Zelluläre Entscheidungen, wie z. B. die Differenzierung von T-Helferzellen (Th-Zellen) in spezialisierte Effektorlinien, haben großen Einfluss auf die Spezifität von Immunreaktionen. Solche Reaktionen sind das Ergebnis eines komplexen Zusammenspiels einzelner Zellen, die über kleine Signalmoleküle, so genannte Zytokine, kommunizieren. Die hohe Anzahl der Komponenten, sowie deren komplizierte und oft nichtlineare Interaktionen erschweren dabei die Vorhersage, wie bestimmte zelluläre Reaktionen erzeugt werden. Aus diesem Grund sind die globalen Auswirkungen der gezielten Beeinflussung einzelner Zellen oder spezifischer Signalwege nur unzureichend verstanden. So wirken beispielsweise etablierte Behandlungen von Autoimmunkrankheiten oft nur bei einem Teil der Patienten. Durch Einzelzellmethoden wie Live-Cell-Imaging, Massenzytometrie und Einzelzellsequenzierung, können Immunzellen heutzutage quantitativ auf mehreren Ebenen charakterisiert werden. Diese Ansammlung quantitativer Daten erlaubt die Formulierung datengetriebener Modelle zur Vorhersage von zellulären Entscheidungen, allerdings fehlen in vielen Fällen Methoden, um die verschiedenen Daten auf geeignete Weise zu integrieren und zu annotieren. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit quantitativen Modellformulierungen für die Entscheidungsfindung von Zellen im Immunsystem mit dem Schwerpunkt auf Lymphozytenproliferation, -differenzierung und -tod. / Cellular decisions, such as the differentiation of T helper (Th) cells into specialized effector lineages, largely impact the direction of immune responses. Such population-level responses are the result of a complex interplay of individual cells which communicate via small signaling molecules called cytokines. The system's complexity, stemming not only from the number of components but also from their intricate and oftentimes non-linear interactions, makes it difficult to develop intuition for how cellular responses are actually generated. Not surprisingly, the global effects of targeting individual cells or specific signaling pathways through perturbations are poorly understood. For instance, common treatments of autoimmune diseases often work for some patients, but not for others. Recently developed methods such as live-cell imaging, mass cytometry and single-cell sequencing now enable quantitative characterization of individual immune cells. This accumulating wealth of quantitative data has laid the basis to derive predictive, data-driven models of immune cell behavior, but in many cases, methods to integrate and annotate the data in a way suitable for model formulation are missing. In this thesis, quantitative workflows and methods are introduced that allow to formulate data-driven models of immune cell decision-making with a particular focus on lymphocyte proliferation, differentiation and death.

Der mitteleuropäische Wasserfroschkomplex umfasst Pelophylax lessonae (Genotyp LL), Pelophylax ridibundus (RR) und deren Hybriden Pelophylax esculentus (LR), der sich hemiklonal durch Rückkreuzen mit LL in lessonae-esculentus (L-E)-Populationen oder RR in ridibundus-esculentus (R-E)-Populationen reproduziert. Außerdem können Hybriden in reine Hybridpopulationen (E) bilden, in denen triploide Individuen die Elternarten funktionell ersetzen. Bislang ist wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, die der klonalen Gametenbildung in der Keimbahn der Hybridform zugrunde liegen. In dieser Studie wurden erstmalig 160 Gene der Elternarten untersucht, die an der Gametenbildung beteiligt sind. Zusätzlich wurden 131 SNPs von 52 dieser Gene von 652 Wasserfröschen aus 26 Populationen analysiert. Im Ergebnis wurden 14 SNPs von 10 Genen entdeckt, deren Frequenzen mit dem Populationssystem assoziiert waren. In Übereinstimmung mit ihren Funktionen könnten diese Gene im Zusammenheng mit den system-spezifischen hybridogenetischen Reproduktionsmodi stehen. Sowohl transkriptomische als auch SNP-Daten lieferten Hinweise auf genetische Introgression, d. h. einen Transfer lessonae-spezifischer Allelen in den ridibundus-Genpool oder umgekehrt. Außerdem wurde bei P. lessonae eine kryptische genetische Diversität beobachtet. SNP-Analysen ergaben auch, dass LR-Individuen aus E-Populationen eine höhere genetische Ähnlichkeit mit LR-Individuen aus R-E als aus L-E-Populationen aufweisen. Diese Ergebnisse werfen die Frage nach dem Ursprung der E-Populationen auf, von denen bisher angenommen wurde, dass sie aus L-E-Populationen hervorgegangen sind. Die neuen molekularen Daten stehen mit den hemiklonalen Fortpflanzungsmodi von P. esculentus im Einklang und unterstreichen, dass diese wahrscheinlich auf komplexen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Genen und Faktoren basieren. / The Central European water frog complex comprises Pelophylax lessonae (genotype LL), Pelophylax ridibundus (RR), and their hybridogenetic hybrid Pelophylax esculentus (LR), which reproduces by backcrossing with LL in lessonae-esculentus (L-E) populations or RR in ridibundus-esculentus (R-E) populations. In addition, hybrids are able to reproduce in all-hybrid (E) populations in which triploid individuals functionally replace the parental species. To date, little is known about the molecular mechanisms underlying clonal gamete formation in the hybrid germline. In this study, 160 genes from