Com o surgimento da metagenômica, a descoberta de compostos bioativos aumentou. A Arrabidaea chica é uma planta trepadeira, usada em tatuagens pelos índios. O enriquecimento da extração dos antocianosídeos através da fermentação das folhas com xilanase de Bacillus pumilus foi estudado anteriormente. A análise qualitativa da produção de xilanase por clones de bibliotecas metagenômicas e B. pumilus SG-32 e B. firmus P1-1 foi feita com a finalidade de elaborar um método miniaturizado para encontrar novas fontes dessa enzima. Bem como avaliar o seu potencial enzimático sobre os antocianosídeos. Os clones e o B. firmus não expressaram xilanases em meio sólido de xilana de bétula. Porém, o B. pumilus SG-32 expressou, como confirmado pelo atividade xilanolítica. Por isso, o caldo enzimático desta espécie foi utilizado como inóculo para o tratamento enzimático das folhas de A. chica que liberou suas antocianidianas, como confirmado pelo método de Bial e CLAE-DAD. Uma nova fonte de xilanase foi descoberta com atividade hidrolítica sobre os antocianosídeos de A. chica. / With the advent of metagenomics, the discovery of bioactive compounds increased. The Arrabidaea chica is a climbing plant, used in tattoos by the Indians. The extraction of anthocyanosides enrichment through fermentation of the leaves with xylanase from Bacillus pumilus has been studied previously. Qualitative analysis of xylanase production by clones of metagenomics libraries and B. pumilus SG-32 and B. firmus P1-1 was made in order to develop a miniaturized method to find new sources of this enzyme. And to evaluate the potential enzymatic on the anthocyanosides. The clones and the B. firmus xylanases did not express in solid birch xylan. However, B. pumilus SG-32 expressed as confirmed by the xylanolytic activity. Therefore, the broth enzymatic of this specie was used as inoculum for the enzymatic treatment of the leaves of A. chica that liberated their anthocyanidines, as confirmed by Bial method and HPLC-DAD. A new source of xylanase was discovered with hydrolytic activity on anthocyanosides from A. chica.

Os elementos de transposição (TEs) se movimentam de um locus para outro no genoma afetando a estrutura e evolução destes. A superfamília de transposases hAT é definida pelos elementos que compartilham os domínios de dimerização e ligação ao DNA com os transposons previamente descritos: hobo, Activator e Tam3. Análises prévias encontraram algumas evidencias da presença genômica e ativação transcricional de TEs relacionados à superfamília hAT em cana-de-açúcar (denominados de família SChAT) e pelo menos três linhagens evolutivas foram postuladas. O objetivo deste trabalho é caracterizar versões genômicas das linhagens de transposons (191 e 257) e linhagem possivelmente domesticada (074). Pretende-se estudar as relações evolutivas, distribuição em gramíneas, identificar os padrões de expressão e propriedades funcionais. Regiões de sintenia foram estabelecidas para estes BACs em Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Sorghum bicolor, Oryza sativa e Zea mays. Elementos relacionados com as três linhagens foram procurados nestes genomas. / Transposable elements (TEs) are able to move from one locus to another within a genome. TE mobilization affects genome structure and evolution. The hAT transposase superfamily is defined as elements that share the dimerization and DNA ligation domains with the previously described hobo, Activator and Tam3 transposon elements. Previous analyses found some genomic and transcriptional evidences of TEs related to hAT superfamily in sugarcane (named SChAT family) and at least three evolutionary lineages were proposed. The aim of this work is to characterize full-length genomic versions of the transposons lineages (191 and 257) and from the domesticated lineage (074). It is proposed to study the evolutionary relationship, distribution along grasses genomes, identify expression patterns and functional capacities of the SChAT elements. Syntenic regions for the BACs containing elements from the three lineages were mapped in Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Sorghum bicolor, Oryza sativa and Zea mays. Related elements were search on the same genomes.

