Uma série de complexos de rutênio de fórmula geral [RuCl(L)(dppb)(4,4`-Mebipy)](PF6)n onde (dppb = 1,4-bis(difenilfosfina butano), 4,4`-Mebipy = 4,4'-dimetil-2,2'-bipiridina e L = CO, NO, NO2-, NO3-, piridina e 4-picolina, foi preparada e caracterizada por IR, UV-Vis, RMN de 1H, 31P{1H} e 13C{1H}, análise elementar, em alguns casos difração de raios X de policristal e voltametria cíclica. Além disso, a estrutura do complexo [RuCl(CO)(dppb)(4,4`-Mebipy)]PF6 foi elucidada pela difração de raios-X de monocristal. A atividade anticancer in vitro na linhagem HepG2 (carcinoma hepatocelular), interação com albumina humana (HSA) e DNA foram avaliadas. As constantes de ligação da albumina de soro humano e os parâmetros termodinâmicos sugerem interações espontâneas dos complexos com a proteína HSA, através de interações de Van der Waals e ligação de hidrogênio. O estudo de titulação espectroscópica indicou que o DNA-CT interage com os complexos por meio de interações não-covalentes. Além disso, para todos os compostos os índices de seletividade estão próximos de 1, indicando uma boa seletividade dos compostos obtidos. / A series of ruthenium phosphine/diimine complexes were prepared and characterized as [RuCl(L)(dppb)(4,4`-Mebipy)]PF6 (dppb = 1,4-bis(diphenylphosphino)butane, 4,4`-Mebipy = 4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridine and L = CO, NO+, NO2-, NO3- , pyridine and 4- picoline), by IR, UV-Vis, 1H, 31P{1H} and 13C{1H} NMR spectroscopies, elemental analysis, X-ray Powder Diffraction and cyclic voltammetry. In addition, the crystal structure of [RuCl(CO)(dppb)(4,4`-Mebipy)]PF6 was elucidated by single crystal X-ray diffraction analysis. Also, the preliminary in vitro anticancer activity, on hepatocellular carcinoma (HepG2), HSA and DNA binding experiments were evaluated. Human serum albumin binding constants and thermodynamic parameters suggest spontaneous interactions of the complexes with this protein, by van der Waals forces and hydrogen bonding. Spectroscopic titration study indicated that the ctDNA interacts with the complexes are primarily through non-covalent interactions. Additionally, for all compounds their SI are close to 1, indicating a good selectivity. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Hipertensão do avental branco significa uma elevação persistente da pressão arterial no consultório médico ou clínica, com pressão normal em quaisquer outras circunstâncias. Existem diversos questionamentos a respeito da origem, significado clínico, prognóstico e tratamento desta manifestação. Em relação à etiologia, nossa hipótese é que uma alteração endotelial, resultando em deficiência na produção ou utilização de óxido nítrico endógeno, constitua um fator primário para a ocorrência da hipertensão do avental branco. Este estudo, desenvolvido entre moradores do município de Dumont - São Paulo, Brasil, teve como objetivos caracterizar os participantes em relação a fatores demográficos, alterações fisiológicas e metabólicas para posteriormente identificar e comparar os níveis plasmáticos de nitrato - produto da degradação do óxido nítrico ? entre os sujeitos da pesquisa. De uma amostra de 441 voluntários, selecionamos 109 indivíduos, que foram divididos em três grupos: normotensão (no=58), hipertensão essencial (no=33) e hipertensão do avental branco (no=18), após medidas de pressão arterial com aparelho oscilométrico e exame de Monitorização Ambulatorial da Pressão Arterial. Realizamos entrevista, mensuração de dados e coleta de exames laboratoriais para comparação das variáveis encontradas entre os grupos. Para o tratamento estatístico, foram utilizados os testes ANOVA e Tukey. Os resultados foram expressos como médias ± erros padrões das médias. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas para p<0,05. A prevalência de hipertensão do avental branco foi de 34,1%, com predominância do sexo feminino (83,3%), média de idade de 45,28 anos, sendo a maioria natural do Estado de São Paulo (66,7%), de cor branca (88,9%), alfabetizada (33,3%), casada (72,2%), com histórico familiar para doenças cardiovasculares (72,2%). A análise da quantificação de nitrato plasmático apontou diferença significativa entre os grupos hipertensão do avental branco e normotensão em comparação aos hipertensos, com elevação dos níveis de nitrato sérico em portadores de hipertensão essencial. Também encontramos diferença estatisticamente significativa para índice de massa corporal, relação cintura/quadril, glicemia e creatinina plasmáticas, na comparação entre hipertensos do avental branco e normotensos. As distinções observadas entre os grupos e a presença de variações clínicas, demográficas e bioquímicas possibilitam inferir que a hipertensão do avental branco é uma condição que deve ser analisada de maneira distinta em relação a indivíduos normotensos e portadores de hipertensão essencial. / The white coat hypertension is understood as a persistent increase in arterial pressure in the medical office or clinic, while normal blood pressure is observed in any other circumstances. There are several issues regarding the origin, clinical meaning, prognosis and treatment of this condition. Concerning the etiology, our hypothesis is that an endothelial alteration, leading to deficiency either in the production or utilization of endogenous nitric oxide, may constitute a primary factor for the occurrence of white coat hypertension. This study, developed with the population of the city of Dumont São Paulo, Brazil, aims to characterize the participants in relation to demographical factors and metabolic and physiological changes to afterwards identify and compare plasma levels of nitrate product of nitric oxide degradation among the researchs subjects. We selected 109 individuals, from a sample of 441, who were divided in three groups: normotensive (n=58), essential hypertension (n=33) and white coat hypertension (n=18), following arterial pressure measures with oscilometric device and Arterial Pressure Monitoring Exam. Interviews, data measures and laboratory exams were accomplished as to enable the comparison of the variables found between groups. For the statistical treatment, ANOVA and Tukeys test were used. Results were expressed in terms of means ± means standard deviations. The significance level adopted was p<0,05. White coat hypertension prevalence was of 34,1% with predominance of the feminine gender (83,3%), mean age 45,28, most of the participants original from the state of São Paulo (66,7%), white (88,9%), alphabetized (33,3%), married (72,2%) and with family history of cardiovascular diseases (72,2%). Quantification of plasma nitrate showed significant difference between the white coat hypertension group and the normotensive group in comparison to hypertensive patients, with increased levels of serum nitrate in essential hypertension patients. We also found statistically significant difference for corporal mass index, hip/waist ratio, plasma glucose and creatinine, in the comparison between white coat hypertensive and normotensive patients. The distinctions observed between groups and the presence of clinical, demographical and biochemical variations allow us to suggest that the white coat hypertension is a condition which must be analyzed in a distinct way in relation to normotensive and essential hypertension patients.