P. lessonae and P. ridibundus known to be involved in gametogenesis were characterized for the first time. In addition, 131 single nucleotide polymorphisms (SNP) from 52 of these genes were analyzed, derived from 652 water frogs of 26 populations. As a result of logistic regressions, 14 SNPs of 10 genes were detected whose frequencies were associated with the population system. Consistent with their functions during gametogenesis, these genes can be considered as candidates associated with the system-specific hybridogenetic modes, i.e. clonal inheritance of the L and/or R genomes. Both transcriptomic and SNP data provided evidence for genetic introgression, i.e. a transfer of lessonae-specific alleles into the ridibundus gene pool or vice versa. In addition, cryptic genetic diversity was observed in P. lessonae. SNP analysis also revealed that LR individuals from E populations exhibit higher genetic similarity to LR individuals from R-E than L-E populations where triploid frogs do not occur. These findings raise the question of the origin of E populations, which were previously thought to have arisen from L-E populations after the emergence of triploid hybrids. The new molecular data are consistent with the reproductive modes of P. esculentus and emphasize that clonal inheritance is most likely caused by complex interactions of different genes and genetic factors.

Einzelzell-Omics-Daten stehen derzeit im Fokus der Entwicklung computergestützter Methoden in der Molekularbiologie und Genetik. Einzelzellexperimenten lieferen dünnbesetzte, hochdimensionale Daten über zehntausende Gene oder hunderttausende regulatorische Regionen in zehntausenden Zellen. Diese Daten bieten den Forschenden die Möglichkeit, Gene und regulatorische Regionen zu identifizieren, welche die Bestimmung und Aufrechterhaltung der Zellidentität koordinieren. Die gängigste Strategie zur Identifizierung von Zellidentitätsmarkern besteht darin, die Zellen zu clustern und dann Merkmale zu finden, welche die Cluster unterscheiden, wobei davon ausgegangen wird, dass die Zellen innerhalb eines Clusters die gleiche Identität haben. Diese Annahme ist jedoch nicht immer zutreffend, insbesondere nicht für Entwicklungsdaten bei denen sich die Zellen in einem Kontinuum befinden und die Definition von Clustergrenzen biologisch gesehen potenziell willkürlich ist. Daher befasst sich diese Dissertation mit Clustering-unabhängigen Strategien zur Identifizierung von Markern aus Einzelzell-Omics-Daten. Der wichtigste Beitrag dieser Dissertation ist SEMITONES, eine auf linearer Regression basierende Methode zur Identifizierung von Markern. SEMITONES identifiziert (Gruppen von) Markern aus verschiedenen Arten von Einzelzell-Omics-Daten, identifiziert neue Marker und übertrifft bestehende Marker-Identifizierungsansätze. Außerdem ermöglicht die Identifizierung von regulatorischen Markerregionen durch SEMITONES neue Hypothesen über die Regulierung der Genexpression während dem Erwerb der Zellidentität. Schließlich beschreibt die Dissertation einen Ansatz zur Identifizierung neuer Markergene für sehr ähnliche, dennoch underschiedliche neurale Vorlauferzellen im zentralen Nervensystem von Drosphila melanogaster. Ingesamt zeigt die Dissertation, wie Cluster-unabhängige Ansätze zur Aufklärung bisher uncharakterisierter biologischer Phänome aus Einzelzell-Omics-Daten beitragen. / Single-cell omics approaches are the current frontier of computational method development in molecular biology and genetics. A single single-cell experiment provides sparse, high-dimensional data on tens of thousands of genes or hundreds of thousands of regulatory regions (i.e. features) in tens of thousands of cells (i.e. samples). This data provides researchers with an unprecedented opportunity to identify those genes and regulatory regions that determine and coordinate cell identity acquisition and maintenance. The most common strategy for identifying cell identity markers consists of clustering the cells and then identifying differential features between these clusters, assuming that cells within a cluster share the same identity. This assumption is, however, not guaranteed to hold, particularly for developmental data where cells lie along a continuum and inferring cluster boundaries becomes non-trivial and potentially biologically arbitrary. In response, this thesis presents clustering-independent strategies for marker feature identification from single-cell omics data. The primary contribution of this thesis is a linear regression-based method for marker feature identification from single-cell omics data called SEMITONES. SEMITONES can identify markers or marker sets from diverse single-cell omics data types, identifies novel markers, outperforms existing marker identification approaches. The thesis also describes how the identification of marker regulatory regions by SEMITONES enables the generation of novel hypotheses regarding gene regulation during cell identity acquisition. Lastly, the thesis describes the clustering-independent identification of novel marker genes for highly similar yet distinct neural progenitor cells in the Drosophila melanogaster central nervous system. Altogether, the thesis demonstrates how clustering-independent approaches aid the elucidation of yet uncharacterised biological patterns from single cell-omics data.

