Die pädiatrische Akute Lymphatische Leukämie ist heutzutage gut behandelbar. Trotzdem ist die Prognose im Falle eines Rezidives weiterhin schlecht. Die häufigsten extramedullären Orte für Rezidive sind das zentrale Nervensystem und der Hoden. Um ein Rezidiv im Hoden zu verhindern, ist es nötig die zellulären und molekularen Vorgänge zu verstehen. Dafür wurde Patientenmaterial auf seine Expression bestimmter Oberflächenmoleküle analysiert. Verglichen wurden Proben von Patienten mit verschiedenen Rezidiv-Arten. Um die funktionellen Aspekte der Hodenphysiologie auf die Leukämiezellmigration und -lokalisation zu untersuchen wurde ein PDX-ALL Mausmodel mit Hodenbeteiligung etabliert. Um potenziell involvierte Chemokin-Chemokinrezeptor-Achsen zu identifizieren, wurden 55 Knochenmarksproben von Patienten untersucht. Die Expressionsmuster der Rezeptoren wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Es wurde festgestellt, dass CXCR4 meistens sehr hoch exprimiert wird. Deshalb wurde anschließend der Einfluss der CXCR4-CXCL12 Achse in in vitro Versuchen mit Hilfe primären Hodenstromas untersucht. Um verschiedene Subpopulationen zu untersuchen, wurde die Isolation von Hodenmakrophagen, Sertoli Zellen und Peritubulären Zellen aus der Maus etabliert und ihr Einfluss auf ALL Zellen untersucht. Es wurde festgestellt, dass Hodenmakrophagen bei Tumorkontakt ihren Phänotyp zugunsten einer tumorfördernden Subpopulation verändern. Zu guter Letzt wurde ein adaptives PDX-ALL Mausmodel mit Hodenbeteiligung entwickelt. Dabei wurden die Hoden von vorpubertären Mäusen bevorzugt infiltriert. Die Bedeutung der CXCR4-CXCL12 Achse für die Hodeninfiltration wurde in einem in vivo Versuch validiert. Während Knochenmark und Milz nach einer anti-CXCR4 Gabe kleine ALL Populationen aufwiesen, war der Hoden komplett Tumor-frei. Das Model kann für Versuche genutzt werden, um weitere Signalwege zu identifizieren, welche in die Hoden gerichtete Migration und das Überleben der Zellen involviert sind. / Advancing therapy strategies led to event-free-survival increase of paediatric acute lymphoblastic leukaemia (ALL). Relapses that occur are often drug resistant and come with poor prognosis. Extramedullary sites for relapse are the central nervous system (CNS) and the testis. To prevent testicular relapse, factors responsible for the infiltration and survival need to be discovered. Primary patient material was analysed with regard to differential expression of surface molecules on leukemic cells from BM. To analyse functional aspects of testis physiology on leukemic cell migration and localisation an adoptive PDX-ALL mouse model with testicular involvement was established. To identify potential chemokine-chemokine receptor axes responsible for the leukaemia cell migration towards the testis, a characterization of 55 patient BM samples was performed. The expression pattern of chemokine receptors on BM derived leukaemia cells was compared by flow cytometry. CXCR4 was identified to be highly expressed on patients cells, regardless of the subclass of relapse. Relevance of the CXCR4-CXCL12 axis was studied in vitro. Primary testicular stroma cultures were available, which provided a useful tool to examine testis directed migration. Isolation of testicular macrophages, Sertoli cells and peritubular cells was established and their impact on ALL cell survival was analysed. The macrophages were found to alter their phenotype upon ALL cell contact towards a tumour favourable subtype. Most importantly, a murine adoptive patient-derived xenograft (PDX)-ALL cell transfer model with testicular involvement was established. Testes of pre-puberty mice were preferentially infiltrated. Blocking CXCR4 with an antibody validated relevance of the CXCR4-CXCL12 signalling axis. The testis showed no infiltration in anti-CXCR4 treated animals. The mouse model will be useful to identify and validate further signalling pathways, participating in testis directed migration and survival.