Neste trabalho foram realizados as sínteses, caracterização e o estudo da reatividade química dos complexos trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O e trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O. Os compostos foram isolados e caracterizados através de técnicas espectroscópicas (UV-vis, infravermelho e 1H RMN), eletroquímicas (voltametria cíclica e polarografia de pulso diferencial) e análise elementar. Os dados espectroscópicos, eletroquímicos e os resultados da análise elementar foram consistentes com as fórmulas dos complexos analisados. Foram utilizados como precursores os compostos [RuCl2(DMSO)4], trans-[RuCl2(py)4] e trans-[Ru(NO2)2(py)4]. O composto com NO foi obtido a partir do complexo trans-[Ru(NO2)2(py)4] em ácido clorídrico concentrado e precipitado como sal de PF6-, formando o complexo trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O. O trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O foi obtido a partir de uma solução do complexo trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2.½H2O, adicionando-se uma solução de cloreto de tetrabutilamônio para precipitar o composto na forma de cloreto. Os espectros na região do UV-vis dos complexos trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O e trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O apresentaram três bandas nas regiões ao redor de 230 nm, 260nm e 450 nm. Os espectros de infravermelho apresentaram freqüência de estiramento NO entre 1900 e 1925 cm-1, cujo valor variou dependendo das condições em que foram obtidos os espectros. O ciclovoltamograma do composto trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O, obtido em solução de acetonitrila, apresentou um processo redox atribuído ao par NO+/0 e um outro processo com E2c = -0,59 V vs Ag/AgCl atribuído à redução do NO0. A atribuição do processo redox com E½ = +0,30 V vs Ag/AgCl foi confirmada através do experimento de espectro eletroquímica na região do infravermelho, onde a banda atribuída ao NO foi diminuindo à medida que o composto ia sendo reduzido. Na espectroeletroquímica na região de UV-vis em acetonitrila foi possível observar uma reação acoplada à redução do composto trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O, podendo ser a substituição do NO0 por uma molécula de solvente. O comportamento eletroquímico do composto trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O foi estudado em solução aquosa. O ciclo voltamograma do composto apresentou um processo redox com E½ =+0,13 V vs Ag/AgCl, que é atribuído ao par NO+/0, um processo em +0,25 V e outro em 0,59 V. Dois processos redox dependentes do processo em +0,25 V foram observados nas faixa entre 0,4-0,7 V e podem ser devidos a produtos formados após uma provável saída do Cl- seguido da liberação do NO, como ocorre com o complexo trans-[RuCl(NO)(cyclam)](PF6)2. No estudo da reatividade do ligante NO no complexo trans-[RuCl(NO)(py)4]2+, observou-se que o NO é pouco reativo ao ataque nucleofílico do OH-, apresentando um pKa do equilíbrio entre as espécies nitro e nitrosilo em 11,5 e um Keq = 6,2.104 L2.mol-2. / In this work, the syntheses, characterization and chemical reactivity of trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O and trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O were studied. The complexes were isolated and characterizated by elemental analyses UV-vis, infrared and 1H NMR spectroscopies, cyclic voltammetry and spectroelectrochemistry. [RuCl2(DMSO)4], trans-[RuCl2(py)4] and trans-[Ru(NO2)2(py)4] were used as precursor complexes. The compound with NO ligand was obtained from the reaction of trans-[Ru(NO2)2(py)4] with chloridric acidic, and precipitation with PF6-, resulting in trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O. The trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O complex was obtained from a trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O acetonitrile solution adding a tetrabutylammonium chloride acetonirile solution. The complex was precipitated as a chloride salt. The UV-vis spectra of trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O and trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O displayed three bands around the 230 nm, 260 nm and 450 nm regions. The infrared spectra showed the stretching frequencies NO in the 1900-1925 cm-1 range whose values depend on the conditions with which the spectra were recorded. The cyclic voltammetry of the trans-[RuCl(NO)(py)4](PF6)2½H2O in acetonitrile solutions showed a pair of peaks (E½ = +0.30 V vs Ag/AgCl) corresponding to the NO+/0 redox processes, and other process at E2c = -0.59 V vs Ag/AgCl assigned to NO0 reduction. The assignment of the redox processes was confirmed through infrared spectroelectrochemistry, where the band of NO decreases while the compound was reduced. The UV-vis spectroelectrochemistry in acetonitrile solution, showed a coupled reaction following the trans-[RuCl(NO)(py)4]2+ reduction. This coupled reaction is probably the NO substitution by a solvent molecule. The electrochemical behavior of trans-[RuCl(NO)(py)4]Cl23H2O was studied in aqueous solution. The cyclic voltammetry of this complex displayed a pair of peaks (E½ = +0.13 V vs Ag/AgCl) corresponding to NO+/0 redox processes, a process at -0,25 V and other at 0,59 V. Two other couples dependent on the process at 0.25 V, were observed between +0,4 V and +0,7 V. These may be due to products of the Cl- release followed by the NO release, as occurs in trans-[RuCl(NO)(cyclam)](PF6)2. The trans-[RuCl(NO)(py)4]2+ complex showed a low affinity for OH-, with a pKa of the equilibrium between nitro and nitrosyl species at 11.5 and a Keq = 6.2 x 104 L2.mol-2.