Saccharomyces cerevisiae ist ein bekanntester Modellorganismen in der Systembiologie, der häufig zur Untersuchung des mitotischen Zellzyklus eukaryotischer Zellen verwendet wird. Des Zellzyklus wird durch Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) und CDK-Inhibitoren (CKI) reguliert. Der wichtigste Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus reguliert den Übergang von der G1 in die S Phase und wird START genannt. Im dieser Arbeit verwenden wir einen stochastischen Modellierungsansatz, um die Auswirkungen verschiedener Synchronisationsmethoden auf den Zellzyklus zu untersuchen. Um Modellparameter zu schätzen, kombinieren wir Phasen aufgelöste mRNA-Verteilungen unsynchronisierter Einzelzellen und Protein-Zeitreihen synchronisierter Zellpopulationen. Somit können wir mRNA-Dynamiken für ausgewählte Synchronisationsmethoden vorhersagen. In einem zweistufigen Optimierungsansatz unterscheiden wir zwischen mRNA- und Protein-Ebene. Die Parameterschätzung basiert auf der Maximum-Likelihood-Methode. Die Phasen aufgelösten mRNA-Verteilungen wurden mithilfe der smFISH-Technik für SIC1, CLN2 und CLB5 gemessen. Die Protein-Zeitreihen wurden mithilfe von Western Blots für entsprechenden Proteine gemessen. Die gemessenen Moleküle sind die Hauptregulatoren des G1-S Phasenübergangs, welche die Komponenten unseres Zellzyklusmodells darstellen. Durch die erfolgreiche Integration von qualitativ unterschiedlichen Datentypen in der Parameterschätzung konnten wir eine systematische Analyse von Synchronisationseffekten auf den Zellzyklus durchführen. Der zeitlicher Ablauf des Zellzyklus ist dabei maßgeblich beeinflusst. Die stärksten zeitlichen Veränderungen weist die Synchronisation mit alpha-Faktor auf. Elutrierte Zellen sind den unsynchronisierten Zellen trotz verlängerter G1 Phase am ähnlichsten. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass synchronisierte Zellpopulationen unzureichend sind, um Rückschlüsse auf den Zellzyklus unsynchronisierter Zellen zu ziehen. / cell cycle, G1/S transition, stochastic modeling, parameter estimation, smFISH, singel cells, Western blotting, cell populations Saccharomyces cerevisiae is a famous model organism in systems biology to study the mitotic cell cycle in eukaryotic cells. The cell cycle is a highly controlled process which is regulated by cyclins, cycline-dependent kinases (CDK) and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI). The main kinase involved in cell cycle regulation is Cdc28. START is the most important check point and controls the G1 to S phase transition. At this point, cells decide if they enter a new cell division cycle or not. In this study, we analyze influences of different synchronization methods on the cell cycle and differences between unsynchronized and synchronized cells by using a stochastic modeling approach. We combine phase-resolved mRNA distributions of unsynchronized single cells and protein time courses of synchronized cell populations to estimate model parameters and to predict synchronization specific mRNA dynamics. Parameter estimation is based on a maximum likelihood approach and performed in a 2-step-optimization in which we differentiate between mRNA and protein level. We measured phase-resolved mRNA distributions of mRNA species SIC1, CLN2 and CLB5 by smFISH and protein time courses of protein species Sic1, Cln2 and Clb5 by Western blotting. These molecules are key regulators of the G1 to S phase transition and represent components of our cell cycle model. By integrating qualitatively different data types in parameter estimation, we come up with a systematic analysis of synchronization effects on the cell cycle. Cell cycle timing is mainly responsible for differences between unsynchronized and synchronized cells and is mostly affected in alpha-factor synchronized cells. Ignoring the prolongation of the G1 phase, elutriated cells are most similar to unsynchronized cells. We show that synchronized cell populations are insufficient to derive general cell cycle behavior of unsynchronized cells.