Bakterielle Wirte wie Escherichia coli dienen der Produktion industrieller rekombinanter Proteine. Dieser Prozess verursacht systemischen Stress und führt zu umfangreichen Veränderungen in mRNA- und Proteinexpression. In meiner Arbeit analysiere ich Regulationsmechanismen der zellulären Reaktion auf diesen Stress. Zudem untersuche ich die zelluläre Ressourcenallokation mittels eines stationären Ganzzellmodells von E. coli, basierend auf der Resource Balance Analysis. Das Modell berücksichtigt Kosten zellulärer Prozesse und Einschränkungen wie Energie, Effizienz und Raum. Es unterstützt die Experimentplanung in der Bioproduktion. Weiterhin habe ich an der Entwicklung von RBApy mitgewirkt, einer Software zur Erstellung und Simulation von RBA-Modellen. Schließlich entwickle ich ein Modell zur Untersuchung der Regulation von Stressreaktionen durch die Tendenz der Zelle, wachstumsoptimale Ressourcenstrategien anzuwenden. Das Modell berücksichtigt zelluläre Beschränkungen und zeigt, dass die erhaltene Stressreaktion der experimentell ermittelten Reaktion ähnelt. Die Integration von Ressourcenzuteilung in Zellmodelle ermöglicht Einsichten in regulatorische Ereignisse und Anpassungen während der Bioproduktion, was zur Optimierung der rekombinanten Proteinexpression in Escherichia coli beiträgt. / Bacterial hosts such as Escherichia coli are used for the production of industrial recombinant proteins. This process causes systemic stress and leads to extensive changes in mRNA and protein expression. In my work, I analyze regulatory mechanisms of the cellular response to this stress. In addition, I investigate cellular resource allocation using a steady-state whole-cell model of E. coli based on resource balance analysis. The model accounts for costs of cellular processes and constraints such as energy, efficiency, and space. It supports experiment design in bioproduction. Furthermore, I contributed to the development of RBApy, a software to create and simulate RBA models. Finally, I developed a model to study the regulation of stress responses by the tendency of the cell to adopt growth-optimal resource strategies. The model accounts for cellular constraints and shows that the obtained stress response resembles the experimentally determined response. Integrating resource allocation into cell models provides insights into regulatory events and adaptations during bioproduction, which contributes to the optimization of recombinant protein expression in Escherichia coli.

Mikroskopaufnahmen kompletter Organismen und ihrer Entwicklung ermöglichen die Erforschung ganzer Organismen oder Systeme und erzeugen Datensätze im Terabyte-Bereich. Solche großen Datensätze erfordern die Entwicklung von Computer-Vision-Tools, um Aufgaben wie Erkennung, Segmentierung, Klassifizierung und Registrierung durchzuführen. Es ist wünschenswert, Computer-Vision-Tools zu entwickeln, die nur eine minimale Menge an manuell annotierten Trainingsdaten benötigen. Ich demonstriere derartige Anwendungen in drei Projekte. Zunächst stelle ich ein Tool zur automatischen Registrierung von Drosophila-Flügeln (verschiedener Spezies) unter Verwendung von Landmarkenerkennung vor, das für die Untersuchung der Funktionsweise von Enhancern eingesetzt wird. Ich vergleiche die Leistung eines Shape-Model-Ansatzes mit der eines kleinen neuronalen Netz bei der Verfügbarkeit von nur 20 Trainingsbeispiele. Beide Methoden schneiden gut ab und ermöglichen eine präzise Registrierung von Tausenden von Flügeln. Das zweite Projekt ist ein hochauflösendes Zellkernmodell des C. elegans, das aus einem nanometeraufgelösten Elektronenmikroskopiedatensatz einer ganzen Dauerlarve erstellt wird. Diese Arbeit ist der erste Atlas der Dauerdiapause von C. elegans, der jemals erstellt wurde, und enthüllt die Anzahl der Zellkerne in diesem Stadium. Schließlich stelle ich eine Bildanalysepipeline vor, an der ich zusammen mit Laura Breimann und anderen gearbeitet habe. Die Pipeline umfasst die Punkterkennung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH), die Segmentierung von Objekten und die Vorhersage des Embryonalstadiums. Mit diesen drei Beispielen demonstriere ich sowohl generische Ansätze zur computergestützten Modellierung von Modellorganismen als auch maßgeschneiderte Lösungen für spezifische Probleme und die Verschiebung des Feldes in Richtung Deep-Learning. / Microscopy images of entire organisms and their development allows research in whole organisms or systems, producing terabyte scale datasets. Such big datasets require the development of computer vision tools to perform tasks such as detection, segmentation, classification, and registration. It is desirable to develop computer vision tools that require minimal manually annotated training data. I demonstrate such applications in three projects. First, I present a tool for automatic Drosophila wing (of various species) registration using landmark detection, for its application in studying enhancer function. I compare the performance of a shape model technique to a small CNN requiring only 20 training examples. Both methods perform well, and enable precise registration of thousands of wings. The second project is a high resolution nucleus model of the C. elegans, constructed from a nanometer-resolved electron microscopy dataset of an entire dauer larva. The nucleus model is constructed using a classical dynamic programing approach as well as a CNN approach. The resulting model is accessible via a web-based (CATMAID) open source and open access resource for the community. I also developed a CATMAID plugin for the annotation of segmentation objects (here, nucleus identity). This work is the first atlas of the C. elegans dauer diapause ever created and unveils the number of nuclei at that stage. Lastly, I detail an image analysis pipeline I collaborated on with Laura Breimann and others. The pipeline involves single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) spot detection, object segmentation, and embryo stage prediction. The pipeline is used to study the dynamics of X specific transcriptional repression by condensin in the C. elegans embryo. With these three examples, I demonstrate both generic approaches to computational modeling of model organisms, as well as bespoke solutions to specific problems, and the shift in the field towards deep learning.

Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich den Einfluss von Seeentstehung und fischereilicher Bewirtschaftung auf Artenreichtum und Zusammensetzung der Fischgemeinschaften in kleinen Seen untersucht. Dafür habe ich fischereilich ungenutzte Naturseen als Referenz herangezogen und deren Fischgemeinschaft mit der von unbewirtschafteten Baggerseen, sowie fischereilich genutzten Baggerseen und Naturseen verglichen. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich die Mechanismen der Totholzrekrutierung in Baggerseen untersucht und die Wichtigkeit von Totholz und anderen Litoralstrukturen im Vergleich zu den klassischen Seenvariablen Nährstoffgehalt und Seemorphologie auf die Fischabundanz im Litoral analysiert. Des Weiteren habe ich die Habitat-spezifischen Effekte auf die artspezifische, litorale Fischabundanz und die Effekte von zusätzlich eingebrachten Totholzbündeln auf die Abundanz typischer Fischarten in Baggerseen analysiert. Ich habe herausgefunden, dass fischereiliche Bewirtschaftung die Anzahl der Fischarten in Bagger- und Naturseen erhöht ohne die Zusammensetzung der Fischgemeinschaft im Vergleich zu fischereilich ungenutzten Naturseen signifikant zu verändern. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die Fischgemeinschaft in fischereilich ungenutzten Baggerseen durch das Fehlen von typischen Seefischarten und eine hohe Variabilität in der Zusammensetzung zwischen den Gewässern. Ich konnte zeigen, dass die litorale Totholzmenge in Baggerseen durch die Baumdichte am Ufer in Kombination mit der Windrichtung, durch fischereiliche Bewirtschaftung in Interaktion mit der Uferneigung und das Alter der Gewässer getrieben wird und entsprechend in jungen Baggerseen niedriger ist als in alten Naturseen. Ich fand heraus, dass Litoralstrukturen, wie Totholz, wertvolle Lebensräume darstellen, wichtige Deskriptoren der art-spezifischen, litoralen Fischabundanz sind und die Fischabundanz grundsätzlich mit der Strukturmenge ansteigt. / In the first part of my thesis, I studied the effects of lake genesis and fisheries management on fish species richness and community composition in small lakes. I used fish communities in unmanaged natural lakes as reference and compared them to unmanaged gravel pit lakes as well as managed gravel pit and natural lakes. In the second part, I investigated the recruitment of littoral deadwood in gravel pit lakes and analysed the importance of deadwood and other littoral structures on littoral fish abundance in gravel pit lakes compared to the lake environmental variables such as nutrient level and lake morphology. I further analysed habitat-specific effects on species-specific littoral fish abundance and focussed explicitly on the effects of deadwood bundles implemented in the littoral zone. I found fisheries management to increase the number of fish species in gravel pit and natural lakes, but not leading to different fish community compositions compared to unmanaged natural lakes. By contrast, unmanaged gravel pit lakes were characterized by a lack of typical lake fish species and a high variation in fish community composition among lakes (β-diversity). I detected littoral deadwood densities in gravel pit lakes to be mainly driven by lake age, riparian tree density in interaction with wind direction and littoral slope in angler-managed lakes, with lowest deadwood densities in shallow areas of angler-managed lakes. Furthermore, deadwood densities were lower in young gravel pit lakes compared to old natural lakes. I detected littoral structures, such as littoral deadwood, as appropriate habitats and important descriptors of the species-specific, littoral fish abundance in gravel pit lakes with generally positive effects of structure extension on fish abundance. Littoral habitat characteristics were mostly of similar, or even higher, importance for fish abundance compared to lake environmental factors.