A redução eletroquímica de íons complexos do tipo trans-[Ru(NH3)4LNO]2+, foi investigada com o intuito de verificar a possibilidade desses complexos atuarem como doadores de nitroxil (HNO/NO-). Neste trabalho foi dada uma ênfase especial no estudo da espécie em que L = P(OEt)3. Aplicando-se as técnicas de voltametria cíclica e de pulso diferencial, voltametria de onda quadrada e espectroeletroquímica, foi possível verificar que a espécie trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]2+ sofre redução monoeletrônica gerando o íon complexo trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+. Foram analisadas as estabilidades relativas das espécies possivelmente formadas, trans- [Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+ e trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3HNO]2+, baseadas na Teoria de Densidade Funcional (DFT). Após a transferência eletrônica, de acordo com a equação abaixo, a espécie formada sofre isomerização de spin, ocorrendo posteriormente a dissociação do grupo NO O processo apresenta-se como irreversível no espectro voltamétrico devido às restrições de spin. A reação do íon complexo trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]3+ com o alfacetoglutarato (Ered = -0,90 V), composto capaz de agir como redutor de dois elétrons por transferência de elétrons de esfera externa, foi monitorada eletroquímica e espectrofotometricamente utilizando a metmioglobina, Mb - Fe(III), captador seletivo de nitroxil. Os resultados obtidos sugerem o complexo supracitado como um possível doador de niroxil. / The electrochemical reduction behavior of the complexes trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]2+ was investigated in order to determine the possibility of these complexes to serve as nitroxyl donors (HNO/NO-). Special emphasis was given when L = P(OEt)3. Using cyclic voltammetry and differential pulse, square wave voltammetry and spectroelectrochemistry techniques was possible to infer that the ion complex trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]2+ suffers an one electron reduction generating the ion complex trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+. Analyzing the behavior of the cyclic voltammetry spectra, is possible to conclude that the process is irreversible by spin restrictions. The reaction of the ion complex trans-[Ru(NH3)4P(OEt)3NO]+ with the reductor agent alpha-ketoglutarate (Ered = -0,90V), a two electron reductor by outersphere pathway, was monitored by electrochemistry and UV-vis spectroscopy techniques using Mb-Fe(III) as a selective nitroxyl scavenger. The results obtained with these experiments confirm the original purpose of this study.

El SNC se ve afectado por procesos inflamatorios en respuesta a infecciones bacterianas, a traumatismos y en los procesos relacionados con la patogénesis de enfermedades neurodegenerativos como Parkinson, Alzheimer (EA), esclerosis múltiple (EM) o la demencia asociada al virus de inmunodeficiencia humana (VIH). La reactividad glial y expresión aumentada de citocinas proinflamatorias son características comunes del proceso inflamatorio asociado a las patologías neurodegenerativas. Las citocinas son proteínas de bajo peso molecular (entre 8 y 26 KDa) que se sintetizan en casi todos los tipos celulares. Se han clasificado en proinflamatorias (IL-1b, TNF-a, INF-g, IL-6) y antiinflamatorias (IL-4, IL-10, IL-12). Las citocinas proinflamatorias, a su vez, inducen en las células del SNC la expresión de NOS-2 provocando una producción elevada y sostenida de NO. El NO es sintetizado por las óxido nítrico sintasas (NOS) de las que se han descrito tres isoformas: NOS-1, NOS-2 y NOS-3. La NOS-2 se induce transcripcionalmente en respuesta a mediadores de inflamación generando altas cantidades de NO (nanomoles) por largos periodos de tiempo que pueden tener efectos citotóxicos. La interacción fisiológica más importante del NO es su unión al Fe2+ del grupo hemo de la guanilil ciclasa soluble induciendo la formación de GMP cíclico (cGMP) a partir de GTP. El cGMP ha sido implicado en muchas de las acciones fisiológicas del NO, tanto en tejidos periféricos como el vascular. En el SNC modula procesos de plasticidad sináptica y formación de memoria, procesamiento sensorial y visual, desarrollo cerebral, secreción neuroendocrina y regulación del flujo sanguíneo cerebral. Se sabe muy poco sobre la regulación de la formación de cGMP dependiente de NO en células del SNC durante la neuroinflamación. En el presente trabajo se aportan evidencias que demuestran que agentes inflamatorios como las citocinas IL-1b y TNF-a, el LPS y los péptidos Ab regulan el metabolismo de cGMP en células astrogliales de rata en cultivo, así como en el cerebro de la rata adulta, indicando que durante la neuroinflamación la señalización vía NO-cGMP se encuentra alterada. / Inflammatory processes in response to bacterial infections, tissue insults caused by trauma and the patogenesis of neurodegeneration induced by neural diseases such as Alzheimer's and Parkinson's disease, multiple sclerosis and HIV-associated dementia, affect CNS. In these situations, glial cells (astroglia, microglia and oligodendrocytes) are the ones taking active part in the process of neuroinflammation. Their activation is one of the most important ferature during neuroinflammation. Glial cells activation is characterised by molecular changes such as increased expresión of GFAP (in astrocytes) and a serie of immunoregulator proteins and inflammation mediators in both astro and microglia. Pro (IL-1b, TNF-a, INF-g, IL-6) and