A metamorfose em insetos é um dos mais complexos e belos eventos biológicos conhecidos, dirigido por sucessivas alterações morfo-fisiológicas. Este intricado processo é coordenado por componentes moleculares como ecdisteroides (20E) e hormônio juvenil (HJ), fatores de transcrição e microRNAs (miRNAs). Os miRNAs regulam a expressão de genes-alvo, que por sua vez orquestram alterações fisiológicas e anatômicas necessárias para o completo desenvolvimento do organismo. Apesar do enorme esforço, os circuitos genéticos e endócrinos que regulam a metamorfose em insetos sociais, como a abelha Apis mellifera, estão longe de serem completamente esclarecidos. Os miRNAs são importantes componentes da maquinaria celular e parecem ser ubíquos no controle de processos biológicos. Desvendar novas interações miRNA-mRNAs alvo envolvidas com a metamorfose e a regulação das cascatas de 20E e HJ lançará uma luz sobre esse complexo evento. Em nosso estudo nós investigamos os papéis de miR-34, miR-281, miR-252a e miR-252b, conhecidos como reguladores da metamorfose em insetos, no modelo A. mellifera. Todos estes miRNAs revelaram alto grau de conservação filogenética, bem como responderam ao tratamento com 20E, sofrendo flutuações na abundância de transcritos. Usando as informações disponíveis e nossos bancos de dados, nós identificamos interações envolvendo estes miRNAs e genes participantes nas cascatas de HJ e 20E: ultraspiracle (Usp), fushi tarazu-transcription factor 1 (ftz-f1), ecdysone receptor (EcR), calponin (chd64), insulin receptor 2 (inr2), e Krüppel homolog 1 (Krh1). A predição das interações miRNA-mRNAs alvo revelou que os receptores de ecdisteroides EcR e Usp, bem como o fator de transcrição ftz-f1 são alvos importantes dos miRNAs estudados, apresentando sítios para os quatros miRNAs investigados. Observamos também que os seis genes codificadores de proteína são putativamente alvejados por miR-34. Por meio do ensaio da luciferase, pudemos validar as interações entre miR-34 e os alvos Kr-h1, chd64 e inr2; miR-252a e os alvos ftz-f1 e EcR; miR-252b e os alvos chd64 e ftz-f1; miR-281 e os alvos ftz-f1, EcR e Usp. A investigação dos perfis de expressão dos miRNAs ao longo do desenvolvimento larval (L3-PP3) e pupal (Pw), contrastados com os perfis de seus respectivos alvos, apontou muitos casos de relações positivas miRNA-mRNA. Estes resultados complementaram os resultados de validação, e expuseram a regulação exercida pelo miRNA sobre seus alvos. Juntos, os nossos resultados apontam para novas interações miRNA-mRNAs, envolvidas com a metamorfose em A. mellifera. As regulações por nós propostas e validadas bem como suas caracterizações e relações com os hormônios reguladores da metamorfose, são inéditas e acrescentam muito ao conhecimento sobre a regulação da metamorfose em A. mellifera. Nesse contexto, nossa pesquisa definitivamente contribui para uma melhor compreensão dos eventos moleculares envolvidos com a metamorfose de abelhas. / Insect metamorphosis is one of the most complex and beautiful of known biological events; it consists of successive morphological and physiological alterations. This intricate process is coordinated by various molecular components, including ecdysteroids (20E), juvenile hormone (JH), transcription factors and microRNAs (miRNAs). The miRNAs regulate gene expression, which in turn orchestrates physiological and anatomical changes necessary for successful insect ontogeny. Despite enormous efforts, the endocrine and genetic circuits that regulate metamorphosis in social insects, such as honey bees (Apis mellifera), are far from being completely elucidated. The miRNAs are a substantial component of this molecular machinery and seem to be ubiquitously involved in the control of biological processes. Disclosing new miRNA-target interactions involved in metamorphosis and in the regulation of 20E and JH cascades can shed light on these poorly understood events. In this study, we provide new pieces to this puzzle. We investigated the roles of miR-34, miR-281, miR-252a and miR-252b, known to be important regulators of insect metamorphosis, in the A. mellifera model. All of these miRNAs revealed a high degree of phylogenetic conservation and responded to treatment with 20E, which altered transcript abundance. Using available information and our databases, we identified interactions involving these miRNAs and the component genes of JH and 20E pathways: ultraspiracle (Usp), fushi tarazu-transcription factor 1 (ftz-f1), ecdysone receptor (EcR), calponin (chd64), insulin receptor 2 (inr2), and Krüppel homolog 1 (Kr-h1). Prediction of miRNA-target interactions revealed that the ecdysteroid receptors EcR and Usp and the transcription factor ftz-f1 are highly targeted by miRNAs involved in metamorphosis; they presented binding sites for all four miRNAs. We also observed that all six-protein coding genes are putatively targeted by miR-34. Using the luciferase assay, we were able to validate the interactions of miR-34 with the targets Krh1, chd64 and inr2; miR-252a with the targets ftz-f1 and EcR; miR-252b with the targets chd64 and ftz-f1; and miR-281 with the targets ftz-f1, EcR and Usp. Investigation of miRNA expression profiles during larval (L3-PP3) and pupal (Pw) development, as a function of the profiles of their respective targets, demonstrated many cases of positive miRNA-mRNA relationships. These results complemented the validation results, showing how the miRNAs regulate their targets. In conclusion, we identified various previously unknown miRNA-mRNA interactions involved in the metamorphosis of A. mellifera. The regulatory pathways proposed and validated by us, as well as their characterizations and relationships with metamorphosis regulator hormones, are unique and add to the understanding of the regulation of metamorphosis in A. mellifera. In this context, our research contributes to a better understanding of the molecular events involved in honey bee metamorphosis.