Transaldolase-Mangel (TALDO) ist ein extrem seltener, angeborener Stoffwechseldefekt, von dem weltweit nur 34 Fälle bekannt sind. Der Defekt geht auf den Verlust des Enzyms Transaldolase 1 aus dem nicht-oxidativen Pentosephosphat-Weg (nicht-oxPPW) zurück und äußert sich in einem weiten Spektrum klinischer Symptome. Die schwerwiegendsten Folgen sind Leber- und Nierenmangelfunktionen, die zum sehr frühen Tod führen können. Desweiteren leiden 15 % der Patienten an wiederkehrenden Infektionen. Neutrophile Granulozyten (Neutrophile) sind die häufigsten weißen Blutkörperchen im Menschen und essentiell für die angeborene Immunantwort gegen Infektionserreger. Ich habe hier funktionale Aspekte von TALDO-Neutrophilen untersucht. Der oxidative Pentosephosphat-Weg (oxPPW) stellt das Reduktionsäquivalent NADPH bereit, welches indirekt für die Entstehung von reactive oxygen species (ROS)-abhängigen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) verantwortlich ist. Der Beitrag des nicht-oxPPW zur ROS-abhängigen NET-Bildung ist bislang nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte ich für Neutrophile aus drei TALDO-Patienten eine jeweils komplett abwesende Entstehung ROS-abhängiger NETs und einen deutlich verringerten oxidativen Burst nach PMA-Stimulation zeigen. Um diese Beobachtungen in einem unabhängigen Modelsystem zu bestätigen, habe ich mit Hilfe des CRISPR-Cas9-Systems, ‚knock-out‘ Mutanten von Transaldolase 1 und dessen Partnerenzym Transketolase in der Neutrophil-ähnlichen Zelllinie PLB-985 hergestellt. Die dergestalt genetisch manipulierten Zellen waren nicht mehr zu PMA-induziertem Zelltod in der Lage. Dies ist somit der erste genetische Beweis für die Abhängigkeit des oxidativen Burst und der Bildung von NETs vom nicht-oxPPW. Diese Erkenntnis trägt zum einen zum mechanistischen Verständnis der NET-Entstehung bei und liefert zum anderen eine potentielle Erklärung für einige der bei TALDO beobachteten Symptome. Desweiteren wurden einige der metabolischen Erfordernisse für die Bildung von NETs mit Hilfe von Inhibitoren untersucht. Die erhaltenen Erkenntnisse zeigen, dass das initiale Maximum des oxidativen Bursts für NET-Bildung unerheblich ist und vielmehr die ROS-Generierung nach ca. 50 Minuten entscheidende Bedeutung für diese hat. / Transdaldolase 1-deficiency (TALDO) is a rare genetic disease with only 34 described cases globally. Transaldolase 1 is part of the non-oxidative pentose phosphate pathway (PPP) and its deficiency results in many clinical symptoms including kidney and liver failure, which can lead to early child-mortality. Some of these patients suffer from recurrent infections, for example in the respiratory tract. Neutrophils are the most abundant white blood cells and essential for the innate immune defence against bacterial and fungal pathogens. The PPP generates reduced NADPH that is crucial for the generation of superoxide by the NADPH oxidase NOX2. In turn, NOX2 is essential for neutrophil extracellular trap (NET) formation. NETs occur through the neutrophil-specific cell death netosis and consist of chromatin decorated with granular proteins. Here I report that neutrophils of three TALDO patients did not make NETs. Deletion of transaldolase 1, and its partner enzyme transketolase, in the neutrophil-like PLB-985 cell line reduced ROS generation and cell death. This confirms that transaldolase 1 is required for NET formation. We present, to the best of our knowledge, the first genetic evidence that the non-oxidative PPP is required for ROS generation and NET formation. Furthermore, some of the metabolic requirements for NET formation were assessed. The obtained data indicate that the initial peak of the oxidative burst is irrelevant for NET formation but the ROS generation after 50 minutes on the contrary has crucial significance.