anti-inflammatory cytokines (IL-4, IL-10, IL-12) and oxigen reactive species (SOR) participate activelly in the process of neuroinflammation. Cytokines are low molecular weigh proteins (8-26 kDa) sintetised by almost all cell types known as well as the nitric oxide sintase enzymes (NOS). NOS activities (1, 2 and 3) have been detected in most of the CNS cells. NOS-2 is trasncriptionally induced in response to inflammatory agents and combination of pro-inflammatory cytokines, producing long term, high levels of NO having citotoxic effects.Tme main target of NO is the hemo-enzime soluble guanylyl cyclase wich after activation by NO catalises the production of the cyclic nucleotide cGMP. It is not completely known the regulation of NO-dependent cGMP formation during neuroinflammation. In the present work we show evidences of cGMP metabolism regulation by the neuroinflammatory agents IL-1b, TNF-a, lipopolisacharide and betaAmiloyd peptides in rat astroglial cells in culture and in the adult rat brain. Our results suggest that during inflammation in the CNS NO/cGMP signal transduction is affected.

La guanilil ciclasa sensible a NO (GCNO) cataliza la formación de GMPc y es la principal diana del NO en el SNC. La GCNO es un heterodímero compuesto por una subunidad &#945; y una &#946;. Dos isoformas de cada subunidad han sido clonadas. En esta tesis estudiamos la distribución anatómica de los mRNAs de las subunidades en cerebro de rata y mono. Nuestros resultados revelan que en ambas especies el mRNA de la &#946;1 es más abundante y ubicuo en cerebro. El mRNA de la subunidad &#946;2 no pudo ser detectado en ninguna de las dos especies. La distribución de las subunidades &#945; presentó similitudes en el sistema límbico y en caudado-putamen de ambas especies y diferencias en la distribución laminar en corteza. Mientras que en rata la subunidad &#945;1 es elevada en capas externas corticales, en mono lo es en las capas internas. Además, el mRNA de &#945;1 es más ubicuo en el mono y el mRNA de la &#945;2 en la rata.Una elevada expresión de las tres subunidades se observó en ganglios basales, sistema olfatorio, hipocampo y corteza. También encontramos regiones donde la expresión de la subunidad &#946;1 era alta y pero la expresión de ambas &#945; era baja o indetectable. En la rata, esto ocurre en las islas de Calleja, la mayoría de los núcleos talámicos y el colículo superior, y en mono ocurre en los núcleos talámicos y en el claustrum. El sistema NO-GMPc ha sido implicado en plasticidad sináptica, procesamiento sensorial y comportamiento en la rata, los niveles elevados de las tres subunidades en regiones como los ganglios basales, hipocampo y cerebelo en mono sugieren que en primates también estaría involucrado en estos procesos.Estudios previos demostraban que agentes inflamatorios disminuían la actividad GCNO como consecuencia de la disminución de la subunidad &#946;1 en astrocitos en cultivo y en cerebro de ratas adultas. En este trabajo estudiamos si la actividad GCNO también estaba alterada en cerebro de pacientes con enfermedades neurodegenerativas con un componente inflamatorio como Alzheimer (AD), Creytzfeldt-Jakob (CJ) y esclerosis múltiple (MS). Los resultados demuestran que no existen diferencias significativas entre los individuos control y los enfermos AD con distinto grado de afectación en la actividad basal GCNO o estimulada con donadores de NO, ni en los niveles de expresión de las subunidades &#946;1 y &#945;1. Mediante inmunocitoquímica demostramos que las neuronas y en astrocitos de sustancia blanca presentan un nivel de expresión elevado para la &#946;1. En pacientes AD, los niveles de expresión no estan alterados en neuronas y astrocitos fibrilares mientras que se detectó disminución de &#946;1 en astrocitos reactivos alrededor de las placas amiloides. El marcaje se ve también disminuido en astrocitos reactivos de sustancia blanca de pacientes con CJ y MS. Así, la inducción de la reactividad glial está asociada a una disminución en la capacidad de generar GMPc en respuesta a NO. Estudios previos demostraban que la disminución de la subunidad &#946;1 inducida por LPS era dependiente de transcripción y síntesis de proteínas, pero independiente de NO. En esta tesis estudiamos el mecanismo involucrado en la degradación de esta subunidad, siendo la vía que involucra al proteosoma y la ubiquitina responsable de la disminución. También, demostramos que el tratamiento con LPS produce la formación de agregados de &#946;1 en el núcleo, en estructuras ricas en proteosoma 20S y ubiquitina con características de clastosomas. La formación de estos agregados es inhibida por inhibidores específicos del proteosoma y de la síntesis de proteínas. Durante estos estudios observamos la presencia de &#946;1 en células con actividad GCNO (neuronas y astrocitos), así como en células sin actividad GCNO (microglía). En ambos casos la localización era mayoritariamente citosólica pero también aparecía en el núcleo. La intensidad de marcaje aumentaba en células en división. A mayor aumento observamos que &#946;1 se encontraba asociada periféricamente a los cromosomas durante todas las fases de la mitosis. Debido a la localización pericromosomal, nos propusimos estudiar si la &#946;1 ejercía alguna función sobre la condensación de la cromatina. Mediante un ensayo de condensación in vitro demostramos que la inmunodepleción de la proteína nuclear y citoplasmática provocaba aumento en la condensación. También demostramos que el silenciamiento de &#946;1 por siRNA producía un aumento del