Nas abelhas sociais Apis mellifera a determinação de castas está relacionada à nutrição diferencial durante o desenvolvimento larval. Os indivíduos são alimentados com geléia real até o terceiro estágio larval, quando aqueles que são destinados a se tornarem operárias passam a receber uma mistura de secreções glandulares, mel e pólen. O conteúdo da dieta recebida após o terceiro estágio larval ativará respostas endócrinas diferenciais que resultarão no estímulo de vias distintas de expressão gênica que culminarão no desenvolvimento de rainhas e operárias. Vários modelos de determinação de castas foram propostos envolvendo diferentes fatores que atuam sobre o desenvolvimento de cada uma, em especial o Hormônio Juvenil (HJ), as vias de sinalização por insulina/IGF e TOR (target of rapamycin) a metilação diferencial e a proteína recentemente descoberta, royalactin, que favorecem o desenvolvimento de rainhas. Para o desenvolvimento de operárias foi sugerido estímulo de outras vias de sinalização, que possivelmente envolveria a participação dos genes ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc) e retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Utilizando diferentes abordagens avaliamos a participação destes genes no processo que culmina no desenvolvimento das castas. Através da análise de expressão gênica em larga escala utilizando microarrays, observamos a existência de genes diferencialmente expressos em rainhas e operárias, sendo a maior que parte deles apresentou expressão preferencial em operárias. Muitos destes genes, inclusive esterase do hormônio juvenil (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D) e peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2), preferencialmente expressos em operárias, estão envolvidos, segundo análises de função por Gene Ontology, em processos essenciais no desenvolvimento das castas como crescimento, reprodução, apoptose, neurogênese, degradação do hormônio juvenil, entre outros. A partir destes resultados, incluímos o gene da esterase do hormônio juvenil (jhe) em nossas análises, como um possível candidato a determinante do desenvolvimento diferencial das operárias. Além disto, foi determinado o perfil de expressão de usp, crc, RfaBp e jhe, durante o desenvolvimento de rainhas e operárias. Observamos que os maiores níveis de expressão de cada um são encontrados em fases posteriores ao período crítico de determinação de castas e que em geral, os maiores níveis de expressão são encontrados em operárias, especialmente crc, RfaBp e jhe. Para usp, os níveis são distintos em rainhas e operária apenas em pontos específicos entre o quinto estágio larval e a fase pré-pupal. Adicionalmente avaliamos a influência da diminuição, através de interferência por RNA (RNAi), dos níveis de expressão de cada um destes genes sobre os níveis dos outros genes estudados, e também sua atuação no desenvolvimento. Vimos que mesmo pequenas modificações nestes níveis inibem ou estimulam a expressão de outros genes e, em alguns casos causam alterações no desenvolvimento das abelhas. Sabendo da importância dos microRNAs (miRNAs) na regulação da expressão gênica e do desenvolvimento, avaliamos os níveis de expressão dos miRNAs preditos como reguladores de jhe. Os resultados obtidos mostraram que alguns deles, como let-7, miR-2796 e miR-263b, por apresentarem correlação negativa com os níveis do gene alvo, são realmente fortes candidatos a seus reguladores. Além disto, alterações nos níveis do gene alvo, mostraram a capacidade de alterar os níveis de expressão da maioria dos miRNAs preditos. Este resultado foi corroborado por sequenciamento em larga escala das amostras tratadas com dsjhe e controle, que apontou também outros possíveis reguladores de jhe, entre eles miR-100, miR-306 e mi-13b. Analisando os resultados obtidos de forma conjunta podemos sugerir que o desenvolvimento de operárias está sob complexa regulação que envolve a participação dos genes aqui estudados, além de outros fatores como os miRNAs. Estes genes agem de maneira coordenada, inclusive com os miRNAs, em momentos específicos do desenvolvimento atuando sobre cascatas de expressão gênica de forma a ativar ou inibir a expressão uns dos outros e também de outros genes, o que culminará no desenvolvimento diferencial de rainhas e operárias em A. mellifera. / In Apis mellifera, a eusocial bee, caste determination during larval development is regulated by differential nutrition. All female larvae are fed royal jelly until the third larval stage, when the workerdestined ones have their diet switched to a gland secretion mix, honey and pollen, Queen-destined larvae, however, are provisioned with a rich diet throughout development. Changes in diet after the third developmental stage modulate larval endocrine responses and different nutritional regimes trigger distinct patterns of gene expression. Thus, nutritional regulation of specific signaling pathways controls development of worker and queen phenotypes. Several proposed models of this process involve caste-specific regulation of hormonal and nutritional factors and/or molecular processes including Juvenile Hormone (JH), insulin/IGF and TOR (target of rapamycin) signaling pathways, differential methylation and the newly discovered protein royalactin, which facilitates queen development. Previous research has also suggested the stimulus of other factors in signaling pathways that acts towards workers development, and they possibly involves the participation of some genes like ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc), and retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Using diverse molecular approaches, we evaluate the role of these genes in caste differentiation. We used microarrays to characterize global differences in gene expression between queen and worker larvae. Functional analysis of significantly, differentially expressed genes identified fundamental biological processes including growth, reproduction, apoptosis, neurogenesis and JH degradation that are involved in caste differentiation. Based on these findings, we selected several candidate genes including juvenile hormone esterase (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D), and peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2) for investigation. Notably, these genes were preferentially upregulated in workers. In a separate experiment, we monitored expression of usp, crc, RfaBp and jhe, in queen and worker larval during stages critical to caste determination. In general, workers expressed crc, RfaBp and jhe at higher levels than queens. For usp, distinct expression levels between worker- and queen-destined larvae were observed only at specific points between the 5th larval stage and pre-pupal phase. Additionally we used RNA interference (RNAi) to monitor the impact of decreased levels of select candidate genes on larval development. We found that even small modification of gene expression levels inhibited or triggered expression of other genes, and, in some cases, caused developmental alterations. Furthermore, microRNAs (miRNAs) are also important regulators of gene expression during development and we identified miRNAs that were predicted jhe regulators and assessed their levels. Results determined that some miRNAs including let-7, miR-2796 e miR-263b were strong candidates for jhe regulation because they were significantly and negatively correlated with target gene expression levels. Furthermore, manipulation of target gene expression levels altered expression of most predicted miRNAs. These results were confirmed by deep sequencing of RNAi samples treated with double-stranded RNA for jhe gene (dsjhe) and controls (with no treatment) which also identified other candidate jhe regulators, like miR-100, miR-306 and mi-13b. Taken together, these results suggest that worker development is regulated by complex interactions that involve usp, crc, RfaBp and jhe in addition to other molecules, including miRNAs. These molecular participants coordinate development at specific time points by regulating activity of gene networks and each other, producing the differential development of workers and queens in A. mellifera.