A PEGlação é uma bem sucedida estratégia nano-biotecnológica que envolve a ligação covalente do polietilenoglicol (PEG) a uma droga para melhorar sua farmacocinética, farmacodinâmica e perfil imunológico, e portanto, aumentar seu efeito terapêutico. Atualmente, a PEGlação é usada para modificar proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de anticorpos. A Uricase (EC 1.7.3.3, UC) é uma enzima pertencente à classe das oxidorredutases, responsável pela oxidação do ácido úrico, produzindo alantoína. Essa enzima é encontrada em muitos organismos vivos como: bactérias, leveduras, fungos, vegetais e animais. Entretanto, durante a evolução das espécies o gene da UC tornou-se inativo, por isso, em humanos a UC é inativa. Nesse sentido, a UC adquiriu destaque como um potencial fármaco uricolítico, devido à necessidade do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento de hiperuricemia e gota. Neste estudo, a uricase recombinante purificada de Candida sp (UC-r) e a de rim bovino (UC-b) foram modificadas por PEGlação com mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) e 2-O-mPEG-4,6-dicloro-s-triazina (mPEG-CN), produzindo conjugados com considerável atividade enzimática residual UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) e UC-b-mPEG-pNP (75%), UC-b-mPEG-CN (50%).Além disso, os conjugados obtidos com a UC-r e UC-b apresentaram valores de KM menores do que as enzimas nativas, indicando que a PEGlação conferiu uma interessante propriedade aos conjugados, que permitiu um aumento da afinidade da UC-r e UC-b pelo ácido úrico. O efeito do pH e da temperatura sobre a UC-r e UC-b modificadas indicou que os conjugados obtidos foram mais ativos em pH próximo ao fisiológico e mais estáveis do que a respectiva enzima nativa. As formas PEGladas da UC-r e UC-b foram mais resistentes à ação de diferentes proteases e mantiveram-se estáveis em soro humano, indicando que a PEGlação favoreceu a resistência a degradação proteolítica. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e infravermelho (FTIR) não apresentaram nenhuma diferença relevante entre a estrutura protéica da UC-r nativa e PEGlada. Estudos in vivo com coelho e camundongos Balb/c mostraram que a UC-r nativa induziu uma intensa resposta imune sendo altamente imunogênica. Por outro lado, a UC-r PEGlada quando injetada cronicamente em camundongos não induziu qualquer resposta detectável de anticorpos. Esses resultados indicam uma suficiente redução da imunogenicidade dessa enzima, devido à conjugação do mPEG-pNP ou mPEG-CN, tornando-a adequada para um possível uso terapêutico. Portanto, nesse trabalho, os resultados obtidos com a UC-r de Candida sp, mostram que dois conjugados apresentaram interessantes propriedades físico-química, biológicas e imunológicas, que permitiram um significativo avanço na transformação de uma enzima de origem fúngica em uma droga, com uma possível aplicação terapêutica no tratamento de hiperuricemia e gota. / PEGylation is a successful nanobiotechnology strategy that involves the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to a drug to improve its pharmacokinetic, pharmacodynamic, and immunological profiles, and thus, enhance its therapeutic effect. Currently, PEGylation is used to modify proteins, peptides, oligonucleotides, antibody fragments, and small organic molecules. Uricase (EC 1.7.3.3, UC) is an enzyme belonging to the class of oxidorreductases responsible for the oxidation of uric acid, producing allantoin. This enzyme is found in many living organisms such as bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. However, during the evolution of the species gene became inactive UC, therefore, in humans UC is inactive. Accordingly, UC has acquired prominence as a potential drug uricolytic due to the need of developing new therapeutic agents for the treatment of hyperuricemia and gout. In this study, purified recombinant uricase from Candida sp (UC-r) and ox kidney (UC-b) were modified by PEGylation with mPEG-p-nitrophenyl-carbonate (mPEG-pNP) and 2-O-mPEG-4,6-dichloro-s-triazine (mPEG-CN), producing conjugates with considerable residual enzyme activity UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) and UC-b-mPEG-pNP (75%),UC-b-mPEG-CN (50%). In addition, conjugates obtained with the UC-r and UC-b had lower KM values than native enzymes, indicating that the PEGylation gave an interesting property the conjugate that increased the affinity of UC-r and UC-b by uric acid. The effect of pH and temperature on the modified UC-r and UC-b indicated that the conjugates were more active at pH close to the physiological and more stable than its native enzyme. PEGylated forms of UC-r and UC-b were more resistant to the action of different proteases and remained stable in human serum, indicating that the PEGylation favored resistance to proteolytic degradation. Spectroscopic analysis of circular dichroism (CD) and infrared (FTIR) did not show any relevant difference in protein structure between native and PEGylated UC-r. In vivo studies with rabbit and Balb/c mice showed that UC-r native elicited an intense immune response being highly immunogenic. On the other hand, the PEGlated UC-r when chronically injected into mice did not induce any detectable response to antibodies. These results indicate a sufficient reduction of immunogenicity of this enzyme, due to conjugation of mPEG-pNP or mPEG-CN, making it suitable for possible therapeutic use. Therefore, the results obtained with the UC-r of Candida sp, showed that two conjugates have interesting physical-chemical, biological and immunological, which allowed a significant advance in the transformation of an enzyme of fungal origin in a drug with a possible application therapeutic in the treatment of hyperuricemia and gout.