Trotz der breiten Anwendung zielgerichteter Therapien und Immuncheckpoint-Inhibitoren, liegt die 5-Jahres-Überlebensrate beim metastasierten klarzelligen Nierenkarzinom (ccRCC) unter 15%. Um den Therapieerfolg für Patienten zu verbessern, werden neue Modelle benötigt, die die Tumorheterogenität rekapitulieren und eine personalisierte Therapieentwicklung ermöglichen. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit habe ich Organoidkulturen direkt aus Patiententumoren und sortierten Krebsstammzellen (CSCs) etabliert und diese Organoide im Detail charakterisiert. Die Rolle von WNT und NOTCH, die zuvor in ccRCC CSCs bestimmt wurde, wurde in Organoiden bestätigt und konnte mit Hilfe von molekularen Inhibitoren als therapeutische Schwachstelle ausgenutzt werden. Diese Ergebnisse heben das Potenzial von Patienten-abgeleiteten Organoiden (PDOs) für die personalisierte Medizin und das Potenzial von WNT und NOTCH Inhibierung in der ccRCC Behandlung hervor. PDOs stellen Werkzeuge für die personalisierte Medizin dar, geben jedoch wenig Einblick in die frühen Stufen der Tumorentstehung. Deshalb habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation VHL, PBRM1 und SETD2 – die drei am häufigsten mutierten Gene in ccRCC – mit einer induzierbaren CRISPR-Cas9 Strategie in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Nierenorganoiden targetiert. Ich differenzierte iPSCs in nierenspezifische Zelltypen aus sowohl metanephrischem Mesenchym als auch Ureterknospen-Epithelium. Knockout von VHL, PBRM1 und SETD2 führte zur Hochregulation von Hypoxie-induzierbaren Genen in Organoiden und Knockout Effekte konnten durch längere Kultivierungszeiten und Zellselektion via FACS verstärkt werden. Obwohl ccRCC-spezifische Signalwege aktiviert wurden, wurde kein Wachstumsvorteil der transformierten Zellen beobachtet. Dennoch stellen diese Organoide ein einzigartiges Modell dar, das auf andere Nephropathien angewendet werden könnte, um die Nieren- und Nierenkrebsforschung weiter voranzutreiben. / Despite the widespread application of targeted therapies and immune checkpoint inhibitors, the five-year survival rate for metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is below 15%, as unpredictable progression, therapy resistance, and tumor relapse occur. In order to improve patient outcome, novel models are needed that recapitulate tumor heterogeneity and allow for a more personalized therapy development. In the first part of my PhD thesis, I established organoid cultures directly from patient tumors and sorted cancer stem cells (CSCs) and I characterized these organoids thoroughly. The roles of WNT and NOTCH, which were previously determined in ccRCC CSCs, were confirmed in organoid cultures and could be exploited as a therapeutic weakness via small molecule inhibition. These results highlight the potential of patient-derived organoids (PDOs) for personalized therapy and further the potential of WNT and NOTCH inhibition for ccRCC treatment. PDOs present suitable tools for personalized medicine, but provide little insight into early stages of tumorigenesis. Therefore, in the second part of my thesis, I targeted VHL, PBRM1, and SETD2 – the three most frequently mutated genes in ccRCC – using an inducible CRISPR-Cas9 genome editing strategy in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived kidney organoids. I used a previously published protocol to differentiate iPSCs into kidney-specific cells originating from both metanephric mesenchyme and ureteric bud epithelium. Knockout of VHL, PBRM1, and SETD2 led to the upregulation of hypoxia-inducible genes in organoids and knockout effects could be enhanced by longer cultivation times and cell selection through FACS. Although ccRCC-specific signaling pathways were activated, a growth advantage of transformed cells was not observed. Nevertheless, these organoids present a unique model that could be applied to other nephropathies to further advance kidney and kidney cancer research.

