Der eukaryotische Zellzyklus ist auf allen Ebenen der Genexpres- sion reguliert. Sowohl breit angelegte genetische Screens als auch funktionale Studien zu den beteiligten Proteinen haben unser Ver- ständnis dieses fundamentalen Prozesses geprägt. In dieser Arbeit behandle ich räumliche Aspekte der post-transkriptionalen Regulation des Zellzyklus, die mit lichtmikroskopischen Einzelzell- und Einzel- molekülmethoden experimentell zugänglich werden. Insbesondere untersuchte ich die subzelluläre Lokalisierung der messenger RNA von CLB2, einem zentralen Regulator der Mitose im eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Bierhefe). Frühere Studien zeigten, dass diese RNA sich im Laufe des vegetativen Zellwachstums in der entstehenden Tochterzelle, der Knospe, anreichert. Mithilfe modernster Fluoreszenzmikroskopie charakterisierte ich die Bewe- gung und Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA-Moleküle auf Zeitskalen von Millisekunden bis hin zur Generationszeit dieser He- fen. Ich zeigte, dass sich mit Hilfe von Multifokusmikroskopie unter Verwendung optimierter Fluoreszenzmarker und der Entwicklung objektiver Analysemethoden die Bewegung einzelner RNA-Moleküle zwischen Mutterzelle und Knospe nachvollziehen lässt. Dazu präsen- tiere ich eine Methode um die beobachteten Trajektorien der messenger RNA mathematischen Analysen der Systembiologie zugänglich zu machen. Weiterhin gab die Beobachtung der Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA Moleküle über den Zellzyklus hinweg mittels einer neuartigen Lichtblattmikroskopie (Lattice Light Sheet Microscopy) Hinweise auf eine bisher unbekannte Dynamik in der Lokalisierung dieser messenger RNA. Die hier entwickelten Methoden ermöglichen eine quantitative Untersuchung räumlicher Aspekte der posttranskrip- tionalen Zellzyklusregulation. / The eukaryotic cell cycle is regulated on all levels of gene expression. Genetic screens and functional studies of the involved proteins have shaped our understanding of this fundamental process. In this thesis I use single cell and single molecule light microscopy methods to investigate spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation. I investigated the subcellular localization of CLB2 mRNA, a central regulator of mitosis in the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast). Previous studies have shown that that this messenger RNA is enriched in the emerging daughter cell, the bud, during vegetative growth. Using pre-commercial fluorescence micro- scopes I characterized the dynamics and partitioning of single CLB2 mRNA on time scales from milliseconds to the generation time of this yeast. I demonstrate that using aberration corrected multifocus mi- croscopy, optimized fluorescent markers, and here developed objective analysis methods, the translocation of single mRNA molecules be- tween mother and bud can be observed. In addition, I report a method to make these trajectories available for the mathematical approaches of Systems Biology. Further, the observation of single CLB2 mRNA partitioning throughout the cell cycle with the use of lattice light sheet microscopy suggested a previously unknown localization behavior of the transcript. The methods developed here enable a quantitative analysis of spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation.

AREG und EREG sind Liganden des EGFR, deren Expression mit einem positiven EGFR-zielgerichtetem Therapieansprechen in Darmkrebs korreliert. Ziel dieser Arbeit war es, einen epigenetischen Einfluss auf die AREG und EREG Expression zu klären. Es wurde gezeigt, dass AREG und EREG in verschiedenen kolorektalen Krebszelllinien differenziell exprimiert sind, und dass die Expression beider Gene durch epigenetische Inhibitoren erhöht werden kann. Eine Analyse in fünf Zelllinien zeigte jedoch, dass die Promotoren beider Gene hauptsächlich unmethyliert vorlagen. Hingegen wurden kurze Regionen im Gen als differentiell methyliert identifiziert. Im AREG Gen liegt diese Region im Exon 2, was auf einen ungewöhnlichen Regulationsmechanismus hindeutet. Promotorfunktionsanalysen zeigten dann, dass diese Region eine methylierungs- und orientierungsabhängige Promotorfunktion hat, in die das MDB-Protein CTCF involviert sein könnte. Expressionsanalysen wiesen darauf hin, dass auch ZBTB33, ein anderes MDB-Protein, in die AREG Regulation involviert sein könnte. Die ZBTB33 Expression korrelierte negativ mit der AREG Expression in den Zelllinien. Eine ZBTB33-Bindungsstelle konnte ausserdem bioinformatorisch im AREG Exon 2 identifiziert werden. Des weiteren wurde gezeigt, dass die Behandlung der Zelllinie LIM1215 mit HDAC Inhibitoren in vitro zu einer Erhöhung der Sensitivität gegenüber EGFR-zielgerichteten Medikamenten führt, begleitet von einer Erhöhung der AREG und EREG Expression. Im in vivo Versuch konnte die Sensitivität von LIM1215 Zellen durch die Behandlung mit DNMT Inhibitoren erhöht werden. Begleitet wurde dies hier mit einer Verringerung der Methylierung der AREG und EREG intragenischen CpGs. