O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.

Orientador: Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kamiya_RegianneUmeko_D.pdf: 1901318 bytes, checksum: 6b54c1e6cbe9e4b6b6fb94ea27db2ec2 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Esta tese, apresentada na forma de 3 artigos, teve por objetivos: (1) analisar a freqüência dos genes de produção de mutacinas I, II, III e IV, em genótipos de S. mutans isolados de indivíduos cárie-ativos e livres de cárie, (2) analisar a freqüência dos genes de produção das mutacinas I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 e genes homólogos às bacteriocinas, identificadas em outras espécies bacterianas, em cepas de S. mutans isolados de crianças, bem como detectar a expressão diferencial dos genes identificados, em células de S. mutans crescidas na condição planctônica e séssil, (3) analisar a expressão dos genes de produção das mutacinas I, II e proteínas kinases CiaH, Dgk e ComD, em diferentes fases do crescimento planctônico e séssil. O rastreamento e a freqüência dos genes estruturais de diferentes mutacinas em isolados de S. mutans, foram realizados pela técnica de PCR e a análise da expressão gênica, pela técnica de RT-PCR semi-quantitativa. Os estudos, apresentados nesta tese, demonstraram o papel das mutacinas como um fator de virulência, altamente diversificado entre a espécie S. mutans, e relacionado com o risco de cárie. Este fator de virulência, pode ser regulado por mecanismos quorum-sensing, sendo assim, dependente da condição de crescimento planctônica ou séssil. A regulação da produção de mutacinas, por mecanismos quorum-sensing, pode representar uma vantagem seletiva à espécie produtora, principalmente em ambiente complexo, como o biofilme dental e lesões de cárie. Futuramente, mais estudos serão necessários para identificar novos determinantes genéticos, necessários para a síntese de substâncias semelhantes às mutacinas, bem como, identificar os mecanismos e componentes, que modulam a expressão deste importante fatorde virulência em S. mutans / Abstract: This thesis, comprised of 3 manuscripts was designed (1) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III and IV, in S. mutans isolated from caries-affected and caries-free individuals, (2) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 and genes homologues to bacteriocins identified in other bacterial species, in S. mutans isolated from children, in addition, to detect the differential expression of these genes, in S. mutans cells grown in planktonic and sessil conditions, (3) and to analyse the expression of the mutacins I and II production genes and kinase proteins genes (ciaH, dgk e comD), in different phases of the planktonic and sessile growth. The screening and frequency of the mutacins structural genes in S. mutans isolates were realized by PCR technique and the analysis of genetic expression, by RT-PCR semiquantitative method. The studies, presented in this thesis, demonstrate the role of mutacins as a virulence factor, highly diverse among S. mutans, and related to risk of dental caries. The mutacins production may be regulated by quorum-sensing mechanisms and is dependent on planktonic and sessile conditions. The modulation by quorum-sensing mechanisms may represent a selective advantage for producer S. mutans strain, mainly in complex environments as the dental biofilm and caries. Hereafter, more studies will be necessary to identify new genetic determinants for synthesis of mutacin-like substances and elucidate the mechanisms and components that modulate the genetic expression of this important virulence factor in S. mutans / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

EPECa tem sido identificada como o principal agente de diarreia aguda em crianças de países em desenvolvimento. Biofilmes são estruturas bacterianas envoltas por uma matriz de exopolissacarídeos. O objetivo deste estudo foi verificar a influência de diferentes condições de cultivo na formação de biofilme por EPECa isoladas de crianças com diarreia e pesquisar a presença de genes relacionados com a formação de biofilme. As sequências genéticas dos genes csgA, crl, fimH e bcsA foram pesquisadas através da PCR e verificadas em 6 (26%), 23 (100%), 22 (95,6%) e 23 (100%) das amostras respectivamente. A formação de biofilme em placas de MTP por EPECa foi melhor evidenciada em meio LB sem sal a 26 °C e em caldo E. coli a 37 °C, tanto em número de amostras quanto em intensidade da formação de biofilme. As microscopias confocal e de varredura propiciaram uma análise qualitativa de microcolônias e pilares, além de EPS respectivamente. As condições de cultivo devem ser usadas com precaução para realmente aferir a capacidade de formação de biofilme por amostras de EPECa. / aEPEC has been identified as the main agent of acute diarrhea in children in developing countries. Biofilms are bacterial structures which are surrounded by a matrix of exopolysaccharides. The aim of this study was investigate the influence of different culture conditions on biofilm formation by 23 aEPEC strains isolated from children with diarrhea and search for the presence of genes related to biofilm formation. The genetic sequences of the csgA, crl, fimH and bcsA genes were screened by PCR and were found in 6 (26%), 23 (100%) 22 (95.6%) and 23 (100%) of the strains respectively. Biofilm formation in MTP plates for aEPEC strains was better evidenced in LB medium without NaCl at 26 ° C and in E. coli broth at 37 ° C, both in number and intensity of biofilm formation. The confocal and scanning electron microscopy provided a qualitative analysis of structures such as microcolonies and pillars, and respectively EPS. The growing conditions should be used with caution to measure the real ability of biofilm formation by strains of aEPEC.