Als Reaktion auf DNA-Schäden aktivieren Zellen den NF-κB-Signalweg, der die apoptotischen Reaktionen reguliert. Die Signalwege, die die zytoplasmatischen NF-κB-Dimere als Reaktion auf eine breite Palette von Immun- und Entzündungssignalen aktivieren, sind umfassend untersucht worden; die molekularen Mechanismen, die die Kern-DNA mit der zytoplasmatischen Aktivierung von NF-κB verbinden, sind jedoch relativ wenig bekannt. Hier haben wir mithilfe genomweiter siRNA-Screens systematisch Regulatoren und wesentliche Komponenten identifiziert, die für die durch DNA-Schäden ausgelöste Aktivierung des NF-κB-Signalwegs erforderlich sind. Von den identifizierten Komponenten konnten wir nachweisen, dass TSG101 die NF-κB-Aktivierung durch DNA-Schäden reguliert. Wir konnten zeigen, dass TSG101 mit PARP1 interagiert und dessen katalytische Aktivität kontrolliert. Die Ausrichtung auf TSG101 führt dazu, dass PARP1 in DNA-Läsionen gefangen wird und die durch DNA-Schäden ausgelöste NF-κB-Aktivierung vermindert wird. In Abwesenheit von TSG101 fehlen den Zellen PAR-abhängige zelluläre Reaktionen und sie sind für die durch DNA-Schäden ausgelöste Apoptose sensibilisiert. Die signalinduzierte Verarbeitung von p100 ist ein wesentlicher Schritt für die Aktivierung des nicht-kanonischen NF-κB-Wegs. Trotz seiner Bedeutung für die Immunantwort, die Entwicklung und verschiedene bösartige Erkrankungen wurden die Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems, die die Verarbeitung von p100 regulieren, nie mit endogenen Systemen analysiert. In dieser Studie haben wir mit Hilfe eines CRISPR-Cas9-basierten Knock-out-Screening-Systems nicht-redundante E3-Ligasen identifiziert, die für die signalinduzierte p100-Verarbeitung erforderlich sind. Außerdem haben wir das TWEAK-induzierte Ubiquitinom mittels Massenspektrometrie charakterisiert. / In response to DNA damage, cells activate the NF-κB pathway that regulates the apoptotic responses. The signaling pathways that activate the cytoplasmic NF-κB dimers in response to a wide range of immune and inflammatory signals have been investigated extensively; however, the molecular mechanisms that link the nuclear DNA with cytoplasmic activation of NF-κB is relatively less known. Here we systematically identified regulators and essential components required for the DNA damage-induced activation of the NF-κB pathway using genome-wide siRNA screens. Amongst the identified components, we validated that TSG101 regulates the NF-κB activation by DNA damage. We showed that TSG101 interacts with PARP1 and controls its catalytic activity. Targeting TSG101 consequently achieves trapping of PARP1 in DNA lesions and diminishes the DNA damage-induced NF-κB activation. In the absence of TSG101, cells lack PAR-dependent cellular responses and are sensitized to DNA damage-induced apoptosis. The signal-induced processing of p100 is an essential step for the activation of the non-canonical NF-κB pathway. Despite of its importance in immune responses, development, and several malignancies, the ubiquitin-proteasome system components regulating p100 processing were never analyzed using endogenous systems. In this study, utilizing a CRISPR Cas9 based knock out screening system we identified non-redundant E3 ligases required for the signal-induced p100 processing. We also characterized the TWEAK-induced ubiquitinome via mass spectrometry.