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass Patienten, die resistent gegenüber EGFR-zielgerichteten Therapien sind, möglicherweise sensitiv gemacht werden können. In dem Fall könnten AREG und EREG als prädiktive Marker eingesetzt werden, um den Effekt der epigenetischen Inhibitoren zu evaluieren. / AREG and EREG are ligands of the EGFR whose expression correlates with a positive EGFR-targeted therapy response in colorectal cancer. Aim of this work was to define the influence of epigenetic mechanisms on AREG and EREG gene expression. It could be shown that AREG and EREG are differentially expressed in a set of colorectal cancer cell lines and that the expression of both genes increases after treatment with epigenetically interfering compounds such as DNMT inhibitors and HDAC inhibitors. Methylation analysis showed that the promoters of both genes were mainly unmethylated. Nevertheless, short intragenic regions were identified to be differentially methylated. For AREG, this region is located within exon 2, indicating an uncommon epigenetic regulatory mechanism. Promoter function analyses showed that the AREG exon 2 region harbor methylation- and orientation dependent promoter function and they suggested CTCF, an MDB-protein, to be involved in this mechanism. Expression analysis experiments suggested also ZBTB33, another MDB-protein, to be involved in AREG regulation. ZBTB33 was differentially expressed in the cells and it correlated inversely with the AREG expression. Additionally, bioinformatic analyses identified a ZBTB33 binding site within AREG exon 2. It was also shown in this work that LIM1215 cells treated with HDACis were more sensitive towards EGFR inhibitors in vitro. This effect was accompanied by an increased AREG and EREG expression. In vivo, an increased sensitivity towards EGFR inhibitors was achieved in LIM1215 cells by treatment with a DNMT inhibitor. Here the effect was accompanied by a reduced methylation within the AREG and EREG intragenic CpGs. Together, the results suggested a new possibility to potentially make EGFR-targeted therapy resistant patients suitable for this therapy by epigenetic compound treatment. In that case AREG as well as EREG might be predictive markers to evaluate the effect of the epigenetic compounds during therapy.

In Anbetracht der enormen Verbesserung der HCV-Therapie durch die Entwicklung hochwirksamer und direkt wirkender Virostatika (DAA) dient diese Studie der Analyse von HCV-Koinfektionen unter den gemeldeten HIV-Neudiagnosen in Deutschland. Zunächst wurde die Eignung zweier kommerzieller HCV Ag/Ab ELISAs, dem Murex (Abbott) und dem Monolisa (Bio-Rad), zum Nachweis von HCV in getrockneten Serumspots (DSS) verglichen. Der Murex-ELISA zeigte sich sensitiver bei Antigen-positiven Plasma-HCV-Serokonversionsproben während der Monolisa eine höhere Sensitivität bei HCV-Antikörper-positiven DSS-Eluaten. Des Weiteren wurde ein Aviditätstest zur Unterscheidung von neuen und bereits länger bestehenden Infektionen bei einem Aviditätsindex Cut-off von 40% und einem Zeitraum von 364 Tagen etabliert. Von den insgesamt 6.097 untersuchten Proben der Jahre 2015-2017 waren 396 HCV-ELISA-reaktiv (6,5%). Von diesen wurden 256 (64,6%) als aktive und 140 (35,4%) als ausgeheilte Infektionen identifiziert. Ein hoher Anteil der HCV-Koinfektionen wurde bei intra-venösen Drogenkonsumenten (77,8%, n=168/216), in der Altersgruppe der 30-39 Jährigen (9%, n=179/1.978) und bei Menschen osteuropäischer Herkunft (38,3%, n=124/324) beobachtet. Im Vergleich zum Jahr 2016 hat sich der Anteil der ausgeheilten Infektionen im Jahr 2017 bei der Gesamtzahl der Patienten (p<0,01) sowie insbesondere bei Personen ausländischer (p<0,01) und osteuropäischer (p<0,05) Herkunft erhöht. Die HCV Subtypen (St)-1a, St-3a und St-1b waren mit 33,9% (n=79/233), 33,5% (n=78/233) und 23,3% (n=52/233) vorherrschend. Der Anteil der St-1a- und St-1b-Proben, deren HCV-Sequenz gegen DAAs resistent ist, war in allen untersuchten Jahren hoch (25%-42,9%). Der beobachtete Anstieg des Anteils der ausgeheilten HCV-Koinfektionen kann auf die DAA-Therapie zurückgeführt werden. Es sind jedoch weitere Anstrengungen erforderlich, damit Gruppen mit weiterhin hoher HCV-Prävalenz von dieser Behandlung profitieren. / In light of the major shift in HCV therapy resulting from the availability of highly potent direct acting antivirals (DAA), this study performed a surveillance of HCV coinfections among reported HIV new diagnoses in Germany. First the suitability of two HCV Ag/Ab ELISAs, Murex (Abbott) and Monolisa (Bio-Rad) for dried serum spots (DSS) was compared. The Murex was more sensitive in antigen positive plasma HCV seroconversion samples while the Monolisa showed a higher sensitivity in HCV antibody positive DSS eluates. Furthermore, an avidity