La déficience du système de réparation des mésappariements de bases aboutit à une instabilité des séquences répétées ou microsatellites (MSI) qui engendre des mutations au niveau de gènes cibles de l'oncogenèse MSI. L'objectif de ma Thèse consistait à définir les conséquences fonctionnelles des mutations d'un nouveau gène cible de la tumorigenèse colorectale MSI : le gène SMAP1 (Small ArfGAP1) qui code une protéine de la famille ArfGAP (ADP ribosylation factor GTPase Activating Protein) spécifique d'Arf6, protéine impliquée dans de nombreux mécanismes cellulaires. Les mutations de SMAP1 sont spécifiques des tumeurs MSI de différentes origines tissulaires et n'apparaissent qu'au niveau de la répétition (A10). Dans les tumeurs colorectales primaires, la fréquence de mutations de SMAP1 observées diminue au cours de la progression tumorale suggérant que les tumeurs dépourvues de mutations de SMAP1 sont plus invasives. D'un point de vue fonctionnel, les mutations de SMAP1 ont pour conséquences un défaut dans le recyclage rapide du récepteur à la transferrine, une augmentation de la prolifération cellulaire et une diminution du pouvoir invasif en maintenant les jonctions adhérentes. Ainsi, nos observations montrant que les mutations de SMAP1 augmentent le pouvoir prolifératif mais diminuent le pouvoir invasif des lignées cellulaires issues de CCR MSI pourraient expliquer certaines caractéristiques cliniques des CCR MSI, les tumeurs MSI étant en effet des tumeurs volumineuses, ayant un faible pouvoir métastatique.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel. / Cardiovascular disease (CVD) is the primary cause of death and morbidity worldwide, claiming about 900 000 lives yearly in North America alone. A high level of circulating LDL-cholesterol is a major risk factor positively correlated with premature development of complex CVD mainly due to a rapid buildup of lipid deposition in the arteries. In collaboration with Dre Boileau, we recently discovered that the convertase PCSK9 is the third locus of familial hypercholesterolemia. A study published in the New Eng J Med revealed that the absence of PCSK9 reduces the risk of CVD by ~88%, resulting from a strong reduction of cholesterol in the bloodstream (LDL-C). It has been shown that PCSK9 directly binds the low-density lipoprotein receptor (LDLR) and by an unknown mechanism, reroutes it towards degradation in late endosomes/lysosomes, resulting in the accumulation of LDL-C particles in plasma. In this thesis, we addressed three different aspects of PCSK9 biology: [1] What are the targets of PCSK9? [2] Which cellular trafficking components are involved in PCSK9-induced LDLR degradation? [3] How can we inhibit the function of PCSK9? [1] We first demonstrated that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and two of its closest family members. These include the very-low-density-lipoprotein receptor (VLDLR) and apolipoprotein E receptor 2 (ApoER2) implicated in neuronal development and lipid metabolism. In addition, we demonstrated that these receptors enhance the cellular association of PCSK9 independently of the presence of the LDLR. This study represents the first evidence that PCSK9 could target other proteins for degradation, reinforcing its role as a key regulator of some members of the LDLR family. [2] Since PCSK9 is a secreted protein, we decided to investigate the contributions of both the intra- and extracellular trafficking pathways in LDLR degradation. Using conditioned media derived from mice primary hepatocytes, we showed that endogenously secreted PCSK9 was not able to influence LDLR levels of PCSK9-deficient primary hepatocytes (Pcsk9-/-). By flow cytometry (FACS), we observed that overexpression of the gain-of-function PCSK9-D374Y, but not wild type PCSK9, decreases cell surface LDLR on adjacent cells suggesting that its spectrum of action is local. We also noticed that blockade of endocytosis in HepG2 cells (commonly used to study endogenous LDLR degradation by PCSK9) does not affect total LDLR protein levels. In contrast, disruption of the intracellular trafficking between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes (siRNAs against clathrin light chains; CLCs) prevented LDLR degradation in a PCSK9-specific manner. [3] By Far Western blotting, we identified that Annexin A2 (AnxA2) specifically interacts with the C-terminal domain of PCSK9, which is crucial