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:49:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:58:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T12:58:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Gram-positive bacterium Staphylococcus saprophyticus, one of the coagulasenegative staphylococci, is the second most common causative agent of urinary tract infection, affecting mainly sexually active women. Staphylococcus saprophyticus can cause acute diseases as pyelonephritis, sepsis, nephrolithiasis, endocarditis, urethritis, epididymitis and prostatitis. This work aims to identify Staphylococcus saprophyticus surface proteins by using a proteolytic shaving approach, a methodology that was established to identify surface-exposed protein domains by tripsinization of intact cells. The peptides obtained were treated by trypsin, reduced, alkylated and identified by nano-chromatography using a nanoACQUITY UPLCTM system (Waters) coupled to a SYNAPT Q-TOF mass spectrometer (Waters). The homology analysis was performed using the software ProteinLynx 2.3 (Waters). Through the shaving, it was possible to identify 219 proteins, many of them, described as virulence factors. Of total, 01 is cell wall protein, 09 are extracelular proteins, 19 are membrane proteins and 190 are citoplasmatic proteins. Besides of the lysis process, the presence of cytoplasmic proteins on cell surface can be due to the activity of export pathways not yet identified and many of these proteins can be proteins with moonlighting function, in other words, proteins that plays more of one function, it can, in this case, plays functions on S. saprophyticus cell surface related to bacterial virulence. The main proteins with moonlighting function include metabolic enzymes of the glycolytic pathway; enzymes of other metabolic pathways, such as, glyoxalate cycle; chaperones and proteins related with the proteic folding. The prediction of cellular localization was performed through LocateP database. The results of this research help to elucidate the strategies and machineries used by proteins during the adhesion, infection and proliferation, leading us to understand the interaction between the pathogenic bacteria S. saprophyticus and the human host. The knowledge about the proteins present on the cell surface is of extreme importance, because many of these proteins represent targets to new drugs, therapeutic antibodies or vaccines, since the pathogen cell surface is the first to contact with the host cells during the infection process. / A bactéria Gram-positiva Staphylococcus saprophyticus, uma das bactérias estafilococos coagulase negativa, é o segundo agente mais comum causador de infecções do trato urinário, afetando principalmente mulheres sexualmente ativas. S. saprophyticus pode causar doenças agudas como pielonefrite, sepse, nefrolitíase, endocardite, uretrite, epididimite e prostatite. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas de superfície de S. saprophyticus pela abordagem de shaving proteolítico, uma metodologia que foi estabelecida para identificar proteínas que possuem domínios proteicos na superfície celular utilizando a tripsinização de células intactas. Posteriormente, os peptídeos obtidos foram tripsinizados, reduzidos, alquilados e identificados através de nano-cromatografia utilizando um sistema nanoACQUITY UPLCTM (Waters) acoplado a um espectrômetro de massas SYNAPT Q-TOF (Waters). Com isso foi possível identificar 219 proteínas, muitas delas descritas como fatores de virulência. Do total, 01 proteína é de parede celular, 09 extracelulares, 19 de membrana e 190 citoplasmáticas. Além do processo de lise, a presença de proteínas citoplasmáticas na superfície celular pode ser devida à atividade de vias de exportação ainda não identificadas e muitas dessas proteínas podem ser proteínas com função moonlighting, ou seja, proteínas que desempenham mais de uma função, podendo, neste caso, desempenhar funções na superfície de S. saprophyticus relacionadas à virulência bacteriana. As principais proteínas com função moonlighting incluem enzimas metabólicas da via glicolítica; enzimas de outras vias metabólicas, tais como, ciclo do glioxalato; chaperonas e proteínas relacionadas com o dobramento proteico. A predição de localização celular foi realizada com o banco de dados LocateP. Os resultados desta pesquisa contribuíram na elucidação das estratégias e maquinarias utilizadas pelas proteínas durante a adesão, infecção e proliferação, levando-nos a compreender a interação entre a bactéria patogênica S. saprophyticus e o hospedeiro humano. O conhecimento acerca das proteínas presentes na superfície celular é de extrema importância, visto que muitas dessas proteínas representam alvos para novas drogas, anticorpos terapêuticos ou vacinas, uma vez que a superfície celular do patógeno é a primeira a entrar em contato com as células do hospedeiro durante o processo de infecção.