test was established to distinguish between new and already longer existing infections at an avidity index cut-off of 40% and a period of 364 days. Of the total of 6,097 samples examined for the years 2015-2017, 396 were HCV ELISA reactive (6.5%). Of these, 256 (64.6%) were identified as active and 140 (35.4%) as resolved infections. A high proportion of HCV coinfections were observed in intravenous drug users (77.8%, n=168/216), in the age group 30-39 years (9%, n=179/1,978) and in people of Eastern European origin (38.3%, n=124/324). Compared to 2016, the proportion of resolved infections in 2017 has increased in the total number of patients (p<0.01) and especially in people of foreign (p<0.01) and Eastern European (p<0.05) origin. HCV subtypes (St)-1a, St-3a, and St-1b were predominant with 33.9% (n=79/233), 33.5% (n=78/233) and 23.3% (n=52/233), respectively. The proportion of St-1a and St-1b samples whose HCV sequence has resistance to DAAs was high in all diagnoses years (25%-42.9%). The observed increase in the proportion of resolved HCV coinfections can be attributed to DAA therapy. However, further efforts are needed to ensure that groups with continued high HCV prevalence benefit from this treatment.

In der vorliegenden Arbeit wurden modernste Multiplexing-Ansätze der quantitativen Proteomanalyse angewandt, um das neuartige Virus SARS-CoV-2 zu untersuchen, den Erreger der globalen COVID-19 Pandemie, die Ende 2019 begann. Trotz enormer internationaler Anstrengungen zur Erforschung dieser Krankheit sind viele Aspekte der grundlegenden Virusbiologie, Virus-Wirt-Interaktionen und der COVID-19-Pathophysiologie noch immer unbekannt. Dies verhindert die Entwicklung gezielter Behandlungen, insbesondere für COVID-19-Patienten mit schwerem Verlauf. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Infektionsdynamik in lungenähnlichen Zelllinien untersucht. Der Vergleich von SARS-CoV mit SARS-CoV-2-Infektion in Zellen mit niedriger ACE2 Expression ermöglichte es, die Rolle anderer Membranproteine ​​als Virus Eintrittsfaktoren neu zu bewerten. In SARS-CoV-2 infizierten Calu-3-Zellen konnten Reaktionen der Wirtszellen beobachtet werden, die die Interaktion zwischen viralen Proteinen und Proteikinasen der Wirtszelle vermitteln. Im nächsten Teil wurde die angeborene Immunantwort des Wirts auf das Virus untersucht. Primäre, aus Blut isolierte Monozyten, die mit SARS-CoV-2 behandelt wurden, wiesen eine spezifische Protein-Signatur auf, die auf eine Polarisierung der Zellen zu einem profibrischen Makrophagen-Phänotyp hindeutet. Weitere Analysen zeigten, dass dieser Prozess weitgehend unabhängig von bekannten antiviralen Reaktionen und viraler RNA-Sensoren in Monozyten abläuft. Die durch das Virus hervorgerufene Phosphoproteom-Signatur deutet an, dass die profibrotische Polarisierung durch die kombinierte Wechselwirkung von viralen Proteinen und Infektionsnebenprodukten mit Wirtsrezeptoren induziert wurde. Zusammenfassend liefert diese Arbeit einen wertvollen Beitrag zur Aufklärung von Mechanismen, die zu einem schweren COVID-19 Verlauf führen können und hebt dabei die Bedeutung von Proteomanalysen in der Erforschung viraler Erkrankungen hervor. / In this thesis, we used cutting-edge multiplexed quantitative proteomics and phosphoproteomics approaches to study the virus SARS-CoV-2. The newly emerged betacoronavirus is the causative agent of the global pandemic of COVID-19 that began in late 2019. Despite the tremendous research effort in studying this disease, many aspects of the basic viral biology, virus-host interactions and COVID-19 pathophysiology still remain obscure. This prevents the development of targeted treatments, especially for severe COVID-19 patients. In the first part of this thesis, we studied infection dynamics in lung-like cell lines. Comparison between SARS-CoV and SARS-CoV-2 infections in low-ACE2-expressing cells allowed us to re-evaluate the role of other membrane proteins as entry factors. In Calu-3 cells, we could observe host responses mediating the interactions between viral proteins and host kinases. Next, we focused on the innate immune response of the host to the virus. Ex vivo monocytes treated with SARS-CoV-2 exhibited a specific proteomic signature indicating a polarization toward a profibric macrophage phenotype. Further dissection of this response revealed it to be largely independent from the viral RNA sensing and antiviral response cellular mechanisms. Furthermore, the specific phosphoproteomics signature induced by the virus indicated that the profibrotic polarization was induced by the combined interaction between viral proteins and infection byproducts with host receptors. In summary, this thesis shows the power of mass spectrometry based proteomics to study the complex dynamics between viruses and host cells. Furthermore, we uncovered a potential mechanism contributing to the development of severe COVID-19.