O presente trabalho procurou aperfeiçoar um código criado para calcular os parâmetros k0 e Q0, denominado COVAR, adicionando um outro método para a determinação do fator k0 e aprimorar a análise de covariância existente, criando uma nova versão: COVAR v4.1. O presente trabalho também desenvolveu um novo método de cálculo para os parâmetros α e vários fatores k0 em um único ajuste de mínimos quadrados, por meio de uma metodologia inédita, utilizando matrizes de covariância e todas as incertezas parciais envolvidas. Para aplicação deste método, outro código foi desenvolvido, denominado AKFIT v2.1, no qual possui a capacidade de efetuar dois ajustes, linear e não-linear, na determinação de α e k0 para várias irradiações. Foi utilizado um conjunto de dados com irradiações realizadas nos anos de 2008 e 2010, pelo Laboratório de Metrologia Nuclear (LMN) e por meio do reator nuclear IEAR-1, do IPEN-CNEN/SP, correspondendo aos radionuclídeos 95Zr, 65Zn, 69mZn, 46Sc, 140La e 60Co, resultando em 21 conjuntos de dados a serem analisados para verificar o desempenho dos códigos criados. Para COVAR v 4.1, os resultados do cálculo alternativo para o fator k0 foram próximos dos valores obtidos pelo método original do programa e foram consistentes com a literatura. Para AKFIT v2.1, realizou-se ajustes com ambas irradiações simultâneas e separadas. Os modelos ajustados concordaram com a literatura. O valor de α foi de 0,0025(83), que está de acordo com resultados obtidos anteriormente pelo LMN. As correlações entre os parâmetros k0 se comportaram como esperado, com valores menores entre diferentes elementos e maiores entre elementos iguais com diferentes energias e usando o mesmo comparador. Pode-se concluir que os métodos propostos foram capazes de calcular os valores de k0, com AKFIT v2.1 sendo uma nova técnica no qual é possível determinar dois parâmetros, α e k0, ao mesmo tempo, de modo rápido e preciso. Espera-se que o código AKFIT possa ser aperfeiçoado, adicionando mais parâmetros, como Q0 e f, tornando-o uma ferramenta de ajuste completo para a determinação de todos os parâmetros essenciais do Método k0 de AAN. / The present work aims to improve a code for calculating k0 and Q0 parameters, called COVAR, adding another method of calculating k0 factor and improving the covariance analysis, creating a new version: COVAR v4.1. The present work also aims the development of a new method of calculating the alpha and several k0 parameters in a single least square fit, by means of a novel methodology, using covariance matrices and all partial uncertainties. For the calculations applying this new method, another code was developed, called AKFIT v2.1 which performs linear and non-linear fittings for the determination of alpha and k0 parameters for several irradiations in different periods. We used a database with irradiations in the years 2008 and 2010 performed at the IEAR-1 nuclear reactor of the IPEN-CNEN/SP, by the Nuclear Metrology Laboratory (LMN), corresponding to radionuclides 95Zr, 65Zn, 69mZn, 46Sc, 140La and 60Co and resulting in 21 data sets which were analyzed in order to verify the performance of COVAR4.1 and AKFIT2.1. For COVAR v4.1, the results with the alternative calculation of k0 factor were close to the already existing calculation and were consistent with the literature. For AKFIT v2.1 fittings were performed with both irradiations simultaneously and separately. The fitted models agreed with the literature. The α value was 0,0025(83), which agrees with previous results obtained by the LMN. The correlations between the parameters k0 behaved as expected, with smaller values between different elements and greater correlations between equal elements with different energies and using the same comparator measurement. It can be concluded that the proposed methods were able to calculate the values of k0, with AKFIT v2.1 being a new technique in which it is possible to determine two parameters, alpha and k0 at the same time, quickly and accurately. It is expected that AKFIT code can be improved by adding more parameters, such as Q0 and f, by making a complete fitting for the determination of all the main parameters for the k0 NAA method.