for its function in LDLR degradation. Moreover, we determined that the R1 domain (amino acids 34 to 108) is responsible for the PCSK9AnxA2 interaction, which confers a new function for this protein. Finally, we showed that addition of AnxA2 prevents PCSK9-induced LDLR degradation. In summary, this work allowed us to identify that PCSK9 induces the degradation of the LDLR and its closest family members, ApoER2 and VLDLR. We also highlighted that the integrity of the intracellular trafficking pathway is crucial for endogenous PCSK9-induced LDLR degradation. Furthermore, we discovered that AnxA2 is a unique, natural inhibitor capable of interfering with the action of PCSK9 in LDLR degradation. It is undeniable that PCSK9 is a genetically validated target to reduce circulating LDL-cholesterol and prevent CVD. This thesis brings forth important contributions in our understanding of the cellular pathways involved and opens the door for novel therapeutic approaches.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est un processus fondamental des cellules eucaryotes. Elle se caractérise par la formation d’invaginations à la membrane plasmique aboutissant à la création de petites vésicules par l’action de la dynamine. Dans le cerveau, elle est impliquée dans la dépression synaptique à long terme, un corrélat cellulaire de la mémoire. La morphologie complexe des neurones et le contrôle précis du code neuronal suggèrent qu’elle puisse être régulée spatialement et temporellement dans ces cellules. Le but de mon travail a été de développer de nouveaux outils pour visualiser et perturber l’EDC afin d’étudier ce type de régulation. Le premier de ces outils est pHuji, un senseur de pH rouge génétiquement encodable. Je l’ai utilisé avec un senseur de pH vert existant pour montrer que dans les cellules NIH- 3T3, le récepteur β2-adrénergique est internalisé dans une sous-population de vésicules contenant le récepteur à la transferrine constitutivement endocyté. Le deuxième est une nouvelle méthode d’imagerie permettant de visualiser l’activité d’endocytose de structures recouvertes de clathrine optiquement stables dans des neurones d’hippocampe. J’ai ainsi pu suivre pour la première fois la cinétique d’internalisation de récepteurs au glutamate de type AMPA dans des conditions de plasticité. Enfin, j'ai élaboré un test combinant imagerie et patch-clamp afin de développer un bloqueur peptidique spécifique de l'EDC. En utilisant des peptides dimériques, j’ai montré que la dynamine se lie à ses partenaires via des interactions multimériques. En conclusion, ce travail propose une boite à outils permettant d’élucider les mécanismes de l’EDC avec une grande résolution spatiale et temporelle. / Clathrin mediated endocytosis (CME) is a fundamental process of all eukaryotic cells. At the level of the plasma membrane, it is characterized by the formation of deep invaginations resulting in the creation of small vesicles after membrane scission by dynamin. In the central nervous system, it is involved in the expression of synaptic long term depression, a proposed cellular correlate of learning and memory. The complex morphology of neurons and the precise timing of neuronal firing suggest that endocytosis may be spatially and temporally regulated in those cells. The aim of the work presented here was to develop new tools to visualize and perturb CME in order to study such regulation. The first tool to be characterized was pHuji, a genetically encoded red pH-sensor. I used it in combination with an existing green pHsensor to demonstrate that in NIH-3T3 cells, the β2-adrenergic receptor was internalized in a subset of vesicles containing the constitutively endocytosed transferrin receptor. The second tool is a new imaging method that allowed me to monitor the endocytic activity of optically stable clathrin coated structures in hippocampal neurons. I was thus able to visualize for the first time the kinetics of internalization of AMPA-type glutamate receptors under plasticity inducing conditions. Finally, I set up an assay combining imaging and cell dialysis in order to develop a specific peptide-based inhibitor of CME. Using dimeric peptides, I found that the interplay between dynamin and its binding partners relies on multimeric interactions. Altogether, this work provides a toolbox to decipher the mechanisms of vesicle formation with high spatial and temporal resolution.