A cárie dental, uma doença multifatorial de caracter bacteriana associada à dieta alimentar, que danifica a estrutura dos dentes, se mantém como um problema de saúde pública mundial. A produção de ácidos por bactérias acidogênicas, como o Streptococcus mutans é considerada um importante fator etiológico no desenvolvimento de cáries. Este microorganismo está sempre presente no biofilme dental potencialmente cariogênico. Além disso, há uma clara e forte evidência que a produção de glucanas é essencial para a expressão da virulência de S. mutans, contribuindo para a aderência efetiva da bactéria à superfície dental, pela exposição à sacarose. Neste trabalho, estudamos a ação do extrato bruto hidroetanólico das folhas (EF), do óleo-resina (OR) e de suas frações, a fração volátil (FV) e a fração resinosa (FR), de Copaíba sobre fatores de virulência de S. mutans. O efeito inibitório na produção de ácido foi monitorado pelo registro potenciométrico de pH da suspensão bacteriana em função do tempo de incubação, tratadas com concentrações seriadas dos produtos naturais de copaíba. Para o ensaio da atividade antibacteriana, a concentração inibitória mínima (CIM) e a bactericida mínima (CBM) foram determinadas e comparadas. Glucanas sintetizadas a partir da sacarose por glucosiltransferases isoladas de S. mutans (GTFs) em presença dos produtos de copaíba foi quantificada pelo método do fenol-sulfúrico. Os valores de de CI50 estabelecidos nos ensaios de potencial acidogênico foram iguais a 0,36 mg/mL (EF), e 0,06 mg/mL (FV). Enquanto a CIM foi estabelecida em 1 mg/mL (EF) e 0,2 mg/mL (FV). No entanto, tanto o EF quanto a F não apresentaram nenhum efeito bactericida nas concentrações testadas, sugerindo que eles exercem um efeito bacteriostático. Por outro lado, o OR exibiu um efeito bacteriostático em baixa concentração (CIM = 0,4 mg/mL) e um efeito bactericida em concentrações maiores (0,8 mg/mL). O OR também apresentou um maior efeito inibitório sobre a produção de ácidos bacterianos quando comparado ao EF, em concentrações menores ou igual a 2,0 mg/mL, porém em concentrações maiores este efeito inibitório foi equivalente. OR inibiu a síntese de glucanas insolúveis em um perfil dose-dependente e suprimiu a atividade das GTFs-AC e GTFs-EC em 70% e 50%, respectivamente, na concentração de 20 ?g/mL. Igualmente o OR suprimiu a síntese de glucanas solúveis pelas GTFs-EC (60%) na mesma concentração. Por outro lado, o EF não apresentou efeito acentuado sobre a atividade de GTFs-AC e GTFs-EC. / Dental caries, a diet-bacterial disease which damages the structure of teeth, continues to be a major public health problem worldwide. Acid production by acidogenic bacteria, such as Streptococcus mutans, which are embedded in a biofilm termed ?dental plaque? is a key aspect of the pathogenesis of dental caries. In addition, there is clear and unequivocal evidence that glucan production is essential for the expression of virulence by mutans streptococci and contribute for the effective adherence of bacteria on dental surfaces formed when exposed to sucrose. In this work, we have evaluated the effect of the hidroethanolic crude extract from the leaves of copaiba (EF), as well as, the wood oil resin from copaiba (OR) and its volatile fraction (FV) upon virulence factors of Streptococcus mutans. The inhibitory effect on bacteria acid production was evaluated through the potentiometric measurement of pH from bacterial suspensions treated with serial concentrations of natural products. For the antibacterial activity assay, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentrations (MBC) were determined and compared. Glucans synthesized from sucrose by streptococci glucosiltransferases (GTFs), in the presence of Copaiba natural products, were quantified by phenol-sulphuric method. The IC50 values established for the acidogenic potential assay were 0.36 mg/mL (EF) and 0.06 mg/mL (FV), while the MIC values were 1.0 mg/mL (EF) and 0.2 mg/mL (FV). However, both EF and FV did not display any bactericidal effect at the tested concentration range, suggesting that they exert a bacteriostact, rather than a bactericidal effect. On the other hand, OR exerted a bacteriostact effect at low concentrations (MIC = 0.4 mg/mL) and a bactericidal effect at higher concentration (MBC = 0.8 mg/mL). OR also displayed a higher inhibitory activity on bacterial acid production when compared to EF, at concentrations less than or equal to 2.0 mg/mL, but at higher concentrations their inhibitory effects were equivalent. OR inhibited insoluble glucan synthesis in a dose-dependent profile and suppressed GTFs-AC and GTFs-EC activities by 70% and 50%, respectively, at a concentration of 20 ?g/mL. Similary, OR suppressed soluble glucans synthesis by GTFs-EC (60%), at the same concentration. On the other hand, the EF did not affect significantly the activity of the GTFs-AC and GTFs-EC.

Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:48:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Endo_MarcosSergio_D.pdf: 3037856 bytes, checksum: a21ebec8d8ad677c201694383adabc1c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: Microrganismos resistentes à terapia endodôntica ou que invadiram o sistema de canais radiculares após os procedimentos clínicos de desinfecção são considerados as principais causas do insucesso endodôntico. Objetivos: 1) investigar a prevalência de Enterococcus faecalis nos casos de retratamento endodôntico e lesão periapical utilizando a técnica de cultura, PCR tradicional e nested PCR, e avaliar a suscetibilidade antimicrobiana e os fatores de virulência dos E. faecalis isolados dos canais radiculares investigados (Capítulo 1); 2) quantificar bactérias viáveis e endotoxinas em dentes com infecções endodônticas secundárias e correlacionar seus níveis com aspectos clínicos e radiográficos, e também avaliar o efeito do preparo químico-mecânico (PQM) com clorexidina 2% gel + EDTA 17% na redução de bactérias e endotoxinas. Também visou investigar determinadas espécies bacterianas Gram-negativas por meio da técnica de PCR (Capítulo 2). Métodos: Amostras microbiológicas foram coletadas de 30 canais radiculares de dentes com tratamento endodôntico prévio e lesão periapical após a remoção da guta-percha (C1) e após o PQM (C2). Técnicas de cultura microbiana, PCR (16S rDNA) e nested PCR foram empregadas para investigação de E. faecalis. Determinadas espécies bacterianas Gram-negativas foram investigadas por meio da técnica de PCR. Níveis de endotoxinas e unidades formadoras de colônias (UFCs) foram monitorados em C1 e C2, utilizando o método LAL e cultura, respectivamente. Cepas clínicas de E. faecalis foram testadas quanto sua suscetibilidade antimicrobiana frente a 12 tipos de antibióticos por meio do E-test. Fatores de virulência (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp e cylA) dos E. faecalis isolados foram investigados pela técnica de PCR. Resultados: E. faecalis foi encontrado pela técnica de cultura (7/30), PCR tradicional (13/30) e nested PCR (23/30). PCR tradicional e nested PCR revelaram maior sensibilidade do que a cultura na detecção de E. faecalis (p<0,05, teste McNemar). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15), T. denticola (1/15), T. socranskii (1/15) e T. forsythia (2/15) foram detectadas nos canais radiculares. Endotoxinas foram detectados em todos os casos (C1 e C2). Correlação positiva entre níveis de endotoxinas e destruição óssea periapical foi observada (p<0,05). E. faecalis apresentou-se suscetível frente à Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, Benzilpenicilina, Moxifloxacina e Vancomicina, entretanto algumas cepas mostraram resistência contra Eritromicina (3/12), Azitromicina (8/12), Rifampicina (4/12), Tetraciclina (2/12) e Doxiciclina (1/12). Foram encontrados os seguintes fatores de virulência nos E. faecalis isolados: ace e efaA (100%), gelE (91,6%), asa (83,3%), esp (25%) e cylA (16,6%). Conclusão: 1) A percentagem de E. faecalis encontrada variou dependendo da técnica empregada. Todos os E. faecalis isolados apresentaram fatores de virulência relacionados à aderência (genes ace e efa). Foi observada resistência frente a alguns antibióticos comumente utilizados na Odontologia (Capítulo 1); 2) Foram encontrados microrganismos e endotoxinas em todos os canais radiculares, antes e após o PQM. Os níveis de endotoxinas presentes inicialmente nos canais apresentaram associação com o tamanho da lesão periapical. O PQM com clorexidina 2% gel + EDTA 17% foi efetivo na redução da carga bacteriana e dos níveis de endotoxinas nos casos de infecção endodôntica secundária. (Capítulo 2) / Abstract: Introduction: Microorganisms resistant to the endodontic therapy or that invaded the root canal system after clinical disinfection procedures are considered the main causes of endodontic failure. Aims: 