O polifenismo facultativo, observado entre rainhas e operárias em insetos altamente eussociais tem como estímulo inicial uma alimentação diferencial na fase larval que afeta tanto o desenvolvimento geral das larvas quanto a diferenciação de órgãos e sistemas, principalmente o sistema reprodutor das fêmeas. A via de sinalização por insulina (IIS) é uma das principais vias que integra o desenvolvimento geral de animais com as suas condições nutricionais. O objetivo desse trabalho foi verificar possíveis relações entre a via de sinalização por insulina e a diferenciação das castas em abelhas Apis mellifera. A partir de análises do genoma de Apis mellifera anotamos genes integrantes desta via e verificamos que há dois genes codificadores para receptores de insulina, InR1 e InR2. Os perfis de transcrição desses dois genes obtidos por RT-PCR quantitativa, em larvas de rainhas e operárias durante o período de troca de alimentação, demonstraram que há diferenças consideráveis nos padrões temporais e nos níveis dos transcritos para os receptores de insulina, InR1 (GB15492) e InR2 (GB18331), dentro de cada casta, como também entre as duas castas. Em rainhas verificamos uma interessante variação na transcrição de InR1, que no terceiro instar larval foi cerca de cinco vezes maior que a transcrição de InR2 e no quarto instar seguiu em níveis semelhantes ao de InR2. Essa variação de InR1 pode estar relacionada ao teor de proteínas da geléia real oferecida às larvas de rainhas no terceiro instar, que é maior do que teor de proteínas da geléia real oferecida a partir do quarto instar larval. Para as amostras de larvas de operárias observamos que os níveis dos transcritos dos dois receptores, InR1 e InR2, foram baixos no terceiro estágio larval e aumentaram, de maneira semelhante, até o início do quinto estágio larval, o que pode ter sido devido a algum composto existente na geléia de operária que estimule a transcrição dos genes para os receptores de insulina. Foram feitas análises complementares dos níveis de transcrição dos genes InR1 e InR2, em amostras de ovários, tanto de operárias quanto de rainhas, e em amostras de operárias adultas cultivadas em diferentes tipos de alimentações. Essas análises complementares evidenciaram que a transcrição dos genes para os receptores de insulina em Apis mellifera foi diferente nos ovários de ambas as castas, quando comparada às amostras de corpo inteiro, e que em operárias o transcrito do InR1 foi dominante ao longo de quase toda a vida adulta, sendo superado pelo transcrito InR2 apenas por volta de 13 e 15 dias.. Além disso, uma relação positiva entre o conteúdo de proteína e a transcrição de InR1 foi observada quando analisamos a sua transcrição em amostras de operárias adultas alimentadas com bee bread, uma dieta rica em proteína. Os resultados obtidos nesse trabalho, juntamente com os de Wheeler e colaboradores (2006), Seehus e colaboradores (2006), e Patel e colaboradores (2007), constituem as primeiras informações da via IIS em Apis mellifera, e servirão de base na busca da relação entre a dieta e os sinais downstream envolvidos na determinação de casta e diferenciação. / The initial stimulus that generates the facultative queen/worker polyphenism in highly social insects is a differential alimentation in the larval stages. It affects the general development of the larvae, as well as the differentiation of organs and systems, especially of the female reproductive system. The insulin signaling pathway (IIS) is one of the main pathways that integrates the general development of animals with their respective nutritional conditions. The aim of this work was to investigate the relationship between IIS and caste differentiation in the honey bee Apis mellifera. Using the available Apis mellifera genome information we annotated genes belonging to this pathway. We noted that there are two genes encoding putative insulin receptors, InR1 and InR2. The transcriptional profiles of these genes were obtained by quantitative RT-PCR of queen and workers larvae, giving special attention the period during which the larval diet changes. These results revealed considerable differences in the temporal patterns and levels of the transcripts of two the insulin receptor genes, InR1 (GB15492) and InR2 (GB18331) between the two castes and during their respective larval development. For queens we noted an interesting modulation in InR1 transcription: in the third larval instar it was about five fold higher than the transcription of InR2, but in the fourth instar both receptors were transcribed at similar levels. This variation in InR1 expression may be related to the protein content of royal jelly offered to the queen larvae in third instar, that is higher than the protein content of the royal jelly offered to fourth larvae instar. For the worker larvae samples we observed that transcripts levels of the two receptors, InR1 and InR2, were low in the third larval stage and increased in parallel until the onset of the fifth larval stage. This may have been due to some compound in the worker jelly which stimulates the transcription of both genes coding for insulin receptors. Complementary analysis of transcription levels of InR1 and InR2 were performed on ovaries of queen and worker larvae, and on adult workers maintained on different diets. These complementary analyses highlighted that transcription of the InR genes in the larval ovaries of Apis mellifera was differed from the whole body samples. In adult workers the expression of InR1 was dominant over InR2 during most of the adult life cycle, an inversion was only seen in 13 to 15 days old bees. Furthermore, a positive relationship between protein content and InR1 transcription was observed when analyzing its transcription in adult workers fed with bee bread, a protein-rich diet. The results of this work, in conjunction with those of Wheeler et al. (2007), Seehus et al. (2006) and Patel et al. (2007), are the first information on the IIS pathway in honey bees and they represent the basis for an in-depth pursuit on the relationship between diet and downstream signallng envolved in caste determination and differentiation.

O desenvolvimento embrionário é o resultado de uma sequência controlada de eventos modulados por sinais ambientais e mecanismos intracelulares. Em Hymenoptera, esse processo tem um caráter especial devido ao sistema de determinação do sexo (Haplodiploide). Neste sistema, os ovos fecundados se desenvolvem em fêmeas (diploides) e os ovos não fecundados em machos (haploides). Assim, eventos importantes, como a ativação do ovo e transição materno-zigótica, eventos iniciais da embriogênese, são elementos-chave para compreender o desenvolvimento de ambos os tipos de embriões. Ativação do ovo é um evento complexo acionado em resposta a estímulos externos, necessários para o início da embriogênese. Em abelhas a ativação ovo ocorre independentemente da fecundação e parece ser desencadeado durante a passagem pelo trato reprodutivo da mãe. Além disso, se o ovócito não for fecundado ele irá se desenvolver em um organismo haploide. No entanto, se o ovo recebe o espermatozóide até 30 minutos depois da ativação, o ovo se desenvolve em um organismo diploide. Em Drosophila, a ativação do ovo é também idependente da fecundação. O estímulo inicial que desencadeia o desenvolvimento é devido tensões mecânicas sofridas pelo ovócito durante a ovulação pela passagem através do trato reprodutivo. Neste modelo, o primeiro sinal de ativação inclui a ativação da via dependente de cálcio. Moléculas maternas que são incorporados no ovócito durante ovogênese, atuam durante a ativação do ovo, bem como no início da embriogênese. Os eventos iniciais da embriogênese também são caracterizados pela ausência de altos níveis de transcrição zigótica. As moléculas depositadas atuam na ativação do ovo, quebrando a dormência da divisão celular permitindo a ocorrência do início do desenvolvimento embrionário. Mas, o embrião em desenvolvimento gradualmente degrada e substitui essas moléculas herdadas da mãe, em um processo conhecido como transição materno-zigótica. Nosso principal objetivo foi o entendimento da comunicação entre as moléculas herdadas e as recém produzidas durante os primeiros passos do desenvolvimento de Apis mellifera. Para alcançar nosso objetivo, 16 bibliotecas de RNAseq (mRNA e miRNA) foram construídas utilizando amostras de RNA total de embriões diploides e haploides de diferentes idades e ovócitos maduros. A análise do transcriptoma mostrou que existem genes diferencialmente expressos entre os dois tipos de embriões já em 1 h de desenvolvimento. Além disso, nossa análise permitiu a identificação de mRNAs e miRNAs maternos e zigóticos, além de processos com que estas moléculas se relacionam. As análises mostraram também que um mesmo miRNA pode atingir diferentes mRNAs em cada tipo de