A superlotação dos pátios de recolhimento de veículos (PRVs) é, atualmente, um assunto em pauta no cenário brasileiro. O objetivo deste trabalho foi estudar os teores totais de elementos potencialmente tóxicos (EPTs) (As, Ba, Co, Cr, Cu, Mo, Pb, V e Zn), elementos-traço (ET) (Cs, Ga, Hf, Rb, Sc, Sr, Ta, Th, U, Y e Zr), elementos terras raras (ETR) (Ce, Eu, La, Lu, Nd, Sm, Tb e Yb) e elementos de liga (EL) (Al, Fe, Mn, Nb, Ni e Ti) no solo e água subterrânea em um PRV localizado no município de Ribeirão Pires. Foram analisados o solo superficial, os testemunhos de três sondagens de solo e a água subterrânea de três poços de monitoramento. A área está sob influência principal de três fatores: (1) camada de aterro com resíduos de construção civil; (2) um resíduo oleoso oriundo de atividades industriais exercidas na área no passado; (3) veículos estacionados na camada superficial do solo. Os resultados foram avaliados por técnicas estatísticas de análise multivariada, cálculos de indicadores de poluição e cálculos de índices de risco ecológico e à saúde humana. O conteúdo da maioria dos EPTs no solo superficial foi superior aos valores de qualidade de solo regulamentados pela agência ambiental do Estado de São Paulo (CETESB), exceto Co, Cu, Mo e Zn. No solo foram observados alguns pontos que apresentaram níveis elevados (hotspots) para grande parte dos EPTs, sugerindo fonte veicular. O Índice de Geoacumulação indicou que o solo pode ser considerado de minima a moderadamente poluído, para a maioria dos elementos, exceto para As e Ba que apresentaram maior acumulação que os demais elementos. O conteúdo de As no solo pode representar um risco ecológico de potencial moderado a alto. O fator de enriquecimento apontou para uma poluição significativa de As e Pb. Os resultados de EPTs e as abordagens estatísticas indicaram que As, Ce, Co, Cu, Mn, Nb, Ni, Pb e Zn são principalmente de fontes antrópicas. O conteúdo da maioria dos EPTs no solo superficial não representa um potencial risco à saúde humana, exceto Cr. O conteúdo de quase todos elementos na água subterrânea foi abaixo dos limites de recomendação de água potável, exceto os conteúdos de Mn e Fe. Para a área em estudo, recomenda-se algumas ações para mitigar o risco ambiental e à saúde humana. À saber: (i) remover o resíduo oleoso que está presente nos tanques de pedra presentes na área; (ii) fechar e impedir o uso do poço caçimba presente perto da sede administrativa do pátio; (iii) remover óleos, combustíveis, fluidos e graxas dos veículos em final de vida ou veículos que permanceçam por períodos superiores ao estipulado por lei (60 dias); (iv) idealmente, reverter o valor das taxas das diárias dos veículos depositados na área para realizar as benfeitorias na área estudo; (v) realizar monitoramento no solo superficial da área para que não ocorra o aumento do número de hotspots que, futuramente, podem caracterizar a área como contaminada. / Impounded vehicle scprayard (IVS) overcrowding is currently a subject of concern in Brazilian scenario. The aim of this study was to assess the total levels of potentially toxic elements (PTEs) (As, Ba, Co, Cr, Cu, Mo, Pb, V and Zn) and trace elements (TE) (Cs, Ga, Hf, Rb, Sc, Sr, Ta, Th, U, Y and Zr), rare earth elements (REE) (Ce, Eu, La, Lu, Nd, Sm, Tb and Yb) and alloy elements (AL) (Al, Fe, Mn, Nb, Ni and Ti) in soil and groundwater in an IVS located in the city of Ribeirão Pires. In order to achieve this objective, topsoil, three soil cores and groundwater of three monitoring wells were analyzed. It was verified that the area is mainly affected by three factors: (1) a landfill layer with construction waste; (2) an oily residue from past industrial activities in the area; (3) vehicles parked on topsoil. For the evaluation of the results, statistical techniques, such as multivariate analysis, pollution, ecological and human health risk indexes were used. Mass fractions of all PTEs, except Co, Cu, Mo and Zn, were higher than reference values. Hot spots were observed for most elements suggesting vehicular source. The Geoaccumulation Index showed minimal to moderate pollution in soil for most elements, except for As and Ba, which showed higher accumulation than other elements. The enrichment factor pointed to a significant enrichment of As and Pb. Arsenic content in soil may pose a moderate to high potential ecological risk. The results of PTEs and as statistical approaches indicated that As, Ce, Co, Cu, Mn, Nb, Ni, Pb and Zn are mainly from anthropogenic sources. The content of most PTEs in topsoil does not pose a potential human health risk, except Cr content. Groundwater levels for most PTEs were below the drinking water recommendation limits, except Mn and Fe content. Namely: (i) remove the oily residue that is inside the stone tanks; (ii) to close and to prevent the use of the hang pit present near the administrative headquarters of the yard; (iii) remove oils, fuels, fluids and greases from end of life vehicles or vehicles that stay for periods longer than described by law (60 days); (iv) ideally, to reverse the value of the daily fees of vehicles deposited in the area to carry out improvements in the study area facilities; (v) monitoring the area surface soil to avoid an increase of hotspots that may, in the future, characterize the area as contaminated.