1) to investigate the prevalence of E. faecalis in cases of endodontic retreatment with periapical lesions using culture technique, traditional PCR and nested PCR; and also to evaluate the antimicrobial susceptibility and virulence factors of E. faecalis isolates (Chapter 1); 2) to quantify cultivable bacteria and endotoxin in root canals with secondary endodontic infection correlating their levels with the presence of clinical features; and also to evaluate the effect of chemomechanical preparation (CMP) with 2% chlorhexidine-gel + 17% EDTA on bacterial and endotoxin removal. Moreover, it was also aimed to investigate the presence of target strict Gram-negative anaerobic bacteria by PCR/ nested PCR (Chapter 2). Methods: Microbial samples were collected from 30 root-filled canals of teeth with secondary endodontic infection after removal of gutta-percha (S1) and after CMP (S2). Microbial culture techniques, PCR (16S rDNA) and nested PCR were used to investigate the presence of E. faecalis. Target Gram-negative bacteria species were investigated by PCR. Levels of endotoxin and CFU were monitored in S1 and S2, using the LAL assay and culture, respectively. Clinical strains of E. faecalis were tested for their antimicrobial susceptibility to 12 types of antibiotics by E-test. The virulence factors (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp and cylA) of E. faecalis isolates were investigated by PCR technique. Results: E. faecalis was found by culture technique (7/30), traditional PCR (13/30) and nested PCR (23/30). The traditional PCR and nested PCR technique revealed higher sensitivity for detection of E. faecalis than culture (p<0.05, McNemar's test). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15) T. denticola (1/15) T. socranskii (1/15) and T. forsythia (2/15) were detected in the root canals investigated. Endotoxins were detected in all cases (S1 and S2). Positive correlation between endotoxin levels and periapical bone destruction was observed (p <0.05). All E. faecalis strains were susceptible to Amoxicillin, Amoxicillin + clavulanic acid, Benzylpenicillin, Vancomycin and Moxifloxacin, however some strains showed resistant to Erythromycin (3/12), Azithromycin (8/12), Rifampicin (4/12), Tetracycline (2/12) and Doxycycline (1/12). The virulence factors of the E. faecalis strains were ace and efaA (100%), gelE (91.6%), asa (83.3%), esp (25%) and cylA (16.6%). Conclusion: 1) The percentage of E. faecalis found varied according to the technique employed. All E. faecalis isolated showed virulence factors related to adherence (genes ace and efa). They also showed resistance to some antibiotics commonly used in dentistry (Chapter 1); 2) Microorganisms and endotoxins were found in all root canals investigated, before and after CMP. The endotoxin levels initially found in the infected root canals were associated with a larger size of periapical radiolucent area. CMP with 2% chlorhexidine-gel + 17% EDTA was effective in reducing both bacterial load and endotoxin contents in the post-treatment apical periodontitis (Chapter 2) / Doutorado / Endodontia / Doutor em Clínica Odontológica

Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_Claudiade_M.pdf: 1002308 bytes, checksum: 1915c0cc8df2cd65fe9c6f087aaddd19 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Infecções por Escherichia coli são uma das maiores causas de diarréia em animais, entre eles os bezerros, sendo assim responsáveis por importantes danos econômicos na pecuária. Em nosso trabalho 58 E. coli originárias de bezerros com diarréia e 43 E. coli isoladas de bezerros sem diarréia, foram analisadas por ensaios de PCR (reação da polimerase em cadeia) quanto à presença dos genes para fatores de virulência eae, EAF, K99, F41, CS31A, F17, STa, LT-II, VT1, VT2, Hly, Ehly, CDT, CNF1, CNF2 e EAST1. Foram também realizados ensaios de citotoxicidade em células Vero para a expressão da Verotoxina (VT) e testes sorológicos