número de células que ingresaban en el ciclo celular y un aumento de la proliferación. Todos estos efectos fueron independientes de la actividad enzimática ya que un inhibidor especifico de la GCNO no mimetizaba los efectos del siRNA ni de la inmunodepleción. Estos resultados nos llevan a proponer que la subunidad &#946;1 de la GCNO podría tener una función independiente de su actividad enzimática. / Nitric oxide (NO) exerts most of its physiological effects through activation of a predominantly soluble guanylyl cyclase (sGC). In mammalian cells sGC exists as a heterodimer of &#945; and &#946; subunits. Currently, four subunits (&#945;1-2 and &#946;1-2) have been characterized. We used in situ hybridization with subunit-specific 33P-labeled oligonucleotide probes to compare the anatomical distribution of sGC subunit mRNAs in rat and monkey brains. Message for all subunits except &#946;2 was detected in both species. The sGC subunit showing the highest expression and widest distribution was &#946;1. High expression for all subunits was found in basal ganglia, olfactory system, hippocampus, cortex, and cerebellum. Minor species differencesin the relative distribution of &#945; subunits were observed. In general, the &#945;1 message was more prominent in monkey brain and the &#945;2 message in rat brain. This was more evident in limbic areas and cerebellar cortex. Some differences were also observed in subunit laminar distribution in cerebral cortex. The limited species differences in sGC subunit distribution suggest that in primates, as occurs in rodents, the NO-cGMP signaling pathway will be involved in important brain functions such as memory formation, sensory processing, and behavior.In Alzheimer's disease (AD) brains increased NO synthase (NOS) expression is found in reactive astrocytes surrounding amyloid plaques. We have recently shown that treatment with &#946;-amyloid peptides or IL-1B down-regulates GCNO in cultured astrocytes and in adult rat brain. In this work, we have examined GCNO activity and expression in postmortem brain tissue of AD patients and matched controls. No significant alteration was observed in basal or NO-stimulated GCNO activity, nor in GCNO &#946;1 and &#945;1 subunit levels in cortical extracts of AD brains. Immunohistochemistry showed intense and widespread labeling of GCNO &#946;1 in cortical and hippocampal neurons and white matter fibrillar astrocytes, while grey matter astrocytes were faintly stained. In AD, expression of GCNO in neurons and fibrillar astrocytes is not altered but is markedly reduced in reactive astrocytes surrounding amyloid plaques. Immunostaining for GCNO &#946;1 was also lacking in reactive astrocytes in cortex and subcortical white matter in Creutzfeldt-Jakob disease brains and in subacute and chronic plaques in multiple sclerosis (MS) brains. Thus, induction of astrocytes reactivity is associated with decreased capacity to generate cGMP in response to NO both in vitro and in vivo. This effect may be related to the development of the astroglial inflammatory responseWe previously showed that treatment with bacterial cell wall lipopolysaccharide (LPS) or proinflammatory cytokines decreases GCNO activity in astrocytes by decreasing the half-life of the obligate GCNO &#946;1 subunit in a NO-independent but transcription- and translation-dependent process. Here we show that LPS-induced &#946;1 degradation requires proteasome activity and is independent of NF&#954;B activation or inhibition of &#946;1 interaction with HSP90. Immunocytochemistry and confocal microscopy revealed that LPS promotes co-localization of the predominantly soluble &#946;1 protein with ubiquitin and the 20S proteasome in nuclear aggregates that present characteristics of clastosomes, nucleoplasmic substructures involved in ubiquitin-proteasome-dependent nuclear proteolysis. Proteasome and protein synthesis inhibitors prevented LPS-induced clastosome assembly and nuclear colocalization of &#946;1 with ubiquitin and 20S proteasome strongly supporting a role for these transient nuclear structures in GCNO down-regulation during neuroinflammation.Functional GCNO exists as &#945;1/&#946;1 and &#945;2/&#946;1 heterodimers and is predominantly cytosolic, although recent studies indicate that it can associate to membranes and other intracellular structures including nuclei. In the CNS, in situ hybridization studies evidenced that &#946;1 is more widespread than &#945; subunits and that in some areas is almost the only GCNO subunit expressed, suggesting that it may have functions other than GCNO activity. In the course of our studies on the cellular and sub-cellular distribution of GCNO in rat CNS glial cells we found that the &#946;1 subunit is localized in the cytoplasm and the nucleus of cells expressing &#945; subunits and GCNO activity (astrocytes, C6 glioma), as well as in cells devoid of &#945; subunits and GCNO activity (microglia). In both cell types &#946;1 associates peripherally to chromosomes during all phases of mitosis. In C6 cells, immunodepletion of &#946;1 enhances chromatin condensation in an in vitro assay. Moreover, silencing &#946;1 by siRNA increases the percentage of cells that enter the cell cycle and the proliferation rate. These actions are not mimicked by treatment with a specific GCNO inhibitor (ODQ). We postulate that the &#946;1 subunit is a multifunctional protein that, in addition to its role as an obligate monomer in active GCNO, associates to chromosomes during mitosis and regulates chromatin condensation and cell cycle progression.