Le virus de l'hépatite C (HCV) infecte environ 180 millions de personnes à travers le monde. De nouveaux antiviraux ont récemment été mis sur le marché mais ils présentent des effets indésirables. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques reste donc d'actualité. Mes principaux travaux ont consisté à développer des approches de biochimie et d'imagerie sur cellules vivantes pour étudier les mécanismes moléculaires d'action des antiviraux silibinine (SbN) et arbidol (ARB) sur HCV. Nous avons montré que SbN et ARB inhibent des vésicules entourées de clathrine et ne sont pas délivrés aux endosomes précoces. SbN et ARB inhibent également l'infection d'autres virus entrant par endocytose clathrine-dépendante, ce qui expliquerait leur activité à large spectre. J'ai également contribué à un projet initié depuis quelques mois au sein de l'équipe. L'hypothèse était qu'un élément présent dans le microenvironnement hépatique (MEH) jouerait un rôle essentiel dans l'infection par HCV. Nous nous sommes intéressés au syndécan-1 (SDC1) car il est fortement exprimé à la surface des hépatocytes. Nos travaux montrent que la déplétion de SDC1 diminue fortement l'infection. SDC1 colocalise à la surface des hépatocytes non infectés avec CD81, un récepteur connu de HCV. Dans les jours suivant l'infection, cette colocalisation est perturbée. Ces données suggèrent que SDC1 serait un co-facteur d'entrée de HCV, agissant en combinaison avec CD81, et que l'infection réorganiserait les molécules du MEH, ce qui pourrait à long terme contribuer à la persistance de l'infection / Hepatitis C virus (HCV) is a global health concern infecting 170 million people worldwide. New antivirals recently received the approval for the treatment against HCV infection but they display many side effects. Research for new therapeutic targets therefore remains an important topic. My main work was to develop approaches in biochemistry and live cell imaging to study the molecular mechanisms of action of antivirals silibinin (SbN) and arbidol (ARB) on HCV infection. We show that SbN and ARB alter clathrin-mediated endocytosis. Viral particles are trapped in clathrin-positive structures and cannot be delivered to the early endosomal compartment, thereby preventing infection. SbN and ARB also prevent cell infection by viruses that enter through clathrin-mediated endocytosis, which could explain their broad spectrum activity. I also contribute to a project initiated for a few months in the lab. We hypothsized that a molecule present in the immediate surrouding of the hepatocyte microenvironment could play a role in HCV infection. We focused on the syndecan-1 (SDC1) because it is essentially anchored on the surface of hepatocytes. We show that SDC1 depletion leads to a drastic decrease of the viral infectivity. SDC1 colocalizes on the unfected hepatocyte surface with the already identified HCV recptor CD81. This colocalization vanished within days in infected cells. These data suggest that SDC1 could act as a cellular co-factor for HCV entry, in combination with CD81; thus infection could reorganized molecules of the hepatocyte microenvironment and contribute to HCV hepatotropism and the peristence of infection

Les voies d’endocytose qui régissent l’internalisation d’éléments extracellulaires peuvent être classées selon que la protéine de manteau, la clathrine, est impliquée ou non dans le processus. Les voies indépendantes de la clathrine sont utilisées par de nombreuses toxines, des virus et des protéines endogènes. Les mécanismes permettant d’induire le recrutement des protéines cargoes et la déformation de la membrane plasmique dans le contexte de l'endocytose clathrine-indépendant restent encore mal compris. Cette étude montre que la galectine 3, une protéine humaine qui se lie aux glucides, induit la formation d’invaginations de la membrane plasmique de manière indépendante de la clathrine. Les glycosphingolipides (molécules jouant un rôle majeur dans la physiologie de la cellule) sont essentielles pour permettre à la galectine 3 d’induire ces invaginations et d’être internalisée dans la cellule. Les structures tubulaires induites par la galectine 3 présentent une morphologie étonnamment