Cyanobakterien sind die einzig bekannten Prokaryoten, die in der Lage sind oxygene Photosynthese zu betreiben. Sie besitzen ein großes Potenzial als nachhaltige Ressourcen für die Herstellung zahlreicher industriell und medizinisch relevanter Wirkstoffe. Trotz ihrer essentiellen Bedeutung ist jedoch das Wachstum von Cyanobakterien bis jetzt nur unzureichend verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich daher ein mathematisches Modell entwickelt, das das Wachstum von Cyanobakterien auf der Grundlage von intrazellulärer Proteinverteilung beschreibt. Dabei wurde das Proteom in wenige relevante Protein-Klassen unterteilt, die an fundamentalen zellulären Prozessen beteiligt sind, darunter Kohlenstoffaufnahme, -fixierung und -stoffwechsel, sowie Photosynthese und Proteintranslation. Besonders interessant sind die aus dem Modell resultierenden sogenannten mikrobiellen Wachstumsgesetze, sprich die Korrelationen zwischen der Wachstumsrate und der Proteinverteilung, die im stationären Zustand des Wachstums beobachtet werden. Das Modell prognostiziert eine charakteristische Krümmung für die Wachstumsgesetze jener Proteine, welche mit Lichtabsorption und Proteintranslation assoziiert werden. Verursacht wird diese Krümmung durch hohe Lichtintensitäten, die eine Abnahme der Wachstumsrate zur Folge haben. Die prognostizierten Wachstumsgesetze werden durch Proteindaten, die mittels Massenspektrometrie erhoben wurden, vom Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 gestützt. Des Weiteren bietet das Modell einen geeigneten Ausgangspunkt für die Erweiterung von der Charakterisierung von Einzelzellen zu einer Population von Zellen in einem lichtlimitierten Chemostat. Das erweiterte Modell stellt einen Zusammenhang her zwischen intrazellulärer Proteinverteilung, Wachstum der Population und Kultivierungseigenschaften, und bietet somit einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung und Verbesserung der Kultivierung von phototrophen Organismen und die Optimierung der photosynthetischen Produktivität. / Cyanobacteria are the only known prokaryotes that perform oxygenic photosynthesis, and therefore, hold significant potential as sustainable resources for the production of numerous industrially and medically relevant compounds. Despite their importance, however, the (molecular) limits and cellular economy of photoautotrophic growth are still insufficiently understood. In this thesis, I present a mathematical model based on a coarse-grained description of cellular protein allocation to describe cyanobacterial growth. The model describes cellular trade-offs considering only proteins that are involved in key cellular processes (carbon uptake, fixation, and metabolism, as well as photosynthesis and protein translation). Of particular interest are the resulting microbial growth laws, i.e., correlations between the growth rate and the protein distribution observed during balanced growth. The model predicts a characteristic kink for the growth laws of the light harvesting components and the translational machinery induced by photoinhibition, a decrease in growth rate due to high light intensities. The resulting growth laws are supported by quantitative mass spectrometry-based proteomics data of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. The proteomics data shows that the mathematical model has intrinsic predictive power, and thus, provides a suitable starting point for extending it from describing single cells to describe a growing population in a light-limited chemostat. The extended modeling framework goes beyond current models using phenomenological growth equations and establishes a mechanistic link between intracellular protein allocation, population growth and cultivation properties. The extended model provides a novel approach to study and guide phototrophic cultivation improvements that maximize photosynthetic productivity.

Hohe Telomeraseaktivität bedingt durch genomische TERT-Rearrangements definiert eine Gruppe an Hochrisiko-Neuroblastompatienten mit ungünstiger Prognose. Das Abzielen auf Telomerase ist ein hochpriorisierter Ansatzpunkt in der Therapie, für die es bislang keine klinisch erfolgreichen Inhibitoren gibt. Der Einsatz von epigenetisch wirksamen Histondeacetylase Inhibitoren (HDACi) stellt dabei eine interessante Therapieoption dar. In TERT-rearrangierten Neuroblastomzellen erzielte die Behandlung mit verschiedenen pan-, Klasse I oder spezifischen HDAC1/2 Inhibitoren eine Supprimierung der TERT mRNA Expression und der Telomeraseaktivität. RNA-Interferenz Studien bestätigten, dass HDAC1 und HDAC2 die TERT Expression positiv regulieren. Die transiente Überexpression von TERT zeigte einen partiellen Rescue des HDACi-bedingten anti-proliferativen Effekts. Der präventive und therapeutische Einsatz von HDACi Panobinostat verlangsamte das Xenografttumorwachstum, die TERT-Expression und Telomeraseaktivität in subkutanen NMRI-Foxn1nu/nu Mausmodellen des TERT-rearrangierten Neuroblastoms bei klinisch relevanten Dosen. Dies zeigt das translationale Potential und die klinische Durchführbarkeit der Panobinostat-Behandlung. ChIP Sequenzierung und Methylierungsanalyse zeigten keine bedeutenden Unterschiede der Histonmodifikationen und der Methylierung von CpG Dinukleotiden am TERT Lokus nach Panobinostatbehandlung. Die Inhibierung der de novo RNA Synthese zeigte, dass die Stabilität des TERT mRNA Transkripts nach Panobinostatbehandlung verringert war. Dies deutet darauf hin, dass die reduzierte