Esse estudo avaliou o efeito da glicose sobre a atividade da PKA e sua interação com o SGLT1 e os trocadores Na+/H+ (NHE1 e NHE3). As células HEK-293 foram transfectadas com hSGLT1 wild type (WT) ou mutante (S418H) e tratadas 20 dias com DMEM contendo glicose 5 mM ou 25 mM. Foi avaliada a expressão de hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 e PKA. Foi avaliada a expressão de hSGLT1+GFP e SGLT2 na membrana, com ou sem H-89, Manose, Sucrose e Filipina. Foi avaliada a velocidade de recuperação do pH intracelular (dpHi/dt), onde a solução de NH4Cl foi substituída por uma solução de glicose 5 ou 25 mM ou ambas as soluções na vigência de H-89 ou S3226. Esses dados indicam que o aumento do AMPc pela glicose altera a expressão e atividade dos SGLTs e NHEs. Nossos experimentos utilizando a transfecção do SGLT1 demonstraram que as células regulam a distribuição de SGLT1 e 2 na membrana, frente ao aumento extracelular desse substrato e que as vias ativadas pela glicose afetam a capacidade de recuperação do pH intracelular (pHi), através do NHE3. / This study evaluated the effect of glucose on the PKA activity and its interaction with SGLT1 and the Na+/H+ exchanger (NHE1 and NHE3). The HEK-293 cells were transfected with hSGLT1 wild type (WT) or mutant (S418H) and treated 20 days with DMEM containing glucose 5 mM or 25 mM. The hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 and PKA expression was analyzed. The surface hSGLT1+GFP and SGLT2 expression with or without H-89, Manose, Sucrose and Filipina was evaluated. The pHi recovery rate (dpHi/dt) was analyzed replacing the NH4Cl solution to glucose 5 or 25 mM solution or both with H-89 or S3226. These data indicate that the glucose increases the cAMP concentration and alters the expression and activity of SGLTs and NHEs. Our experiments using SGLT1 transfection demonstrated that, in the treatment with high glucose concentration, HEK-293 cells regulate the SGLT1 and 2 cellular distribution and that the pathways activated by glucose impair the pHi recovery rate, through the NHE3.

Introdução: O trauma é um fenômeno que cursa com lesão tecidual, sendo que o trauma cirúrgico (TC) apresenta a referida lesão como consequência de um ato cirúrgico. A isquemia seguida de reperfusão (IR) é um evento comum em várias condições patológicas, bem como em diversos procedimentos cirúrgicos, principalmente transplantes. É frequente o desenvolvimento de lesões teciduais locais e remotas após trauma e após a I/R, parte de um fenômeno conhecido como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS), frequentemente seguida pela falência de múltiplos órgãos (FMO). Estudos provaram o envolvimento do neutrófilo em tais síndromes como resultado da ação de enzimas proteolíticas secretadas a partir de grânulos citoplasmáticos, radicais livres produzidos por explosão respiratória e citocinas liberadas após a infiltração nos tecidos. Nesse contexto, foi provado que o pré-condicionamento isquêmico (PCI), definido como curtos episódios de isquemia precedendo a IR, protege contra essas lesões, com menor ativação de neutrófilos. No entanto, o conhecimento a respeito dos mecanismos operantes nos neutrófilos após o trauma cirúrgico, a isquemia seguida de reperfusão ou o pré-condicionamento isquêmico, ainda são preliminares. Objetivo: Analisar com maior profundidade o impacto dessas condições (TC, IR e PCI) no proteoma e fosfoproteoma do neutrófilo. Métodos: Foi realizada a análise de parâmetros hematológicos juntamente com a análise proteômica e fosfoproteômica de neutrófilos de ratos submetidos a TC, IR e PCI, comparados ao grupo controle. A análise proteômica foi realizada em sistema de nLC-MS/MS orbitrap de alto desempenho, usando marcação com iTRAQ, enriquecimento de fosfopeptídios e pré-fracionamento por HILIC. A análise estatística baseada em clusters utilizando scripts em R mostrou proteínas com abundância relativa diferencial em todas as condições. Resultados: A avaliação dos parâmetros hematológicos antes e depois de TC, IR e IPC demonstrou alterações no número, forma e tamanho de linfócitos, hemácias, plaquetas e, principalmente, neutrófilos (granulócitos). Observou-se um claro aumento na contagem de neutrófilos após TC e IR, sendo que tal aumento foi prevenido pelo PCI. Um total de 393 proteínas foram determinadas como reguladas para abundância relativa entre o grupo controle e o grupo TC. A maioria das proteínas encontradas como reguladas em comum nos grupos TC e IR estão relacionadas à apoptose (caspase-3), motilidade celular (PAK2), transdução de sinal (IL-5, IL-6 e TNF) e degradação pelo sistema proteassoma no neutrófilo. Maior produção de espécies reativas de oxigênio e disfunção da migração direcional de neutrófilos (PKC-delta) com aumento do tempo de vida dos neutrófilos são eventos iniciais importantes que podem resultar em mais dano tecidual e em infecção. A análise proteômica de neutrófilos de ratos após PCI levou à identificação de 2437 grupos de proteínas atribuídos a 5 clusters diferentes, contendo proteínas de abundância relativa significativamente aumentada ou diminuída em IR e PCI. O estudo de vias desses clusters baseado no KEGG revelou aumento nas vias de