similaire à celle de compartiments intermédiaires de transport décrits dans la littérature pour l’endocytose indépendante de la clathrine. Des cargos utilisant la voie indépendante de la clathrine, tels que CD44 et les intégrines α5 et β1, sont retrouvés dans les tubules induits par la galectine 3. De plus, cette dernière est nécessaire à l’internalisation de CD44. Cela indique donc que la galectine 3 pourrait relier des protéines cargos glycosylés à des glycosphyngolipides de la membrane plasmique et ainsi induire une déformation de la membrane et leur internalisation dans les cellules. Ce mécanisme diffère de celui utilisé par la toxine pentamérique de Shiga et par la toxine cholérique, qui sont leur protéines cargos propores et interagissant directement avec le glycosphyngolipide leur servant de récepteur. Les tubules induits par la galectine 3 sont distincts de ceux induit par les autres lectines. Celles-ci présentent des spécificités différentes de liaison aux glucides, montrant ainsi la l'importance des interactions entre les lectines et les sucres dans ce processus. De plus, nous avons constaté que la galectine 3 module l’équilibre à l’état basal de l’intégrine β1 à la surface de la cellule. Cette protéine étant capitale pour les phénomènes d’adhésion et de migration cellulaires, nous avons donc exploré le rôle conjoint de la galectine 3 et des glycosphingolipides dans la migration cellulaire. La galectine 3 inhibe la migration des cellules humaines de carcinomes mammaires alors qu’elle stimule au contraire celle de cellules de tumeurs mammaires murines. Or, nous avons montré que la régulation par la galactine 3 de la migration de différentes lignées cellulaires est dépendante des glycosphingolipides. Il ressort donc de cette étude que la galectine 3 et les glycosphingolipides contribuent de manière synergique au processus d’induction de déformation de la membrane, à l’endocytose de protéines cargos et à la migration cellulaire. / Endocytic processes which govern the uptake of extracellular material into the cell can be classified based on their dependence on the coat protein, clathrin. Clathrin-independent mechanisms are used by many toxins, viruses and endogenous proteins. How cargo is recruited and membranes are bent is not well understood in these cases. Here, we discovered that galectin 3, a human carbohydrate binding protein induced the clathrin-independent formation of endocytic plasma membrane invaginations. Glycosphingolipids, which have established functions in key physiological processes, were found to be essential for the formation of galectin 3-induced invaginations and for the efficient uptake of the protein into the cell. Galectin 3-induced tubular structures were found to have a strikingly similar morphology to that of the clathrin-independent carriers described in literature. Clathrin-independent endocytic cargoes such as CD44, α5 and β1 integrin were present in galectin 3-induced tubules, and galectin activity and glycosphingolipids were required for the uptake of CD44. This indicated that galectin 3 could link glycosylated cargoes with glycosphingolipids for cargo recruitment and membrane bending. In contrast, the pentameric Shiga and cholera toxins are their own cargoes and drive membrane deformations by directly binding to their respective glycosphingolipid receptors. Galectin 3-induced tubules were distinct from those induced by lectins with different carbohydrate binding specificities, which revealed the importance of lectin-glycan interaction in this process. Further, we observed that galectin 3 modulated the steady state surface dynamics of β1 integrin, a protein which like CD44 is critical for cell adhesion and migration. Subsequently, we explored the interplay of galectins and glycosphingolipids in cell migration. Galectin 3 inhibited cell migration in human breast carcinoma cells, and stimulated migration in a mouse mammary tumor cell line. However, the regulation of migration by galectin 3 was in both cases found to be dependent on glycosphingolipids. In conclusion, galectin 3 and glycosphingolipids synergistically contribute to the clathrin-independent curvature generation process, cargo endocytosis and cell migration.