embrião, na mesma fase de desenvolvimento. Além disso, um mesmo gene pode ser diferentemente regulado nos dois tipos de embriões. Por exemplo, broad/GB48272, que é classificado como materno em embriões dipoides é regulado por quatro miRNAs diferentes e em embriões haploides é classificado como zigótico, regulado por apenas um miRNA. Análise das bibliotecas de RNAseq e hibridação in situ mostrou o padrão de expressão de zelda em embriões jovens de abelhas. Zelda é um ativador chave do genoma zigótico em Drosophila e regula eventos importantes na embriogênese se ligando a um motivo conservado, TAGteam. Em A. mellifera, encontramos um motivo TAGteam putativo que tem sido relacionado à transcrição zigótica precoce. Além disso, a hibridização in situ e PCR mostraram três primiRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p e ame-mir-263b-5p) que se expressam durante a clivagem. A presença de pri-miRNAs evidenciou a início da transcrição zigótica durante a clivagem. Em suma, podemos dizer que este é o primeiro trabalho em Apis mellifera a descrever os eventos de iniciais do desenvolvimento embrionário comparando embriões haploides e diploides usando os recentes protocolos de bioinformática e os avanços da biologia molecular. / Embryonic development is the result of a precisely controlled sequence of events modulated by environmental signals and intracellular mechanisms. In Hymenoptera, this process takes a special character due the sex-determination system (haplodiploidy). In this system, fertilized eggs develop in females (diploid) and unfertilized eggs in males (haploid). Thus, important events such as egg activation and maternal-zygotic transition, events of the early embryogenesis are key elements to understand the development of both types of embryos. Egg activation is a complex event triggered in response to external stimuli and necessary for the onset of embryogenesis. In honeybees egg activation occurs independently of fertilization and seems to be triggered during the passage through mother\'s reproductive tract. Furthermore, if the egg is not fertilized it will develop into haploid organism. However, if the egg receives the sperm up to 30min after activation, this egg develops into a diploid organism. In Drosophila, the egg activation is also fertilization independent. Initial stimulus that triggers the development is due mechanical stresses suffered by the egg during ovulation and passage through the reproductive tract. In this model, the first activation signal includes activation of calciumdependent pathway. Maternal molecules that are incorporated into the oocyte during ovogenesis, act during egg activation, as well as in early embryogenesis. Early embryogenesis events are also characterized by absence of high levels of zygotic transcription. The deposited molecules drive egg activation, breaking cell division dormancy permitting the beginning of embryonic development. But, the developing embryo gradually degrades and substitutes these mother-inherited molecules, in a process known as mother-to-zygote transition. Our main objective was the understanding of the deep crosstalk among the inherited molecules and the newly ones produced during the first steps of Apis mellifera embryogenesis. To achieve our objective 16 deep sequenced RNA (mRNA, miRNA) libraries were constructed using different age diploid and haploid embryos, and mature oocytes. Genome-wide transcriptome analysis was performed and interactive regulatory networks were constructed. Our analysis permitted the identification of maternal and zygotic mRNAs and miRNAs and related processes. Based on expression profiles of mRNAs and miRNAs in mature oocytes and haploid and diploid embryos of 2, 6 and 18-24 h of development, we constructed integrative regulatory networks (miRNA:mRNA) showing that the same miRNA could target different mRNAs in each type of embryo, in the same phase of development. As example we cite broad/GB48272, which is classified as maternal in diploid embryos and regulated by four different miRNAs. However, in haploid embryos it is zygotic and regulated by only one miRNA. Analysis of RNAseq and in situ hybridization showed the expression pattern of zelda in early honeybee embryos. Zelda is a key activator of Drosophila early zygotic genome and regulates important events in early embryogenesis binding to TAGteam motif. In A. mellifera, we found a putative TAGteam motif that has been implicated in early zygotic transcription. Moreover, in situ hybridization and PCR assay showed three pri-miRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p and ame-mir-263b-5p) expressed during cleavage. The presence of pri-miRNAs is the first evidence of early zygotic transcription during cleavage. In short, we could say that this is the first work on Apis mellifera describing the early embryonic developmental events comparing haploid and diploid embryos using modern bioinformatics tools and advanced molecular analysis.

Nutrição, regulação da expressão gênica e estresse oxidativo são características corresponsáveis pelo desenvolvimento e tempo de vida. Muitos animais apresentam uma relação clara entre o aumento da longevidade e a diminuição da reprodução quando submetidos a restrições alimentares. Contudo, a relação nutrição-longevidade não está completamente elucidada em organismos prioritariamente inférteis e cuja alimentação varia durante a vida adulta, tais como abelhas operárias da espécie A. mellifera. Para explorar tais questões, operárias recém-emergidas foram confinadas em gaiolas e alimentadas com uma dieta isenta de proteína (DNP), ou uma dieta rica em proteínas (DP) por sete dias. Investigamos a influência das dietas sobre: a morfologia das glândulas hipofaringeanas, o transcriptoma do corpo gorduroso, o acúmulo de dano oxidativo, a composição de hidrocarbonetos cuticulares (CHC) e a sobrevivência. Operárias do grupo DNP apresentaram menor sobrevivência e menor grau de ativação das glândulas hipofaringeanas do que operárias do grupo DP. A anotação funcional do transcriptoma de operárias do grupo DNP revelou ainda a ativação da resposta a estímulos, diferenciação, migração e desenvolvimento celular e de projeções neuronais. Todas essas são características compatíveis ao que se observa em operárias naturalmente mais velhas, como é o caso das forrageiras. A anotação funcional do transcriptoma de operárias do grupo DP revelou a ativação do metabolismo de proteínas, lipídios e carboidratos e regulação do sistema imunológico, características ligadas a operárias naturalmente jovens, como as nutridoras. Um total de 436 genes codificadores de proteínas foi apontado pelo sequenciamento em larga escala como dieta-responsivos (fold change > 2). O sequenciamento de RNAs curtos revelou três miRNAs dieta-responsivos (fold change > 2), miR-31a, miR-100 e miR-125, todos superexpressos no grupo DNP. Dentre esses 439 genes codificadores (mRNAs) e não codificadores de proteínas (miRNAs), dez foram experimentalmente validados em corpos gordurosos por RT-qPCR e quatro dos dez revelaram um perfil de expressão semelhante em cérebros frente às dietas. Juntos, nossos achados sustentam a existência de um circuito biológico integrado entre cabeça e corpo gorduroso capaz de regular os diferentes aspectos do controle da longevidade e do comportamento social. O ensaio de estresse oxidativo revelou não haver diferença entre o acúmulo de danos em cabeças nos dois grupos alimentares, talvez sinalizando a existência de uma resistência ou defesa antioxidante mais acentuada no sistema nervoso, protegendo-o. Por outro lado, observamos um nível maior de estresse oxidativo em corpos gordurosos de operárias do grupo DNP, sugerindo um déficit da resposta antioxidante, característica atrelada ao envelhecimento. Referente aos perfis de CHC, esses são similares entre operárias do grupo DP e operárias jovens (maior proporção de n-alcanos), bem como entre operárias do grupo DNP e operárias velhas (maior proporção de alcenos). Em conjunto, nossos resultados indicaram que uma dieta livre de proteínas antecipa o envelhecimento e sugerimos alguns novos marcadores do status nutricional e da progressão do desenvolvimento adulto em operárias: XP_624408.2, XP_393528.3 e XP_006561863.1, os órtólogos de CG9986, CG6058, CG2852, CG32031, CG5848 e CG9331, CG11138, CG10160, CG2674, CG5178, CG15884 e CG1322, além dos três microRNAs já citados. As alterações relacionadas ao status nutricional e envelhecimento, observadas nesse trabalho, suportam o uso de A. mellifera como um excelente organismo modelo no campo da nutrigenômica, bem como contribuem para o entendimento das modulações promovidas pela dieta no desenvolvimento adulto desse organismo. / Nutrition, oxidative stress and gene expression regulation are features responsible for development and lifespan. Many animals have a well-established relationship