fagocitose mediada por Fc-gama R, sinalização por quimiocinas, adesão focal e migração transendotelial, citoesqueleto de actina, metabolismo e diminuição nas vias ribossomais, de transporte de RNA, de processamento de proteínas. A regulação da fosforilação de proteínas após IR e PCI mostrou algumas vias como quimiocinas, Fc-gama, GPCR, migração celular e vias pró e antiapoptóticas, sendo que a via de splicing alternativo foi a que apresentou regulação mais evidente (p < 0.0001). A regulação da abundância, bem como da fosforilação, presença de motivos e de domínios levou à identificação de fosfatases, como Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 e ptprc reguladas por IR, bem como stk38, pkn1, syk e inpp5d reguladas por PCI. A interação mais marcante entre proteínas foi demonstrada como sendo entre os receptores de Fgr e Ptp. Conclusão: Concluímos que as alterações causadas por TC, IR e PCI levaram a intenss alterações na abundância de algumas proteínas e em eventos de fosforilação em neutrófilos, levando ao efeito destrutivo observado após a IR e ao efeito protetor consequente ao PCI / Introduction: Trauma is a phenomenon that involves tissue injury, whereas the surgical trauma (ST) has such injury as a consequence of a surgery. Ischemia reperfusion is common event in many surgical procedures, especially in transplants, as well as in many pathological conditions. Local and remote tissue injuries usually develop after trauma and ischemic reperfusion, part of a phenomenon known as systemic inflammatory response syndrome, frequently followed by multiple organ failure (MOF). Studies have proven the involvement of the neutrophil in all these injuries as a result of proteolytic enzymes secreted from cytoplasmic granules, free radicals produced by respiratory burst, cytokines released after tissue infiltration. In that context, ischemic preconditioning (IPC), that are short episodes of ischemia before ischemia reperfusion, was proved to be protective against these injuries with less activation of neutrophils. However the knowledge about the underlying mechanism operating in the neutrophil after surgical trauma, ischemia reperfusion and preconditioning is preliminary. Objective: To deeply analyze the impact of these conditions (ST, IR and IPC) on the neutrophil proteome and phosphoproteome. Methodology: We did hematological analysis along proteomics and phospho proteomics through high throughput nLC-MS/MS analysis by orbitrap using iTRAQ labeling, phospho peptide enrichments, and HILIC pre-fractionation. Neutrophils from control, ST, IR and IPC conditions after extraction were processed for proteomic analysis. Statistical package using R based on cluster analysis led to the detection of differentially regulated proteins in all conditions. Results: The evaluation of the hematological parameters before and after ST, IR or IPC on blood cells stated alteration in size, number and shape of lymphocytes, RBCs, platelets and specially neutrophils (granulocytes). In the analysis, a clear increase in neutrophil count after ST and IR with such increase prevented by IPC. A total of 393 proteins were found differentially regulated between control and trauma groups. Most of the common proteins found regulated in trauma and IR seem to be related to apoptosis (caspase-3), cell motility (PAK2) and signal transduction in IL5, IL6 and TNF and proteasomal degradation in neutrophil. Higher oxygen species production and dysfunction of directional neutrophil migration (PKC delta) with increase in the life span of neutrophils are early important events that can finally result into more tissue damage and infection. The total proteomic analysis of rat neutrophils after IPC led to the identification of 2437 protein groups assigned to five different clusters with significantly up and downregulated proteins in IR and IPC. Cluster based KEGG pathways analysis revealed up-regulation of chemokine signaling, focal adhesion, leukocyte transendothelial migration, actin cytoskeleton, metabolism and Fc gamma R mediated phagocytosis, whereas downregulation in ribosome, spliceosome, RNA transport, protein processing in endoplasmic reticulum and proteasome, after intestinal ischemic preconditioning. The phosphoregulated proteins containing domains and motifs in the regulated peptides after IR and IPC led to the identification of some of important players such as chemokine, Fc gamma, GPCR, migration and pro/anti-apoptotic pathways. The phosphoproteins from alternative splicing was the pathway presenting the most remarkable regulation with a p-value of 0.0001. The regulation in expression as well as in phosphorylation, the presence of motifs and domains led to the identification of kinases and phosphatases including Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 and ptprc in neutrophils after IR whereas stk38, pkn1, syk, and inpp5d in neutrophil due to IPC. The highest protein-protein interaction was shown by Fgr and Ptp receptors. Conclusion: We concluded that the changed stimulus produced after ST, IR and IPC led to the huge alteration in proteins expression and phosphorylation events in the neutrophil proteome as mentioned in our work, that leads to final destructive and protective phenotype of neutrophils respectively

