado foi realizado. Esta nova estirpe, juntamente com a descrita previamente BRSV-25-BR (único isolado presente até então no Brasil), é representante do subgrupo B do BRSV e constitui importante ferramenta para a avaliação do perfil dos isolados brasileiros de BRSV, estimar a origem destes isolados e redefinir as necessidades locais com relação ao conteúdo das vacinas. As técnicas de RTnested- PCR e IHQ padronizadas serão úteis em estudos epidemiológicos bem como, no diagnóstico laboratorial do BRSV no Brasil / Abstract: Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) is the etiologic agent of widely distributed respiratory infections and is responsible for significant economic losses in commercial cattle production. Infection by BRSV produces pathological changes such as bronchiolitis and interstitial pneumonia and affects mainly young animals. The poor growth of the virus in cell cultures and its instability represent difficulties in virus isolation from clinical samples. The aim of the present work was to standardise fast, sensitive and specific methods to detect BRSV, using a Brazilian strain. For this purpose, Balb/c mice were used as experimental model to the BRSV infection, from which the virus was detected by the RT-nested-PCR and immunohistochemistry (IHC) standardised, and the results were compared with experimentally infected calves. RT-nested-PCR was more sensitive in detecting BRSV than IHC, from both mouse and calf tissues. These techniques were also used to screen calves suspected of being infected with BRSV. One of the suspected samples was positive by RTnested- PCR and IHC. Sequencing of the PCR products of this sample was carried out. This new isolate and the previously described BRSV-25-BR strain (the only well-known isolate in Brazil) are belong to subgrupo B and provide an important tool to evaluate the profile and to esteem the origin of Brazilian BRSV isolates and to determine the local necessities about the vaccines content. The standardised RT-nested-PCR and IHC techniques could be useful in the epidemiological studies and laboratory diagnosis of BRSV in Brazil / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador : Alvaro Santos Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T04:55:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gaspar_JoseOsmar_M.pdf: 5774831 bytes, checksum: 158c3f0cc650e4c53956150c44870a22 (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: Partículas longas e curtas do vírus do anel do pimentão ? VAP ? (?Brazilian tobacco rattle vírus?) foram visualizadas em tecidos foliares e de anteras de tomateiros (Lycopersicon esculentum Mill.) infectados. De modo característico, o VAP apareceu formando agregados de partículas sempre associados externamente a mitocôndrias, com exceção para micrósporos e grãos de pólen maduros, onde também foram encontrados agregados de partículas não associados com essa organela celular e partículas livres no citoplasma. Algumas vezes, partículas longas e curtas do VAP aparecem associadas numa extremidade a uma mitocôndria e na outra ao tonoplasto. O VAP foi localizado em todos os estágios de maior duração da mitocrosporogênese de tomateiros infectados, ou seja, estágio pré-meiótico, estágio meiótico, estágio de micrósporo pré-mitótico e estágio de grão de pólen maduro. Em grãos de pólen maduros partículas longas e curtas do VAP foram encontradas tanto nas células vegetativas como nas generativas. Em nenhum caso foram identificados vírions do VAP no núcleo celular, nem associação das partículas virais com paredes celulósicas, paredes de calose ou parede envolvente dos grãos de pólen. A quantidade relativamente pequena do vírus em células-mães dos grãos de pólen e micrósporos pré-mitóticos e o acúmulo de partículas longas e curtas em grãos de pólen maduros, levam-nos a acreditar que ocorre síntese do VAP durante o período de amadurecimento dos grãos de pólen... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Long and short particles of the Brazilian tobacco rattle virus (BTRV) were visualized in leaf cells and in cells of the various anther tissues of infected tomato plants. The BTRV appeared mostly as aggregates of parallel particles associated on both ends to mitochondria, though isolated aggregates and individual particles were seen in microspores and mature pollen grains. In a few cases particle aggregates were observed associated with a mitochondria on one end and to the tonoplast of a vacuole on the other end. The BTRV particles could be seen in the cytoplasm of infected cells during the various phases of microsporogenesis from the stage of pre-meiotic cells until mature pollen grains. ln these the short and long particles could be seen in the cytoplasm of both the vegetative and generative cells. No virus particle was ever seen in the nuclei of infected cells; neither associated with the cellulose or callose walls, nor on the outside wall of pollen grains. The small number of virus particles present in the pollen mother cells and pre-mitotic microspores on one side, and the great number of short and long particle aggregates in the mature pollen grains on the other, indicate that virus increase must occur during pollen grain maturation and is not the result of only distribution... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-16T15:20:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1293935 bytes, checksum: b779340631eccc4bf24d086b2784d036 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-16T15:20:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1293935 bytes, checksum: b779340631eccc4bf24d086b2784d036 (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A dengue é a doença mais importante causada por um arbovírus no mundo. O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae e possui 4 sorotipos antigenicamente distintos. São vírus de RNA fita simples, polaridade positiva, com o genoma de aproximadamente 11 Kb que é traduzido em uma poliproteína subdividida em três proteínas estruturais e sete proteínas não- estruturais (que estão relacionadas com a replicação viral, expressão das proteínas virais e virulência dos sorotipos). Nos últimos vinte anos têm sido observado um incremento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica e transmissão contínua dos diferentes sorotipos em áreas onde a doença não era prevalente. Um dos eventos mais alarmantes tem sido o aumento do número de casos da Febre da Dengue Hemorrágica (FDH) nas Américas. Um ponto ainda limitante dos testes diagnósticos que capturam o anticorpo presente no soro de pacientes infectados consiste na dificuldade de obtenção de baixo custo e produção em grande escala dos antígenos. Diante destas considerações objetivou-se expressar a proteína não-estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana. O gene da proteína NS1 foi otimizado para a expressão em plantas e clonado no plasmídeo pCAMBIA3301. O vetor de expressão pCAMBIA3301/NS1 foi utilizado para transformação de Arabidopsis thaliana. A terceira geração de plantas transformadas foi selecionada em homozigose dominante. A transformação de Arabidopsis thaliana foi evidenciada pela imunolocalização da proteína NS1 marcada dentro do lúmen do retículo endoplasmático em tecidos foliares. Este sistema será utilizado para obtenção do antígeno NS1 com finalidade de aplicação em testes de diagnóstico da dengue. / Dengue fever is the most important disease caused by an arbovirus in the world. The dengue virus belongs to the Flaviviridae family and has four antigenically distinct serotypes. They are single stranded RNA viruses, positive polarity, with a genome of approximately 11 Kb which is translated into a polyprotein subdivided in three structural proteins and seven non-structural proteins (that are related to viral replication, expression of viral proteins and virulence of serotypes). In the last twenty years, it was observed a significant increase in the epidemic activity, expansion of the geographical distribution and streaming of different serotypes in areas where the disease was not prevalent. One of the most alarming events was the increase in the number of cases of dengue hemorrhagic fever (DHF) in the Americas. A further limiting point of the diagnostic tests that capture antibody present in the serum of infected patients is the difficulty of obtaining low-cost and large-scale production of the antigens. Due to this factor, we aimed to build a system in transgenic Arabidopsis thaliana expressing the nonstructural protein (NS1) of the dengue-2 virus. The gene of the NS1 protein was optimized for expression in plants and cloned into the plasmid pCAMBIA3301. The expression vector pCAMBIA3301/NS1 was used for transformation of Arabidopsis thaliana. The third generation of transformed plants were selected by dominant homozygous. The construction of a transgenic Arabidopsis thaliana system was demonstrated by immunolocalization of the NS1 protein into the lumen of the endoplasmic reticulum in the leaf tissues. This system will be used to obtain the NS1 antigen with application purpose of dengue diagnostic tests.

Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Coorientador: Danila Vedovello de Jesus / Banca: Erna Geessien Kroon / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe / Banca: Sergio Moraes Aoki / Resumo: Dengue é a infecção por arbovírus mais comum em todo o mundo e é causada por quatro sorotipos distintos (DENV 1-4). No presente trabalho analisamos a transmissão do Dengue virus (DENV) em São José do Rio Preto (SP) no período entre 2011 e 2014. Foram utilizadas amostras de sangue de pacientes febris que procuraram o serviço de saúde do município. A pesquisa do DENV foi realizada através da técnica Multiplex RT-PCR utilizando primers que se ligam a regiões do gene da proteína não estrutural NS5 e da proteína estrutural C, seguido por Nested-PCR com iniciadores espécie-específicos. Foram analisadas 1.098 amostras no período entre agosto de 2011 a junho de 2014. Setecentos e noventa e oito amostras (798/1098, 72%) foram confirmadas como positivas por Multiplex-Nested-PCR. Os sorotipos de DENV encontrados foram: 65,41% (522/798) DENV-4, 22,56% (180/798) DENV-1, 11,28% (90/798) DENV-2 e 0,75% (6/798) co-infecção (DENV-1/DENV-4, DENV- 1/DENV-2), mostrando um padrão complexo de circulação dos sorotipos. Com a utilização de técnicas de geoestatística dos casos de dengue foi possível a detecção de áreas (zona Norte de São José do Rio Preto) com risco relativo elevado de ocorrência de DENV-4, áreas estas que foram priorizadas com relação ao emprego de medidas de vigilância e controle. Trinta e três amostras de DENV-4 foram submetidas ao sequenciamento do gene do envelope, assim como, à reconstrução filogenética. Dentre as 33 amostras, dez tiveram o genoma completo sequenciado, sendo filogeneticamente classificadas. As análises filogenéticas mostram que as amostras identificadas neste estudo foram agrupadas no genótipo Americano, que circula no Brasil. O genótipo Americano demonstrou apenas um clado agrupando todas as amostras de SJRP, indicando a circulação de uma única linhagem. A análise filogenética do genoma completo de DENV-4 mostra relação entre os isolados... / Abstract: Dengue is the most common arboviral infection worldwide and is caused by four distinct serotypes. In the present study we assessed the Dengue virus (DENV) transmission in São José do Rio Preto (SP) from 2011 to 2014. We analyzed blood samples from febrile patients who where attended at health care services in São José do Rio Preto. The DENV detection was performed with Multiplex RT-PCR using Flavivirus generic primers based on nonstructural protein (NS5) and structural protein (C), followed by Nested-PCR assay with species-specific primers. We analyzed 1098 samples from August 2011 to June 2014. Seventy two samples (798/1098, 72%) were confirmed as positive by multiplex RT-PCR. The DENV serotypes distribution were: 65.41% (522/798) DENV-4, 22.56% (180/798) DENV-1, 11.28% (90/798) DENV-2 and 0.75% (6/798) coinfection (DENV-1/DENV-4, DENV-1/DENV-2), showing a complex serotypes circulation pattern a of serotypes circulation. With the use of geostatistical techniques of dengue cases it was possible to detect areas (northern zone of São José do Rio Preto) with high relative risk of DENV-4 occurrence, these areas should be prioritized regarding the employment of surveillance and control measures. Thirty-three DENV-4 have been subjected to sequencing of the entire envelope gene and were used for phylogenetic reconstruction. Among the 33 samples ten had the full genome sequenced and were classified phylogenetically. The phylogenetic analyses showed that the samples identified in this study were grouped with American genotype that circulating in Brazil. The American genotype showed only one clade grouped with all SJRP samples, indicating the circulation of a single lineage. Phylogenetic analysis of DENV-4 complete genome shows a relationship between isolates from São José do Rio Preto with isolates found in northern region of south America. Amino acid substitutions were observed in the structural proteins (21%) and non-structural proteins... / Doutor

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.

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O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.