para determinação dos sorogrupos. Os fatores de colonização (FC) foram detectados em 31 amostras, sendo 28 originárias de bezerros com diarréia e três amostras de bezerros sadios, onde 26 foram CS31A e onze F17, com seis delas apresentando CS31A/F17 associados. O gene eae esteve presente em 43 E. coli, sendo 35 isolados de animais com diarréia. Os FC K99, F41 e EAF não foram detectados. Quanto às toxinas pesquisadas, a mais freqüente foi a toxina VT1 presente em 43 E. coli, sendo 24 de origem de animais diarréico e 19 de bezerros sadios. Quarenta amostras foram EAST1, com 17 amostras foram isoladas de bezerros com diarréia, dez amostras foram VT2+ com seis delas isoladas de bezerros saudáveis. Oito amostras foram Ehly, seis CDT, quatro CNF2 e apenas duas LT-II. Nenhuma amostra foi positiva para Hly, STa e CNF1. A expressão fenotípica de VT e Ehly foram confirmadas em ensaios in vitro. Onze amostras foram negativas para todos os fatores de virulência pesquisados. Vinte amostras mostraram associação eae/VT1 e 13 foram CS31A/VT1. Foram detectados 35 sorogrupos entre as E. coli estudadas. A associação entre CS31A e VT1 não tinha sido descrita na literatura até o presente momento e a grande associação entre o gene eae e a toxina VT1 mostram que bezerros podem ser considerados como reservatórios de VTEC / Abstract: Infections caused by Escherichia coli are the most cause of diarrhea in animals, bovines and cattle, being thus responsible for important economic losses in farms. In this work, 58 strains isolated from calves with diarrhea and 43 strains isolated from healthy calves were studied for PCR analysis about the virulence factors eae, EAF, K99, F41, CS31A, F17, STa, LT-II, VT1, VT2, Hly, Ehly, CDT, CNF1, CNF2 and EAST1. We utilized techniques in vitro for the VT and Ehly production and serological assays for detecting serogroups. Of the studied strains, 31 of them were positive for colonization factors, being 28 isolated from diarrheic calves and five isolated from healthy calves, where 26 were CS31A+, eleven F17 and an association between CS31A/F17 was found in six strains from diarrheic calves. The eae gene was present in 43 strains, where 35 were isolated from calves with diarrhea and no E. coli were positive for the FC K99, F41 and EAF. About the toxin genes, the most frequent was VT1 in 43 strains, being 24 of diarrheic origin and 19 from healthy calves. Forty strains were EAST1, with of them 17 isolated from diarrheic calves, ten strains were VT2, being six isolated from healthy calves. Eight strains were Ehly, six CDT, four CNF2 and only two strains LT-II. Twenty E. coli showed association of eae/VT1 and 13 are CS31A/VT1 positive. No strains were positive for STa, Hly and CNF1. The production of VT and Ehly were positive in in vitro assays. Eleven strains were negative for all the genes probes. We detected 35 serogroups between E. coli studied. To our knowledge, this is the first description of an association between CS31A and VT1. The association between eae gene and VT1 toxin show that calves should be considered VTEC reservoir in Brazil for human infection / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Microbiologia

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mariana_almeida_iglesias.pdf: 683600 bytes, checksum: 7c2d99601551e443f9b19dd649609f3f (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that can cause listeriosis, both in humans and in animals. The contamination by this microorganism is difficult to control, given its wide dissemination and physiological adaptability, which allow its development under conditions which are usually unfavorable to other pathogenic bacteria. Therefore, this pathogen has become of concern to the food industry as well as consumers, since it is highly pathogenic, especially in relation to risk group and may be fatal in 30% of cases of listeriosis. Although any isolate of L. monocytogenes can be considered potentially