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La morphologie des cellules et leurs interactions avec l’environnement découlent de divers procédés mécaniques qui contribuent à la richesse et à la diversité de la vie qui nous entoure. À titre d’exemple, les cellules mammifères se conforment à différentes géométries en fonction de l’architecture de leur cytosquelette tandis que les bactéries et les levures adoptent une forme circulaire par turgescence. Je présente, dans cette thèse, la découverte d’un mécanisme de morphogénèse supplémentaire, soit la déformation de surface cellulaire via l’assemblage de protéines par démixtion de phases aqueuses non miscibles et l’adhésion entre les matériaux biologiques. J’expose de façon spécifique comment ce mécanisme régule le recrutement et le mouvement dynamique des protéines qui induisent l’invagination de la membrane plasmique lors de l’endocytose clathrine-dépendante (CME). Le phénomène de démixtion des protéines dans le cytoplasme est analogue à la séparation de phase de l’huile en solution aqueuse. Il constitue un mécanisme cellulaire important et conservé, où les protéines s’agglomèrent grâce aux interactions intermoléculaires qui supplantent la tendance du système à former un mélange homogène. Plusieurs exemples de compartiments cellulaires dépourvus de membrane se forment par démixtion de phase, tels que le nucléole et les granules de traitement de l’ARN [1-6]. Ces organes ou compartiments dénommés NMO, du terme anglais « non-membranous organelles », occupent des fonctions de stockage, de traitement et de modification chimique des molécules dans la cellule. J’explore ici les questions suivantes : est-ce que les NMO occupent d’autres fonctions à caractère morphologique ? Quels signaux cellulaires régulent la démixtion de phase des protéines dans la formation des NMO ? Fondée sur la physique mécanique du contact entre les matériaux, j’émets l’hypothèse que des compartiments cellulaires nanoscopiques, formés par démixtion de phase, génèrent des forces mécaniques par adhésion interfaciale. Le travail mécanique ainsi obtenu déforme le milieu cellulaire et les surfaces membranaires adjacents au NMO nouvellement créé. Le but de mon doctorat est de comprendre comment les cellules orchestrent, dans le temps et l’espace, la formation des NMO associés au CME et comment ceux-ci génèrent des forces mécaniques. Mes travaux se concentrent sur les mécanismes de démixtion de phase et d’adhésion de contact dans le processus d’endocytose chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour enquêter sur le rôle des modifications post-traductionnelles dans ces mécanismes, nous avons premièrement analysé la cinétique de phosphorylation des protéines en conditions de stress. Mes résultats démontrent que le recrutement et la fonction de certaines protéines impliquées dans le CME se régulent via des mécanismes de phosphorylation. Outre les processus de contrôle post-traductionnel, nous avons élucidé le rôle des domaines de faible complexité dans l’assemblage de plusieurs protéines associées avec le CME. De concert avec les modifications de phosphorylation, des domaines d’interaction protéine-protéine de type PrD (du terme « prion-like domains ») modulent directement le recrutement des protéines au sein des NMO associés au CME. La nature intrinsèquement désordonnée de ces PrD favorise un mécanisme d’assemblage des protéines par démixtion de phase tel que postulé. Finalement, mes travaux confirment que la formation de ces NMO spécifiques génère des forces mécaniques qui déforment la membrane plasmique et assurent le processus de CME. D’un point de vue fondamental, mes recherches permettent de mieux comprendre l’évolution d’une stratégie cellulaire pour assembler des compartiments cellulaires sans membrane et pour fixer les dimensions biologiques associées au CME. De manière plus appliquée, cette étude a le potentiel de générer des retombées importantes dans la compréhension et le traitement de maladies neurodégénératives souvent associées à une séparation de phase aberrante et à la formation d’agrégats protéiques liés à la pathologie. / Evolution has resulted in distinct mechanical processes that determine the shapes of living