Die Genexpression ist ein stochastischer Prozess, dessen strenge Regulation einen ungestörten Zellzyklusverlauf ermöglicht. Jeglicher Stress löst eine Neuprogrammierung der Expression und somit einen Stillstand des Zellzyklus aus. Um ein besseres Verständnis des eukaryotischen Zellzyklus zu erlangen, wurde in dieser Arbeit die Fluoreszenzmikroskopie einzelner Zellen (S.cerevisiae) mit stochastischer Modellierung der Hauptregulatorgene des G1/S-Übergangs (SIC1, CLN2, CLB5) kombiniert. Mithilfe des MS2-CP-Systems wurden mRNA-Level von SIC1 in lebenden Zellen bestimmt und verschiedene Transportwege von SIC1-mRNA visualisiert. RNA-FISH in Kombination mit genetischen und morphologischen Markierungen ermöglichte es, die absolute Quantifizierung von SIC1-, CLN2- und CLB5-mRNA in allen Zyklusphasen vorzunehmen. Die Auswirkung von Osmostress, in Hinblick auf eine transkriptionale Verzerrung, wurde untersucht. Basierend auf den experimentellen-Daten wurde ein stochastisches Model entwickelt, dass die Expression von SIC1, CLN2 und CLB5 mRNA und Proteinlevel in Abhängigkeit von Osmostress über den gesamten Zellzyklus hinweg abbildet. Die Modellierung ermöglichte eine in silico Synchronisation und somit die Extraktion kinetischer Parameter. Die Expression der beobachteten Gene wurde im Verlauf des Zellzyklus nicht ein- und ausgeschaltet, stattdessen kam es zu Phasen hoher oder niedriger Expression. Niedriger SIC1 Expression gewährleistete niedriger Sic1 Protein Verzerrung und robustes G1/S Timing. CLN2 und CLB5 zeigten ein maximales Expressionslevel in G1 und auch eine erhöhte Expression in der späten Mitose. Osmostress induzierte einen langanhaltenden Effekt auf die Transkription und die Dauer der Zellzyklusphasen. Der hier vorgestellte Ansatz ermöglichte quantitative Einblicke in die Genexpression und zeitliche Koordination des Zellzyklus von S.cerevisiae. Einige der hier beobachteten Regulationsmechanismen könnten allgemeine Gültigkeit im eukaryotischen Zellzyklus besitzen. / Gene expression is a stochastic process and its appropriate regulation is critical for cell cycle progression. Cellular stress response requires expression reprogramming and cell cycle arrest. Time-resolved quantitative methods on single cells are needed to understand eukaryotic cell cycle in context of noisy gene expression and external perturbations. We applied single-cell fluorescence microscopy and stochastic modeling to SIC1, CLN2 and CLB5, the main G1/S regulators in S. cerevisiae. Using MS2-CP system we estimated SIC1 mRNA levels and visualized different types of transport for SIC1 mRNA particles in living cells. With RNA-FISH combined to genetic and morphological markers we monitored absolute numbers of mRNA and transcriptional noise over cell cycle phases with and without osmostress. Stochastic modeling enabled in silico synchronization, the extraction of kinetic parameters as well as expanded the static mRNA data into time courses for mRNAs, proteins and their noise. Based on our experimental data we developed a stochastic model of G1/S timing centered on SIC1 and a second one for the entire cell cycle involving SIC1, CLN2 and CLB5 and the response to osmostress. All three genes exhibited basal expression throughout cell cycle enlightening that transcription is not divided in on and off but rather in high and low phases. A low SIC1 transcript level ensured a low protein noise and a robust timing of the G1/S transition. CLN2 and CLB5 showed main expression peaks in G1 as well as an expression upshift in late mitosis. Osmostress induced different periods of transcriptional inhibition for CLN2 and CLB5 and long-term impact on cell cycle phase duration. Our approach disclosed detailed quantitative insights into gene expression and cell cycle timing, not available from bulk experiments. Importantly some regulation mechanisms specific to SIC1, CLN2 and CLB5 might be generalized to other genes as well as to other organisms.