pathogenic for humans, several studies suggest that this micro-organism has a heterogeneous pathogenicity of the strains, which makes it essential to know the gene expression of the pathogen can be understood that the differences in their virulence mechanisms, and how different potential pathogenicity. The present study aimed to verify the occurrence of. L. monocytogenes in slaughterhouses in southern Rio Grande do Sul, and through the isolates, assess their sensitivity to antibiotics, and perform a genotypic characterization by verifying the presence of virulence genes. L. monocytogenes occured in 6% of the samples, detected after bleeding at the point where the collect was held in the leather of the animal, and point 4 (pre-cooling after washing).Twelve isolates were obtained, which were evaluated for sensibility to 15 antimicrobials, of which 100% were susceptible to most antibiotics tested. Resistance to gentamycin (8%), ampicilin (8%), kanamycin (8%) and sulfonamide (83%) were observed in some isolated of L. monocytogenes. Intermediate susceptibility to clindamycin (60%) and erythromycin (8%) was observed, and multidrug-resistant strains were also observed. Proceeded to evaluate the presence of virulence genes (hlyA, plcA, inlA, inlB, inlC, inlJ, plcB, iap, actA, mpl and PrfA) and, through the results of PCR, it was observed that all isolates possessed the evaluated genes, also confirmed the expression of the gene of internalin A by RT-PCR, showing the potential pathogenic strains of L. monocytogenes isolated from food in southern Brazil. / Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar capaz de causar listeriose, tanto em humanos como em animais. A contaminação por este micro-organismo é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que usualmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas. Assim sendo, esse patógeno tornou-se motivo de preocupação para a indústria de alimentos bem como para os consumidores, uma vez que é altamente patogênica, principalmente em relação ao grupo de risco, podendo ser fatal em até 30% dos casos de listeriose. Embora qualquer isolado de L. monocytogenes possa ser considerado potencialmente patogênico para humanos, vários estudos sugerem que este micro-organismo apresenta patogenicidade heterogênea, o que torna essencial a caracterização molecular de cada isolado, bem como o conhecimento de sua expressão gênica, para que possam ser entendidas as diferenças nos seus mecanismos de patogenicidade.. Em vista do exposto, o presente estudo objetivou verificar a ocorrência de L. monocytogenes em carcaças bovinas abatidas em dois frigoríficos-matadouros do sul do Rio Grande do Sul e, a partir dos isolados, avaliar sua sensibilidade a antimicrobianos, e realizar a caracterização genotípica, através da verificação da presença de genes de virulência e da expressão da internalina A. A ocorrência de L. monocytogenes nas carcaças foi de 6%, a qual foi detectada no Ponto 1 (após a sangria) e no Ponto 4 (após a lavagem pré-resfriamento). Foram obtidos 12 isolados, os quais foram avaliados quanto a sensibilidade a 15 antimicrobianos, dos quais 100% mostraram-se sensíveis a maioria dos antibióticos testados. Resistência à gentamicina (8%), ampicilina (8%), canamicina (8%) e a sulfonamida (83%) foram observadas em parte dos isolados. Suscetibilidade intermediária foi observada para clindamicina (60%) e eritromicina (8%). Quanto aos isolados multirresistentes, dois deles apresentaram resistência a mais de um agente antimicrobiano. Procedeu-se à avaliação da presença de genes de virulência (prfA, plcA, plcB, hlya, iap, actA, mpl, inlA, inlC e inlJ) e, através dos resultados da PCR, foi possível observar que todos os isolados possuíam os genes avaliados, sendo também confirmada a expressão do gene da internalina A através da técnica de RT-PCR, evidenciando o potencial patogênico das cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos no sul do Brasil.