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

O escorpião Tityus serrulatus é considerado uma das espécies mais perigosas para os seres humanos no Brasil, e sua peçonha induz resposta inflamatória local e sistêmica. Neste projeto, tivemos como objetivo estudar a produção de mediadores inflamatórios, as vias de ativação celular e os receptores da imunidade inata responsáveis pelo reconhecimento da peçonha do escorpião T. serrulatus (TsV), bem como de suas toxinas. Nós demonstramos que TsV, e suas toxinas Ts1 e Ts6 induzem a produção de NO, IL-6 e TNF-? por células J774.1, as quais podem ser potencializadas pela presença de LPS. No entanto, Ts2 apresenta atividade anti-inflamatória por induzir produção de IL-10 e inibe a liberação de NO, IL-6 e TNF-?, induzida pelo LPS. Mostramos ainda que Ts2 ou Ts6 isoladas do TsV, além das citocinas, induzem a produção dos mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2), e estes contribuem para o recrutamento de leucócitos para a cavidade peritoneal. Em conjunto, os nossos dados demonstraram que Ts2 e Ts6 induzem inflamação por mecanismos dependentes da produção de citocinas e mediadores lipídicos, e que Ts2 pode desempenhar papel regulador da resposta. No entanto, os mecanismos responsáveis pelo reconhecimento da peçonha e indução da liberação de mediadores inflamatórios por células de mamíferos, são desconhecidos. Assim, dando continuidade aos nossos estudos, demonstramos que os receptores TLR2, TLR4 e CD14 reconhecem TsV, e medeiam a produção de citocinas e mediadores lipídicos. Além disso, nós demonstramos que TsV ativa NF-?B dependente de MyD88, e o fator c-Jun, independente de MyD88. Semelhante ao TsV, a sua toxina majoritária, Ts1, induz a fosforilação de NF-?B dependente de MyD88, via reconhecimento por TLR2 e TLR4, enquanto a ativação c-Jun é via TLR4, mas independente de MyD88. Dentro deste contexto, nós propusemos o termo Padrões Moleculares Associados à Venenos (VAMP) para se referir às moléculas que são introduzidas no hospedeiro por picadas e são reconhecidas por receptores de reconhecimento padrão (PRRs), resultando em inflamação. Demonstramos ainda, a formação de corpúsculos lipídios (CLs) e a geração de eicosanóides, após o reconhecimento do TsV por TLR2 e TLR4. Nossos dados mostraram que a formação de eicosanóides se correlaciona com a formação dos CLs, que por sua vez são dependentes de TLR2 e TLR4, e da ativação de PPAR?, sugerindo que este receptor nuclear pode modular a produção de citocinas pró-inflamatórias. Assim, concluímos que PPAR? pode ser um candidato-alvo atrativo para novas estratégias terapêuticas para prevenção dos efeitos deletérios resultantes da intensa liberação sistêmica de mediadores inflamatórios após envenenamento. / Tityus serrulatus is the scorpion considered one of the most dangerous species to humans in Brazil, which venom induces local and systemic inflammatory response. In this project, we aimed to study In this project, we aimed to study the inflammatory mediators production, cell activation and receptors of innate immunity responsible for recognition of the venom of the scorpion T. serrulatus (TsV) as well as their toxins. We have demonstrated that TsV and their toxins Ts1 and Ts6 induce NO, IL-6 and TNF-? production in J774.1 cells, which may be potentiated by presence of LPS. However, Ts2 exhibits anti-inflammatory activity due induction of IL-10 production and inhibits the release of NO, IL- 6 and TNF-? induced by LPS. We also show that Ts2 or Ts6 isolated of TsV, besides of the cytokines, induce the production of lipid mediators (LTB4 and PGE2), and these mediators contribute to leukocytes recruitment into the peritoneal cavity. Taken together, our data demonstrated that Ts2 and Ts6 induce inflammation by mechanisms dependent on the production of cytokines and lipid mediators, and that Ts2 may play regulatory role on the cell response. Furthermore, continuing our studies, we demonstrated that TLR2, TLR4 and CD14 receptors recognize TsV, mediating cytokines and lipid mediators production. We also showed TsV MyD88- dependent activation of NF-?B, and a MyD88-independent activation of the factor c-Jun. Similar to TsV, the majority toxin Ts1 induces MyD88-dependent phosphorylation of NF-kB via TLR2 and TLR4 recognition, while the c-Jun activation is through TLR4 recognition, but independent of MyD88. Within this context, we propose the term Venom-Associated Molecular Pattern (VAMP), to refer molecules that are introduced into the host by st ings and recognized by PRRs, resulting in inflammation. Finally, we investigated the formation of lipid bodies (LBs) and generation of eicosanoids, through TsV recognition by TLR2 and TLR4. Our data showed that eicosanoid production correlates with the LBs formation, which are dependent on TLR2, TLR4 and PPAR? activation, suggesting that this nuclear receptor can modulate cytokines inflammatory. Thus, we suggest that PPAR? may be an attractive candidate target for novel therapeutic strategies to prevent the deleterious effects of intense systemic release of inflammatory mediators after envenomation.