Das Schicksal einer differenzierten Zelle wird durch epigenetische Grenzen bestimmt und mittels Schutzmechanismen bewahrt, wodurch die Reprogrammierung in andere Zelltypen verhindert wird. In dieser Studie haben wir ein Chromatin-regulierendes Protein, das konservierte MORF4-Verwandte-Gen (MRG) Protein MRG-1, als Barriere für die Reprogrammierung von Zellen in Caenorhabditis elegans (C. elegans) identifiziert. RNAi gegen MRG-1 ermöglicht es uns Keimzellen mittels Überexpression des Neuronen-induzierenden Transkriptionsfaktors CHE-1 in neuronenartige Zellen umzuwandeln. Mittels ChIP-seq fanden wir heraus, dass MRG-1 unterschiedliche DNA Bindungsstellen in den Keimbahnen und somatischen Geweben von C. elegans aufweist. Wir konnten zeigen, dass MRG-1 besonders stark am Genkörper angereichert ist und sich hauptsächlich auf Genen befindet, welche die aktive Histonmarkierung H3K36me3 tragen. Die Charakterisierung der Protein-Protein-Interaktionspartner von MRG-1 mittels Co-IP/MS ergab, dass MRG-1 mit der Histon-H3K9-Methyltransferase SET-26 und der b-gebundenen N-Acetylglucosamin Transferase OGT-1 zusammenarbeitet, um die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen zu verhindern. Basierend auf RNA-Seq Experimenten in mrg-1-Mutanten und Wildtyp konnten wir weitreichende Veränderungen der Genexpression mit Auswirkung auf Signalwege wie den Notch Signalweg enthüllen, welcher bekanntermaßen die Zelltyp-Reprogrammierung fördern. Mittels Long-Read basiertem RNA-seq in mrg-1-Mutanten und der Integration entsprechender ChIP-seq Daten habe ich die Beteiligung von MRG-1 am prä-mRNA-Spleißen in C. elegans gezeigt, analog zum Säugetierortholog MRG15. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass MRG-1 durch die Regulierung des Chromatins und die Sicherstellung des korrekten Spleißens die Expressionsniveaus kritischer Gene und Signalwege aufrechterhält, um eine ordnungsgemäße Keimbahnentwicklung zu gewährleisten und das Schicksal der Keimzellen zu schützen. / Das Schicksal einer differenzierten Zelle wird durch epigenetische Grenzen bestimmt und mittels Schutzmechanismen bewahrt, wodurch die Reprogrammierung in andere Zelltypen verhindert wird. In dieser Studie haben wir ein Chromatin-regulierendes Protein, das konservierte MORF4-Verwandte-Gen (MRG) Protein MRG-1, als Barriere für die Reprogrammierung von Zellen in Caenorhabditis elegans (C. elegans) identifiziert. RNAi gegen MRG-1 ermöglicht es uns Keimzellen mittels Überexpression des Neuronen-induzierenden Transkriptionsfaktors CHE-1 in neuronenartige Zellen umzuwandeln. Mittels ChIP-seq fanden wir heraus, dass MRG-1 unterschiedliche DNA Bindungsstellen in den Keimbahnen und somatischen Geweben von C. elegans aufweist. Wir konnten zeigen, dass MRG-1 besonders stark am Genkörper angereichert ist und sich hauptsächlich auf Genen befindet, welche die aktive Histonmarkierung H3K36me3 tragen. Die Charakterisierung der Protein-Protein-Interaktionspartner von MRG-1 mittels Co-IP/MS ergab, dass MRG-1 mit der Histon-H3K9-Methyltransferase SET-26 und der b-gebundenen N-Acetylglucosamin Transferase OGT-1 zusammenarbeitet, um die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen zu verhindern. Basierend auf RNA-Seq Experimenten in mrg-1-Mutanten und Wildtyp konnten wir weitreichende Veränderungen der Genexpression mit Auswirkung auf Signalwege wie den Notch Signalweg enthüllen, welcher bekanntermaßen die Zelltyp-Reprogrammierung fördern. Mittels Long-Read basiertem RNA-seq in mrg-1-Mutanten und der Integration entsprechender ChIP-seq Daten habe ich die Beteiligung von MRG-1 am prä-mRNA-Spleißen in C. elegans gezeigt, analog zum Säugetierortholog MRG15. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass MRG-1 durch die Regulierung des Chromatins und die Sicherstellung des korrekten Spleißens die Expressionsniveaus kritischer Gene und Signalwege aufrechterhält, um eine ordnungsgemäße Keimbahnentwicklung zu gewährleisten und das Schicksal der Keimzellen zu schützen.