Organoide aus adulten Mäusen sind vielversprechende Modelle für die Nierenforschung. Ihre Charakterisierung wurde jedoch nicht auf ein zufriedenstellendes Niveau gebracht. Hier habe ich ein langfristiges 3D-Maus-Organoid (Tubuloid)-Modell etabliert und charakterisiert, das die Erneuerung und die Reparatur sowie die Architektur und die Funktionalität der adulten tubulären Epithelien rekapituliert. In der Zukunft wird das Modell detaillierte Untersuchungen der Trajektorien selbsterneuernder Zellen sowohl zur teilweisen Wiederherstellung der Niere als auch zur malignen Transformation der Niere ermöglichen. Das klarzellige Nierenzellkarzinom (ccRCC) ist der häufigste und aggressivste Nierenkrebs. Die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens Von Hippel-Lindau (VHL) ist der Haupttreiber des ccRCCs. Zuvor hatten wir die Hochregulation der Wnt- und Notch-Signalübertragung in den CXCR4+MET+CD44+-Krebsstammzellen (CSC) aus primären humanen ccRCC-Tumoren identifiziert. Das Blockieren von Wnt und Notch in von Patienten stammenden Xenotransplantaten, Organoiden und nicht-anhaftenden Sphären unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren beeinträchtigte die Selbsterneuerung der CSC und das Tumorwachstum. Um CSC-gesteuertes humanes ccRCC in genetischen Mausmodellen nachzuahmen, begann ich mit der Erzeugung von zwei Doppelmausmutanten; β-Catenin-GOF; Notch-GOF und Vhl-LOF; β-Catenin-GOF. Sowohl die β-Catenin-GOF; Notch-GOF Mausmutante als auch die Vhl-LOF; β-Catenin-GOF Mausmutante entwickelten innerhalb einiger Monate schwere Krankheitssymptome. Überraschenderweise beobachtete ich weder Tumore oder Tumorvorläuferläsionen noch höhere Zellproliferationsraten in den mutierten Nieren. Weitere Analysen ergaben, dass die Mausmutanten Merkmale chronischer Nierenerkrankung (CKD) aufwiesen. / Adult mouse organoids are promising models for kidney research. However, their characterization has not been pushed forward to a satisfying level. Here, I have generated and characterized a long-term 3D mouse organoid (tubuloid) model, which recapitulates renewal and repair, and the architecture and functionality of the adult tubular epithelia. In the future, the model will allow detailed investigations of trajectories of self-renewing cells towards both the partial recreation and malignant transformation of the kidney. Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common and aggressive kidney cancer. Inactivation of the Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene is the major driver of ccRCC. Earlier, we identified the upregulation of Wnt and Notch signaling in CXCR4+MET+CD44+ cancer stem cells (CSCs) from primary human ccRCCs. Blocking Wnt and Notch in patient-derived xenografts, organoids and non-adherent spheres using small-molecule inhibitors impaired self-renewal of CSCs and tumor growth. To mimic CSC-governed human ccRCC in genetic mouse models, I started from the generation of two double mouse mutants; β-catenin-GOF; Notch-GOF and Vhl-LOF; β-catenin-GOF. Surprizingly, I observed neither tumors or tumor precursor lesions nor higher cell proliferation rates in the mutant kidneys. Further analyses revealed that the mutant mice displayed features of chronic kidney disease (CKD). Thus, β-catenin-GOF; Notch-GOF and Vhl-LOF; β-catenin-GOF mouse mutants did not develop kidney tumors under the given experimental conditions.