Transkriptstabilität der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die hohe Telomeraseaktivität in TERT-rearrangierten Neuroblastommodellen durch den Einsatz zugelassener HDACi supprimiert werden kann. / Telomerase activation by genomic TERT-rearrangements defines a subgroup of high-risk neuroblastomas with adverse outcome. Accordingly, telomerase activity presents a high-priority drug target with no currently available clinical inhibitors. It was assessed whether telomerase activity could be inhibited through histone deacetylase (HDAC) inhibition in models of TERT-rearranged neuroblastoma. Treatment with a panel of seven pan-, class I- or specific HDAC1/2 inhibitors suppressed TERT mRNA expression and telomerase activity in TERT-rearranged neuroblastoma cells at clinically achievable concentrations. RNA interference-based studies confirmed that HDAC1 and HDAC2 positively regulate TERT transcript levels. Enforced TERT expression partly rescued the anti-proliferative effect of HDAC inhibition indicating a causal role of TERT suppression in the HDAC inhibitormediated tumor-suppressive phenotype. Panobinostat treatment, in preventive and therapeutic settings, considerably attenuated tumor growth in subcutaneous TERT-rearranged neuroblastoma xenograft models in NMRI-Foxn1nu/nu mice and suppressed TERT transcript levels and telomerase activity at clinically relevant doses, thus demonstrating translational potential and clinical feasibility. ChIP sequencing detected no major differences in the chromatin context of the TERT locus between HDAC inhibitor-treated and control cells. Likewise, HDAC inhibition did not substantially alter the methylation profile in the TERT region. Blocking de novo RNA synthesis, however, reduced TERT mRNA transcript levels in HDAC inhibitor-treated cells, suggesting reduced TERT transcript stability as the underlying molecular mechanism. In summary, high-level telomerase activity caused by genomic rearrangements in neuroblastoma models is suppressed by treatment with clinically approved HDAC inhibitors, suggesting indirect druggability and a potential molecular rationale for therapeutic intervention.

Der eukaryotische Zellzyklus ist auf allen Ebenen der Genexpres- sion reguliert. Sowohl breit angelegte genetische Screens als auch funktionale Studien zu den beteiligten Proteinen haben unser Ver- ständnis dieses fundamentalen Prozesses geprägt. In dieser Arbeit behandle ich räumliche Aspekte der post-transkriptionalen Regulation des Zellzyklus, die mit lichtmikroskopischen Einzelzell- und Einzel- molekülmethoden experimentell zugänglich werden. Insbesondere untersuchte ich die subzelluläre Lokalisierung der messenger RNA von CLB2, einem zentralen Regulator der Mitose im eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Bierhefe). Frühere Studien zeigten, dass diese RNA sich im Laufe des vegetativen Zellwachstums in der entstehenden Tochterzelle, der Knospe, anreichert. Mithilfe modernster Fluoreszenzmikroskopie charakterisierte ich die Bewe- gung und Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA-Moleküle auf Zeitskalen von Millisekunden bis hin zur Generationszeit dieser He- fen. Ich zeigte, dass sich mit Hilfe von Multifokusmikroskopie unter Verwendung optimierter Fluoreszenzmarker und der Entwicklung objektiver Analysemethoden die Bewegung einzelner RNA-Moleküle zwischen Mutterzelle und Knospe nachvollziehen lässt. Dazu präsen- tiere ich eine Methode um die beobachteten Trajektorien der messenger RNA mathematischen Analysen der Systembiologie zugänglich zu machen. Weiterhin gab die Beobachtung der Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA Moleküle über den Zellzyklus hinweg mittels einer neuartigen Lichtblattmikroskopie (Lattice Light Sheet Microscopy) Hinweise auf eine bisher unbekannte Dynamik in der Lokalisierung dieser messenger RNA. Die hier entwickelten Methoden ermöglichen eine quantitative Untersuchung räumlicher Aspekte der posttranskrip- tionalen Zellzyklusregulation. / The eukaryotic cell cycle is regulated on all levels of gene expression. Genetic screens and functional studies of the involved proteins have shaped our understanding of this fundamental process. In this thesis I use single cell and single molecule light microscopy methods to investigate spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation. I investigated the subcellular localization of CLB2 mRNA, a central regulator of mitosis in the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast). Previous studies have shown that that this messenger RNA is enriched in the emerging daughter cell, the bud, during vegetative growth. Using pre-commercial fluorescence micro- scopes I characterized the dynamics and partitioning of single CLB2 mRNA on time scales from milliseconds to the generation time of this yeast. I demonstrate that using aberration corrected multifocus mi- croscopy, optimized fluorescent markers, and here developed objective analysis methods, the translocation of single mRNA molecules be- tween mother and bud can be observed. In addition, I report a method to make these trajectories available for the mathematical approaches of Systems Biology. Further, the observation of single CLB2 mRNA partitioning throughout the cell cycle with the use of lattice light sheet microscopy suggested a previously unknown localization behavior of the transcript. The methods developed here enable a quantitative analysis of spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation.