cells and their interactions with each other and with the environment. These molecular mechanisms have contributed to the wide variety of life we observe today. For example, mammalian cells rely on a complex cytoskeleton to adapt specific shapes whereas bacteria, yeast and plants use a combination of turgor pressure and cell walls to have their characteristic bloated form. In this dissertation, I describe my discovery of an unforeseen additional mechanism of morphogenesis: protein aqueous-aqueous phase separation and adhesive contact between biomaterials as a simple and efficient ways for cells to organize internal matter and accomplish work to shape internal structures and surfaces. I specifically describe how a fundamental process of phospholipid membrane and membrane-embedded protein recycling, clathrin-mediated endocytosis (CME), is driven by this mechanism. Analogous to water and oil emulsions, proteins, and biopolymers in general, can phase separate from single to a binary aqueous phase. For proteins that de-mix from the bulk environment, the intermolecular interactions (or cohesive energy) that favors protein condensation only needs to overcome the low mixing entropy of the system and represents a conserved and energy efficient cellular strategy [2, 3, 7, 8]. So far, various examples of phase separated cellular compartments, termed non-membranous organelles (NMOs), have been discovered. These include the nucleoli, germ line P granules and P bodies, to name a few [1-6]. NMOs are involved in many conserved biological processes and can function as storage, bioreactor or signaling bodies. Cells use phase separation as a scheme to organize internal matter, but do NMOs occupy other complex functions, such as morphogenesis? What specific signals trigger protein phase separation? Based on mechanical contact theory, I proposed that hundreds of nanometer- to micron-scale phase separated bodies can deform the cellular environment, both cytoplasm and membranes, through interfacial adhesion. I studied how mechanical contact between a phase-separated protein fluid droplet and CME nucleation sites on membranes drive endocytosis in the model organism budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. Specifically, this dissertation describes first, my investigations of post-translational modifications (phosphorylation) of several CME-mediating proteins and the implications of these modifications in regulating CME. I then describe how my efforts to understand what was distinct about the proteins that are phosphorylated led me to propose their phase separation into droplets capable of driving invagination and vesicle formation from plasma membrane. I used fluorescence microscopy, mass spectrometry and micro rheology techniques to respectively determine the spatiotemporal dynamics, phosphorylation modifications and material properties of coalesced CME-mediating proteins. I further investigated how phase separation of these proteins might generate mechanical force. I demonstrate that changes in the phosphorylation of some endocytic proteins regulates their recruitment to CME nucleation sites. We achieved reliable predictions of functional phosphosites by combining information on the conservation of the post-translational modifications with analysis of the proportion of a protein that is dynamically phosphorylated with time. The same dynamically phosphorylated proteins were enriched for low amino acid compositional complexity “prion-like domains”, which we demonstrated were essential to these proteins undergoing aqueous-aqueous phase separation on CME nucleation sites. I then demonstrate how phase separated droplet can produce mechanical work to invaginate membranes and drive CME to completion. In summary, I have discovered a fundamental molecular mechanism by which phase separated biopolymers and membranes could apply work to shape each other. This mechanism determines the natural selection of spatial scale and material properties of CME. Finally, I discuss broader implications of this dissertation to mechanistic understandings of the origins of neurodegenerative diseases, which likely involve pathological forms of protein phase separation and/or aggregation.