Neuronen sind bei der Informationsübertragung des zentralen Nervensystems von entscheidender Bedeutung. Ihre Aktivität liegt der Signalverarbeitung und höheren kognitiven Prozessen zugrunde. Neuronen sind in den extrazellulären Raum eingebettet, der mehrere Teilchen, darunter auch Ionen, enthält. Ionenkonzentrationen sind nicht statisch. Intensive neuronale Aktivität kann intrazelluläre und extrazelluläre Ionenkonzentrationen verändern. In dieser Arbeit untersuche ich das Wechselspiel zwischen neuronaler Aktivität und der Dynamik der Ionenkonzentrationen. Dabei konzentriere ich mich hauptsächlich auf extrazelluläre Kalium- und intrazelluläre Natriumkonzentrationen. Mit Hilfe der Theorie dynamischer Systeme zeige ich, wie moderate Änderungen dieser Ionenkonzentrationen die neuronale Aktivität qualitativ verändern können, wodurch sich möglicherweise die Signalverarbeitung verändert. Dann modelliere ich ein leitfähigkeitsbasiertes neuronales Netzwerk mit Spikes. Das Modell sagt voraus, dass eine moderate Änderung der Konzentrationen, die einen Mikroschaltkreis von Neuronen umgeben, die Leistungsspektraldichte der Populationsaktivität verändern könnte. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit die Bedeutung der Dynamik der Ionenkonzentrationen für das Verständnis neuronaler Aktivität auf langen Zeitskalen und liefert technische Erkenntnisse darüber, wie das Zusammenspiel zwischen ihnen modelliert und analysiert werden kann. / Neurons are essential in the information transfer mechanisms of the central nervous system. Their activity underlies both basic signal processing, and higher cognitive processes. Neurons are embedded in the extracellular space, which contains multiple particles, including ions which are vital to their functioning. Ionic concentrations are not static, intense neuronal activity alters the intracellular and extracellular ionic concentrations which in turn affect neuronal functioning. In this thesis, I study the interplay between neuronal activity and ionic concentration dynamics. I focus specifically on the extracellular potassium and intracellular sodium concentrations. Using dynamical systems theory, I illustrate how moderate changes in these ionic concentrations can qualitatively change neuronal activity, potentially altering signal processing. I then model a conductance-based spiking neural network. The model predicts that a moderate change in the concentrations surrounding a microcircuit of neurons could modify the power spectral density of the population activity. Altogether, this work highlights the need to consider ionic concentration dynamics to understand neuronal activity on long time scales and provides technical insights on how to model and analyze the interplay between them.

Die elektrische Signalverarbeitung in Nervenzellen basiert auf deren erregbarer Zellmembran. Üblicherweise wird angenommen, dass die in der Membran eingebetteten leitfähigen Ionenkanäle nicht auf direkte Art gekoppelt sind und dass die Kapazität des von der Membran gebildeten Kondensators konstant ist. Allerdings scheinen diese Annahmen nicht für alle Nervenzellen zu gelten. Im Gegenteil, verschiedene Ionenkanäle “kooperieren” und auch die Vorstellung von einer konstanten spezifischen Membrankapazität wurde kürzlich in Frage gestellt. Die Auswirkungen dieser Abweichungen auf die elektrischen Eigenschaften von Nervenzellen ist das Thema der folgenden kumulativen Dissertationsschrift. Im ersten Projekt wird gezeigt, auf welche Weise stark kooperative spannungsabhängige Ionenkanäle eine Form von zellulärem Kurzzeitspeicher für elektrische Aktivität bilden könnten. Solche kooperativen Kanäle treten in der Membran häufig in kleinen räumlich getrennte Clustern auf. Basierend auf einem mathematischen Modell wird nachgewiesen, dass solche Kanalcluster als eine bistabile Leitfähigkeit agieren. Die dadurch entstehende große Speicherkapazität eines Ensembles dieser Kanalcluster könnte von Nervenzellen für stufenloses persistentes Feuern genutzt werden -- ein Feuerverhalten von Nutzen für das Kurzzeichgedächtnis. Im zweiten Projekt wird ein neues Dynamic Clamp Protokoll entwickelt, der Capacitance Clamp, das erlaubt, Änderungen der Membrankapazität in biologischen Nervenzellen zu emulieren. Eine solche experimentelle Möglichkeit, um systematisch die Rolle der Kapazität zu untersuchen, gab es bisher nicht. Nach einer Reihe von Tests in Simulationen und Experimenten wurde die Technik mit Körnerzellen des *Gyrus dentatus* genutzt, um den Einfluss von Kapazität auf deren Feuerverhalten zu studieren. Die Kombination beider Projekte zeigt die Relevanz dieser oft vernachlässigten Facetten von neuronalen Membranen für die Signalverarbeitung in Nervenzellen. / Electrical signaling in neurons is shaped by their specialized excitable cell membranes. Commonly, it is assumed that the ion channels embedded in the membrane gate independently and that the electrical capacitance of neurons is constant. However, not all excitable membranes appear to adhere to these assumptions. On the contrary, ion channels are observed to gate cooperatively in several circumstances and also the notion of one fixed value for the specific membrane capacitance (per unit area) across neuronal membranes has been challenged recently. How these deviations from the original form of conductance-based neuron models affect their electrical properties has not been extensively explored and is the focus of this cumulative thesis. In the first project, strongly cooperative voltage-gated ion channels are proposed to provide a membrane potential-based mechanism for cellular short-term memory. Based on a mathematical model of cooperative gating, it is shown that coupled channels assembled into small clusters act as an ensemble of bistable conductances. The correspondingly large memory capacity of such an ensemble yields an alternative explanation for graded forms of cell-autonomous persistent firing – an observed firing mode implicated in working memory. In the second project, a novel dynamic clamp protocol -- the capacitance clamp -- is developed to artificially modify capacitance in biological neurons. Experimental means to systematically investigate capacitance, a basic parameter shared by all excitable cells, had previously been missing. The technique, thoroughly tested in simulations and experiments, is used to monitor how capacitance affects temporal integration and energetic costs of spiking in dentate gyrus granule cells. Combined, the projects identify computationally relevant consequences of these often neglected facets of neuronal membranes and extend the modeling and experimental techniques to further study them.