H-REV107-1 wird in normalen Geweben ubiquitär exprimiert, während die Expression in humanen Mamma-, Ovarial-, und Lungentumoren unterdrückt ist. H-REV107-1 hemmt das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Die Expression und Regulation des H-REV107-1 Gens wurde in verschiedenen, humanen Zelllinien untersucht. In Tumor Zelllinien wird die H-REV107-1 Expression durch IFNgamma induziert Eine Korrelation der H-REV107-1 und der IRF1 Expression nach Induktion mit IFNgamma wurde gezeigt. H-rev107-1 konnte nach konditionaler IRF1 Expression, Proteinsynthese-unabhängig, nachgewiesen werden und ist ein direktes Zielgen von IRF1. Die H-rev107-1 Expression ließ sich durch Unterdrückung des MEK/ERK Signalwegs mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 aktivieren. Dies bedeutet, dass H-REV107-1 durch mindestens zwei verschiedene Signalwege, IFNgamma und MEK/ERK, reguliert wird. Der in vitro amplifizierte H-REV107-1 Promoter enthält keine TATA-Box, sondern ein Initiator Element sowie, in dem für eine TATA-Box definierten Abstand, eine ATF2 Bindungsstelle. Die Inkubation von transient transfizierten Zellen mit TNF alpha, cAMP und IFN gamma steigerte die Luciferase Aktivität. Mit Hilfe von Deletions- und Mutationskonstrukten wurden die regulatorischen Bereiche des Promoters bestimmt. Eine Mutation der cRel-Bindungsstelle, potentiell über NFkappaB reguliert, resultierte in einer Luciferase Aktivität von nur 9% des Wildtyp Promoters. Die Mutation der CREB/ATF2 Bindungsstelle reduzierte die Luciferase Aktivität auf 37%. Die Ko-Transfektion eines NFkappaB Suppressor reduzierte die Luciferase Aktivität um 53%. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NFkappaB und ATF2 die H-REV107-1 Expression positiv regulieren. In einem EMSA wurde die Bindung von ATF2 an die CREB/ATF-2 Bindungsstelle gezeigt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass H-REV107-1 durch eine IFNgamma induzierte, möglicherweise PKR vermittelte, Signalkette von den Faktoren IRF1 und ATF2 direkt, sowie von NFkappaB indirekt, reguliert wird. / The H-REV107-1 class II tumor suppressor gene is ubiquitously expressed in normal tissues and down regulated in human breast, ovarian and lung tumors. H-REV107-1 has the capacity to suppress growth of tumor cells in vitro and in vivo. H-REV107-1 is up regulated after treatment with IFN gamma. A NIH3T3 cell line harboring an estrogen inducible IRF.1/hER fusion protein showed a protein synthesis independent up regulation of H-rev107-1 expression after induction of IRF-1. H-rev107-1 is a direct target of IRF-1. Inhibition of the MEK/ERK pathway, using the MEK1 inhibitor PD 98059, leads to a restored expression of H-rev107-1. Therefore, H-REV107-1 can be a target of the MEK/ERK-pathway. Thus, H-REV107-1 is regulated by at least two different pathways. To understand the regulatory mechanisms of the expression of the H-REV107-1 gene, the putative promoter region was analyzed in silico. The sequence was amplified and cloned. Induction of the promoter constructs with TNF alpha, cAMP and IFN gamma increased the luciferase activity. Several deletions constructs and constructs with putative transcription factor binding sites mutated were used to narrow down the important regulatory elements of the promoter. The mutations of a cRel binding site and a CREB/ATF-2 binding site decreased the luciferase activity by 91% and 63%, respectively. Co transfection of the full length promoter construct with a repressor of NFkappaB activation, reduced the luciferase activity to 47%. As a result of the investigation H-REV107-1 is directly regulated by IRF-1 and probably indirectly regulated by NFkappaB and the MEK/ERK signaling pathway. In an Electro Mobility Shift Assay (EMSA), the binding of ATF-2 to the CREB oligonucleotid was demonstrated by the use of a specific antibody. The ATF.2 binding site in the posititon –30 bp - 23 bp of the human, TATA-less H-REV107-1 promoter replaces the TATA-like element, which can be found in the H-rev107-1 promoter of rat and mouse.