O Estudo de Dieta Total (EDT) tem sido recomendado pela Organização Mundial da Saúde como o método mais adequado para estimar as ingestões dietéticas de contaminantes e nutrientes para um país ou grandes grupos populacionais. O presente estudo é o segundo realizado no Brasil, atualizado com dados da Pesquisa de Orçamento Familiar-POF 2008-2009 do IBGE, para avaliação de ingestão dietética dos elementos essenciais e tóxicos referente à região Sudeste do Brasil. Os alimentos que compõe a lista de alimentos foram coletados em mercados, preparados como prontos para consumo, liofilizados e homogeneizados para a análise pelos Métodos de Análise por Ativação com Nêutrons Instrumental (INAA) e Absorção Atômica com Forno de Grafite (GF-AAS). Foram determinados os elementos As, Br, Ca, Cd, Cl, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Rb, Sc, Se e Zn. Os valores de ingestão dietética diária dos elementos foram calculados e mostraram-se satisfatórios para os elementos Cl, Cu, Fe, Mg, Mn, Se e Zn. Para Ca, Cr e K as ingestões dietéticas calculadas encontraram-se abaixo das recomendações nutricionais. Já para os elementos cujos valores de ingestão diária média superaram as recomendações nutricionais (Cu, Fe, Mg e Mn), as ingestões foram comparadas com os valores de Limite tolerável de ingestão (UL). Concluiu-se que nenhum elemento se encontrava em quantidade acima desses limites, exceto o Na que apresentou valor ligeiramente mais alto que o UL. Em relação aos elementos tóxicos, os valores de concentração estiveram muito abaixo dos valores limites estabelecidos pela legislação brasileira, exceto para o As no grupo de peixes. Porém a ingestão de peixe é baixa, o que contribuiu para que a ingestão dietética de As nesse estudo estivesse bem abaixo do limite máximo tolerável preconizado pela JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives), assim como o valor de ingestão dietética mensal de Cd, que esteve bem abaixo limite tolerável mensal (PTMI). / The World Health Organization (WHO) has been encouraging Total Diet Study (TDS) since WHO considered this study to be the most adequate method to estimate the dietary intakes of contaminants and nutrients of countries or populations on a large-scale. This study is the second carried out in Brazil, and is up to date with data from IBGE National Household Food Budget Survey POF 2008-2009, to evaluate essential and toxic element dietary intakes, concerning the Southeast Region of Brazil. The food represented in food list were collected in supermarkets, preparing read-to-consumed food, freeze-dried and homogenized for analyses, by Instrumental Neutron Activation Analysis (INAA) and Atomic Absorption Spectroscopy (GFAAS). The elements As, Br, Ca, Cd, Cl, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Rb, Sc, Se e Zn were determined. The daily intake values were calculated and the values were satisfactory for the elements Cl, Cu, Fe, Mg, Mn, Se and Zn. For Ca, Cr and K the dietary daily intake values were below the nutritional recommendation. For Cu, Fe, Na, Mg and Mn elements which average daily intakes exceeded the nutritional recommendation, it was observed that no values were above than tolerable upper limits (UL), except for Na which values was slightly higher value than the UL. In relation of toxic elements, the concentration values were below than Brazilian legislation values, except for As in fish group. However the dietary intake of As is below than tolerable upper limit (UL) recommended by JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) since the fish intake is low in the São Paulo diet. For Cd the month dietary intake was below than PTMI (provisional tolerable monthly intake) recommendation.