AREG und EREG sind Liganden des EGFR, deren Expression mit einem positiven EGFR-zielgerichtetem Therapieansprechen in Darmkrebs korreliert. Ziel dieser Arbeit war es, einen epigenetischen Einfluss auf die AREG und EREG Expression zu klären. Es wurde gezeigt, dass AREG und EREG in verschiedenen kolorektalen Krebszelllinien differenziell exprimiert sind, und dass die Expression beider Gene durch epigenetische Inhibitoren erhöht werden kann. Eine Analyse in fünf Zelllinien zeigte jedoch, dass die Promotoren beider Gene hauptsächlich unmethyliert vorlagen. Hingegen wurden kurze Regionen im Gen als differentiell methyliert identifiziert. Im AREG Gen liegt diese Region im Exon 2, was auf einen ungewöhnlichen Regulationsmechanismus hindeutet. Promotorfunktionsanalysen zeigten dann, dass diese Region eine methylierungs- und orientierungsabhängige Promotorfunktion hat, in die das MDB-Protein CTCF involviert sein könnte. Expressionsanalysen wiesen darauf hin, dass auch ZBTB33, ein anderes MDB-Protein, in die AREG Regulation involviert sein könnte. Die ZBTB33 Expression korrelierte negativ mit der AREG Expression in den Zelllinien. Eine ZBTB33-Bindungsstelle konnte ausserdem bioinformatorisch im AREG Exon 2 identifiziert werden. Des weiteren wurde gezeigt, dass die Behandlung der Zelllinie LIM1215 mit HDAC Inhibitoren in vitro zu einer Erhöhung der Sensitivität gegenüber EGFR-zielgerichteten Medikamenten führt, begleitet von einer Erhöhung der AREG und EREG Expression. Im in vivo Versuch konnte die Sensitivität von LIM1215 Zellen durch die Behandlung mit DNMT Inhibitoren erhöht werden. Begleitet wurde dies hier mit einer Verringerung der Methylierung der AREG und EREG intragenischen CpGs. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass Patienten, die resistent gegenüber EGFR-zielgerichteten Therapien sind, möglicherweise sensitiv gemacht werden können. In dem Fall könnten AREG und EREG als prädiktive Marker eingesetzt werden, um den Effekt der epigenetischen Inhibitoren zu evaluieren. / AREG and EREG are ligands of the EGFR whose expression correlates with a positive EGFR-targeted therapy response in colorectal cancer. Aim of this work was to define the influence of epigenetic mechanisms on AREG and EREG gene expression. It could be shown that AREG and EREG are differentially expressed in a set of colorectal cancer cell lines and that the expression of both genes increases after treatment with epigenetically interfering compounds such as DNMT inhibitors and HDAC inhibitors. Methylation analysis showed that the promoters of both genes were mainly unmethylated. Nevertheless, short intragenic regions were identified to be differentially methylated. For AREG, this region is located within exon 2, indicating an uncommon epigenetic regulatory mechanism. Promoter function analyses showed that the AREG exon 2 region harbor methylation- and orientation dependent promoter function and they suggested CTCF, an MDB-protein, to be involved in this mechanism. Expression analysis experiments suggested also ZBTB33, another MDB-protein, to be involved in AREG regulation. ZBTB33 was differentially expressed in the cells and it correlated inversely with the AREG expression. Additionally, bioinformatic analyses identified a ZBTB33 binding site within AREG exon 2. It was also shown in this work that LIM1215 cells treated with HDACis were more sensitive towards EGFR inhibitors in vitro. This effect was accompanied by an increased AREG and EREG expression. In vivo, an increased sensitivity towards EGFR inhibitors was achieved in LIM1215 cells by treatment with a DNMT inhibitor. Here the effect was accompanied by a reduced methylation within the AREG and EREG intragenic CpGs. Together, the results suggested a new possibility to potentially make EGFR-targeted therapy resistant patients suitable for this therapy by epigenetic compound treatment. In that case AREG as well as EREG might be predictive markers to evaluate the effect of the epigenetic compounds during therapy.