Phosphorylierung modulieren. Obwohl heute bereits Tausende von Phosphorylierungsstellen annotiert sind, sind entsprechende funktionelle Informationen begrenzt. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es keine Hochdurchsatzmethoden zur Erforschung der Funktion einer Phosphorylierungsstelle gibt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, habe ich eine auf Shotgun-Proteomik basierende Strategie zur Messung der RNA-Bindungsaktivität von RBPs und ihren phosphorylierten Proteoformen entwickelt, die 'quantitative RNA-Interactome Capture (qRIC)' genannt wird. QRIC quantifiziert die Pull-Down-Effizienz von RBPs, die mit Oligo(dT)-Magnetbeads isoliert werden. Diese Effizienz korreliert mit der Anzahl der RNA-Bindungsstellen und der Spezifität der Motivbindung, und spiegelt so die RNA-Bindung in vivo wieder. In einer Gegenüberstellung der Pull-Down-Effizienz verschiedener Proteoformen in unbehandelten Zellen, habe ich qRIC als unvoreingenommenes Screening von regulatorischen Phosphorylierungsstellen in RBPs eingesetzt. Für jede einzelne Phosphorylierungsstelle wurde ein Delta-Effizienzwert berechnet, der den Einfluss auf die RNA-Bindung in vivo reflektiert. Die Effizienzunterschiede spiegelten das erwartete Verhalten von RBPs während der Phasentrennung von membranlosen Organellen und die Ladungsabstoßung zwischen Phosphorylierungsstellen und Nukleotiden bei physiologischem pH-Wert wider. Mithilfe des Delta-Effizienzwertes identifizierte ich mehrere bereits bekannte regulatorische Phosphorylierungsstellen in SF3B1, UPF1 und ELAVL1, sowie neue, bisher unbekannte und möglicherweise regulatorische Phosphorylierungsstellen in SERBP1, LARP1 und RBM20. Phosphomimetische Mutationsvarianten dieser Phosphorylierungsstellen wurden analysiert, um den molekularen Einfluss auf die Regulation der RBP-Funktion zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung bestimmter Stellen im Spleißregulator RBM20 dessen nukleo-zytoplasmatische Lokalisierung, die Assoziation mit zytosolischen RNA-Granula und die Spleißfunktion beeinflusst. Diese Erkenntnisse könnten sich beispielsweise auf die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Patienten mit dysfunktionalen RBM20-Mutationen auswirken, die zu dilatativer Kardiomyopathie führen. QRIC kann als Hochdurchsatzverfahren dazu beitragen, unser Wissen über die Regulierung von Protein-RNA-Interaktionen durch Phosphorylierung zu erweitern. / Post-transcriptional regulation of gene expression is fundamental in health and disease. RNA-binding proteins (RBPs) directly bind and govern the fate of RNAs in cells. At the same time, cell signaling cascades control RBP functions by modulating their physicochemical properties through post-translational modifications, like phosphorylation. Although thousands of phosphorylation sites have been annotated, functional information is limited. This, in part, is due to the lack of high-throughput methods that measure function. To tackle this challenge I developed a shotgun proteomics-based strategy for measuring the RNA-binding activity of RBPs and their phosphorylated proteoforms, named quantitative RNA-interactome capture (qRIC). In qRIC, pull-down efficiency of RBPs isolation with oligo(dT) magnetic beads is quantified in cells at steady state and correlates with the number of RNA-binding sites and motif binding specificity, reflecting a link to RNA-binding in vivo. By contrasting pull-down efficiency of different proteoforms in the cells, I applied qRIC as an unbiased screening of regulatory phosphorylation sites in RBPs affecting pull-down efficiency. A delta efficiency score was calculated for each individual phosphorylation site to denote its influence on RNA-binding in vivo. Efficiency differences globally reflected the expected behavior of RBPs during phase separation of membraneless organelles and charge repulsion between phosphorylation sites and nucleotides in physiological pH. Using the delta efficiency score, I identified several previously known regulatory phosphorylation sites in SF3B1, UPF1 and ELAVL1, plus novel candidate regulatory sites in SERBP1, LARP1 and RBM20. Phosphomimetic mutant variants of these sites were analysed to investigate the molecular mechanism of regulation. Importantly, I show that phosphorylation of candidate sites in the splicing regulator RBM20 affects its nucleo-cytoplasmic localization, association with cytosolic RNA granules, and splicing function. These findings could have implications for the development of novel treatments based on kinase activity for patients with dysfunctional RBM20 mutations leading to congenital dilated cardiomyopathy. I anticipate that qRIC, as a high throughput approach, will help to expand our knowledge about the regulation of protein-RNA interactions and their regulation by phosphorylation.