Chez les procaryotes, les protéines sont synthétisées dans le cytoplasme avant d'être transportés vers différentes destinations, intra- ou extra-cellulaires. Les bactéries Gram-négatives ont mis au point une grande collection de mécanismes et systèmes, appelés systèmes de sécrétion bactérienne, pour sécréter des protéines à travers leur paroi cellulaire vers l'extérieur. Le système de sécrétion de type VI, identifié dans les années 2006-2008, est une nano-machine polyvalente répandue chez les bactéries pathogènes. Il y a de nombreuses preuves que T6SS injecte des protéines toxiques (effecteurs) directement dans les cellules eucaryotes et procaryotes pour les tuer. Pour empêcher la destruction cellules provenant de la même espèce, les bactéries possédant un T6SS produisent également des protéines d'immunité qui neutralisent les effets toxiques des effecteurs de leurs congénères. Le T6SS est formé de 13 composants de coeur (nommés TssA-M) en une structure souvent comparée à un "bactériophage inversé". La queue, semblable à celle de phages, a une forme tubulaire (la gaine et le tube interne) et polymérise à partir d'une plaque basale ancrée sur un complexe membranaire trans-périplasmique. La contraction de la gaine fournit l'énergie nécessaire pour propulser le tube intérieur à travers la paroi vers les cellules proies. Dans le cadre de ma thèse, je me suis impliqué dans la détermination de la structure et la dynamique de certains composants du T6SS de la d’Escerichia coli enteroaggrégatif (EAEC). Plusieurs structures ont été déterminées et analysées. Quatre articles ont été publiés et deux autres sont en préparation. / In prokaryotes, proteins are synthesized in the cytoplasm before being transported to various destinations, intra- or extra-cellular. Gram-negative bacteria have developed a large collection of mechanisms and systems, termed bacterial secretion systems, to secrete proteins through their cell wall to the exterior. The type VI secretion system, identified in years 2006-2008, is a versatile nano-machine prevalent in pathogenic bacteria. There have been many evidences that T6SS delivers toxic proteins directly into both eukaryotic and prokaryotic cells to kill them. To prevent killing of sibling cells (cells from the same species), T6SS+ cells produce also immunity proteins that neutralize the toxic effects of their cognate effectors. T6SS contains 13 core-components (TssA-M), assembling a structure often quoted as an “inverted bacteriophage”. A phage-like tubular tail (the sheath and the internal tube) polymerizes from a baseplate-like complex, anchored to the cell internal and outer membranes via a membrane anchored complex spanning the periplasm. Contraction of the sheath provides the necessary energy to propel the internal tube through the wall towards the prey cells. In the framework of my PhD, I became involved in determining the structure and dynamics of some components of the EAEC sci1 T6SS, mostly on the membrane and baseplate subcomplexes. Several structures have been determined and analysed. Four articles have been published and two other are in preparation.

Uropathogenic E. coli (UPEC) is the most frequent cause of urinary tract infection (UTI), being responsible for up to 85% of community acquired and 40% of nosocomial cases. UPEC strains harbour various virulence factors that contribute to their ability to cause disease. The high prevalence across the globe of multidrug resistant UPEC is a significant threat to therapy. Virulent and resistant UPEC strains have been recognised as belonging to major lineages and we have only recently begun to understand the factors contributing to their successful global dissemination. Work in this thesis was carried out to identify the population structure of E. coli isolates recovered from urosepsis and biliary sepsis, to reveal any differences in genetic background. A total of 100 isolates from the blood and urine of 50 patients presenting with urosepsis and 27 isolates from cases of biliary sepsis were subjected to genotypic and phenotypic analysis, including MLST, virulence gene detection and antibiogram and metabolic profiling. Urosepsis paired isolates showed identical genotypes and antimicrobial resistance profiles. However, several pairs of isolates showed discrepant metabolic activity profiles suggesting niche specific regulation of metabolism. Members of the ST131 clone were significantly associated with antibiotic resistance and ST38 isolates were associated with the highest level of metabolic activity. An in vivo infection model was used to investigate the virulence potential of isolates from the major UPEC lineages. Galleria mellonella larvae inoculated with ST69 and ST127 isolates showed significantly higher mortality rates than those infected with other strains. However, one isolate of ST127 (strain EC18) was avirulent and comparative genomic analyses with a single virulent ST127 strain revealed an IS1 mediated deletion in the O-antigen cluster in strain EC18, which is likely to explain the lack of virulence in the larvae and demonstrates the importance of this cell surface molecule in the model system. Finally, a total of 202 UPEC isolates were recovered from community and hospital urine samples from a tertiary care hospital in Riyadh, Saudi Arabia. Molecular epidemiological investigation of the strains was carried out to examine the overall UPEC population structure, for the first time in any part of Saudi Arabia. The most common lineages were ST131 (17.3%), ST73 (11.4%), ST38 (7.4%), ST69 (7.4%) and ST10 (6.4%). The findings highlight the successful spread of multidrug resistant, CTX-M positive ST38, ST131 and ST405 UPEC in Saudi Arabia. The high proportion (35%) of ESBL producing E. coli isolates is a particular concern and is driving frequent prescription of carbapenem antibiotics. A total of four isolates of ST38 were positive for aggR, which is a virulence marker of enteroaggregative E. coli (EAEC); ST38 strains that cause UTI but have an EAEC genetic background are becoming recognised as novel UPEC and this clonal group warrants further study.