Kürzlich wurde mithilfe von Ribo-seq Experimenten die Translation hunderter Mikroproteine in menschlichen Herzen entdeckt. Diese blieben zuvor aufgrund ihrer geringen Größe (< 100 Aminosäuren) unentdeckt, und ihre physiologische Rolle ist noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Promotionsarbeit ist es, potentielle Funktionen dieser neuartigen Mikroproteine zu entschlüsseln. Dabei sollen insbesondere die Aufklärung ihrer evolutionären Konservierungssignatur, subzellulären Lokalisierung und ihres Proteininteraktoms helfen. Die Konservierungsanalyse ergab, dass fast 90% der Mikroproteine nur in Primaten konserviert ist. Weiterhin konnte ich die Produktion von Mikroproteine in vitro und in vivo nachweisen, die subzelluläre Lokalisierung von 92 Mikroproteinen definieren, und Interaktionspartner für 60 Mikroproteine identifizieren. Dutzende dieser Mikroproteine lokalisieren in Mitochondrien. Dazu gehörte ein im Herzen angereichertes Mikroprotein, das aufgrund der Interaktions- und Lokalisationsdaten einen neuartigen Modulator der mitochondrialen Proteintranslation darstellen könnte. Der Interaktom-Screen zeigte außerdem, dass evolutionär junge Mikroproteine ähnliche Interaktionsfähigkeiten wie konservierte Kandidaten haben. Schließlich wurden kurze Sequenzmotive identifiziert, die Mikroprotein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, wodurch junge Mikroproteine mit zellulären Prozessen – wie z.B. Endozytose und Spleißen – in Verbindung gebracht werden konnten. Zusammenfassend wurde die Produktion vieler kleiner Proteine im menschlichen Herzen bestätigt, von denen die meisten lediglich in Primaten konserviert sind. Zusätzlich verknüpften umfangreiche Lokalisierungs- und Interaktionsdaten mehrere Mikroproteine mit Prozessen wie Spleißen, Endozytose und mitochondrialer Translation. Weitere Untersuchungen dieses zuvor verborgenen Teils des Herzproteoms werden zu einem besseren Verständnis von evolutionär jungen Proteinen und kardiologischen Prozessen beitragen. / Recently, the active translation of hundreds of previously unknown microproteins was detected using ribosome profiling on tissues of human hearts. They had remained undetected due to their small size (< 100 amino acids), and their physiological roles are still largely unknown. This dissertation aims to investigate these novel microproteins and validate their translation by independent methods. Particularly, elucidating their conservation signature, subcellular localization, and protein interactome shall aid in deciphering their potential biological role. Conservation analysis revealed that sequence conservation of almost 90% of microproteins was restricted to primates. I next confirmed microprotein production in vitro and in vivo by in vitro translation assays and mass spectrometry-based approaches, defined the subcellular localization of 92 microproteins, and identified significant interaction partners for 60 candidates. Dozens of these microproteins localized to the mitochondrion. These included a novel cardiac-enriched microprotein that may present a novel modulator of mitochondrial protein translation based on its interaction profile and subcellular localization. The interactome screen further revealed that evolutionarily young microproteins have similar interaction capacities to conserved candidates. Finally, it allowed identifying short linear motifs that may mediate microprotein-protein interactions and implicated several young microproteins in distinct cellular processes such as endocytosis and splicing. I conclude that many novel small proteins are produced in the human heart, most of which exhibit poor sequence conservation. I provide a substantial resource of microprotein localization and interaction data that links several to cellular processes such as splicing, endocytosis, and mitochondrial translation. Further investigation into this hidden part of the cardiac proteome will contribute to our understanding of recently evolved proteins and heart biology.