Die physische Nähe zwischen Genpromotoren und regulatorischen Elementen (Enhancer) spielt eine entscheidene Rolle in der Genexpression, um präzise räumliche und zeitliche Genexpressionmuster während der Embryogenese zu erzeugen. Abhängig von der Aktivität der Zielgene lassen sich zwei Typen von Interaktionen unterscheiden. Zum einen führen dynamische Enhancer-Promoter Interaktionen unmittelbar zur Genexpression, wohingegen in anderen Fällen stabile Interaktionen bereits vor der Genexpression existieren. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle der stabilen Interaktion zwischen dem Shh Gen und dem Extremitätenenhancer, der ZRS, während der Embryonalentwicklung in der Maus untersucht. Der Verlust der konstitutiven Transkription, die den ZRS Enhancer abdeckt, führte zu einer Verschiebung innerhalb der Shh-ZRS Kontakte und einer moderaten Reduzierung der Shh Genexpression. Im Gegensatz dazu führte die Mutation von CTCF Bindungsstellen, die den ZRS Enhancer umgeben, zu einem Verlust der stabilen Shh-ZRS Interaktion und einem 50%igen Rückgang in der Shh Genexpression. Dieser Expressionsverlust hatte jedoch keine phänotypischen Auswirkungen in den Deletionsmutanten, was darauf hindeutet, dass die restliche Genaktivität und Enhancer-Promotor-Interaktion über einen zusätzlichen, CTCF-unabhängigen Mechanismus erfolgt. Erst die kombinierte Deletion von CTCF-Bindungsmotiven und einem hypomorphen ZRS-Allel führte zu einem fast vollständigen Expressionsverlust von Shh und damit zu einem schweren Funktionsverlust und Gliedmaßen-Agenesie. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die stabile Chromatinstruktur am Shh Locus von mehreren Komponenten getragen wird und die physicalische Interaktion zwischen Enhancern und Promotern für eine robuste Transkription während der Embryonalentwicklung benötigt werden. / Long-range gene regulation involves physical proximity between enhancers and promoters to generate precise patterns of gene expression in space and time. However, in some cases proximity coincides with gene activation, whereas in others preformed topologies already exist before activation. In this study, we investigate the preformed configuration underlying the regulation of the Shh gene by its unique limb enhancer, the ZRS, in vivo during mouse development. Abrogating the constitutive transcription covering the ZRS region led to a shift within the Shh-ZRS contacts and a moderate reduction in Shh transcription. Deletion of the CTCF binding sites around the ZRS resulted in a loss of the Shh-ZRS preformed interaction and a 50% decrease in Shh expression but no phenotype, suggesting an additional, CTCF-independent mechanism of promoter-enhancer communication. This residual activity, however, was diminished by combining the loss of CTCF binding with a hypomorphic ZRS allele resulting in severe Shh loss-of-function and digit agenesis. Our results indicate that the preformed chromatin structure of the Shh locus is sustained by multiple components and acts to reinforce enhancer-promoter communication for robust transcription.

Transkriptionsfaktoren (TFs) empfangen Signale in Signaltransduktionskaskaden und übersetzen diese in eine zelluläre Antwort. Dadurch ermöglichen sie es Zellen, Organen und Organismen sich an verändernde Umgebungsbedingungen anzupassen. In früheren Studien wurde gezeigt, dass viele TFs nach Aktivierung Oszillationen im Zellkern aufweisen. Ein Beispiel dafür ist p53. Als zentrales Protein im Rahmen der zellulären Stressantwort reguliert es nach DNA Schaden die Expression hunderter Zielgene die das Zellschicksal steuern. Anomalien in der Aktivität von p53 stehen im Zusammenhang mit schwerwiegenden Erkrankungen wie der Krebsentstehung. Die Dynamik der Akkumulation von p53 im Zellkern ist abhängig von der Art des DNA Schadens und korreliert mit der resultierenden zellulären Antwort. Obwohl dieser Zusammenhang mehrfach gezeigt wurde, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen jedoch weitgehend unerforscht. Mit der vorliegenden Arbeit soll ein Beitrag zum Verständnis dazu geleistet werden, wie p53 Oszillationen im Zellkern die Transkription von Zielgenen auf Einzelzellebene modulieren. Dazu wurden sieben Zielgene ausgewählt und mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz in situ Hybridisierung und mathematischer Analyse charakterisiert. Es werden Ergebnisse der quantitativen, zeitaufgelösten mRNA Expression und der bursting Aktivität von Zielgenpromotoren mit Einzelzell- und Einzelmolekülauflösung dargestellt. Diese Analyse weist darauf hin, dass die Aktivierung von p53 nach DNA Doppelstrangbrüchen primär die Frequenz des stochastischen bursting der untersuchten Zielgene reguliert. Diese können anhand ihrer Promotoraktivität in drei Archetypen eingeteilt werden: anhaltend, transient und pulsierend, die jedoch nicht ausschließlich durch veränderte p53 Menge im Zellkern erklärt werden können. Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Veränderungen im Acetylierungszustand der C-terminalen Lysinreste von p53 entscheidend für diese Gen-spezifische Regulation sind. / Transcription factors (TFs) are receiver and compiler of cell signaling, transmitting incoming inputs into cellular responses that enable cells, organs and organisms to respond and adapt to a changing environment. In the past, it has been shown that many TFs exhibit oscillations of nuclear abundance over time when activated. One of these TFs is the tumor suppressor p53, a central hub in the signaling network regulating the cellular stress response, controlling cell fate decisions by changing the expression of hundreds of target genes. Aberrations in p53’s activity are related to severe human malignancies such as cancer. The dynamics of its nuclear accumulation are stimulus dependent and enable the p53 pathway to mediate distinct responses to cellular stress. However, the molecular mechanisms translating such dynamics to altered gene expression remain elusive. In this thesis, I analyzed how oscillations of p53 affect the transcriptional regulation of target genes in single-cells and at individual promoters. I chose a panel of seven targets and employed a combinatorial approach of single-molecule fluorescence in-situ hybridization and mathematical analysis. I present quantitative, time-resolved measurements of target gene mRNA expression and transcriptional bursting activity with single-cell and single-molecule resolution. The resulting data show characteristic principles how p53 nuclear accumulation increases transcriptional bursting upon stimulation and reveal gene-specific modulations. P53 target promoters are regulated by changing the fraction of active promoters, indicating burst frequency regulation. Based on this, genes can be grouped along three archetypes of promoter activity: sustained, transient and pulsatile. These archetypes cannot solely be explained by nuclear p53 levels or promoter binding of total p53. Instead, I provide evidence that the time-varying acetylation state of p53’s C-terminal lysine residues is critical for this gene-specific regulation.