Bajo el nombre de Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) se agrupan dos patologías inflamatorias crónicas y recidivantes de etiología desconocida: la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La relativamente elevada incidencia de estas patologías hace que estudiar su etiopatogenia sea un objetivo importante, ya que actualmente no existe ningún tratamiento curativo y/o que prevenga la recidiva A pesar de que los pacientes afectados de EII presentan síntomas relacionados con alteraciones de la motilidad digestiva se desconoce la implicación que pueden tener estos desordenes en la patogénesis de la enfermedad. Uno de los principales objetivos de esta tesis doctoral ha sido la obtención y caracterización de un nuevo modelo experimental de Enfermedad Inflamatoria Intestinal crónica en la rata, con el objetivo de valorar los cambios que la inflamación provoca sobre los mecanismos fisiopatológicos que intervienen en la regulación tanto de la actividad motora como de la función de la barrera intestinal, así como la implicación que tienen estas alteraciones en la cronificación del proceso inflamatorio.Este nuevo modelo, que se ha obtenido a partir de la modificación realizada sobre el modelo clásico de enteritis inducida por indometacina en rata, ofrece una gran ventaja respecto al modelo clásico, ya que hemos reproduce las recidivas de inflamación intestinal que se producen de forma espontánea en los pacientes humanos. Así, en este modelo los animales presentan una alternancia de fases de inflamación activa, caracterizadas por leucocitosis, incremento de TNF en suero y aumento de la actividad MPO, con otras de aparente recuperación de la normalidad. Estudios realizados en este modelo demuestran que las diferentes fases van acompañadas de cambios en la flora intestinal y alteraciones de la motilidad. Mientras que durante la fase activa se observa una hipomotilidad generalizada acompañada de sobrecrecimiento de bacterias luminales, la fase de recuperación está asociada a un incremento en los parámetros motores y el restablecimiento de la carga microbiana La regulación de la síntesis de NO juega un papel clave en el curso de las alteraciones motoras asociadas al proceso inflamatorio. Mientras que el incremento de motilidad observado durante las fases de recuperación parece ser debido a la reducción del tono inhibitorio intestinal derivado de la inhibición de la expresión de nNOS, la disminución de motilidad y sobrecrecimiento bacteriano asociado a las fases activas parecen ser debidos a un incremento de la síntesis de NO producido por la sobre-expresión de iNOS. Recientemente también hemos demostrado que los animales con inflamación inducida presentan un aumento sostenido de la permeabilidad intestinal, sugiriendo que la vulnerabilidad de la función de la barrera epitelial es uno de los factores involucrados en la cronificación del proceso inflamatorio. Además, durante las fases de inflamación activa se observa una estrecha correlación entre el aumento de la permeabilidad transcelular y la translocación de bacterias luminales, sugiriendo que éste podría ser uno de los mecanismos involucrados en las recaídas cíclicas de inflamación intestinal.De manera conjunta, todos estos resultados dan pie a la siguiente hipótesis: mientras que la carga antigénica se mantiene dentro de unos límites, debido a una normal o incrementada motilidad, no hay respuesta inflamatoria a pesar del incremento de permeabilidad intestinal. Sin embargo, cuando la actividad motora decrece, el incremento de la interacción antígeno-mucosa facilita el paso de moléculas a través del epitelio, incluidas bacterias, resultando en la activación del sistema inmune y la liberación de mediadores inflamatorios. / Inflammatory Bowel Disease (IBD) includes two chronic inflammatory pathologies characterized by alternation of active and quiescent phases of inflammation with yet unknown aetiology: Crohn's disease and ulcerative colitis. The ultimate goal of gaining a better understanding of the pathological mechanisms involved in the development of IBD is to find an effective treatment. Although IBD patients present symptoms that suggest motor alterations, their implication in the pathogenesis of the disease has not been well established. The purpose of this Thesis have been to obtain and to characterize a new experimental model of Inflammatory Bowel Disease in the rat to evaluate the effects of inflammation in the mechanisms involved in the regulation of both intestinal motility and epithelial barrier function, as well as the implication of both disorders in the development of chronic inflammation.This new model has been obtained by the modification of the classic model of indomethacin-induced enteritis. Similarly to human IBD, this model is characterized by spontaneous alternation of active and quiescent phases of inflammation. Active phases are related to leukocytosis, increased TNF and increased tissular MPO. In contrast, quiescent phases are related to a reduction of inflammatory parameters. Studies made in this model have also demonstrated changes in both bacterial load and motor activity. Whereas active phases are characterized by hypomotility and bacterial overgrowth, quiescent phases are related to hypermotility and the reduction of bacterial load.The regulation of the synthesis of NO plays a key role in the motility disturbances associated to the inflammatory process. Whereas hypermotility observed during the quiescent phases seems to be consequence of the reduction of the intestinal inhibitory tone due to nNOS down-regulation, hypomotility and bacterial overgrowth are related to an over-production of NO by up-regulated iNOS. Recently we have demonstrated animals with induced inflammation present a sustained enhancement of paracellular permeability, suggesting epithelial barrier dysfunction is involved in the chronicity of inflammation. By contrast, trancellular permeability and bacterial translocation only increased during the active phases, when hypomotility and bacterial overgrowth are also present, suggesting these factors may play a critical role in the course of acute relapses in IBD. The results obtained are in agreement with the following hypothesis: while antigen load is maintained at lower level, due to normal or enhanced motility, there is no inflammatory response despite the increased intestinal permeability (mainly paracellular). However, when motor activity decreases, the increase in the interaction antigen-mucosa facilitate massive antigenic uptake and bacterial translocation, leading to the activation of the immune system and the release of inflammatory mediators.