between an increase in longevity and a decrease in reproduction when subjected to dietary restrictions. However, the biological circuit nutrition-longevity is not fully elucidated in organisms primarily infertile and whose food consumption varies during adulthood, such as honey bee workers A. mellifera. To explore such questions, newly-emerged A. mellifera workers were confined in cages and fed a high protein diet (DP) or a protein free diet (DNP) for seven days. We analyzed the morphology of hypopharingeal glands, mRNAs and miRNAs global expression, oxidative damage, cuticular hydrocarbons profiles (CHC), and workers survival. Workers from DNP group had lower survival and lower activation of hypopharingeal glands than workers from DNP group. The functional annotation of DNP group transcriptome revealed activation of response to stimuli, cell differentiation, cell migration, cell growth and development of neuronal projections. All these biological processes are consistent with naturally older workers, such the foragers. The functional annotation of DP group transcriptome revealed activation of protein, lipid and carbohydrate metabolism and regulation of the immune system, features linked to younger workers, such nurses. Large-scale sequencing revealed that 436 protein-coding genes are diet-responsive (fold change > 2). Small RNAs sequencing revealed that three miRNAs are diet-responsive (fold change > 2), miR-31a, miR-100 and miR-125, all of them overexpressed in DNP group. Among these 439 coding (mRNA) and non-coding (miRNA) genes, 10 were validated in fatty bodies by RT-qPCR, and four of them showed a similar expression profile in brains in response to diets. Altogether, our results support the existence of an integrated biological circuit between head and fat body, which regulates different aspects of lifespan control and social behavior. Oxidative stress assay showed no difference between damage accumulation in honeybees heads from DP and DNP groups; maybe supporting the existence of a sharp resistance or antioxidant defense in the nervous system, protecting it. On the other hand, we observed a greater accumulation of oxidative stress markers in fat bodies of DNP, suggesting a deficit of antioxidant response, an aging feature. The CHC profiles are similar between DP group workers and young workers (high proportion of n-alkanes), and also similar between DNP group workers and old workers (high proportion of alkenes).Taken together, our results suggest that protein-free diet anticipates aging process and provides new markers of nutritional status and progression of workers adult development: XP_624408.2, XP_393528.3, XP_006561863.1, the orthologs of CG9986, CG6058, CG2852, CG32031, CG5848 e CG9331, CG11138, CG10160, CG2674, CG5178, CG15884 and CG1322, besides the three microRNAs already mentioned. The genetic changes related to nutritional status and aging observed in this work support the use of A. mellifera as an excellent model organism in the field of nutrigenomics and also contribute to the understanding of modulations promoted by diet on the adult development of this organism.

A diferenciação morfo-fisiológica entre rainhas e operárias de Apis mellifera decorre da alimentação recebida durante o desenvolvimento larval. Dentre as diferenças morfológicas entre as duas castas encontram-se estruturas especializadas para a coleta de pólen e própolis, localizadas nas pernas metatorácicas das operárias, ausentes nas pernas de rainhas. Os padrões de expressão de Ultrabithorax (Ubx) durante o desenvolvimento de operárias e rainhas estão associados aos padrões de cerdas das pernas de fêmeas adultas. Pernas mesotorácicas de operárias apresentam estruturas descritas como importantes na coleta de pólen, ausentes em rainhas. Por outro lado, as asas não possuem estruturas casta-específicas. No presente trabalho, análises globais de transcrição gênica por hibridação de lâminas de microarrays a partir de RNA total de pernas metatorácicas de operárias e rainhas em três estágios do desenvolvimento mostram 1952 genes diferencialmente expressos. Discos de pernas metatorácicas de larvas no início do quinto estágio larval, quando comparados aos de estágios mais tardios no desenvolvimento, têm alto níveis de transcritos de ativadores de Ubx, o qual está 25 vezes mais expresso em estágios subseqüentes do desenvolvimento. Buscas por motivos de ligação de fatores de transcrição nos promotores dos grupos de genes diferencialmente expressos revelam que os motivos para ligação de Ubx, Zeste e Twist estão super-representados em um dos conjuntos analisados. Dentro deste grupo, estão presentes genes cujos ortólogos em Drosophila são controlados por Ubx, como o caso do gene lola. Análises do processamento do mRNA de Ubx em pernas e asas de ambas as castas mostram que são produzidas três isoformas diferentes quanto à presença de dois microéxons (m1 and m2), que contêm 42 nt and 53 nt, respectivamente. A isoforma IIa-like, que contém o m2, entretanto, parece não ser capaz de produzir uma proteína Hox, já que possui um códon de terminação antes do homeodomínio. O perfil de transcrição diferencial de Ubx entre as castas está associado a apêndices que apresentam diferenças morfológicas, sendo Ubx mais transcrito em pernas meso e metatorácicas de operárias que rainhas. Quando analisadas as porcentagens de expressão de cada isoforma nos apêndices, claramente a isoforma IVa-like, sem microéxons, é a mais transcrita em todos os tecidos. Entretanto, nota-se que nas asas anteriores, onde há menos Ubx, a isoforma IIa-like é proporcionalmente mais transcrita que II nos outros apêndices. Destaca-se uma tendência à inclusão do microéxon m1 (isoforma IIIa-like) ao mRNA de Ubx transcrito em asas posteriores e pernas de rainhas em comparação a operárias, em detrimento da isoforma IVa-like. Análises do uso da região 3UTR em pupas de operárias mostram que há um microssatélite transcrito na porção distal da região 3UTR deUbx. A estrutura secundária predita agrupa separadamente as regiões codificadora e as regiões 3UTR proximal e distal. Análises de seqüenciamento de última geração revelaram que oito dos 51 microRNAs com sítios-alvo preditos na região 3UTR de Ubx estão mais expressos em asas anteriores, e outros dois em asas posteriores. Assim, nossos resultados mostram que o controle da expressão diferencial de Ubx é dada pela ativação desse gene por fatores de transcrição que se ligam ao promotor, controle do splicing alternativo, e expressão de microRNAs diferencial em cada casta e apêndice, controlando, assim, a morfogênese diferencial dos apêndices de fêmeas observada em A. mellifera. / Along with differences in physiological and behavioral characteristics, workers and queens of Apis mellifera also differ in appendage morphology. Some appendage specializations in the hind legs of honeybee workers, which are highly specialized pollinators, deserve special attention. The hind tibia of the worker has an expanded bristle-free region used for carrying pollen and propolis, the corbicula. In queens, this structure is absent. Although these morphological differences have been well characterized, the genetic inputs triggering the development of this alternative morphology have remained unknown. Through microarray analysis, we detected 1,952 genes that are differentially expressed during worker versus queen hind leg development. The gene expression signatures of the two castes have similar patterns of genes controlling development. At the beginning of the last larval instar, Ultrabithorax (Ubx) activators are more strongly expressed than in prepupae and early pupae; at this time Ubx expression is approximately 25 times higher. Within the gene expression signature, we identified a cluster formed by genes in which Ubx, Twist and Zeste binding sites are over-represented. This cluster includes genes for which Drosophila orthologs are known to be bound by Ubx, as in the case of lola. We also tested the extent of Ubx mRNA processing during wing and leg development. Unexpectedly, we found Ubx alternative splicing in both workers and queens; there were two microexons (m1 and m2) encoding 42 nt and 53 nt, respectively, arguing against the hypothesis that alternative splicing occurs exclusively within the Diptera. Inclusion of the m2 exon inserts a stop codon upstream from the exon containing the homeodomain, producing a truncated protein. Moreover, these bee microexons conserve the nucleotides known to be important for alternative splicing in Drosophila. During bee wing development, Ubx mRNA isoforms are transcribed in similar amounts in both castes; however, during leg development, queens produce 60% of the Ubx levels transcribed by workers. Analysis of 3UTR usage during bee development revealed a microsatellite region transcribed within the Ubx 3UTR. The predicted secondary structure locations separated the coding region into three branches and the proximal and the distal 3UTR regions. Deep-sequencing analysis revealed that eight out of 51 miRNAs predicted to target the Ubx mRNA are more highly expressed in worker forewings and two are more expressed in the hindwings. Therefore, we conclude that Ubx differential expression is activated by transcription factors that bind to its promoter, by control of alternative splicing, and moreover by microRNAs differentially expressed according to tissue and caste, resulting in differential morphogenesis of the hind leg in honeybee females.