Die 3D Struktur von Chromosomen im Zellkern reguliert verschiedene Funktionen in der Zelle und Fehler in der 3D Faltung des Genoms können pathogen sein. 3D Genomfaltung kann mit verschiedenen Methoden untersucht werden um Chromatinkontakte, sowie die Position von DNA in Relation zu sub-nuklearen Bereichen oder der Kernmembran zu detektieren. Hier verwende ich GAM und Hi-C um zwei Aspekte der 3D Genomtopologie zu untersuchen, die Allelspezifität von Chromatinkontakten und Kontakte zwischen Chromosomen. Ich untersuche allelspezifische Kontakte in murinen embryonalen Stammzellen und Interaktionen zwischen Chromosomen im Zusammenhang mit Autismus Spektrum Störung auf ihre Relevanz in der Regulation von Genen. Zur allelspezifischen Detektion von Chromatinkontakten generierte ich einen GAM Datensatz der tausende von nuklearen Cryodünnschnitten enthält. Die Generierung dieser Daten beinhaltete die Entwicklung einer verbesserten Version der GAM Methode zur Produktion von großen Datensätzen in Hochdurchsatz. Hier zeige ich, dass GAM effizient Haplotyp-spezifische Chromatinkontakte bestimmen kann. Erste Untersuchungen von allelspezifischer 3D Genomtopologie zeigten weitreichende Unterschiede zwischen den Allelen, welche „A/B compartments“ und spezifische Chromatinkontakte beinhalten, wie zum Beispiel am Imprinting Locus H19/Igf2. Zur Untersuchung von interchromosomalen Kontakten detektierte ich Chromatinkontakte mit Hi-C im Kontext einer genomischen Deletion am humanen 16p11.2 Locus, assoziiert mit Autismus Spektrum Störung. Ich zeige hier, dass die Deletion am 16p11.2 Locus zu der Reorganisation von spezifischen interchromosomalen Kontakten zwischen 16p11.2 und Chromosom 18 führt, und stelle eine Hypothese auf wie diese interchromosomalen Kontakte zur ektopischen Aktivierung von Pcdh Genen auf Chromosom 18 führen. Protocadherins haben wichtige Funktionen in neuronaler Konnektivität, ein Prozess dessen Störung zur Manifestierung von Autismus Spektrum Störung beitragen könnte. / The 3D folding of interphase chromosomes inside the nucleus regulates important nuclear functions and once disrupted can lead to the manifestation of disease. Different techniques can be used to map 3D genome folding and detect pairwise and multiway interactions of the genome, or map the positions of DNA with respect to subnuclear compartments or the nuclear lamina. Here, I use GAM and Hi-C to explore two aspects of 3D genome topology, the allele specificity of chromatin contacts and long-range contacts between chromosomes, respectively. I detect specific contacts of the parental alleles in mouse embryonic stem cells and interactions between chromosomes in the context of congenital disease and study them with regard to their functionality and importance in mammalian gene regulation. For detecting chromatin contacts with allele specificity, I produced a GAM dataset containing thousands of nuclear slices. The collection of this data was accompanied by the development of a high-throughput version of GAM that allows the generation of large datasets. I show that GAM can determine haplotype-specific chromatin contacts with high efficiencies. First explorations of allele-specific chromatin topologies reveal many differences between the parental alleles, including allele-specific compartments A and B, and specific chromatin contacts, for example at the imprinted H19/Igf2 locus. For the exploration of inter-chromosomal contacts in disease, I mapped chromatin interactions with Hi-C in the context of a CNV at the human 16p11.2 locus, associated with autism spectrum disorders. Here, I show that the deletion at the 16p11.2 locus results in the rearrangement of specific inter-chromosomal contacts between the 16p11.2 locus and chromosome 18 and propose a role for these inter-chromosomal contact changes in the upregulation of the nearby Pcdhb gene cluster, which comprises protocadherin genes with important functions in neuronal connectivity during development.