El óxido nítrico (ON) es considerado un de los posibles reguladores del metabolismo y de la actividad celular del tejido óseo. Es producido por la sintasa inducible ON (SON).Los osteoblastos y los osteoclastos expresan fundamentalmente la sintasa endotelial (SONe) y la sintasa inducible (SONi). Este estudio investigó, en una primera etapa, las funciones individuales de cada una de estas isoformas, mediante histomorfometría y técnicas de biología molecular, empleando animales transgénicos deficientes en la SONe (SONe-/-) y en la SONi (SONi-/-), respectivamente. En una segunda etapa, este estudio investigó los efectos de la lactancia sobre el metabolismo óseo y el posible rol del ON en la patogénesis de la osteoporosis lactacional en ratas, mediante estudios bioquímicos, histomorfométricos e inmunohistoquímicos. Los estudios desarrollados en los ratones SONe-/- y en los ratones SONi-/- mostraron que ambas isoformas están involucradas en la regulación de la masa ósea y que la ausencia de los genes que expresan alguna de estas isoformas resulta en la reducción del volumen óseo(BV/TV) y en el índice de formación ósea (BFR/BS). Las alteraciones observadas estan relacionadas con una disfuncion osteoblásticas. La ausencia de la SONe se encuentra asociada con una reducción en el reclutamiento de los osteoblastos a los sitios de remodelación; mientras que la ausencia de la SONi esta relacionada con una disminución en la actividad metabólica de estas células. Los estudios desarrollados en las ratas en lactación mostraron una reducción del BV/TV y un aumento marcado del índice de remodelación ósea, mas pronunciados que los observados en las ratas ovariectomizadas. Sin embargo, mostraron una marcada disminución de las superficies mineralizadas (MS/BS), del índice de aposición mineral (MAR)y del BFR/BS. Se observó una correlación positiva entre los niveles de expresión de la SONe en los discos epifisiarios con la intensidad del crecimiento endocondral y con la magnitud en la intensidad de la remodelación ósea. / Nitric oxide (NO) is consideres as a possible local regulator of bone metabolism and bone cell activity. NO es generated by NO sythsses (NOS) isoforms. Thi endothelial (eNOS) and the inducible (iNOS) isoforms are expressed by osteoblasts and osteoclasts. The first aim of this study was to investigate the specific roles of these isoforms using eNOS and iNOS gene-deficient mice (eNOS -/- and iNOS, respectively) by performing histomorphometry and molecular biology techniques. The second aim of this study to investigate the role of NO in the pathogenesis of lactational osteoporosis in rats and to assess the effects of lactation on bone metabolism and bone cell activity. Endothelial NOS gene-deficient mice showed a decrease in bone volume (BV/TV) and in bone formation rate (BFR/BS). These appear to be due to a decrease in osteoblast surface and therefore, suggest thart there is an abnormal osteoblast commitmentand recruitment. Similary, iNOS-/- mice displayed a reduction in BV/TV and in BFR/BS. However, it seems to be due to a reduction in osteoblast metabolism and activity rather than to a reduction in osteoblast recruitment. Study conducted in rats during lactation showed in BV/TV and an increase in bone remodelling, more pronounced than the observed in ovariectomized rats. However, lactated rats also showed a reduction in mineralised surface (MS/BS), in mineral appositional rate (MAR) and in BFR/BS. A positive correlation was observed between the level of eNOS expression in the growth plate and the intensity of endochondral growth rate and with the intensity of bone remodelling activity in the methaphyses. A positive correlation was also observed between the oestrogen levels and the level of eNOS expression in the growth plate but not with the eNOS expression in the trabecular metaphyses. Taking together these data suggest that eNOS is involved in endochondral growth and in bone remodelling. However, oestrogen levels seems to be related, at least in part, with endochondral growth rate but seems to have less influence in bone remodelling activity.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000411460-Texto+Completo-0.pdf: 1742083 bytes, checksum: 3931f88773ce035b46bd7477e96796d2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Evidence suggests that the NO/sGC/PKG pathway plays a key role in memory processing but the actual participation of this signaling cascade in the amygdala during memory consolidation remains unknown. Here we show that when infused in the amygdala immediately after inhibitory avoidance training, but not later, the NO synthase inhibitor L-NNA hindered long-term memory retention without affecting locomotion, exploratory behavior, anxiety state or retrieval of the avoidance response. The amnesic effect of L-NNA was not state dependent and was mimicked by the soluble guanylyl cyclase inhibitor LY83583 and the PKG inhibitor KT-5823. On the contrary, posttraining intra-amygdala infusion of the NOS substrate L-Arg, the NO-releasing compound SNAP or the non-hydrolysable analog of GMPc 8Br-GMPc increased memory retention in a dose-dependent manner. Co-infusion of 8Br-GMPc reversed the amnesic effect of L-NNA and LY83583 but not that of KT-5823. Our data indicate that the NO-induced activation of PKG in the amygdala is a necessary step for consolidation of inhibitory avoidance memory. / Evidências sugerem que a via de sinalização NO/sGC/PKG tem papel chave no processamento da memória, entretanto a atuação desta cascata de sinalização na amígdala durante a consolidação da memória