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-17T13:11:55Z No. of bitstreams: 1 luishenriquesoaresalves.pdf: 1368142 bytes, checksum: 146491577e583fc2d7e21436e994771f (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-28T14:15:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 luishenriquesoaresalves.pdf: 1368142 bytes, checksum: 146491577e583fc2d7e21436e994771f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T14:15:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luishenriquesoaresalves.pdf: 1368142 bytes, checksum: 146491577e583fc2d7e21436e994771f (MD5) Previous issue date: 2015-09-25 / As abelhas são constantemente empregadas em estudos para avaliar a biodiversidade, pois são sensíveis às modificações ambientais e climáticas. Muitos desses estudos incluem espécies invasoras como as abelhas africanizadas. Contudo, não há um consenso na literatura, sobre os impactos provocados por essa espécie invasora, ou mesmo se pode estar havendo limitação de recursos para as abelhas nativas, ou até mesmo a desestabilização das comunidades biológicas. Algumas plantas são fundamentais na manutenção das comunidades de abelhas, principalmente durante a escassez de recursos. Nesse contexto, podemos destacar Vernonia polyanthes, conhecida popularmente por Assa-peixe, espécie que além de contribuir na manutenção da comunidade abelhas, é muito utilizada pela apicultura na produção de mel. A apicultura é uma atividade econômica, que explora racionalmente os produtos oriundos das abelhas do gênero Apis. Grande parte da apicultura brasileira é desenvolvida por pequenos e médios agricultores, que comercializam diversos produtos e pequenos animais. A despeito dessa atividade, não se conhece a possível interferência do aumento da biomassa dessa espécie invasora, em virtude da introdução de colmeias de abelhas, sobre as comunidades de abelhas. Os possíveis impactos provocados pela apicultura familiar e a relação das espécies de abelhas visitantes das inflorescências de V. polyanthes com os fatores ambientais, não estão completamente elucidados. Sendo assim, esta tese teve como objetivo conhecer os efeitos dos fatores abióticos sobre as interações e comportamentos exibidos pelas abelhas nas inflorescências V. polyanthes (Assa-peixe), identificar as espécies visitantes e a estrutura faunística da comunidade, além de verificar a ação da apicultura desenvolvida em pequenas escalas sobre a comunidade de abelhas nativas. A pesquisa foi realizada em duas localidades rurais da cidade de Valença, Rio de Janeiro, sendo uma com apiário e outra sem. As coletas foram realizadas semanalmente durante o período de floração de V. polyanthes, julho a agosto (inverno) de 2012 e 2013, em sessões de 10 minutos a cada hora do período de estudo (9 às 16 h), totalizando 26 horas e 30 minutos de amostragens. Foram registrados 1434 (60,43%) indivíduos na localidade com apiário e 934 (39,57%) na localidade 9 sem apiário, totalizando 2.373 indivíduos, distribuídos em 19 espécies, sendo a maior parte comum às duas comunidades (n = 15; 78,95%). As visitas das operárias ocorreram das 9 às 16 h, com maior atividade entre 11 e 15 h. Dentre os fatores abióticos, a umidade relativa do ar (rs = -0,691; p < 0,0001) e a temperatura (rs = 0,531; p < 0,0001) estiveram correlacionados com a atividade forrageadora. As horas mais quentes do dia compreendidas entre 9 e 15 horas com (altas temperaturas e baixa umidade) apresentaram as maiores frequências de forrageio das abelhas (46,9%). Pode-se observar que houve uma diferença significativa na abundância (t (1; 19) = 2,140; p = 0,046), entre as localidades estudadas (área com e sem apiário). Já para a riqueza, não houve diferença significativa (t (1; 19) = -0.600; p = 0,555) entre essas localidades. A ausência de impactos significativos na riqueza e diversidade de abelhas entre as áreas com e sem apiário, destaca a apicultura familiar como um bom modelo para projetos ambientais, uma vez que é ecologicamente sustentável podendo gerar renda em uma atividade ambiental de baixo impacto ambiental para espécies nativas. / The bees are constantly used in studies in order to assess biodiversity, since they are sensible to environmental and climatic changes. Many of these studies include exotic species such as Apis mellifera scutellata (Africanized bees). However, the literature shows no agreement on the impact provoked by Africanized bees or on the resource limitation for native species and the destabilization of biologic communities. Some botanic species are fundamental to the maintenance of bee communities, especially during resource shortage. In this context, we may highlight Vernonia polyanthes, popularly known as “Assa-peixe”, widely used in apiculture and honey production. Apiculture, or bee-keeping, is an economic activity which rationally explores the products made by Apis bees. Much of the Brazilian apiculture is carried out by family farmers in small and medium size productions, which commercialize many products and small animals. In spite of this activity, it is not known whether apiculture interferes on bee communities due to the introduction of Africanized bee hives (and consequent increase in the biomass of this exotic species). The knowledge on the species of bees visiting V. polyanthes inflorescences and possible impact caused by family apiculture is not yet fully elucidated. Therefore, this thesis aimed to understand the interactions and behaviors shown by bees in V. polyanthes inflorescences, identify the flower-visiting bee fauna and also to verify the impact of apiculture upon the native bee community. The research was carried out in two localities in the countryside of Valença, Rio de Janeiro, and only one of them had an apiary. Samples were held at a weekly basis during the flowering period of V. polyanthes, from July to August (winter) of 2012 and 2013, in 10-minutes sessions for each hour in the study period (from 09:00 to 16:00), totaling 1600 minutes of samples. We recorded 1434 (60.43%) individuals in the locality with the apiary and 934 (39.57%) in the one without the apiary, totaling 2373 individuals distributed in 19 species, most of them being common to both communities (n= 15; 78.95%). Worker visitations occurred from 09:00 to 16:00, with increased activity between 11:00 and 15:00. Among the abiotic factors, relative humidity of air (rs= -0.691; p< 0.0001) and temperature (rs= 0.531; p< 0.0001) were correlated to the foraging activity. The hottest hours of day (high temperature and low humidity) concentrated the 11 greatest bee foraging frequencies (46.9%). We observed a significant difference in abundance (t (1; 19) = 2.140; p= 0.046) between the studied localities. Regarding richness, there was no significant difference (t (1; 19) = -0.600; p= 0.555) between localities. The nectar volume, as well as a high concentration of sugar in V. polyanthes, might be easing the effects of competition between the bee species due to a great offer of food resources. That botanic species stands out as a good alternative for beekeepers to enhance their productivity, generating wealth without significantly impact the richness and diversity of bees, thus being a good model for environmental projects due to its sustainability.