La toxine bactérienne de Shiga se lie au glycosphingolipide (GSL) globotriaosylcéramide (Gb3) afin d’entrer par endocytose dans les cellules en utilisant une voie dépendante et indépendante de la clathrine. Dans la voie indépendante de la clathrine, la toxine de Shiga réorganise les lipides de la membrane de façon à imposer une contrainte mécanique sur la bicouche, conduisant ainsi à la formation de pic d’invagination d'endocytose profonds et étroits. Mécaniquement ce phénomène n’est pas encore compris, notamment il reste énigmatique, comment se traduisent les propriétés géométriques de l’agrégation des glycosphingolipides GSLS et de la toxine. Dans mon travail de thèse, via l’utilisation de la sous-unité B de la toxine de Shiga (STxB) comme un modèle, différentes espèces moléculaires de son récepteur Gb3 ont été synthétisés avec des structures délibérément choisis. Les études réalisées par imagerie de haute résolution et par la modélisation informatique ont permis d’élucider les contraintes mécano-chimique sous-jacente conduisant à une réorganisation efficace qui a pour résultat l’agrégation de la toxine et la réorganisation des lipides. En combinant des expériences de simulation sur ordinateur de dynamique des particules dissipatives (DPD) et des expériences sur des modèles de membranes cellulaires, nous avons fourni la preuve de l’induction d’une force de fluctuation-membrane, de type « force de Casimir », conduisant à l'agrégation des molécules de toxines associées à la membrane à des échelles de longueur mésoscoiques. Nous avons observé et mesuré, en outre la condensation lipidique induite par la toxine, quantitativement sur des monocouches de Langmuir en utilisant la réflectivité des rayons X (XR) et par la mesure de la diffraction des rayons X par incidence rasante (GIXD), fournissant ainsi une preuve directe de l'hypothèse que la toxine a le potentiel de réduire de façon asymétrique la surface moléculaire sur la partie membranaire exoplasmique, ce qui conduit à une déformation locale de la membrane. Durant ma thèse, nos efforts ont été consacrés à la réalisation de nouveaux glycosphinolipides (GSL) comme outils chimiques à visée biologique. Par ailleurs, une nouvelle stratégie de reconstitution de GSL fonctionnels sur la membrane cellulaire, basée sur une réaction de ligation de type « click » entre un glycosyl-cyclooctyne et un azido-sphingosine a été étudiée. Les résultats obtenus sur les cellules se sont avérés beaucoup moins efficace que ceux in vitro. Une poursuite de l'optimisation de cette méthodologie est actuellement en cours. Une sonde fluorescente du glycosphinolipide Gb3, marquée à l’Alexa Fluor 568 lui-même lié par l'intermédiaire d'un bras PEG-α à la position de la chaîne acyle, a été synthétisée. Cette sonde se lie à la STxB sur couche mince de TLC, mais pas sur des membranes modèles. D'autres améliorations sont discutées. / Bacterial Shiga toxins bind to the glycosphingolipid (GSL) globotriaosylceramide (Gb3) to enter cells by clathrin-dependent and independent endocytosis. In the clathrin-independent pathway, Shiga toxin reorganizes membrane lipids in a way such as to impose mechanical strain onto the bilayer, thus leading to the formation of deep and narrow endocytic pits. Mechanistically how this occurs is not yet understood, and notably how the geometric properties of toxin-GSLs complexes translate into function has remained enigmatic. In my thesis work, using the B-subunit of Shiga toxin (STxB) as a model, different molecular species of its receptor Gb3 have been synthesized with deliberately chosen structures, coupled with high resolution imaging and computational modeling, to understand the underlying mechano-chemical constraints leading to efficient toxin clustering and lipids reorganization. By combining dissipative particle dynamics (DPD) computer simulation and experiments on cell and model membranes, we provided evidence that a membrane fluctuation-induced force, termed Casimir-like force, drives the aggregation of tightly membrane-associated toxin molecules at mesoscopic length scales. Furthermore, toxin-induced lipid condensation was observed and measured quantitatively on Langmuir monolayers using X-ray reflectivity (XR) and grazing incidence x-ray diffraction (GIXD), thereby providing direct evidence for the hypothesis that the toxin has the potential to asymmetrically reduce the molecular area of the exoplasmic membrane leaflet, leading to local membrane deformation. During my PhD, effort was also invested to develop new GSL tools applied to the biological setting. A novel strategy based on the Cu-free click reaction between glycosyl-cyclooctyne and azido-sphingosine was designed with the goal to functionally incorporate GSLs into cellular membranes. Following the synthesis work, click reactions have been performed in solution and on cells. Compared to the former, results on cells were far less efficient. Further optimization is currently ongoing. A fluorescently labeled Gb3 probe with Alexa Fluor 568 coupled via a PEG linker to the α-position of the acyl chain, was synthesized, to which STxB bound on TLCs, but not on model membranes. Further improvements are discussed.