permanece desconhecida. Neste trabalho se comprova que quando infundido na amígdala de ratos imediatamente após o treino na tarefa de esquiva inibitória, porém não em outros tempos de infusão, o inibidor da NO sintase, L-NNA, prejudica a retenção da memória de longa duração, sem afetar a locomoção, o comportamento exploratório, o estado de ansiedade ou a expressão da resposta aversiva dos animais. O efeito amnésico do L-NNA não demonstra ser dependente de estado e foi mimetizado pelo inibidor da guanilil-ciclase solúvel, LY83583, e pelo inibidor da PKG, KT5823. Pelo contrário, a infusão pós-treino do substrado da NOS, L-Arg, do composto doador de NO, SNAP, e do análogo não-hidrolizável do GMPc, 8-Br-GMPc, aumentaram a retenção da memória de forma dose-dependente. A co-infusão de 8-Br-GMPc reverteu o efeito amnésico do L-NNA e do LY83583, porém não a do KT5823. Os dados indicam que a ativação da PKG induzida pelo NO na amígdala é um passo necessário à consolidação de memórias aversivas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000430781-Texto+Completo-0.pdf: 5344417 bytes, checksum: ac9d8005af7e08aa4f34ebcea8bacac1 (MD5) Previous issue date: 2010 / The aim of this research was to determine the role in the modulation of inflammation of Fructose-1,6-bisphosphate, in experimental C. albicans-induced sepsis, and in COX-2, IL-6 and NF-Kappa B gene expression, NOx production and expression of iNOS in macrophages. Intratracheal sepsis model was performed in CF-1 mice, using fluconazole-resistant and -susceptible strains of C. albicans. FBP (500mg/Kg) was administered to mice at the time of operation in Sepsis + FBP Group. Five to six animals from each group were killed 24h, 5 days, and 10 days after the sepsis induction. Blood was taken for assessment of complete hematological profile and cytokine assay (IL-6 and MCP-1). The rest of the mice were observed for mortality. In order to determine the possible anti-inflammatory mechanism of FBP, a series of transfections in RAW macrophages using COX-2, IL-6 and NF-Kappa B promoters has been conducted. The NO production by macrophages and iNOS expression in RAW has been determined. We also investigate the regions of COX-2 promoter gene that mediate the inductive effects of zymosan. Transient transfections with a series of COX-2 promoter–mutation constructs were performed to further elucidate the effects of zymosan on COX-2 transcription. Mortality decreased significantly in groups that received FBP in C. albicans susceptible to fluconazole group. All cytokine and hematological indexes of FBP group were similar to sepsis group, with exception of platelets count. FBP significantly prevented the decrease in platelets count. FBP does not seem to act in the transcription of COX-2, IL-6, and NF-Kappa B. FBP reduced amounts of NOx levels in BAL fluid through the inhibition of expression of iNOS. Exposure to zymosan (50 g/mL for 24 h) markedly enhanced the relative luciferase activity in RAW 264. 7 macrophages transfected with COX-2 luciferase promoter constructs. Deletion on the CCAAT-enhancer binding protein (C/EBP) and nuclear factor kappa B (NF-kappa B) binding site resulted in an important decrease in reporter gene activity and a deletion of NF-kappa B and C/EBP with mutation of the cyclic adenosine monophosphate response element (CRE) and/or activator protein-1(AP-1) totally abolished the COX-2 activity induced by zymosan. / O objetivo deste estudo foi determinar o papel da Frutose-1,6-bisfosfato na modulação do processo inflamatório na sepse induzida por C. albicans, na expressão de COX-2, IL-6 e NF-Kappa B e na produção de NO e expressão de iNOS em macrófagos. Um modelo de sepse intratraqueal foi realizado em camundongos CF-1 utilizando cepas de C. albicans sensíveis e resistentes ao fluconazol. FBP(500mg/kg) foi administrada aos animais no momento no momento da indução no grupo Sepse+FBP. Cinco a seis animais de cada grupo foram mortos 24h, 5dias e 10 dias após a indução de sepse. O sangue foi coletado para a realização do perfil hematológico completo e para o ensaio das citocinas (IL-6 e MCP-1). O restante dos animais foram utilizados para dados de mortalidade. A fim de determinar o possível efeito anti-inflamatório da FBP, uma série de transfecções utilizando promotores dos genes COX-2, IL-6 e NF-Kappa B foram realizados em células RAW. A produção de NO em macrófagos e a expressão de iNOS em RAW também foi realizada. Investigamos ainda as regiões do promotor do gene da COX-2 que realizam a mediação dos efeitos do zymosan. Transfecções transientes com uma série de contruções com mutações na região promotora da COX-2 foram realizadas para elucidar os efeitos do zymosan na transcrição da COX-2. A mortalidade diminuiu significativamente nos animais que receberam FBP após indução no grupo C. albicans sensível ao fluconazol. As citocinas e os índices hematológicos foram similares ao grupo sepse, com exceção da contagem de plaquetas. A FBP previne significativamente o decréscimo do número de plaquetas. A FBP parece não atuar na transcrição de COX-2, IL-6 e NF-Kappa B. A FBP reduziu os níveis de NO no lavado bronco-alveolar através da inibição da expressão de iNOS.A exposição ao zymosan (50μg/ml por 24h) marcadamente aumenta a atividade relativa de luciferase em macrófagos RAW transfectados com o promotor da COX-2. Deleções nos sítios de ligação C/EBP e NF-Kappa B resultam em um importante decréscimo na atividade do gene repórter e uma deleção no sítio NF-Kappa B e C/EBP com mutações nos sítios CRE e/ou AP-1 anula a atividade da COX-2 induzida por zymosan.