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mara_pinto.pdf: 1701468 bytes, checksum: 129a0acebb2c74f24bbcae81aad541a4 (MD5) Previous issue date: 2010-05-11 / Feeding bees Apis mellifera is considered one of the main bottlenecks of beekeeping, having effects on entire production chain. In this species feeding is crucial, not only is necessary to support the maintenance, reproduction and production, but also is responsible for caste differentiation. In contrast to its importance, few studies addressing the development of economically viable diets, easy to purchase and with proven results. Possibly, their development is contingent on available food regionally. Studies on the basic nutritional needs are quite old and made with European bees. The development of applied research addressing this subject with the focus on testing the efficiency of artificial diets is more recent, and still needs improvement, especially in regard to the assessment methodologies. The literature data are much less abundant and more inchoate than those referring to other domesticated species, like mammals and poultries. Aiming to test the effect of diets for Apis mellifera, an experiment in laboratory was carried, with newly emerged bees, kept in an incubator at 32° C, humidity 70-80%, for six days, where they received diet and water ad libidum. Seven experimental diets were tested, using to evaluate the following parameters, the total protein content in the hemolymph, the weight of the bees and the consumption of diets. Four diets showed significant differences in protein content of the hemolymph as compared to control group. One of which was also higher in the parameters weight and consumption. Based on this work, diets with better performance were tested under field conditions in three distinct regions of Santa Catarina state, were evaluated the brood area (drone, opened, closed and total), storage areas for food (honey and pollen), the percentage of Varroa destructor mite infestation, and the physical-chemical analysis of honey. In field experiments, we noted a wide variation in the data, even when considering the same treatment, suggesting that environmental variables might influence the results, and significant differences were demonstrated only in the areas of brood opened, brood total (Serrana region) and mite infestation (Oeste Catarinense and Serrana regions) compared to control. Diets did not alter the patterns of identity and quality of honey produced, and may be considered appropriate for supplemental feeding during times of scarce of pollen. / A alimentação das abelhas Apis mellifera é considerada um dos principais gargalos da apicultura, influindo em diversas áreas da atividade apícola. Nesta espécie, a alimentação é determinante, pois além de levar o suporte necessário para a manutenção, reprodução e produção, também é responsável pela diferenciação das castas. Em contraponto à sua importância, existem poucos estudos contemplando o desenvolvimento de dietas economicamente viáveis, de fácil aquisição e de resultados comprovados. Possivelmente, o seu desenvolvimento esteja condicionado aos alimentos disponíveis regionalmente. Estudos sobre as necessidades nutricionais básicas são bastante antigos e realizados com abelhas europeias. O desenvolvimento de pesquisas aplicadas abordando o tema, com o enfoque de testar a eficiência de dietas artificiais, parece ser mais recente e, ainda, necessita de aprimoramento, principalmente no que tange às metodologias de avaliação. Os dados da literatura são bem menos abundantes e mais incipientes do que aqueles referentes às outras espécies animais domésticas, como os mamíferos e aves. Com o objetivo de testar o efeito de dietas para Apis mellifera, realizou-se experimento em laboratório, com abelhas recém-emergidas, mantidas em incubadora a 32°C, umidade entre 70-80%, por seis d ias, onde receberam as dietas e água ad libidum. Foram testadas sete dietas, utilizando-se como parâmetros de avaliação o teor de proteínas totais na hemolinfa, o peso das abelhas e o consumo das dietas. Quatro dietas apresentaram diferença significativa no teor de proteína da hemolinfa quando comparadas ao grupo controle, sendo que uma delas foi superior também nos parâmetros peso e consumo. Com base neste trabalho, as dietas que apresentaram melhor desempenho foram testadas em campo, em três regiões distintas, no Estado de Santa Catarina, avaliando-se as áreas de cria (zangão, aberta, fechada e total); as áreas de depósito de alimento (mel e pólen) e a porcentagem de infestação pelo ácaro Varroa destructor. No experimento de campo, notou-se uma grande variação dos dados, mesmo quando considerado o mesmo grupo de tratamento, demonstrando que as variáveis ambientais podem mascarar os resultados e as diferenças significativas somente foram demonstradas nas áreas de cria aberta, cria total (região Serrana) e infestação por Varroa destructor (região Oeste Catarinense e Serrana) em comparação ao grupo controle. As dietas utilizadas não alteraram as características físico-químicas do mel produzido, podendo ser consideradas adequadas para suplementação alimentar em época de escassez de recurso natural de pólen.

De nombreuses études suggèrent que le déclin des colonies d’abeilles domestiques (Apis mellifera) serait dû à l’action combinée de plusieurs facteurs de stress, et notamment des agents pathogènes et des pesticides. Nous avons précédemment démontré qu’une co-exposition des abeilles au parasite intestinal Nosema ceranae et à l'insecticide fipronil, administré chroniquement en doses sublétales, entraînait une forte augmentation de la mortalité des abeilles. De plus, des études suggèrent que l'infection par N. ceranae pourrait augmenter la capacité antioxydante des cellules intestinales de l'abeille. Nous nous sommes demandé si l'élévation du taux de mortalité dans un contexte d'infection, combiné à une intoxication au fipronil, pourrait être le résultat d'une production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO). Nos résultats indiquent une diminution de la quantité des ERO, mais aussi de la quantité de protéines oxydées en présence de N. ceranae. Ceci pourrait être la résultante d’une augmentation des activités enzymatiques antioxydantes. Lorsque les abeilles ont été traitées avec les deux facteurs de stress (N. ceranae et fipronil), nous n’avons cependant pas mesuré d’augmentation des ERO, tandis que l’oxydation des protéines était significativement augmentée. Ainsi, la présence du parasite semble perturber la balance oxydative des cellules intestinales et pourrait augmenter la toxicité du fipronil. Des études complémentaires ont également été menées in vitro sur des cellules humaines HFF, infectées avec une autre espèce microsporidienne, Encephalitozoon cuniculi, et/ou exposées au fipronil. Les résultats ont montré que la présence du parasite limitait l’augmentation des ERO induite par le fipronil. De plus, des résultats préliminaires tendent à montrer une augmentation de l’activité métabolique des mitochondries dans les cellules infectées par le parasite. Enfin, dans le but de mieux comprendre le dialogue N. ceranae/abeille/microbiote intestinal, nous avons analysé par une approche de séquençage d’amplicons d’ADNr et d’ARNr 16S la composition et l’abondance des communautés microbiennes de l’intestin après infection et/ou intoxication chronique avec différents pesticides. N. ceranae semble perturber l’activité de plusieurs groupes bactériens, et la présence de pesticides accroît fortement ces perturbations. Ainsi, l’impact d’une co-exposition N. ceranae/pesticides sur le microbiote intestinal pourrait être l’un des éléments clés du déclin des colonies. / Many studies suggest that the observed decline of Apis mellifera honeybee colonies would be due to the combined action of multiple stressors, including both pathogens and pesticides. We previously demonstrated that the honeybee co-exposure to the gut parasite Nosema ceranae and the fipronil insecticide, administered chronically in sublethal doses, highly increased the bee mortality. Moreover, studies suggest that the infection by N. ceranae may increase the antioxidant capacity of the bee intestinal cells. We wondered whether the increase in mortality rate when infection is combined with fipronil intoxication could be the result of reactive oxygen species (ROS) production. Our results indicate that both the ROS amount and the concentration of oxidized proteins decreased upon infection. This could be the result of an increased antioxidant enzymatic activities. When bees were co-exposed to both stressors (N. ceranae and fipronil), we did not measured any increase in ROS level, but the amount of oxidized proteins was significantly increased. Thus, the presence of the parasite seems to disrupt the oxidative balance of the intestinal cells and could increase the toxicity of fipronil. Complementary studies were also conducted in vitro with human cells (HFF), infected with a different microsporidian species, Encephalitozoon cuniculi, and/or treated with fipronil. The results showed that the presence of the parasite reduced the increase in ROS induced by fipronil. In addition, preliminary results showed an increase in mitochondrial metabolic activity in cells infected with the parasite. Finally, in order to better understand the N. ceranae/honeybee/intestinal microbiota dialogue, we analysed the composition and the abundance of microbial communities in the gut after infection and/or intoxication with different pesticides using a next generation sequencing of both rDNA and rRNA 16S amplicons. N. ceranae seems to upset the activity of different groups of bacteria, and the presence of pesticides greatly increased these disturbances. Thus, the impact of N. ceranae/pesticide co-exposure on the intestinal microbiota may be one of the key elements in the decline of honey bee colonies.

Les Cévennes sont depuis des siècles connues pour être des « terres de miel ». L'apiculture y est caractérisée par lo brusc, une ruche traditionnelle construite avec un tronc de châtaignier évidé, couvert d'une lauze de schiste. Les ruchers-troncs constituent une forme d'apiculture très ancienne et rustique, qui a contribué à l'histoire de l'occupation humaine et à la dynamique des paysages en Cévennes. Les ruches étaient à l'origine exclusivement sédentaires et peuplées d'abeilles noires (Apis mellifera mellifera), présentes en Cévennes bien avant l'arrivée des humains. Aujourd'hui, l'apiculture cévenole se fait principalement en ruches à cadres. Les pratiques apicoles actuelles — achat d'abeilles, transhumance, sélection, etc.— ont conduit à la diminution des populations de sous-espèces d'abeilles locales et à leur homogénéisation génétique. Afin de mieux connaître et de préserver ce patrimoine apicole naturel et culturel exceptionnel, le Parc national des Cévennes a initié cette étude pluridisciplinaire à travers le financement d'une thèse CIFRE. Ce travail est composé de trois parties.(I) L'objet de la première partie est l'habitat, la ruche. Les documents d'archives permettent d'affirmer que les ruches-troncs sont apparues en Cévennes à la fin du Moyen Âge, puis se sont développées et maintenues jusqu'à la première moitié du XXe siècle. Le passage de la ruche-tronc à la ruche à cadres moderne s'est réalisé progressivement au cours du siècle dernier. Les témoignages des anciens Cévenols ont permis d'appréhender les pratiques, les savoirs et les savoir-faire associés à ces ruchers traditionnels. Enfin, le micro-environnement des ruchers a été caractérisé grâce à des analyses spatiales qui viennent corroborer le discours local sur l'emplacement idéal d'un rucher.(II) L'abeille noire est au cœur de la deuxième partie. De l'abeille commune à l'abeille « noire agressive », les considérations du milieu apicole sur l'abeille locale ont évolué au cours du siècle écoulé. Un état des lieux de la population d'abeilles a été réalisé en utilisant la morphométrie géométrique, puis l'ADN mitochondrial. La morphométrie permet de dire que les 2/3 de la population d'abeilles des Causses et des Cévennes sont constitués d'abeilles noires. L'étude de l'ADN mitochondrial nous alerte néanmoins sur le taux élevé d'introgression dans ces populations. Cette introgression touche autant les populations d'abeilles élevées en ruches à cadres que celles maintenues en ruches-troncs. Ces populations ne se démarquent pas génétiquement l'une de l'autre.(III) La dernière partie de ce travail concerne la conservation du patrimoine apicole par l'établissement public du Parc national des Cévennes. Elle détaille les moyens et actions passés, présents, ainsi que les difficultés et les perspectives de conservation pour la ruche-tronc et l'abeille noire en contexte d'aire protégée. Cette partie met en exergue l'impérieuse nécessité d'une concertation multi-acteurs, axée sur une intégration de plusieurs types de savoirs — local, scientifique, d'expert — qui tienne compte des changements sociaux, économiques et écologiques auxquels la région des Cévennes est soumise. / For several centuries, the Cévennes region in Southern France has been renowned as a “land of honey”. Beekeeping in Cévennes is characterized by lo brusc, a traditional hive that is made of a hollowed chestnuts log which is covered with a schistous stone slab called “lauze”. Log hive apiaries are a very old and rustic form of beekeeping, which was a major driver of human occupation history and landscape dynamics throughout the Cévennes. From their origins, log hives were home most exclusively to black bees (Apis mellifera mellifera) that were settled in the region far before the rise of humankind. Nowadays, beekeeping in Cévennes is mainly carried out in frame hives. Current beekeeping practices — purchase of bees, transhumance, queen selection… — have led to a drastic decrease in populations of local bee subspecies, and to their genetic homogenization. In order to better understand and preserve this remarkable natural and cultural beekeeping heritage, the Cévennes National Park implemented a multidisciplinary study, through the funding of a CIFRE (Industrial contract for training through research) doctoral research.1- The first part of the study is dedicated to the hive. Archive documents strongly support the assertion that the very first log hives that were established in Cévennes date back to the end of the Middle Age. Afterwards they expanded and were maintained until the middle of the 20th century. The shift from log hive to frame hive occurred progressively throughout the past century. Testimonies by old Cévennes inhabitants helped assessing local practices, knowledge and know-how related to these traditional apiaries. Furthermore, spatial analyses were undertaken to characterize the micro-environment surrounding apiaries. These analyses corroborate local discourses about where an apiary should ideally be set up.2- The black bee is the epicenter of the second part of the study. From the common bee to the “black and aggressive” bee, views by the beekeeping community concerning the local bee in Cévennes have evolved over the past century. Genetic analyses using geometrical morphometry and mitochondrial DNA were successively implemented to establish a state of the art of local bee populations. Morphometric data tell us that nearly 2/3rd of the bee populations of Causses and Cévennes are composed of black bees. However, mitochondrial DNA data alert us on the high level of introgression within these populations. Such introgression equally affects bees kept in frame hives and those kept in log hives.3- The third part of the study addresses the sensitive issue of a conservation strategy of local beekeeping patrimony that is carried out by the public development agency of the Cévennes National Park. Past conservationist resources and actions are described and so are the perspectives and obstacles to a valuable conservation strategy of black bees and log hives in a context of protected area. In conclusion, the study advocates for an indispensable multi-stakeholder conciliation and a necessary integration of several types of knowledge — local ecological knowledge, knowledge from learned experts, scientific knowledge — that takes into consideration the social, economical and ecological changes affecting the overall Cévennes region.